CN108138197B - 用于油脱胶的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于酶法油脱胶的组合物和方法。

Description

用于油脱胶的组合物和方法
相关申请
本申请要求2015年7月17日提交的美国临时申请62194018的优先权权益。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用的方式并入本文，其程度如同明确且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用的方式并入。
发明背景
随着对食品、化妆品以及生态学上可靠的燃料的需求的不断增长，优化粗油的加工以实现高产量和稳定性是重要的。
特别是，需要具有成本效益和效率的方法，用于从油组合物(可食用油、粗油等)除去磷脂质和卵磷脂(统称为“胶”)，以生产可用于消费性产品如食品或燃料的脱胶油产品。
如W.van Nieuwenhuyzen，“Lecithin production and properties”in Journalof the American Oil Chemists′Society(1976)53：425-427中所详细说明的，卵磷脂是磷脂(如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酸)、它们的溶解化合物、甘油三酯、糖(如蔗糖、棉子糖和水苏糖)、一些糖脂和其他微量组分的复杂混合物，其中卵磷脂通常含有大约35重量％的甘油三酯油。
由于粗油中存在多种杂质，可应用一系列化学和物理方法来除去影响油的稳定性、性能质量、味道、气味或颜色的不期望的杂质。最近，使用酶法脱胶取得了进展。
酶法脱胶相对于化学和物理方法具有许多优点，如更低的成本、更少的化学废弃物和更高的精炼油产率。
Francis Turner在书籍Edible Oil Processing from a Patent Perspective，Albert Dijkstra，Ed.Springer第5章中总结了自1990年以来关于本领域主要参与者开发的不同脱胶方法的现有技术(Chapter 5，“Degumming”，p121-155，A.J.Dijkstra，EdibleOil Processing from a Patent Perspective，Springer Science+Business Media，LLC2013)，该文献作为参考文献并入本文中。
在过去几年已开发了一些酶法油脱胶技术。其中一些在专利中公开，如：美国专利号9228211B2、美国专利号US 7.906.307B2、美国专利号9315764、美国专利申请号20120210467；美国专利号8541211和美国专利号8241876。
美国专利号9228211B2公开了可食用油(优选粗可食用油)的水脱胶方法，包括在特定条件下混合可食用油(优选粗可食用油)和脂质酰基转移酶的步骤。在一个特定实施方式中，脂质酰基转移酶(LAT)可与磷脂酶C联合使用。该专利表明以0.5TIPU/gr油的浓度使用脂质酰基转移酶达到最好的结果，导致油相减少。该专利解释说“在形成固醇酯期间，向粗油添加脂质酰基转移酶催化磷脂的脂肪酸部分向固醇转化”。在分子水平上，在粗豆油中，固醇的量不足磷脂的量的1/3。因为在粗豆油中酰基接受者固醇是KLM3′的限制因素，根据酶用量和反应时间可能发生水解反应”。所以发现当用脂质酰基转移酶KLM3′处理粗油时，向该粗油添加更多的固醇产生更多的固醇酯，并且与不添加固醇的油相比，形成的游离脂肪酸的量减少。这一文献表明，使用LAT(0.1-1TIPU/g油的推荐剂量)的酶法脱胶增加了油的游离脂肪酸含量。因为酰基接受者固醇是粗大豆油中LAT的限制因素，发生水解反应。添加0.25-0.75％固醇的替代方案不是经济可行的，并且对于工业方法而言是行不通的。而且，在联合使用LAT和PLC的实施例中，与单独用PLC处理相比，甘油二酯的含量减少。
美国专利号7696369公开了从水脱胶植物油获得的湿胶回收甘油三酯油的方法，将这些胶与磷脂溶解剂(phospholipidolytic agent)混合。这样的磷脂溶解剂可以是磷脂酶。该专利公开了使用Novozyme的
Figure BPA0000254504300000021
Ultra(PLA)进行湿胶处理，并在实施例7中记载了使用每kg干胶物质250mg该酶的方法。不仅是对于等量的磷脂而言，该方法所需要的酶的量比粗油脱胶处理所需的量高大约100倍，而且提供的数据来自于长达5天的处理。因此，这样的方法不能用于压榨行业中。
美国专利号9315764公开了处理诸如皂脚、干胶和湿胶等脂质材料的方法，其中使用酶来催化脂质材料的水解以回收脂肪酸。提供的处理湿胶的实施例包括在20小时的处理过程中使用2％磷脂酶A2，达到30％的油产率。这样的酶量和过程持续时间太高而不能在压榨业中作为有利的方法进行实施。
发明简述
本公开涉及用于油脱胶的组合物和方法。
在第一方面，本公开涉及使油组合物脱胶的方法，该油组合物可以是植物油或来自植物油的胶，含有1-40％w/w的磷脂和1-30％w/w的水，该方法包括：使所述油组合物与酶混合物接触，其中该酶混合物具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶活性、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶活性以及脂质酰基转移酶；其中溶血磷脂和游离脂肪酸的浓度保持在大约它们的初始水平。
在该方法中，所述脂质酰基转移酶是其他酶的酶稳定剂，并且增加酶混合物的其他成分的半衰期，特别是脂质酰基转移酶增加具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶活性、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶活性的多肽的半衰期。
在所述方法的一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶是磷脂酰胆碱-固醇O-酰基转移酶。这种脂质酰基转移酶在本公开中以油脱胶的推荐浓度(现有技术中这一浓度为0.1-0.5TIPU/g油)的1/10至1/100的浓度使用，其中所述酰基转移酶在所述磷脂酶与所述油组合物反应时稳定所述磷脂酰肌醇特异性磷脂酶以及所述磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶的活性。在一些实施方式中，酶混合物可将油组合物中存在的大于60％、70％、80％或90％(w/w)的磷脂水解成二酰基甘油和磷酸酯。在该方法的一些实施方式中，与非酶法脱胶方法相比，该方法使油产率增加了至少1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％或更多。优选地，与非酶法脱胶方法相比，该方法使油产率增加了多达40％。
在一些实施方式中，该方法不包含磷脂酶A。在该方法的一些实施方式中，油组合物中的游离脂肪酸含量不增加。在该方法的一些实施方式中，油组合物中的溶血磷脂含量不增加。在一些实施方式中，该方法减少了油组合物中多于60％、70％、80％或90％质量的胶。在一些实施方式中，在该方法过程中，所述磷脂酰肌醇特异性磷脂酶活性以及所述磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶活性保持在80-90％活性水平。在一些实施方式中，与不含脂质酰基转移酶的酶法油脱胶方法相比，所述磷脂酰肌醇特异性磷脂酶活性或所述磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶活性更高。在一些实施方式中，与不含脂质酰基转移酶的酶法脱胶方法相比，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶以及磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶的总酶活性高了至少10％、20％、30％、40％或50％。在该方法的一些实施方式中，以不超过酶法油脱胶方法的推荐浓度的十分之一的浓度使用所述脂质酰基转移酶。
在该方法的一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为不大于0.01TIPU/g油。在该方法的一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为不大于0.06TIPU/g油。在该方法的一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为不大于0.05TIPU/g油。在一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为大约0.01TIPU/g油。在一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为大约0.001TIPU/g油。在一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为大约0.06TIPU/g油。在一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为大约0.008TIPU/g油。在所述方法的一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NOs：6、7、8、9或10具有至少80％的同一性。在该方法的一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO：10具有至少80％的同一性。在该方法的一些实施方式中，提供所述磷脂酰肌醇特异性磷脂酶活性的酶与SEQ.ID.NOs：1、2、3或4具有至少80％的同一性。在一些实施方式中，提供所述磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶活性的酶与SEQ.ID.NO：5具有至少85％的同一性。在该方法的一些实施方式中，所述油组合物是可食用油。在该方法的一些实施方式中，所述可食用油是大豆油、油菜籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、棕榈油、芝麻油或花生油，或它们的组合。在该方法的一些实施方式中，所述油组合物是粗油。在该方法的一些实施方式中，所述油组合物是湿胶，其与所述酶混合物接触至少4小时，并且初始湿胶中存在的总磷脂有大于70％被水解；油收益为每100g处理的胶回收至少34g的油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶活性由与SEQ.ID.NOs.：1、2、3或4具有至少80％的同一性的酶以低于80ug/g油的浓度提供；所述磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶活性由与SEQ.ID.NO：5具有至少85％的同一性的酶以低于40ug/g油的浓度提供；并且所述脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO：10具有至少80％的同一性，浓度为低于1.2ug/g。在该方法的一些实施方式中，所述磷脂酰肌醇特异性磷脂酶活性由与SEQ.ID.NOs.：1、2、3或4具有至少80％的同一性的酶提供，并且其中所述磷脂酰肌醇特异性磷脂酶和作为酶稳定剂的所述脂质酰基转移酶之间的重量关系为50∶1。
在第二方面，本公开涉及由本公开提供的任何一种方法制得的用于消费性产品的可食用油。
在第三方面，本公开涉及由本公开提供的任何一种方法制得的生物燃料。
在第四方面，本公开涉及用于消费性产品的油，其包含可检测量的多肽，所述多肽与SEQ.ID.NOs：1、2、3或4具有至少80％的序列同一性。
在第五方面，本公开涉及用于消费性产品的油，其包含可检测量的多肽，所述多肽与SEQ.ID.NOs：6、7、8、9或10具有至少80％的同一性。
在第六方面，本公开涉及一种载体，其包含：编码具有磷酸二酯酶活性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ.ID.NOs：1、2、3或4具有至少80％的序列同一性和异源序列。在该载体的一些实施方式中，所述多核苷酸包含与SEQ.ID.NOs：11、12、13或14具有至少80％的序列同一性和异源序列。在该载体的一些实施方式中，所述磷酸二酯酶活性是针对磷脂酰肌醇的。在该载体的一些实施方式中，所述多肽在大约37℃至大约65℃的温度范围下具有磷酸二酯酶活性。在一些实施方式中，所述多肽在大约pH 4至pH 9的pH范围内具有磷酸二酯酶活性。
在第七方面，本公开涉及一种载体，其包含：编码脂质酰基转移酶的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ.ID.NOs.：7、8、9或10具有至少80％的同一性和异源序列。在一些实施方式中，所述多核苷酸包含与SEQ.ID.NOs：15或16具有至少80％的序列同一性和异源序列。在一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶在大约37℃至65℃的温度范围下和在大约pH4至pH 9的pH范围内充当酶稳定剂。
在第八方面，本公开涉及一种基因改造的微生物(GMO)，优选大肠杆菌(Escherichia coli)。在一些实施方式中，所述基因改造微生物包含载体，所述载体包含编码脂质酰基转移酶的多核苷酸，其中所述多肽包含与SEQ.ID.NOs.：7、8、9或10具有至少80％的同一性和异源序列；其中所述脂质酰基转移酶在磷脂酶与油组合物反应时稳定磷脂酰肌醇特异性磷脂酶以及磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶的活性。在一些实施方式中，所述基因改造微生物包含载体，所述载体包含多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ.ID.NOs：15或16具有至少80％的序列同一性和异源序列。在一些实施方式中，该基因改造微生物包含编码具有磷酸二酯酶活性的多肽，并且其中该多肽包含与SEQ.ID.NOs：1、2、3或4具有至少80％的序列同一性和异源序列。在一些实施方式中，所述磷酸二酯酶活性是磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C。在一些实施方式中，所述基因改造微生物包含载体，所述载体包含异源序列、与SEQ.ID.NO：5具有至少85％的同一性的多肽，其中该多肽具有磷脂酶C活性。在一些实施方式中，该基因改造微生物包含载体，所述载体包含多核苷酸，所述多核苷酸与SEQ.ID.NO：11具有至少80％的序列同一性并包含异源序列。在一些实施方式中，所述基因改造微生物包含本公开的一种或多种载体。在一些实施方式中，该基因改造微生物包含本公开的载体的任意组合。
在第九方面，本公开涉及从培养基分离的多肽，所述培养基包含本发明的基因改造生物(GMO)。在某一实施方式中，所述从包含所述基因改造生物(GMO)的培养基分离的多肽，其中该GMO包含载体，该载体包含具有脂质酰基转移酶活性的多核苷酸，并具有与SEQ.ID.NOs.：7、8、9或10至少80％的同一性和异源序列。在某一实施方式中，所述从包含所述基因改造生物(GMO)的培养基分离的多肽，其中所述GMO包含载体，该载体包含具有磷脂酶C活性的多肽，并具有与SEQ.ID.NO：5至少85％的同一性和异源序列。在某一实施方式中，所述从培养基分离的一种或多种多肽包含本公开的一种或多种GMO。在一些实施方式中，所述从培养基分离的多肽是包含磷酸二酯酶活性的多肽，并与SEQ.ID.NOs.：1、2、3或4具有至少80％的序列同一性。在一些实施方式中，所述从培养基分离的多肽是脂质酰基转移酶并具有与SEQ.ID.NOs.：6、7、8、9或10至少80％的同一性。在一些实施方式中，所述从所述培养基分离的多肽是包含磷酸二酯酶活性的多肽并与SEQ.ID.NO.：5具有至少85％的同一性。在一些实施方式中，所述磷酸二酯酶活性是磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C。
在第十方面，本公开涉及用于精炼油组合物的酶混合物组合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，优选具有与SEQ.ID.NOs：1、2、3或4至少80％、优选90％的同一性；磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶，优选与SEQ.ID.NO：5具有至少85％、优选90％的同一性；和脂质酰基转移酶，优选与SEQ.ID.NOs.：6、7、8、9或10具有至少80％、优选90％的同一性，更优选与SEQ.ID.NO.：10具有至少80％的同一性。在该酶混合物的一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶是磷脂酰胆碱-固醇O-酰基转移酶。在该酶混合物的一些实施方式中，所述酶混合物不增加脱胶后油组合物中的游离脂肪酸含量。在该酶混合物的一些实施方式中，所述酶混合物不增加脱胶后油组合物中的溶血磷脂含量。在一些实施方式中，所述与SEQ.ID.NOs.：6、7、8、9或10具有至少80％同一性、更优选与SEQ.ID.NO.：10具有至少80％同一性的脂质酰基转移酶是酶稳定剂，该酶稳定剂稳定磷脂酰肌醇特异性磷脂酶以及磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶在与油组合物反应时的活性。其中所述磷脂酰肌醇特异性磷脂酶和所述脂质酰基转移酶之间的重量关系为至少50∶1；并且其中所述脂质酰基转移酶是酶稳定剂，该酶稳定剂稳定磷脂酰肌醇特异性磷脂酶以及磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶在与油组合物反应时的活性。在一些实施方式中，所述酶混合物不包含磷脂酶A。在一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为油脱胶的推荐浓度(其为0.1-1TIPU/g油)的1/10至1/100。在一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为不大于0.01TIPU/g油。在一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为不大于0.001TIPU/g油。在一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为不大于0.06TIPU/g油。在一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为大约0.01TIPU/g油。在一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为大约0.001TIPU/g油。在一些实施方式中，脂质酰基转移酶的浓度为大约0.05TIPU/g油。
在第十一方面，本公开涉及一种油混合物，其包含：粗油、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和脂质酰基转移酶。在一些实施方式中，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C与SEQ.ID.NOs：1、2、3或4具有至少80％的同一性。在一些实施方式中，脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NOs：6、7、8、9或10具有至少80％的同一性。在一些实施方式中，脂质酰基转移酶是磷脂酰胆碱-固醇O-酰基转移酶。在一些实施方式中，脂质酰基转移酶是酶稳定剂，该酶稳定剂稳定磷脂酰肌醇特异性磷脂酶以及磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶在与油组合物反应时的活性。在一些实施方式中，对于油脱胶，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C的所述浓度和所述脂质酰基转移酶之间的重量关系是至少50∶1，优选60∶1，更优选80∶1.2。
在第十二方面，本公开涉及用于使可食用油脱胶的方法，其包括：(a)提供与SEQ.ID.NOs：1、2、3或4具有至少80％同一性的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶；(b)提供与SEQ.ID.NO：5具有至少80％同一性的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C；(c)提供与SEQ.ID.NOs：6、7、8、9或10具有至少80％同一性的脂质酰基转移酶；以及将可食用油与步骤(a)、(b)和(c)的酶混合，从而使可食用油脱胶。在一些实施方式中，该方法不包含磷脂酶A。在该方法的一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶是磷脂酰胆碱-固醇O-酰基转移酶。在该方法的一些实施方式中，所述可食用油是大豆油、油菜籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、棕榈油、芝麻油或花生油，或它们的组合。在一些方面，本公开提供了一种使可食用油脱胶的方法，其包括：提供所述的与SEQ.ID.NOs：1、2、3或4具有至少80％同一性的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶；提供所述的与SEQ.ID.NO：5具有至少80％同一性的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C；提供所述的与SEQ.ID.NOs：6、7、8、9或10具有至少80％同一性的脂质酰基转移酶；以及将可食用油与步骤(a)、(b)和(c)的酶混合，从而使可食用大豆油脱胶，(i)其中该方法将可食用油中大于80％(w/w)的磷脂水解成二酰基甘油和磷酸酯；(ii)其中该方法与非酶法脱胶方法相比使油产率增加了至少2.0％；(iii)其中游离脂肪酸含量不增加；(iv)其中该方法使油组合物中的胶质量减少大于70％；(v)其中磷脂酰肌醇特异性磷脂酶的活性以及磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶的活性保持在80-90％活性水平；(vi)其中与不含脂质酰基转移酶的酶法油脱胶方法相比，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶或磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶更高；并且(vii)其中与不含作为酶稳定剂的脂质酰基转移酶的酶法油脱胶方法相比，包含磷脂酰肌醇特异性磷脂酶活性以及磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶活性的总酶活性高了至少10％，或者其中溶血磷脂和游离脂肪酸的浓度保持大约它们的初始水平。在一些实施方式中，该方法不包含磷脂酶A。在该方法的一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为不大于0.01TIPU/g油。在该方法的一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为不大于0.001TIPU/g油。在该方法的一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为不大于0.06TIPU/g油。在该方法的一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为大约0.01TIPU/g油。在该方法的一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为大约0.008TIPU/g油。在该方法的一些实施方式中，所述脂质酰基转移酶的浓度为大约0.001TIPU/g油。在该方法的一些实施方式中，可食用油为大豆油、油菜籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、棕榈油、芝麻油或花生油，或它们的组合。
在第十三方面，本公开涉及获得与SEQ.ID.NO：1具有至少80％同一性的赖氨酸芽孢杆菌(L.sphaericus)的重组磷脂酰肌醇特异性磷脂酶的发酵方法，其包括以下步骤：
(1)培养包含与SEQ.ID.NO：11具有至少80％序列同一性的多核苷酸的基因改造微生物，以获得滴度为至少13g l-1的所述磷脂酶，
(2)使所述磷脂酶与上清液分离。
在该发酵方法的一些实施方式中，步骤(1)包含在pH 7、搅拌和37℃温度下的半合成HM培养基，并且用L-阿拉伯糖和甘油作为碳源在OD600为100下诱导PI-PLC基因的表达。
附图简述
本发明的新特征特别阐述在附随的权利要求中。参照下面的阐述利用本发明原理的示例性实施方式的详细说明将更好地理解本发明的特征和优点，示例性实施方式中的附图如下所述：
图1：显示PIPLC表达分析。携带质粒pKCN231(PI-PLC蜡样芽孢杆菌(B.cereus)，第2道)、pKCN232(PI-PLC黄曲霉(A.flavus)，第3道)、pKCN233(PI-PLC赖氨酸芽孢杆菌(L.sphaericus)，第4道)、pKCN234(PI-PLC抗生素链霉菌(S.antibioticus)，第5道)和pKCN235(PI-PLC粪肠球菌(E.faecalis)，第6道)的大肠杆菌菌株上清液(左)和沉淀(右)的SDS-PAGE分析。第1道对应于携带空载体的大肠杆菌菌株。红色箭头表示相应的PI-PLC蛋白质。
图2：显示赖氨酸芽孢杆菌生产PI-PLC的分批进料发酵方法开发。在含有半合成培养基的2-L发酵器中，在分批进料发酵过程中，PI-PLC总蛋白质浓度(菱形)、生物质(黑色方块)和甘油流量(灰色线)的时间进程。使用甘油作为唯一的碳源，并使用L-阿拉伯糖作为诱导物。
图3：显示PI-PLC活性分析。在粗大豆油中以释放的磷酸酯浓度测定纯化的PI-PLC蛋白质的活性。每种PI-PLC的使用浓度为5、10和15μg蛋白质/g粗大豆油。结果表示为至少三次独立实验的平均值和标准偏差。
图4A-D：显示作为测试多肽在油中的特异性磷脂酶C水解活性的一种方法的对比NMR分析。在NMR谱图中，缩写“PC”表示磷脂酰胆碱，“PE”表示磷脂酰乙醇胺，“PI”表示磷脂酰肌醇，“PA”表示磷脂酸，“p-Cho”表示磷酸胆碱，“p-Et”表示磷酸乙醇胺，以及“p-Ino”表示磷酸肌醇。PI-PLC(SEQ.ID.NO 1)处理的油的NMR谱图，(B)PC/PE-PLC(SEQ：ID.NO 5)处理的油的NMR谱图和(C)未经处理的粗油的示例性NMR谱图，(D)PC/PE-PLC+PI-PLC处理的油的示例性NMR谱图。
图5(A)-(C)：与经未处理的粗油相比采用低浓度LAT酶的三酶油脱胶方法的对比NMR分析。(A)显示对未处理粗油的NMR分析，(B)显示对三酶混合物PC/PE-PLC+PI-PLC+LAT0.01TIPU/g的NMR分析，(C)显示对PC/PE-PLC+PI-PLC+LAT 0.005TIPU/g的NMR分析。
图6.油处理后回收的胶。对用(A)水(记录为H2O)、(B)PC/PE-PLC单用或(C)PC/PE-PLC+PI-PLC+LAT处理的粗油计算g胶/100g油。
图7：对粗油(3)、用LAT 0.1TIPU/g处理的粗油(1)或用PC/PE-PLC、PI-PLC和LAT0.01TIPU/g的混合物处理的粗油(2)的NMR分析。
图8 PC/PE-PLC稳定性。单独(A)或以PC/PE-PLC+PI-PLC+LAT的混合物(B)储存的PC/PE-PLC。将酶在4℃或室温25℃下储存。在制备时(初始)或50天、140天和365天后测定酶活性。
图9：显示在油中的酶稳定性的比较。
图10：从酶处理含有15％磷脂的油组合物回收的油。
1.发明详述
I.总体概述
本公开涉及用于油脱胶的组合物和方法。在多个方面，本文描述的组合物和方法涉及产生待用于消费性产品中的油。在一个方面，该组合物和方法用于制造用于消费性产品的可食用油。在另一方面，本文提供的组合物和方法用于制造用于消费性产品的生物燃料。
本公开还提供了与油脱胶方法有关的多种组合物。在一些方面，本公开提供了多肽及其功能性同源物。在一些方面，本公开提供可在微生物中传播的载体和盒。在一些方面，本公开提供多种基因改造生物。在一些方面，本公开提供包含一种或多种基因改造生物的组合物或其组合的培养基。在一些方面，本公开提供分离多肽或从包含本公开的基因改造生物的培养分离的多肽。在一些方面，本公开提供了许多用于油脱胶的酶混合物。在一些方面，本公开提供了包含本文描述的酶混合物或酶组合物的粗油混合物。在一些方面，本公开提供了具有可检测量的本公开的多肽的脱胶的或精炼的可食用油。在一些方面，本公开提供了具有可检测量的本公开的多肽的脱胶的或精炼的生物燃料。
本公开还提供了多种与油脱胶有关的方法。在一些方面，本公开提供了具有改善的酶活性的油脱胶方法。在一些方面，本公开提供了改善磷脂的水解的油脱胶方法。在一些方面，本公开提供了在油脱胶过程中使用较少量的酶的油脱胶方法。在一些方面，本公开提供了使用较少量的脂质酰基转移酶的油脱胶方法。在一些方面，本公开提供了精炼可食用油用于消费性产品或生物燃料的方法。在一些方面，本公开提供了精炼可食用油用于消费性产品或生物燃料的二酶方法。在一些方面，本公开提供了精炼用于消费性产品的可食用油或生物燃料的三酶方法。在一些方面，精炼用于消费性产品的可食用油或生物燃料的三酶方法使用较少量的脂质酰基转移酶。最后，本公开提供了用于可食用油如大豆油的改进的油脱胶方法。在一些方面，用于可食用油的改进的油脱胶方法使用较少量或较小浓度的脂质酰基转移酶。
II.定义
为了便于对本公开的理解，在下文对一些术语和短语进行定义。
如本文所用，除非另有说明，冠词“a”表示一或多，除非另有明确规定。
如本文所用，除非另有说明，诸如“含有”、“包括”、“具有”或“带有”等术语表示“包含”。
如本文所用，除非另有说明，术语“或”可为连接词或转折词。
如本文所用，除非另有说明，任何实施方式均可与任何其他实施方式组合。
如本文所用，除非另有说明，本文的一些创造性实施方式涵盖了数值范围。可以以范围模式表示本发明的许多方面。应当理解范围模式的描述仅是为了方便和简洁的目的，并且不应被解释为对本发明范围的刚性限制。因此，对范围的描述应被视为具有具体公开的所有可能的子范围以及该范围内的个体数值，其如同被明确写出来一样。例如，描述一个范围如1至6应被视为具有具体公开的子范围如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等以及该范围内的个体数字，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何，这均适用。当出现范围时，该范围包括范围端点。
术语“功能性同源物”是指在一个或多个碱基对、密码子、内含子、外显子或氨基酸残基(分别)改造但仍保留本发明的磷脂酶的生物活性的本发明的多核苷酸或多肽。可通过许多手段生产变体，包括举例来说如易错PCR、改组(shuffling)、寡核苷酸定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱变(recursive ensemblemutagenesis)、指数整体诱变(exponential ensemble mutagenesis)、位点特异性诱变、基因重装配、GSSMTM，及它们的任意组合。用于生产在一定pH或温度下具有活性的变体磷脂酶(不同于野生型磷脂酶)的技术包括在本文中。
如本文所用的术语“转染”是指将外源核酸引入到真核细胞中。转染可以通过本领域已知的多种手段来完成，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质体转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和基因枪。
术语“稳定的转染”或“稳定转染”是指将外源核酸、DNA或RNA引入和整合到所转染细胞的基因组中。术语“稳定的转染体”是指已将外源DNA稳定地整合到基因组DNA中的细胞。
如本文所用，术语“核酸分子编码”、“DNA序列编码”和“DNA编码”是指脱氧核苷酸沿着脱氧核糖核酸的链的顺序或序列。这些脱氧核苷酸的顺序决定氨基酸沿着多肽(蛋白质)链的顺序。所述该核酸序列因此编码为氨基酸序列编码。
如本文所用的术语“异源序列”是指连接至或经操作连接至其天然本质上不与之连接的或者其本质上天然在不同位置与之连接的核酸序列的多肽或核苷酸序列。异源核酸可以包括不是在其所被引入的细胞中天然并未发现存在的核苷酸碱基对或氨基酸残基或序列，或者异源核酸可以含有相对于天然存在的序列的一些修饰改造。
术语“大约”被理解为在本领域的正常容许范围内，除非另有明确说明或者根据上下文是明显的。例如，“大约”可被理解为在平均值的2个标准偏差内，“大约”可被理解为所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％以内。除非根据上下文是明确的，本文提供的所有数值被术语“大约”修饰。
术语″粗油″可包括来自常规来源的全粗油，包括已经过一些预处理的粗油。术语粗油还可被理解为包括已进行了水油分离或油精炼领域已知的或将被知晓的其他加工步骤的油。
术语酶稳定剂被理解为这样一个化合物，其保持在水溶液中储存的PLC酶80-90％的活性水平至少1年，并且还保持在油中PLC活性超过其初始活性的80％至少6小时。所述酶稳定剂是大分子，如蛋白质、多糖或糖脂，更准确的说是可与脂质相互作用的蛋白质。优选地，对于本发明，所述酶稳定剂是来自肠棕气单胞菌(Aeromonas enteropelogenes)的脂质酰基转移酶。所述酶稳定剂稳定了其他酶并导致酶混合物的其他组分的半衰期时间增加，特别是脂质酰基转移酶增加了具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶活性、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶活性的多肽的半衰期时间。
术语油组合物可包括可食用油、粗油、湿胶和其他胶。
III.方法
本公开提供了用于使油组合物脱胶的增强方法和工艺。在一些方面，本公开提供了二酶方法。在一些方面，该方法不包含磷脂酶A。在一些方面，在油脱胶过程之后，游离脂肪酸含量不增加。在一些方面，在油脱胶过程中，溶血磷脂含量不显著增加。
在另一方面，本公开提供了用于油精炼的三酶方法。
在一些方面，用于油精炼的三酶方法可包含磷脂酰肌醇特异性磷脂酶、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶和脂质酰基转移酶。在一些方面，用于使油组合物脱胶的方法不包含磷脂酶A。在一些方面，油组合物中的游离脂肪酸含量增加不超过1％、2％、3％、4％、5％。在一些方面，油组合物中的游离脂肪酸含量不增加。在一些方面，脂质酰基转移酶是磷脂酰胆碱-固醇O-酰基转移酶。
在一些方面，本公开提供了增强油脱胶的方法，其包括：使油组合物与酶混合物接触，其中该酶混合物包含磷脂酰肌醇特异性磷脂酶活性、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶活性以及脂质酰基转移酶。在一些方面，使油组合物脱胶的方法不包含磷脂酶A活性。在一些方面，油组合物中游离脂肪酸含量增加不超过1％、2％、3％、4％、5％。在一些方面，油组合物中游离脂肪酸含量不增加。在一些方面，脂质酰基转移酶是磷脂酰胆碱-固醇O-酰基转移酶。
在某些方面，酶混合物可将油中存在的大于40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(w/w)的磷脂水解成二酰基甘油和磷酸酯。
在一些方面，与非酶法脱胶方法相比，该方法使油产率增加了至少0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5.0％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％或6.0％。
在一些方面，与酶法脱胶方法相比，该方法使油产率增加了至少0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5.0％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％或6.0％。
在某些方面，该方法使油中胶的质量减少大于10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些方面，在该方法期间，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶活性以及磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶活性保持在40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的活性水平。在该方法的一些实施方式中，与不含脂质酰基转移酶的酶法油脱胶方法相比，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶活性或磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶活性更高。
在一些方面，与不含脂质酰基转移酶的酶法脱胶方法相比，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶以及磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶的总酶活性高至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％。
用于油脱胶的推荐LAT浓度
用于本发明的粗油脱胶方法的脂质酰基转移酶的推荐浓度为不大于大约0.01TIPU/g油。在一些应用中，脂质酰基转移酶的推荐浓度为不大于大约0.06TIPU/g油。在一些应用中，脂质酰基转移酶的推荐浓度为不大于大约0.002TIPU/g油。在一些应用中，脂质酰基转移酶的推荐浓度为大约0.01TIPU/g油。在一些应用中，脂质酰基转移酶的推荐浓度为大约0.05TIPU/g油。在一些应用中，脂质酰基转移酶的推荐浓度为大约0.002TIPU/g油。在一些应用中，推荐LAT浓度比在油为部分粗油、部分精炼油或基本为精炼油的应用中的0.01TIPU/g、0.05TIPU/g油或0.06TIPU/g油少大约10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些应用中，推荐LAT浓度比包含两种或更多种油类型的油混合物的0.01TIPU/g、0.06TIPU/g油，或0.001TIPU/g油高大约10％、20％、30％、40％、50％或60％。
根据被加工的油类型和LAT制剂，采用本发明的方法使粗油脱胶的脂质酰基转移酶推荐浓度为大约0.2mg/kg油。对于本发明的液体酰基转移酶(LAT)：0.2mg/kg油等于0.2ug/g油，并等于0.01TIPU/g油。
仅作为一个实例，用于使大豆油类型脱胶的推荐LAT浓度可以为大约0.2mg/kg油。在一些应用中，推荐LAT浓度可以比油为部分粗油、部分精炼油或基本为精炼油的应用中的少大约10％、20％、30％、40％、50％或60％。在一些应用中，对于包含两种或更多种油类型的复杂油混合物而言，推荐LAT浓度可以高大约10％、20％、30％、40％、50％或60％。
在一些方面，在本发明中使用脂质酰基转移酶的浓度是酶法油脱胶方法的推荐浓度的十分之一或百分之一。在一些方面，脂质酰基转移酶的浓度不大于0.01TIPU/g油。在一些方面，脂质酰基转移酶的浓度不大于0.06TIPU/g油。在一些方面，脂质酰基转移酶的浓度不大于0.005TIPU/g油。在一些方面，脂质酰基转移酶的浓度为大约0.01TIPU/g油。在一些方面，脂质酰基转移酶的浓度为大约0.06TIPU/g油。在一些方面，脂质酰基转移酶的浓度为大约0.002TIPU/g油。
在一些方面，本发明的脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NOs：6、7、8、9或10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，提供磷脂酰肌醇特异性磷脂酶活性的酶与SEQ.ID.NOs：1、2、3或4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些方面，提供磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶活性的酶与SEQ.ID.NO：5具有至少80％、81％、82％、83％、84％或85％的同一性。
在该方法的一些实施方式中，油为可食用油。在该方法的一些实施方式中，可食用油为大豆油、油菜籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、棕榈油、芝麻油或花生油，或它们的组合。
在一些方面，该方法可包括水解粗油中初始浓度的至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的磷脂。在一些方面，使油组合物脱胶的方法不包含磷脂酶A。
在一些方面，该方法可包括水解粗油中至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇或磷脂酸，或它们的组合。
在一些方面，该方法包括与非酶法油脱胶方法相比使油产率增加了至少0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5.0％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％或6.0％。
本公开提供了一种使油组合物脱胶的方法，其包括：用多肽处理油组合物，所述多肽具有磷酸二酯酶活性并且与SEQ.ID.NOs：1、2、3或4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
本公开提供了一种使油组合物脱胶的方法，其包括用多肽处理油组合物，所述多肽具有脂质酰基转移酶活性并与SEQ.ID.NOs：6、7、8、9或10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，使油组合物脱胶的方法不包含磷脂酶A。
在一些方面，使油组合物脱胶的方法进一步包括，其中所述方法抑制至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的磷酸二酯酶、磷脂酶C、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶或磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶的活性。在一些方面，使油组合物脱胶的方法不包含磷脂酶A。
在一些方面，使油组合物脱胶的方法进一步包括，其中在脱胶过程期间，磷酸二酯酶、磷脂酶C、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶或磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶保持其酶活性的10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在该方法的一些方面，与粗油组合物中最初脂肪酸含量相比，脂质酰基转移酶活性使油中脂肪酸含量增加不大于1％，2％，3％，4％，5％。
在一些方面，与采用磷脂酶A的酶法油精炼方法相比，该方法可使油产率增加了至少0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5.0％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6.0％。
在一些方面，所述使油组合物脱胶的方法得到生物燃料。在一些方面，所述使油组合物脱胶的方法得到生物燃料，其为生物柴油。在一些方面，使油组合物脱胶的方法得到可食用油。在一些方面，可食用油为大豆油、油菜籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、棕榈油、芝麻油或花生油。
本公开提供了一种提高酶法油精炼效率的方法，其包括：提供包含磷脂的油组合物；使油磷脂与至少两种磷酸二酯酶和脂质酰基转移酶反应，从而产生磷酸酯和二酰基甘油。
提高酶法效率
本公开提供了提高酶法油精炼效率的方法，其包括：提供包含磷脂的油组合物；使油磷脂与至少两种磷酸二酯酶和脂质酰基转移酶(并且不包含磷脂酶A)反应，从而产生磷酸酯和二酰基甘油。
在一些方面，所述提高酶法油精炼效率的方法包含至少两种磷酸二酯酶，其中与不采用脂质酰基转移酶的油精炼方法相比，至少一种磷酸二酯酶具有更多的活性。
在一些方面，所述提高酶法油精炼效率的方法包括多肽，所述多肽具有磷酸二酯酶活性并与SEQ.ID.NOs.：1、2、3或4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，使油组合物脱胶的方法不包含磷脂酶A。
在一些方面，提高酶法油精炼效率的方法包括其中第二多肽具有磷酸二酯酶活性并且与SEQ.ID.NO：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，使油组合物脱胶的方法不包含磷脂酶A。
在一些方面，提高酶法油精炼效率的方法包含从载体分离的多肽，所述载体包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有磷酸二酯酶活性，与SEQ.ID.NOs：1、2、3或4至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，以及异源核酸序列。在一些方面，所述使油组合物脱胶的方法不包含磷脂酶A。
在一些方面，所述提高酶法油精炼效率的方法包含从载体分离的多肽，该载体包含：编码具有多肽的多核苷酸，该多肽具有脂质酰基转移酶活性，并具有与SEQ.ID.NOs：7、8、9或10至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性和异源序列。在一些方面，使油组合物脱胶的方法不包含磷脂酶A。
在一些方面，所述提高酶法油精炼效率的方法包含脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NOs：6、7、8、9或10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，使油组合物脱胶的方法不包含磷脂酶A。
在一些方面，提高酶法油精炼效率的方法包括从载体分离的多肽，该载体包含编码以下蛋白质中的两种或更多种的多核苷酸：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和脂质酰基转移酶，磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C和脂质酰基转移酶，以及磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C。在一些方面，该分离的多肽从包含该载体的媒介中获得。
可食用油的脱胶
本公开提供了一种使可食用油脱胶的方法，其包括以下步骤：(a)提供磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NOs：1、2、3或4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；(b)提供磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；(c)提供脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NOs：6、7、8、9或10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；将粗大豆油与步骤(a)、(b)和(c)的酶混合，从而使粗大豆油脱胶。在一些方面，使粗大豆油脱胶的方法不包含磷脂酶A。
在另一方面，本公开提供一种使可食用油脱胶的方法，其包括：提供与SEQ.ID.NOs：1、2、3或4具有至少80％同一性的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶；提供与SEQ.ID.NO：5具有至少80％同一性的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C；提供与SEQ.ID.NOs：6、7、8、9或10具有至少80％同一性的脂质酰基转移酶；以及将可食用油与步骤(a)、(b)和(c)的酶混合，从而使可食用大豆油脱胶。在该方法的一些实施方式中，脂质酰基转移酶是磷脂酰胆碱-固醇O-酰基转移酶，(i)其中该方法将可食用油中大于80％(w/w)的磷脂水解成二酰基甘油和磷酸酯；(ii)其中该方法与非酶法脱胶方法相比使油产率增加了至少2.0％；(iii)其中游离脂肪酸含量不增加；(iv)其中磷脂酰肌醇特异性磷脂酶以及磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶的活性保持80-90％的活性水平；(v)其中与不含脂质酰基转移酶的酶法油脱胶方法相比，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶或磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶较高于不含脂质酰基转移酶的酶法油脱胶方法；并且(vi)其中包含磷脂酰肌醇特异性磷脂酶活性以及磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶活性的总酶活性比不含脂质酰基转移酶活性的酶法油脱胶方法高至少10％。在该方法的一些实施方式中，作为酶稳定剂的脂质酰基转移酶的浓度为不大于0.01TIPU/g油。在该方法的一些实施方式中，脂质酰基转移酶的浓度为不大于0.05TIPU/g油。在该方法的一些实施方式中，脂质酰基转移酶的浓度为不大于0.002TIPU/g油。在该方法的一些实施方式中，脂质酰基转移酶的浓度为大约0.01TIPU/g油。在该方法的一些实施方式中，脂质酰基转移酶的浓度为大约0.002TIPU/g油。在该方法的一些实施方式中，脂质酰基转移酶的浓度为大约0.05TIPU/g油。
IV.组合物
用于消费性产品的油
本公开提供了通过本文提供的方法和工艺制得的用于消费性产品的可食用油。在一些方面，用于消费性产品的可食用油可包含大豆油、油菜籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、棕榈油、花生油、阿萨伊油(acai oil)、扁桃仁油(almond oil)、巴巴苏仁油(babassu oil)、黑加仑籽油、琉璃苣籽油(borage seed oil)、芥花油(canola oil)、腰果油(cashew oil)、蓖麻油、椰子油、芫荽油(coriander oil)、棉花籽油、海甘蓝油(crambeoil)、亚麻籽油(flax seed oil)、葡萄籽油、榛果油、其他坚果油、大麻籽油(hempseedoil)、麻疯果油(jatropha oil)、荷荷巴油(jojoba oil)、亚麻仁油(linseed oil)、澳洲坚果油(macadamia nut oil)、芒果核油、白芒花油(meadowfoam oil)、芥子油、牛蹄油(neat’s foot oil)、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精油、山核桃油(pecan oil)、松子油、阿月浑子树油(pistachio oil)、罂粟籽油(poppy seed oil)、油菜籽油、米糠油、葵花籽油、山茶花油(sasanqua oil)、乳木果油(shea butter oil)、妥尔油(tall oil)、椿油(tsubakioil)、胡桃油(walnut oil)，或它们的任意组合。
本公开提供了通过本文提供的工艺和方法制得的生物燃料。在一些方面，生物燃料可包含鱼油、动物油、植物油(plant oil)、海藻油、植物油(vegetable oil)、直馏植物油(a straight vegetable oil)、初榨植物油(a virgin vegetable oil)、废植物油(awaste vegetable oil)、动物脂肪、油脂(grease)、牛脂(tallow)、猪油(lard)或黄色油脂，或包含脂质或烷基酯的任何组合物。
B.表达载体和表达盒
本公开提供了一种表达载体或表达盒，其包含SEQ.ID.NOs：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的至少一个核酸或其片段、变体或衍生物。在该表达载体或表达盒中，本文提供的核苷酸序列可操作性连接于调控序列从而使调控序列能够提供宿主细胞或生物体对所述核苷酸序列的表达。
本公开的载体或盒可包含具有调控序列、启动子、基因、选择标记基因、异源调控序列、异源启动子、异源基因或它们的组合的分子骨架。
所述载体或盒可用于在宿主细胞中生产RNA或蛋白质分子。所述载体或盒可被转染或转换到宿主细胞中。
在一些方面，所述该载体或盒在体外表达。在一些方面，所述该载体或盒在体内表达。所述该载体或盒可被瞬时转化换到宿主细胞或生物体中。可使用本领域已知的任何方法将所述该载体或盒引并入到宿主细胞或生物体的基因组中。术语“引并入”优选涵盖稳定地引并入到细胞或生物的基因组中。
在一些方面，本公开提供了待在宿主细胞中表达的载体或盒。本公开提供了待在宿主细胞中表达并在培养基中培养宿主细胞的载体或盒。本公开提供了待在宿主细胞中表达的载体或盒并在培养基中培养宿主细胞，从而允许宿主细胞生长和复制，之后从培养基分离表达的重组多肽。
有许多商业上可获得的表达载体。本公开可使用的表达载体的实例包括但不限于pBR322(ATCC 37017)、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)、GEM1(Promega Biotec，Madison，Wis.，USA)pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pD10、psiX174pBluescript II KS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)、pK 232-8和pCM7。特定的真核载体包括pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。这些表达载体和本领域中已知的其他表达载体可以用于本公开。
调控序列
载体或盒可包含用于控制本公开所提供的序列的表达的一个或多个调控序列。
调控序列可以是核酸分子的任何片段，其能够增加或减少宿主细胞或生物体内特定基因的表达。用于控制表达的调控序列可来自宿主细胞或生物体。用于控制表达的调控序列可以是异源的。调控序列可以是嵌合的，包含来自两个或多个不同调控序列的序列元件。
本公开的序列使用的3’UTR调控序列的实例如下所述：载体可包含基因表达的增强子或阻遏子。载体可包含3’UTR序列以控制RNA分子的表达或稳定性。3’UTR序列可以来自相同的宿主细胞。3’UTR序列可以是异源的。3’UTR序列可以是嵌合的，包含来自两个或更多个不同3’UTR序列的序列元件。
作为另一个实例，载体可包含分泌前导序列。前导序列可来自相同的宿主细胞或生物体。分泌前导序列可以是异源的。适合的前导序列可包括但不限于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-18个氨基酸和24个氨基酸两种，例如来自黑曲霉属(Aspergillus))、a-因子基因(酵母，例如酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)和汉逊酵母属(Hansenula))或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属(Bacillus))。在一些方面，嵌合分泌前导序列可用于本公开。通常基于待用于表达基因或蛋白质的宿主细胞选择特定的分泌前导序列。
启动子
启动子可以是DNA的启动特定基因、细胞类型或宿主细胞的转录的区域。启动子通常位于基因的转录起始位点附近。载体或盒可包含一个或多个启动子。载体或盒可包含一个或多个启动子，并且可进一步包含如本文所提供的一个或多个调控序列。
本公开使用的启动子可以是组成型启动子。启动子可以是诱导型启动子。启动子可以是宿主细胞特异性启动子。启动子可以是组织特异性启动子。启动子所来自的宿主细胞或生物体可以与其在其中表达的相同。启动子可以是异源的。启动子可以是嵌合的，包含来自上文所述的两个或更多个不同启动子的序列元件。
根据应用，可以使用原核启动子或真核启动子。可以使用的适合的原核启动子的实例包括但不限于大肠杆菌lac或trp启动子、lacI启动子、lacZ启动子、T3启动子、T7启动子、gpt启动子、lambda PR启动子、lambda PL启动子、来自编码糖解酶如3-磷酸甘油酯激酶(PGK)的操纵子的启动子、或酸性磷酸酶启动子。
适合的真核启动子的实例包括但不限于CMV即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、热休克启动子、早期和晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTRs或小鼠金属巯蛋白-I启动子。
适合本公开使用的启动子的长度可以为大约40-60个碱基对、大约80-100碱基对、大约100-300个碱基对、300-1000个碱基对。
此外，根据应用或宿主细胞类型，将使用特定的启动子类型。本公开使用的启动子可包含TATA盒，Pribnow盒，SOS盒，CAAT盒，CCAAT盒，操纵子，质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、pIJ702的复制起点，上游激活序列等。
载体可进一步包含一个或多个选择标记基因。选择标记基因的实例可以是赋予抗生素抗性(例如，氨苄西林、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。在一些方面，选择可以通过与携带一个或多个选择标记基因的第二载体并转化来完成。
本公开的核苷酸序列可以存在于表达载体中。可供组合物和方法使用的表达载体类型的实例包括但不限于：质粒、粘粒、病毒(如DNA病毒、RNA病毒、逆转录病毒)、噬菌体载体、噬菌粒、福斯质粒(fosmid)、噬菌体(如噬菌体P1-衍生的载体(PAC))或人工染色体(如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC))。
本公开还提供了其他形式的表达载体，其提供等同功能，并且是或成为本领域中已知用于实施蛋白质在宿主细胞或生物体中的表达。
对于给定应用所选的载体类型将取决于所需蛋白质的量、待在其中表达的宿主细胞的类型、待在载体中使用的构建体的尺寸或待用于表达载体的生物体。
C.基因改造的生物体
本公开提供了基因改造的生物(GMOs)，其包含编码如本文提供的SEQ.ID.NOs：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的多肽的核苷酸序列或它们的互补序列。
本公开涵盖的基因改造的生物体是包含本公开的序列、载体或盒的任何微生物或宿主细胞。在一些方面，所述基因改造的生物体包含编码如本文提供的SEQ.ID.NOs：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的多肽的变体、片段或功能性同源物的核苷酸序列。
GMO可以被改造为缺少一个或多个基因。GMO可以被基因改造为包含一个或多个基因。GMO可以被基因改造为缺少一个或多个基因并包含一个或多个基因。
转化宿主细胞以制成GMO的各种手段是本领域中熟知的。可以使用多种技术中的任何技术将载体引入到宿主细胞中，包括但不限于：转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或Ti介导的基因转移。本公开可以使用的特定方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔，参见Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods inMolecular Biology，(1986)and Sambrook et al Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。
在一些方面，GMO可包含一种类型的载体或盒。在一些方面，GMO可包含至少一种或多种类型的载体或盒。在一些方面，GMO可包含本公开的盒和载体。
本公开的核苷酸序列可被引入到宿主的基因组内或被作为自主质粒或其他分子结构被宿主稳定复制。
适合制备本公开的GMO的宿主细胞可以是：原核生物、真菌、细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物的细胞。本公开可使用的酵母细胞的实例包括但不限于：毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。可以使用的细菌细胞的实例包括但不限于大肠杆菌、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、链霉菌(Streptomyces)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，或芽孢杆菌属内的任何种，举例来说，如地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、坚硬芽孢杆菌(B.firmus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)或嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，或链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的任何种。
在一些方面，优选的原核宿主细胞可以是大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。可以使用的昆虫细胞的实例包括但不限于果蝇S2(Drosophila S2)和夜蛾Sf9(Spodoptera Sf9)。哺乳动物细胞的实例可包括任何小鼠或人细胞系。基于其特征可以选择特定的宿主细胞，参见表1：(Gene Expression Systems.Using nature for the art of expression(Fernandez，J.M.&Hoeffler，J.P.，eds)，Academic Press，San Diego，1999.)。
表1：
Figure BPA0000254504300000281
Figure BPA0000254504300000291
D.培养基混合物
本公开提供了培养基混合物组合物。在一些方面，培养基混合物包含本文提供的多肽中的至少一种，其中所述多肽自宿主分泌至培养基中。在一些方面，培养基混合物可包含引入到宿主微生物或细胞的基因组中的载体或盒。在一些方面，培养基混合物可包含可被瞬时保持在宿主微生物或细胞中的载体或盒。在一些方面，培养基混合物包含一种类型的宿主生物。在一些方面，培养基包含至少一种或多种类型的宿主微生物或细胞。
如本领域技术人员已知的，生长或培养基是设计用于支持微生物或细胞的生长的液体或凝胶。如本领域技术人员将理解的，不同类型的培养基用于生长不同类型的细胞或生物体。基因改造的生物体(例如，包含本公开的序列、载体或盒的宿主细胞)可在营养培养基中培养以制成包含本公开的多核苷酸或多肽的培养基。
一般来说，有两种主要类型的生长培养基：用于细胞培养的生长培养基，其通常用于来源于植物或动物的特定细胞类型的生长；和用于微生物培养的生长培养基，其通常用于生长细菌或酵母和其他微生物。
用于微生物的最常见的生长培养基是营养肉汤和琼脂板，其可使用例如营养肉汤，如LB肉汤(酪蛋白酶消化物，10g/L；低钠酵母提取物，5g/L；氯化钠，5g/L；惰性制片助剂，2g/L)或SAS培养基(K2HPO4，10g/L；MOPS(3-吗啉丙磺酸)，40g/L；氯化钠，5WI；防泡剂(Sin 260)，5滴/I；脱脂大豆粉，20g/L；Biospringer 106(100％dw YE)。
对于一些微生物，可能需要含有其他因子的更专门的培养基用于它们的生长和培养。举例来说，病毒需要包含活细胞的生长培养基用于它们的生长和繁殖。
营养培养基
营养培养基含有大多数细菌生长和培养所需要的所有元素。
营养培养基的一些实例包括但不限于平板计数琼脂、营养琼脂或胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂。
基本培养基(minimal media)
基本培养基是含有菌落生长可能的最少营养素并常用于生长“野生型”或基因未改变的微生物的生长培养基。一般来说，基本培养基通常包含：水；用于生长的碳源，举例来说，如糖(例如，葡萄糖或琥珀酸酯)；各种盐，其可被定制用于特定微生物；以及其他必需的生长元素，举例来说，如镁、氮、磷或硫。
富集培养基
富集培养基通常包含支持各种生物体生长所需的所有营养素。它们可以用于培养许多不同类型的生物体。富集培养基的实例包括但不限于血琼脂或巧克力琼脂。
选择培养基
本公开的方法和组合物可使用选择性生长培养基以确保表达本发明的多肽和多核苷酸的细胞的存活或增殖增值。选择性生长培养基通常将包含细胞，所述细胞具有抗生素抗性或能够合成某一代谢物的细胞，从而并因此允许本文提供的特定具体微生物或重组宿主细胞类型的生长和选择的能力。
例如，如果将微生物制成对某一抗生素具有抗性，如包含氨苄西林或四环素的生物，则可以将该抗生素加入到培养基中以便防止不具有该抗性基因的其他细胞生长。或者，选择培养基可连同微生物缺少氨基酸如脯氨酸，而与之关联的该微生物发生则是经基因改造而改变并且天然不能合成该氨基酸。
转运培养基
本公开还涵盖了用于本公开的方法和组合物的转运培养基。一般来说，转运培养基包含缓冲剂和盐，并缺少碳、氮和有机生长因子以防止微生物增殖。这些类型的培养基可用作被转运以稍后进行培养的试样的临时储存。转运培养基的实例包括但不限于：巯基乙酸盐肉汤或stuart转运培养基。
E.多肽和多核苷酸序列
本公开的多肽和多核苷酸序列通常包含异源序列。
在一些方面，异源序列可编码一种或多种多肽、多肽的同源物、多肽的变体、多肽的片段肽或具有类似功能的多肽的融合物。此外，本公开提供了为多肽序列编码的核苷酸序列以及它们的互补序列。
在一些方面，多肽包含来自SEQ.ID.NO.：1的序列，如其功能性同源物或变体，例如，其包含以下SEQ.ID.NO.：1的最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个氨基酸变化，如取代或删除：
MAASERDNINLSEWMREIPNSNTLAEISIPGTHDSGTFRLEDPIKSVWAKTQENDFRYQMDHGVRFFDIRGRVTDDNTIVLHHGPIYLYVTLQQFINEAKEFLKSHPSETIIMSLKEEYESMPGAKESFAKTFENMYFGDSIFLKTEGNITLGDSRGKIVLLRRYSGSTMTGGFKNFGWKDNATFTSTTNGNVKITVQDKYNVNYEEKKAAIDSMLKETVLNKDNPNHIHINFTSLSSGGTAWSSPYYYASYLNSISAAKVRLDHLKNLDTKAGWIIMDYIGDRWDPKLYEEIIRANFRYPPTDEPHLFEHIDGEGIDFTNLPHSKWNDQVSSILLKSYTEITIYEHSNFTGKSVTLTNTTNSAQLFNLTTYNFNDKMSSYTWKLIR，(SEQ.ID.NO.：1)。
在一些方面，所述多肽包含来自SEQ.ID.NO.：2的序列，如其功能性同源物或变体，例如，其包含以下SEQ.ID.NO.：2的最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个氨基酸变化，如取代或删除：
MGVRLSVQDWMSALGDATPVQRLTIPGTHDSGARVGGPWVACQNTPVDAQLNSGIRFLDVRCRAIDNVFAIHHGAFYQELMFGDVLNACRAFLRAHPSETVLMRVKQEYSEVGAEEFRRIFGIYLDDKGYRSLFRLDAGLPTLGQARGRVVLLADSDGLGGVRYADPQLFDIQDDYMAEAFGKYPKIEAQFRKAVAQPGKLFVNYVSTAALLPPRSNADRLNPQVKRLLEGSEGSGWTGLGIVPMDFPNENGLAETLIRHNLAGQGVRLTA，(SEQ.ID.NO.：2)。
在一些方面，多肽包含来自SEQ.ID.NO.：3的序列，如其功能性同源物或变体，例如，其包含以下SEQ.ID.NO.：3的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个氨基酸变化，如取代或删除：
MVKKIFLNFLIGIGLIILNNFVFSVNEVFADSRWMSTIRDDKPLSRVAVPGTHDSGTFKMSDPIISALVRTQEQDFRQQLEQGIRFFDIRGRATKNNQIVLHHGPKYLLVTLHQFLQEAENFLRNNPSETIIMSLKEEYPAMEEVTKSFFSIFKESYFNYYPFYTGNSSNPKIQETRGKIVLFDRTGNSTLPGYNKIYNWEDNATFQTTTNNTLPLYVQDEYNATYNRKTHAILDLLKTSSESNEGIFLNYVSLATGGTAWSSPYYFASYLNPLTGGYINEFHVSNPGWVVMDYSGNRWNPNLTKKVIETNRYLQ，(SEQ.ID.NO.：3)。
在一些方面，所述多肽包含来自SEQ.ID.NO.4的序列，如其功能性同源物或变体例如，其包含以下SEQ.ID.NO.4的最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个氨基酸变化，如取代或删除：
MSIYSSANLNAWMGELKDDTLLSSLSIPGTHNSPTCHVAPPSVRCQAVSPREQLENGVRFFDIRVQPQYPEDADKDELALVHSVFPISLTGSKYFRDLMREVNEFLDQNPSETLIISLKREGPGEHTDQQLSRILSDHYARPDSRWYTNPKIPTLGEVRGKVVLIRRFDILDHLKDIHGGAGWGICASGWADNCSNATCPSGQLCIQDFYEVLETENIGEKIKYVQEHCFRAAETCYPFGVLPDHEATKAHPFYINFLSASNFWKLGTWPEKIAGKLNPAAVDYLCRKHGEKDDCDWSTGILVTDWVGLDGDWDLVRCIVGMNARLKLRQDRHEGDN，(SEQ.ID.NO.：4)。
在一些方面，所述多肽包含来自SEQ.ID.NO.：5的序列，如其功能性同源物或变体，例如，其包含以下SEQ.ID.NO.：5的最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个氨基酸变化，如取代或删除(还参见PCT/US2014/043294，其通过引用的方式以其整体并入本文)：
WSAEDKHKEGVNSHLWIVNRAIDIMSRNTTLVKQDRVALLNEWRTELENGIYAADYENPYYDNST[W或Y]ASHFYDPDNGKTYIPYAKQAKETGAKYFKLAGESYKNKDMKQAFFYLGLSLHYLGDVNQPMHAANFTNLSYPQGFHSKYENFVDTIKDNYKVTDGNGYWNWKGTNPEDWIHGAAVVAKQDYAGIVNDNTKDWFVRAAVSQEYADKWRAEVTPMTGKRLMDAQRVTAGYIQLWFDTYGNR，(SEQ.ID.NO.：5)。
在一些方面，所述多肽包含来自SEQ.ID.NO.：6的序列，如其功能性同源物或变体，例如，其包含以下SEQ.ID.NO.：6的最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个氨基酸变化，如取代或删除：MAKFMDKTHPISELYVFGDSLSDTGMVFRATGGMYPPNPTYFQGRYSNGRVWIEYLAESLHLSPKQTHNFAYGGATTANVGNSYVPSLLNQVQSFTQTHQQTNPDALYVLWAGANDYLQGVSSASIPVKNVTTAINSLTDVGAKKILVGNLPDLGQLPATRNSTNSVSLSALTQAHNQGLRRSLKVLGQQHSDLEIVQLDANALYRHAIAKPAAFNFTNVISPCLSGDRTCSNPDQFLFWDGIHPTAAAHRIIAETAFSTIQEAGMTNPLLSLSLEYN，(SEQ.ID.NO.：6)。
在一些方面，所述多肽包含来自SEQ.ID.NO.：7的序列，如其功能性同源物或变体，例如，其包含以下SEQ.ID.NO.：7的最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个氨基酸变化，如取代或删除：
MAPIQSSNMIQISHQINRLYVFGDSLSDVGNVYHASGKIYPPNPPYFEGRYCNGLVWVEYLSAKLALTPEQNANFAYGGATTGNGSVNGVPGLLAQVQAFTKVHQEVNSNALYVLWAGANDYLYGGANPTLTLGNISKAVESLLKMGAKKIMVVNLPDLGKLPATRTSANSNTISSFAIAHNQSLAKSVEELKQKLGSDTQIAILDIYSLYQEATKHPGMFGLTNVTNACSNNLAICDRPDKYLFWDGIHPTTVAHRIIAEAALKVIKTEFSFSATSPQPLS，(SEQ.ID.NO.：7)。
在一些方面，所述多肽包含来自SEQ.ID.NO.：8的序列，如其功能性同源物或变体，例如，其包含以下SEQ.ID.NO.：8的最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个氨基酸变化，如取代或删除：
MAPTTSITNCHTSINELYVFGDSLSDIGNVFNATEGFHPSSPPYFQGRFSNGLVWVEYLASGLALTPKQNTNFAYGGATTGSGNINRIPDLLTQVDGFIKIHQQVDRNALYILWAGANDYLHSMSNPSVSISNISQAIQSLAKVGAKKILVANLPDLGNIPATRNSPYSSILSSATIAHNLSLVKSLDILKQKLGHDSQMIMLDVHSLYKEAIANPTKFGFINVTEACLNKLATCGNPDKFLFWDGIHPTTAAHQILAKAALKELKTTYSFPPLPELLQ，(SEQ.ID.NO.：8)。
在一些方面，所述多肽包含来自SEQ.ID.NO.：9的序列，如其功能性同源物或变体，例如，其包含以下SEQ.ID.NO.：9的最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个氨基酸变化，如取代或删除：
MAEGRQPFSRVVMFGDSLSDTGKMYKKMRGYLPSSPPYFNGRFSNGPVWLEQLGDERFPGLVVANEAEGGATAVAYNHLGALNGWLGFWSWDPKYQVINNLDYEIDQFLKKDKFRPDDLVVIWVGANDYLAYGWNTERDADRVIDTIRLASNRLVLNGAQQILLFNIPDLGQTPSARSMKVVEKVRHVASYHNQKLQNLTRELAPLGIVKLFEVDKQFDEMMRDPQLFGLSDTEHACYGGGYTWKPFSGSAAEVAATPALSVSERVAIAGNPILAQAVVSGQAKGRAATLNCDEHMFWDQVHPTRTVHKVLSQRVADFIDQHYEFVRH，(SEQ.ID.NO.：9)。
在一些方面，所述多肽包含来自SEQ.ID.NO.：10的序列，如其功能性同源物或变体，例如，其包含以下SEQ.ID.NO.：10的最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40或更多个氨基酸变化，如取代或删除：
MMKKWLVCLLGLLALTAQAVERPSFSRIVMFGDSLSDTGKMYKKMKGYLPSSPPYYEGRFSNGPVWLERLRDEHFPGLQLANEAEGGATAVAYNKLGWLNFWAWDPKYQVINNLDYEIDQFLAKDSLRPDDLVVIWVGANDYLAYGWNQEKDADRVIETIRLASNRLVLNGAQQILLFNIPDLGRTPSANSMKVVDQVRHVASYHNQRLLNLSRELAPLGIVKMFEVDKQFDEMVGDPQKFGLSDIEHACYGGGYLWKPFSDASEAPALSVPERLAVAGNPILAQAVVSPQAARSAAARNCDEHMFWDQVHPTATVHKAMGERVAAFIEQHYEFIRR，(SEQ.ID.NO.：10)。
具体地，本公开提供了包含SEQ.ID.NOs：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或它们的互补序列的多肽。本公开还提供了其功能性同源物或变体，所述多肽包含与示例性多肽SEQ.ID.NOs 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10至少大约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
本公开还提供了所述多肽的片段或较小的肽，其包含示例性多肽SEQ.ID.NOs.：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或更多个连续碱基。示例性多肽的这些较小的肽可以是其功能所需要的片段、基序、活性位点或结合位点。
功能性同源物
上文描述的多肽的功能性同源物也适合用于本文描述的方法。
功能性同源物是与本文描述的参考多肽或多核苷酸具有一定序列相似性并实施参考多肽的一个或多个生物化学或生理学功能的多肽。
在一些方面，功能性同源物和参考多肽可以是天然存在的。在一些方面，功能性同源物和参考多肽可以是非天然存在的，也就是说不同于野生型(例如，天然存在的)序列。
本公开提供的同源物的百分比序列相似性可能因趋同性或分歧性演化事件而是低的。这样，功能性同源物也被称为同源物、直向同源物物或旁系同源物。
本公开还涵盖天然存在的功能性同源物的变体，举例来说，例如野生型编码序列的变体所编码的多肽自身可以是功能性同源物。功能性同源物可通过多肽的编码序列的定向诱变或者通过组合来自不同的天然存在的多肽的编码序列的结构域而形成(″结构域交换″)。
术语″功能性同源物″也可应用于编码功能性同源多肽的核酸。改造编码本文提供的多肽的基因的技术是本领域中熟知的。例如，为了改造DNA序列，可以使用以下方法，包括但不限于定向演化技术、定点诱变技术或随机诱变技术。这些技术可用于以增加油产率的期望的方式增加多肽的特定活性，改变底物特异性，改变表达水平，改变亚细胞定位，或改造多肽的相互作用。对本公开的多核苷酸和多肽的这些改造被认为是本公开所涵盖的功能性同源物。
可用于识别本公开的功能性同源物的一种方法可以是借助于核苷酸或多肽的序列比对。例如，对核苷酸或多肽序列的数据库进行查询可鉴别本文提供的多肽的同源物。可使用本领域已知的或本文提供的计算机比对和序列同一性软件来鉴别同源物。
序列分析可包括使用作为本文提供的参考序列的氨基酸序列，对非冗余数据库进行BLAST、Reciprocal BLAST或PSI-BLAST分析。在一些情况中，从核苷酸序列推导出氨基酸序列。
数据库中具有大于40％的序列同一性的多肽作为候选物进一步评价其作为本公开多肽的功能性同源物的适用性。此外，可进行同源物候选物的人工检查。可通过选择看起来具有本公开提供的多肽中存在的保守功能结构域的那些候选物来进行人工检查。
保守区域可通过定位多肽的一级氨基酸序列内的区域来鉴别，该区域是重复序列，形成一部分二级结构(例如，螺旋和β折叠)，建立正电荷或负电荷结构域，或者代表了蛋白质基序或结构域。例如，参见例如在万维网(World Wide Web)上sanger.ac.uk/Software/Pfam/和pfam.janelia.org/网址下的Pfam网页，该网页描述各种蛋白质基序和结构域的共有序列。Pfam数据库包括的信息被记载在以下文献中：Sonnhammer et al，Nucl.Acids Res.，26：320-322(1998)；Sonnhammer et al.，Proteins，28：405-420(1997)；和Bateman et al.，Nucl.Acids Res.，27：260-262(1999)。保守区域也可通过比对来自紧密相关的物种的相同或相关多肽的序列来测定。紧密相关的物种优选来自同一家族。在一些实施方式中，比对来自两个不同种的序列是足够的。
通常，表现出至少大约40％的氨基酸序列同一性的多肽可用于鉴别保守区域。相关多肽的保守区域表现出至少45％的氨基酸序列同一性(例如，至少50％、至少60％)、至少70％＞、至少80％＞或至少90％＞的氨基酸序列同一性)。在一些实施方式中，保守区域表现出至少92％、94％＞、96％＞、98％＞或99％的氨基酸序列同一性。序列同一性可如本文所述或通过本领域已知的其他方法来测定。
具有磷脂酶活性的多肽
本公开提供具有磷脂酶活性的诸多示例性多肽和编码它们的核酸，以及该示例性多肽的较小的肽，该较小的肽涵盖赋予其功能活性的重要活性位点、调控、结合结构域或它们的组合。
如本文所用，术语“磷脂酶”涵盖具有任何磷脂酶活性(例如，裂解磷酸甘油酯连接(催化磷酸甘油酯连接的水解))的酶。在一些方面，具有磷脂酶活性的多肽可以具有包含裂解磷酸甘油酯连接的活性(即水解磷酸酯键的能力)，包括马铃薯糖蛋白(patatin)、脂质酰基水解酶(LAH)、磷脂酶A、B、C和/或磷脂酶D活性，或它们的任意组合。
磷脂酶活性可包含磷脂酶C(PLC)活性；PI-PLC活性；磷脂酶A(PLA)活性，如磷脂酶A1或磷脂酶A2活性；磷脂酶B(PLB)活性，如磷脂酶B1或磷脂酶B2活性，包括溶血磷脂酶(LPL)活性和/或溶血磷脂酶-转酰酶(LPTA)活性；磷脂酶D(PLD)活性，如磷脂酶D1或磷脂酶D2活性；或马铃薯糖蛋白活性；或它们的任意组合。在一些方面，磷脂酶活性可进一步包含马铃薯糖蛋白酶活性，包括马铃薯糖蛋白酯酶活性。在一些方面，磷脂酶活性可进一步包含脂质酰基水解酶(LAH)活性。
磷脂酶的类型
天然存在的磷脂酶可以在原核生物和真核生物中找到。一些类型的磷脂酶是已知的，根据进攻磷脂分子中键的位置，它们的特异性有所不同。
有四种主要类型的磷脂酶，区别在于它们催化的反应类型，分别称为：磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C和磷脂酶D。C和D型磷脂酶被认为是磷酸二酯酶。
磷脂酶A可进一步被分成两个亚类型，称为：A1和A2。磷脂酶A1裂解SN-1酰基链。磷脂酶A2-裂解SN-2酰基链，释放花生四烯酸。磷脂酶A2作用于完整的卵磷脂分子并水解酯化至第二碳原子的脂肪酸。得到的产物可以是溶血卵磷脂和脂肪酸。
磷脂酶B裂解SN-1和SN-2酰基链；该酶也被称为溶血磷脂酶。显示PLA1和PLA2两种活性的酶常被称为磷脂酶B。
磷脂酶C在磷酸酯之前裂解，并可用于释放二酰基甘油和含磷酸酯的头基。磷脂酶C也可被认为是磷酸二酯酶。
磷脂酶D在磷酸酯之后裂解，释放磷脂酸和醇。磷脂酶D也可被认为是磷酸二酯酶。而且，磷脂酶D可被进一步分成两个亚类型，称为D1和D2。
已在细菌和真核生物锥体虫中鉴定了磷脂酶C(PLC)酶家族。PLC酶属于水解酶和磷酸二酯酶家族。PLC以钙依赖性方式参与磷脂酰肌醇4，5-二磷酸酯(PIP2)代谢和脂质信号传导途径。
对各种磷脂酶C亚型的研究表明在一些方面，这些亚型可在它们的激活模式、表达水平、催化调控、细胞定位、膜结合活性和组织分布方面有所不同。参见(Carmen，G.，J.Biol.Chem.270(1995)1871 1-18714，Jianag，Y.，J.Biol.Chem，271(1996)29528-29532，Waggoner，D.，J.Biol.Chem.270(1995)19422-19429，Molecular Probes Product Sheet2001，和Sano et al，Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.281：844-851，2001)。
磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)酶是真核生物胞内酶家族，其可在信号转导方法中起重要作用。PI-PLC催化的反应为：1-磷脂酰基-1D-肌醇4，5-二磷酸酯(也称为PIP2，磷脂酰肌醇二磷酸)+H2O→1D-肌醇1，4，5-三磷酸酯(也叫做IP3，肌醇三磷酸酯)+二酰基甘油。
在一个方面，PLC磷脂酶可催化各种磷脂底物的水解，包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)或磷脂酸(PA)，或它们的组合。此外，这些酶对这些磷脂的溶血磷脂形式可具有不同程度的活性。例如，它们可以对一种类型的磷脂底物水解最初浓度的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，且对另一种类型的磷脂底物水解最初浓度的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
可使用本文提供的处理油和未处理油的比较核磁共振(NMR)分析来确定特异性磷脂酶底物以及获得的水解程度，来测试给定的磷脂酶是否被本公开所涵盖。
在一些方面，本公开的多肽可使用各种磷脂底物，包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酸(PA)，或它们的组合。在一个方面，多肽的功能是磷脂酶活性。示例性多肽的磷脂酶活性可包含磷脂酶C(PLC)活性；磷脂酶A(PLA)活性，如磷脂酶A1或磷脂酶A2活性；磷脂酶D(PLD)活性，如磷脂酶D1或磷脂酶D2活性。
在另一方面，本公开的磷脂酶可具有多功能活性。在一些方面，本公开的多肽可包含一种磷脂酶底物活性，或磷脂酶活性的任何组合。例如，磷脂酶活性可包含对以下底物的特异性：PE和PC；PE和PI；PE和PS；PS和PC；PS和PI；PI和PC；PS、PI和PC；PE、PI和PC；PC、PE和PS；PE、PS和PI；或PE、PS、PI和PC，或它们的任何组合。
具有酰基转移酶活性的多肽
在一个方面，本公开的多肽是酰基转移酶。在另一方面，所述多肽是脂质酰基转移酶。在另一方面，所述多肽是磷脂酰胆碱-固醇O-酰基转移酶。
在本发明的一些方面，脂质酰基转移酶是酶稳定剂，并且其在油脱胶方法的推荐浓度的1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/11、1/12、1/13、1/14、1/15、1/16、1/17、1/18、1/19、1/20、1/30、1/40、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90或1/100浓度下起作用。
在一些方面，脂质酰基转移酶的浓度不大于0.01TIPU/g油。在一些方面，脂质酰基转移酶的浓度不大于0.002TIPU/g油。在一些方面，脂质酰基转移酶的浓度不大于0.06TIPU/g油。
在一些方面，脂质酰基转移酶的浓度为大约0.01TIPU/g油。在一些方面，脂质酰基转移酶的浓度为大约0.002TIPU/g油。在一些方面，脂质酰基转移酶的浓度为大约0.06TIPU/g油。
条件和多肽活性
本公开的多肽可包含示例性多肽SEQ.ID.NOs.：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的同源物或变体。例如，所述同源物或变体可在高度或中等严谨条件下与SEQ.ID.NOs.：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10杂交。所述多肽可包含SEQ.ID.NOs.：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的功能性片段或位置。功能性片段是可在本公开提供的方法中实现基本上相同的功能的多肽。
在一个方面，所述多肽可在包含以下温度范围的条件下保持其如本文所提供的功能活性：大约37℃至大约95℃，大约55℃至大约85℃，大约70℃至大约95℃，或大约90℃至大约95℃。
在另一方面，本公开所涵盖的多肽可以是耐热的。所述多肽可在暴露于大于37℃至大约95℃范围中或大于55℃至大约85℃范围中的温度后保持活性。在一个方面，示例性多肽可在暴露于大于90℃至大约95℃范围中的温度后保持其如本文所提供的功能活性。
在一个方面，所述多肽可在包含大约pH 6.5、6、5.5、5、4.5或4的条件下保持其如本文所提供的活性。在另一方面，所述多肽可在包含大约pH 7、7.5、8.0、8.5、9、9.5、10、10.5或11的条件下保持其如本文所提供的功能活性。
在一些方面，所述多肽在大约pH 3至pH 10的pH范围内具有活性。在一些方面，多肽在大约pH 4至pH 9的pH范围内具有活性。在一些方面，多肽在大约pH 5至pH 9的pH范围内具有活性。在一些方面，多肽在大约pH 4.5至pH 9.5的pH范围内具有活性。
酶活性水平的测定
油中的磷脂酶活性
可使用例如Ultra-Turrax T 50 Homogenizer(IKA)将未处理的、脱胶的油乳化1分钟。接着，用900μl NMR溶液(100mM Tris-HCl pH 10.5，50mM EDTA，2.5％脱氧胆酸钠)在37℃、不断搅拌1小时，提取300mg油样品。可将得到的水相用600μl己烷萃取，并通过NMR进行分析。
使用Bruker DRX 600设备获取NMR波谱。可将PC、PE、PA和PI的纯样品作为标准并行运行。通过比较未处理油和处理油，可确定油中给定多肽的PC、PE、PA和PI活性程度。
PC-PLC活性
简单地说，将10μl含有PC-PLC的样品与最终体积为100μl的缓冲液250mM HEPESpH7、0.1mM ZnCl2中的作为底物的10mM O-(4-硝基苯基磷酰基)胆碱一起在55℃下孵育30分钟。测定405nm下的吸光度并计算PLC活性。1PLC单位对应于每分钟释放1μmol对-硝基酚的酶量。
PI-PLC活性
可使用例如水溶性荧光底物丁基-FLIP(Toronto Research chemicals)来测定PI-PLC活性。1个单位是在指定条件下每分钟将1umol底物(butyl-FLIP)转化成产物的酶量。
简单地说，在H2O中制备2mg/ml丁基-FLIP储备溶液，并储存在-20℃。
在50mM乙酸钠缓冲液pH 5、1uM BSA、0.04mM丁基-FLIP中将酶制剂(10-100nM)与作为底物的丁基-FLIP一起孵育。在96孔多比色皿(polycuvette)中在总体积为0.2mL的条件下进行测定，并在温度保持在25℃的Synergy HT酶标仪中测定荧光。
使用分别为485和528nm的激发和发射滤光器和20nm的狭缝宽度来记录荧光光谱。
记录10-min时间扫描，并通过利用校准曲线将得到的荧光变化转化为每秒产生的uM荧光产物的单位，该校准曲线通过延长稀氢氧化钠处理将底物溶液完全转化成产物而制成。
LAT活性
可使用例如WAKO NEFAC试剂盒按滴定磷脂酶单位(TIPU)测定脂质酰基转移酶(LAT)活性。该试剂盒利用体外酶比色测定法来定量未酯化的(或游离的)脂肪酸。
简单地说，在30℃下将45ul含有0.6％PC、0.4％triton、5mM CaCl2、50mM HEPESpH 7的底物溶液与5ul含有LAT酶的样品一起孵育10min。之后，加入100ul NEFA A溶液并在37℃下孵育10min，在该孵育之后，加入200ul NEFA B溶液并在37℃下孵育10min，使用Synergy HT酶标仪在520nm下测量吸光度。可将酶活性TIPU计算为每分钟产生的微摩尔FFA。
异源序列
多肽或编码多肽序列的核苷酸序列可包含异源序列。
异源序列可以是与天然存在的序列相比有一个或多个氨基酸变化。异源序列可以是与天然存在的序列相比有一个或多个翻译后修饰。
在一些方面，异源序列可以是位于多肽的氨基端、羧基端或这两端上的额外的序列。异源序列可包含启动子、前导序列、分泌信号、信号肽、催化结构域、活性位点、RNA或蛋白质稳定序列，或它们的组合。
在一些方面，异源多肽可包含具有至少一个非天然存在的翻译后修饰的示例性多肽。可在本公开的异源多肽上存在的非天然存在的翻译后修饰的实例包括但不限于糖基化、磷酸化、乙酰化、甲基化、生物素化、谷氨酰化、甘氨酰化、羟基化、异构化、异戊烯化、豆蔻酰化、脂化、磷酸泛酰巯基乙胺化(phosphopantetheinylation)、硫酸化、ISGylation、亚硝基化、棕榈酰化、SUMO化、泛素化、类泛素化(neddylation)、瓜氨酸化(citrullination)、酰胺化和二硫键形成，或二硫键还原。
在一些方面，异源多肽可包含具有在天然存在的多肽中未发现的至少一个糖基化位点的示例性多肽。在一个方面，非天然存在的糖基化可以是N-连接糖基化。在一个方面，非天然存在的糖基化可以是O-连接糖基化。在一个方面，异源多肽可包含在宿主细胞中表达后在两个或更多个非天然存在的位点糖基化的示例性多肽。
异源多肽或核苷酸序列可包含示例性多肽和如本文所提供以及本领域中已知的一个或多个调控序列。在一些方面，异源多肽或核苷酸序列可包含示例性多肽和盒构建体。在一些方面，异源多肽或核苷酸序列可包含示例性多肽和如本文所提供的载体装置(vector means)。
本公开通过使用可选的密码子置换提供SEQ.ID.NOs 1、2、3，4，5，6、7、8、9或10的异源变体。这些异源变体可通过置换核酸密码子以使密码子促进增加(例如，优化)其在特定宿主细胞中的表达而制成。
在一些方面，针对宿主细胞大肠杆菌，对本文提供的示例性序列进行优化。寻找本公开的增加其在特定宿主细胞中的表达的修饰核苷酸序列的方法可包括以下步骤：(a)提供本发明的示例性多核苷酸；(b)鉴别所述核酸中非优选或不太优选的密码子并将其用优选的或中立使用的编码相同氨基酸的密码子作为置换密码子而置换，其中优选的密码子是在宿主细胞的基因中的编码序列中过度代表(over-represented)的密码子，非优选或不太优选的密码子是在宿主细胞的基因中的编码序列中代表不足(under-represented)的密码子，从而修饰本发明的示例性多核苷酸以增加其在特定宿主细胞中的表达。
在一些应用中，SEQ.ID.NO.：1的大肠杆菌密码子优化的DNA序列可以是：ATGGCGGCGTCAGAAAGAGACAACATTAACTTGAGCGAGTGGATGAGAGAAATTCCTAACAGCAACACATTGGCAGAAATCAGCATTCCGGGAACACATGATTCAGGAACGTTTAGACTGGAAGACCCTATTAAAAGCGTGTGGGCAAAGACCCAGGAAAACGATTTCCGTTATCAAATGGACCACGGCGTCAGATTTTTCGATATCCGCGGACGTGTCACCGATGACAACACTATTGTTCTGCATCACGGTCCAATCTACTTGTACGTGACACTGCAACAATTCATCAACGAAGCGAAGGAGTTCTTGAAGTCTCATCCTTCCGAAACGATTATCATGAGTCTGAAAGAAGAGTATGAGTCTATGCCAGGCGCTAAAGAATCCTTTGCCAAGACTTTCGAGAACATGTACTTTGGAGATTCCATTTTCTTGAAAACCGAAGGTAATATCACTCTGGGTGACTCACGTGGCAAGATTGTCCTGTTGCGTAGATATTCCGGCTCAACCATGACTGGTGGCTTTAAAAACTTCGGATGGAAGGATAATGCTACATTTACGTCCACCACTAACGGTAATGTTAAAATTACCGTGCAGGACAAGTACAACGTTAACTACGAAGAGAAAAAGGCTGCCATCGATTCAATGTTGAAAGAAACTGTGCTGAACAAGGACAACCCAAATCATATTCACATCAATTTCACCTCTCTGTCTTCTGGTGGTACGGCATGGTCAAGCCCGTATTACTATGCGTCTTACCTGAACAGCATTAGTGCAGCGAAAGTTCGCCTGGATCACTTGAAAAATCTGGACACAAAGGCTGGTTGGATTATCATGGATTACATCGGCGATCGTTGGGACCCAAAGCTGTATGAAGAGATTATCAGAGCCAACTTTCGCTACCCACCGACCGATGAACCGCATTTGTTTGAGCACATTGATGGCGAAGGAATCGACTTCACTAACCTGCCTCATAGTAAATGGAATGATCAAGTCAGTTCTATTCTGTTGAAGTCTTACACAGAGATCACGATCTACGAACACTCAAACTTCACTGGAAAGAGCGTTACCTTGACTAACACAACCAACTCTGCCCAACTGTTCAACCTGACCACCTACAACTTCAATGATAAAATGTCCTCCTACACTTGGAAACTGATTAGATAA，(SEQ.ID.NO.：11)。
在一些应用中，SEQ.ID.NO.：2的大肠杆菌密码子优化的DNA序列可以是：ATGGGAGTTAGACTGTCCGTTCAAGACTGGATGAGCGCATTGGGCGACGCAACCCCTGTTCAAAGACTGACGATTCCGGGCACGCACGACTCCGGTGCACGTGTTGGTGGACCATGGGTGGCGTGTCAGAACACTCCTGTTGATGCTCAACTGAATAGCGGCATTAGATTTTTGGATGTCCGCTGCCGTGCAATTGACAACGTTTTCGCTATCCATCACGGTGCCTTTTATCAGGAACTGATGTTCGGCGATGTTTTGAATGCATGTCGTGCGTTTCTGCGTGCTCATCCGAGTGAGACAGTGTTGATGAGAGTCAAACAAGAATACTCTGAAGTGGGTGCCGAAGAGTTTCGTAGAATTTTCGGCATCTATCTGGATGACAAGGGATACCGCTCACTGTTCCGTTTGGATGCCGGCCTGCCTACGTTGGGACAGGCAAGAGGTCGCGTTGTGCTGTTGGCGGATTCTGACGGACTGGGAGGTGTCCGCTATGCAGATCCACAGTTGTTTGACATTCAAGATGACTATATGGCAGAAGCGTTTGGAAAATACCCAAAGATCGAGGCGCAGTTCCGTAAAGCTGTGGCCCAACCGGGAAAGCTGTTCGTCAACTACGTTTCAACCGCTGCCCTGTTGCCACCGAGAAGCAACGCCGATCGCCTGAATCCTCAAGTGAAACGTCTGTTGGAAGGTTCTGAGGGCTCCGGATGGACTGGTTTGGGCATCGTCCCTATGGACTTTCCAAACGAAAATGGCTTGGCAGAAACATTGATTAGACATAACTTGGCAGGACAGGGAGTGAGATTGACAGCATAA，(SEQ.ID.NO.：12)。
在一些应用中，SEQ.ID.NO.：3的大肠杆菌密码子优化的DNA序列可以是：ATGGTCAAGAAGATTTTCCTGAACTTCCTGATTGGTATCGGACTGATTATCCTGAATAACTTTGTGTTTAGCGTGAATGAGGTGTTTGCTGATAGCCGCTGGATGAGTACTATTCGTGATGACAAACCACTGAGTCGCGTCGCTGTTCCGGGCACGCATGATTCTGGAACCTTCAAGATGTCTGACCCGATTATCTCCGCCCTGGTGCGTACCCAGGAACAAGATTTTCGCCAGCAATTGGAGCAGGGTATTCGTTTCTTTGACATCCGTGGTAGAGCTACTAAAAACAATCAAATCGTGCTGCATCACGGTCCTAAGTATCTGTTGGTCACACTGCACCAGTTCTTGCAAGAAGCAGAGAATTTTCTGAGAAACAATCCATCAGAAACGATTATCATGAGCTTGAAAGAAGAGTACCCGGCGATGGAAGAGGTCACCAAATCCTTTTTCTCAATCTTCAAGGAATCTTACTTCAACTACTACCCTTTTTACACTGGCAACTCTTCCAATCCAAAAATTCAGGAGACACGTGGAAAGATCGTTCTGTTCGATAGAACTGGTAACTCCACATTGCCTGGCTACAACAAAATTTACAACTGGGAAGACAACGCTACGTTTCAGACCACTACAAACAATACCCTGCCATTGTATGTTCAAGATGAGTATAATGCAACTTACAACCGTAAAACACATGCGATTCTGGACCTGTTGAAGACCTCAAGCGAATCCAATGAGGGTATCTTTCTGAACTACGTTTCATTGGCTACGGGTGGCACCGCCTGGAGTTCTCCGTATTACTTCGCCTCTTATCTGAACCCTTTGACTGGAGGTTACATTAATGAATTTCACGTGAGCAACCCAGGCTGGGTTGTGATGGATTATAGTGGCAACAGATGGAACCCTAACCTGACAAAGAAAGTGATTGAGACTAATAGATACCTGCAATAA，(SEQ.ID.NO.：13)。
在一些应用中，SEQ.ID.NO.：4的大肠杆菌密码子优化的DNA序列可以是：ATGTCTATTTATTCCTCCGCAAACCTGAACGCTTGGATGGGCGAGTTGAAAGACGACACACTGCTGTCCTCATTGAGTATCCCTGGCACCCATAACTCACCAACATGTCACGTTGCACCACCATCTGTGAGATGCCAGGCAGTCTCCCCGCGTGAACAACTGGAGAATGGTGTTCGTTTCTTTGATATTAGAGTGCAGCCTCAATATCCAGAAGATGCTGACAAAGATGAGCTGGCCTTGGTCCATTCTGTTTTTCCGATCTCACTGACCGGCAGCAAGTACTTCCGCGATCTGATGCGTGAAGTGAACGAGTTTTTGGACCAGAATCCGTCCGAAACACTGATTATCTCATTGAAAAGAGAAGGACCTGGAGAGCATACGGATCAGCAACTGAGTCGCATTTTGTCTGATCACTATGCCAGACCTGACTCACGCTGGTACACAAACCCGAAAATCCCTACGCTGGGAGAAGTTCGCGGAAAGGTTGTGTTGATTCGTAGATTCGATATCCTGGACCATTTGAAAGATATTCACGGTGGCGCAGGCTGGGGAATCTGTGCAAGCGGATGGGCGGACAACTGTAGCAATGCTACCTGCCCTAGTGGTCAGCTGTGCATTCAAGATTTTTATGAGGTCTTGGAAACTGAGAACATTGGCGAAAAGATCAAGTACGTTCAAGAGCATTGTTTTAGAGCTGCCGAAACCTGCTACCCATTCGGAGTTCTGCCGGACCATGAAGCTACTAAAGCCCACCCATTTTATATTAACTTCCTGTCTGCTTCCAATTTCTGGAAGTTGGGCACCTGGCCTGAGAAAATCGCCGGAAAGCTGAATCCAGCAGCGGTGGATTACTTGTGTCGTAAACACGGTGAAAAGGATGACTGCGATTGGTCCACCGGCATTCTGGTGACTGACTGGGTCGGTCTGGACGGCGATTGGGACTTGGTCAGATGCATTGTTGGTATGAACGCAAGACTGAAGTTGAGACAGGATAGACACGAAGGAGATAATTAA，(SEQ.ID.NO.：14)。
在一些应用中，SEQ.ID.NO.：10的DNA序列可以是：ATGAAAAAATGGCTTGTTTGTTTATTGGGGTTACTGGCGCTGACCGCTCAGGCGGTGGAGCGCCCGAGCTTTTCCCGGATCGTGATGTTTGGTGACAGCCTCTCGGACACCGGCAAGATGTACAAGAAGATGAAGGGGTATCTCCCCTCCAGCCCTCCCTATTACGAGGGGCGTTTCAGCAATGGCCCGGTCTGGTTGGAACGGTTGCGAGACGAACACTTCCCCGGGCTTCAGCTGGCTAACGAGGCTGAAGGTGGGGCGACGGCGGTGGCCTACAACAAGCTGGGCTGGCTCAACTTCTGGGCCTGGGATCCCAAGTATCAGGTGATCAACAACCTCGACTACGAGATCGATCAGTTCCTGGCGAAGGACAGCTTGCGTCCCGACGATCTGGTGGTGATCTGGGTGGGGGCCAACGACTATCTGGCCTATGGCTGGAATCAGGAGAAAGATGCCGATCGGGTGATCGAGACCATTCGCCTGGCATCCAACCGACTGGTGCTCAACGGGGCGCAGCAGATCCTGCTGTTCAACATCCCGGATCTGGGCAGAACTCCATCCGCCAACAGCATGAAGGTAGTGGATCAGGTGCGCCACGTAGCCAGCTATCACAACCAGCGGCTGCTCAATCTCTCGCGCGAACTGGCCCCCCTTGGCATCGTCAAGATGTTCGAAGTGGACAAGCAGTTTGACGAGATGGTTGGTGATCCCCAGAAATTCGGGCTGAGCGACATCGAGCACGCCTGCTATGGCGGCGGGTATCTGTGGAA
GCCCTTCTCCGATGCGAGCGAGGCGCCAGCCTTGAGCGTCCCAGAGCGTCTGGCAGTGGCCGGCAACCCGATCCTGGCCCAGGCTGTTGTGAGCCCGCAAGCGGCCCGCAGTGCGGCAGCCCGGAACTGCGATGAACACATGTTCTGGGATCAGGTGCACCCGACTGCGACGGTGCACAAGGCGATGGGGGAGCGGGTCGCCGCTTTCATCGAACAGCATTACGAGTTTATTCGTCGCTGA，(SEQ.ID.NO.：15)。
在一些应用中，SEQ.ID.NO.：10的大肠杆菌密码子优化的DNA序列可以是：
ATGGTGGAACGCCCGAGTTTCTCACGTATTGTTATGTTTGGTGATAGTCTGTCCGACACCGGCAAAATGTACAAGAAAATGAAAGGTTATCTGCCGAGCAGCCCGCCGTATTACGAAGGTCGTTTTAGCAATGGTCCGGTGTGGCTGGAACGTCTGCGTGATGAACATTTCCCGGGTCTGCAACTGGCAAATGAAGCTGAAGGCGGTGCCACGGCAGTTGCTTATAACAAACTGGGCTGGCTGAATTTTTGGGCGTGGGACCCGAAATATCAGGTCATTAACAATCTGGATTACGAAATCGACCAATTCCTGGCCAAAGATTCACTGCGTCCGGATGACCTGGTGGTTATTTGGGTTGGTGCGAACGATTATCTGGCCTACGGCTGGAATCAGGAAAAAGATGCAGACCGCGTCATTGAAACCATCCGTCTGGCATCCAACCGCCTGGTGCTGAATGGTGCTCAGCAAATTCTGCTGTTTAACATCCCGGATCTGGGCCGTACGCCGTCAGCGAACAGCATGAAAGTCGTGGACCAGGTGCGCCATGTTGCCTCATATCACAACCAACGTCTGCTGAATCTGTCGCGCGAACTGGCCCCGCTGGGTATCGTCAAAATGTTCGAAGTGGATAAACAGTTCGACGAAATGGTGGGTGATCCGCAAAAATTTGGCCTGAGCGACATCGAACATGCATGCTATGGCGGTGGCTACCTGTGGAAACCGTTCAGCGATGCTTCTGAAGCCCCGGCACTGTCTGTTCCGGAACGTCTGGCAGTTGCTGGTAACCCGATCCTGGCCCAGGCAGTTGTCAGTCCGCAAGCCGCACGTTCCGCAGCTGCGCGTAATTGTGATGAACACATGTTCTGGGACCAGGTGCATCCGACCGCGACGGTTCACAAAGCGATGGGCGAACGTGTGGCAGCATTTATTGAACAACATTATGAATTTATCCGTCGTTAA，(SEQ.ID.NO.：16)。
用于扩增和分离本公开提供的序列的各种方法是本领域内熟知的。举例来说，可以通过已制定的标准方法，例如，Beucage S.L.et al(1981)Tetrahedron Letters 22，p1859-1869描述的氨基磷酸盐(phosphoroamidite)方法，或Matthes et al(1984)EMBOJ.3，p 801-805描述的方法，合成制备编码多肽的核苷酸序列。在该氨基磷酸盐方法中，寡核苷酸是合成的，例如在自动DNA合成仪中，并对其进行纯化、退火、连接以及在适当的载体中克隆。
或者，可以构建基因组DNA或cDNA库。可以合成带有标记的寡核苷酸探针，并用于从由生物体制备的基因组库鉴别编码多肽的克隆。或者，可以使用包含与另一已知的多肽基因同源的序列的带标记的寡核苷酸探针来鉴别编码多肽的克隆。在后一种情况中，使用较低严谨性的杂交和洗涤条件。在方法的又一实例中，可获得表达所述多肽的克隆，然后使用聚合酶链反应来扩增感兴趣的序列并分离核酸序列。
本公开的多核苷酸可以用于生产引物，例如PCR引物，用于可选的扩增反应的引物；探针，例如使用放射性或非放射性标记物通过常规手段用揭示标记物(revealinglabel)标记的探针，或者该多核苷酸可以被克隆到载体中。这些引物、探针以及其他片段可用于鉴别文库中的蛋白质或本公开提供的同源变体。这些引物、探针可以具有至少15、20、25、30、35或40个核苷酸碱基对的长度，并且也可以被本公开涵盖。
在一个方面，本公开的多肽或多核苷酸可以为分离的形式。术语“分离的”可意指该序列至少基本上不含至少一个其他组分，该其他组分在自然界中与该序列天然相关以及在自然界发现。术语“分离的”可意指该序列具有至少一个不是在自然界天然发现的组分。
在另一方面，本公开的多肽或多核苷酸可以为纯化的形式。术语“纯化的”可以是至少大约51％纯，或至少大约65％纯，或至少大约70％纯，或至少大约75％，或至少大约80％纯，或至少大约90％纯，或至少大约95％纯，或至少大约98％纯或至少大约99％纯。
同源物的鉴别
本公开还提供了使用本文提供的核酸、多肽和片段而发现本公开所涵盖的磷脂酶同源物的方法。如此，本公开也涵盖使用能够与本文提供的序列、衍生物或其任何片段互补的序列杂交的核苷酸序列。本公开还涵盖能够与该序列杂交的序列互补的序列。
一般来说，基于核苷酸复合物的熔解温度(Tm)和/或长度来选择杂交条件。参见Berger and Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods inEnzymology，Vol.152，Academic Press，San Diego Calif.)。
本公开所涵盖了能够在中等至最大严谨度的条件下与本文提供的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。优选地，该序列也具有如本文所提供的功能特性。
作为一般指南并且不被任何特定理论束缚，可以使用最大严谨度杂交来识别与本公开涵盖的序列具有大约90％至100％序列同一性的高度同一的序列，可中等严谨度杂交可鉴别与本公开涵盖的多核苷酸具有大约90％至70％序列同一性的序列。
最大严谨度的杂交条件通常发生在大约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)，高严谨度发生在比Tm低大约5℃至10℃的温度下，中等严谨度发生在比Tm低大约10℃至20℃的温度下，以及低严谨度发生在比Tm低大约20℃至25℃的温度下。仅作为一个实例，高严谨度的条件可包含：在大约42℃下在包含25mM KPO4(pH 7.4)、5×SSC、5×Denhart′s溶液、50μg/mL变性的超声处理的鲑鱼精子DNA、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖和1-15ng/mL SEQ.ID.NOs 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的杂交溶液中杂交，在大约65℃下在包含0.2×SSC的洗涤溶液中洗涤。
油脱胶
简单地说，使用Ultra-Turrax T8 Homogenizer(IKA)将3g含有大约1000ppm磷酸酯的粗大豆油与在90μl含有柠檬酸钠50mM pH 6.2、1mM ZnCl2的缓冲液中的大约22.5μg关注蛋白质均质化大约1min。接着在使用磁力震动搅拌器如VP 710磁力震动搅拌器(VP-Scientific)不断搅拌下将含有该反应混合物的试管在大约50℃孵育。接着，将油均质化并将200μl均质化油与200μl 2M Tris-HCl pH 8混合以在不同的时间点(例如，在60-120min之间)停止反应。然后，将800μl水加入到混合物中，并在37℃、不断搅拌下孵育1h，然后以14000g离心大约5min。最后，回收45μl水相，并用0.3U牛小肠磷酸酶(Promega，WI，USA)在37℃下处理1h。
可根据Sumner(Sumner，J.B.，Science 1944 196：413)的方法测定无机磷酸盐的浓度。简单地说，将500μl含有在5％TCA中的0.025至0.25μmol无机磷酸盐的样品与500μl颜色试剂(4％FeSO4，1％(NH4)6MoO24.H2O，3.2％H2SO4)混合。分光光度计读数应当在大约700nm下进行，并且可使用标准曲线计算样品中无机磷酸盐的微摩尔。
比较核磁共振分析
用大约900μl的NMR溶液(100mM Tris-HCl pH 10.5，50mM EDTA，2.5％脱氧胆酸钠)采用不断搅拌步骤在37℃下持续1h期间，萃取油样品。将得到的水相用600μl己烷萃取，然后通过NMR分析进行分析。
可使用Bruker DRX 600获取粗油和经处理粗油的NMR光谱，然后可运行纯磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸和磷脂酰肌醇作为标准。
F.分离的多肽
本公开提供了分离的多肽酶组合物。在一些方面，分离的多肽酶包含如本文所提供的示例性序列或其功能性同源物或变体。在一些方面，所述分离的多肽酶包含示例性序列或同源物和至少一个异源序列或核苷酸。在一些方面，分离的多肽酶是磷脂酶C，其包含至少一个异源序列或核苷酸。
在一些方面，分离的多肽酶是磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其包含至少一个异源序列或核苷酸。在一些方面，分离的多肽酶是磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C，其包含至少一个异源序列或核苷酸。在一些方面，分离的多肽酶是磷脂酰胆碱特异性的磷脂酶C，其包含至少一个异源序列或核苷酸。
在一些方面，分离的多肽酶是磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶C和磷脂酰胆碱特异性的磷脂酶C，其包含至少一个异源序列或核苷酸。
在一些方面，可使用分离的多肽酶进行油脱胶过程。在一些方面，本文所提供的分离的酶用于可食用油或生物燃料的油脱胶方法，用于生产消费性产品。例如，分离的酶可用于处理不同形式的油和磷脂，包括粗形式、脱胶形式、胶、洗涤水、粘土、二氧化硅、皂脚等。
在一些方面，生物燃料可以是油或脂肪的组合物。在一些方面，生物燃料可以是包含鱼油、动物油、植物油、海藻油、植物油、直馏植物油、初榨植物油、废植物油、动物脂肪、油脂、牛脂、猪油或黄色油脂。在一些方面，生物燃料可以是包含脂质或烷基酯的组合物。
分离的多肽酶可用于制备在处理或精炼粗油、可食用油、生物燃料中使用的酶混合物或者用于处理不同形式的油和磷脂，包括粗形式、脱胶形式、胶、洗涤水、粘土、二氧化硅、皂脚等。
具有磷酸二酯酶活性的分离的多肽可自以下属的培养基获得：赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、链霉菌属、肠球菌属(Enterococcus)或曲霉属(Aspergillus)。在另一方面，具有磷酸二酯酶活性的分离的多肽可自以下种的培养基获得：赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)、抗生素链霉菌(Streptomyces antibioticus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或黄曲霉(Aspergillus fiavus)。
在一些方面，酶可以自基因改造的微生物的培养基获得，如改造成拥有编码来自以下属的磷酸二酯酶的序列的大肠杆菌菌株：赖氨酸芽孢杆菌属、链霉菌属、肠球菌属或曲霉属。在一些方面，酶可自拥有编码来自以下种的磷酸二酯酶的序列的基因改造的大肠杆菌菌株的培养基获得：赖氨酸芽孢杆菌、抗生素链霉菌、粪肠球菌或黄曲霉。
在一些方面，分离的多肽酶可自拥有由示例性SEQ.ID.NOs.：1、2、3或4编码的磷酸二酯酶的基因改造的大肠杆菌菌株的培养基获得。本公开还涵盖了使用能够实现本文所举例说明的方法的示例性序列的任何同源物、衍生物、片段或其酶衍生物。
在一些方面，所述同源物、变体、片段或衍生物包含与SEQ.ID.NOs.：1、2、3或4至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，并给本文所提供的用于精炼粗油的酶方法提供相似的功能性益处。在一些方面，其同源物、变体、片段或酶衍生物可以包含示例性序列的保守氨基酸取代。
分离的脂质酰基转移酶可以自以下属的培养基获得：念珠藻属(Nostoc)、侧生藻属(Fischerella)、伪枝藻属(Scytonema)或气单胞菌属(Aeromonas)。分离的多肽脂质酰基转移酶可以自以下种的培养基获得：点形念珠藻(Nostoc punctiformes)、串珠费氏藻(Fischerella muscicola)、伪枝藻(Scytonema spp.)、维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)或肠棕气单胞菌(Aeromonas enteropelogenes)。
在一些方面，酶可自基因改造的微生物的培养基获得，如改造成拥有编码来自以下属的脂质酰基转移酶的序列的大肠杆菌菌株：念珠藻属、侧生藻属、伪枝藻属或气单胞菌属。在一些方面，酶可自拥有编码来自以下种的脂质酰基转移酶的序列的基因改造的大肠杆菌菌株的培养基获得：点形念珠藻、串珠费氏藻、伪枝藻、维氏气单胞菌或肠棕气单胞菌。在一些方面，酶可自拥有由SEQ.ID.NOs.：6、7、8、9或10的序列编码的脂质酰基转移酶的基因改造的大肠杆菌菌株的培养基获得。
在一些方面，分离的多肽酶可自拥有由示例性SEQ.ID.NOs.：6、7、8、9或10编码的脂质酰基转移酶的基因改造的大肠杆菌菌株的培养基获得。本公开还涵盖使用能够实现本文所举例说明的方法的示例性序列的任何同源物、衍生物、片段或其酶衍生物。在一些方面，所述同源物、变体、片段或衍生物包含与SEQ.ID.NOs.：6、7、8、9或10至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，并为本文所提供的用于精炼粗油的酶方法提供相似的功能性益处。在一些方面，其同源物、变体、片段或酶衍生物可以包含本公开提供的示例性序列的保守氨基酸取代。
多肽的生产
本公开的多肽的大规模生产可通过培养本文提供的基因改造的生物体得到。仅作为实例，大规模生产可通过以下方法得到：
a)将编码基因或功能性同源物的经密码子优化的序列的核酸分子克隆到任何适合的载体，举例来说，如pET24b质粒(Novagen，USA)或宿主细胞，所述基因或功能性同源物编码SEQ.ID.NOs.：2、3、4、5、6、7、8、9或10。
b)通过电穿孔或任何其他手段将得到的质粒转化到宿主细胞生物如BL21AI大肠杆菌菌株中。可以在含有50mg/L卡那霉素的LBA板中选择转化的菌落。
c)重组克隆的菌落可以在37℃、100ml LB上生长，直到细胞密度达到大约OD600＝2。
d)将培养物转移到含有大约10升(L)培养基(如下文描述的HM培养基)的种子发酵罐，并在35℃下生长10小时。
e)将培养物转移到含有大约600L HM培养基或类似物的1000L发酵器罐，并在大约35℃下生长，直到甘油耗尽。然后以足以保持比生长速率数值为大约0.35h-1±0.05的速率开始含有大约80％w/v甘油和大约20g/L MgSO4的营养液的指数流加。当OD600达到大约80的值时，加入大约1mM IPTG，并以大约9±1L/h的恒定速率流加营养液10小时。必要时，通过富集具有纯氧的空气流使溶氧浓度保持为大于大约30％的饱和度。必要时通过加入NH4OH使pH保持为大约7。
f)在发酵方法结束时，可在APV均质器中在大约1000bar下进行三次加压/解压循环来处理肉汤，以破坏宿主细胞。
g)可将得到的液体在sharpless离心机中以大约5000g离心，直到澄清以分离固体物质。
h)向澄清的液体加入(NH4)2SO4直至大约80％的饱和度，可将混合物在8℃下孵育3小时，然后以5000g离心以获得褐色糊状物。
变体和片段
本公开提供了一种确定本公开的酶的功能性同源物、变体、片段或衍生物的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供包含本发明的氨基酸序列的酶的同源物、变体、片段或衍生物；和(b)从步骤(a)的序列删除多个氨基酸残基并对剩余的子序列测试如本文提供的给定的活性，从而确定功能性片段。
本公开涵盖的示例性多肽的变体可包括其中已引入保守取代的那些。保守取代在本领域中被公认为将一个氨基酸用具有类似性质的另一个氨基酸取代。可根据物理性质和对二级和三级蛋白质结构的贡献对氨基酸进行分类。
在一个方面，保守氨基酸取代可如以下所述：
保守取代I
侧链特征：取代氨基酸残基
脂肪族的：G A P
非极性的：I L V
极性-不带电荷的：C S T M N Q
极性-带电荷的：D E K
芳香族的：H F W Y
其他：N Q D E
或者，保守氨基酸可如表Y中所述。参见Lehninger，[Biochemistry，SecondEdition；Worth Publishers，Inc.NY，NY(1975)，pp.71-77]。
表Y：保守取代II
侧链特征：氨基酸
非极性的(疏水性的)
脂肪族的：A L I V P
芳香族的：F W
含硫的：M
边界：G
不带电荷的-极性的
羟基：S T Y
酰胺：N Q
巯基：C
边界：G
带正电荷的(碱性的)：K R H
带负电荷的(酸性的)：D E
作为又一个替代方案，示例性保守取代如以下所述：
保守取代III
原始残基：示例性取代残基
Ala(A)：Val，Leu，He
Arg(R)：Lys，Gin，Asn
Asn(N)：Gin，His，Lys，Arg
Asp(D)：Glu
Cys(C)：Ser
Gin(Q)：Asn
Glu(E)：Asp
His(H)：Asn，Gin，Lys，Arg lie(I)Leu，Val，Met，Ala，Phe，
Leu(L)：He，Val，Met，Ala，Phe
Lys(K)：Arg，Gin，Asn
Met(M)：Leu，Phe，lie
Phe(F)：Leu，Val，lie，Ala
Pro(P)：Gly
Ser(S)：Thr
Thr(T)：Ser
Trp(W)：Tyr
Tyr(Y)：Trp，Phe，Thr，Ser
Val(V)：He，Leu，Met，Phe，Ala
变体同源物还可以使用简并PCR获得，该简并PCR使用的引物被设计为靶向编码本公开序列内的保守氨基酸序列的序列。一般而言，同源物包含对本文提供的序列的重要功能结构域、活性位点等进行编码的保守序列。
可例如通过比对几种变体同源物的氨基酸序列来预测本公开提供的保守序列。为了构建和精修多序列比对以鉴别保守功能结构域，可使用计算机软件，例如PileUp、SeqLab和GCG Wisconsin软件包。
例如，磷脂酶活性可通过提供磷脂酶底物并与适当的实验对照并行检测底物(举例来说，如含磷脂的油)的量降低或者反应产物的量增加来测量。
同样地，脂质酰基转移酶活性可通过提供脂质酰基转移酶底物(举例来说，如胆固醇)并检测底物的量增加或反应产物的量减少来测量。
序列同一性或相似性百分比
序列同一性计算可通过人工进行或者更经常地借助于公众可获得的序列比较程序来进行。这些商业上可获得的计算机程序可计算两个或更多个序列之间的序列同一性百分比或序列相似性(即具有类似的化学性质/功能的氨基酸残基)百分比。
序列同一性百分比或序列相似性百分比可在连续序列上计算，即一个序列与另一个序列比对，并将一个序列中的每一个氨基酸与另一个序列中的对应氨基酸直接比较，一次一个残基。这被称为“不带空位”的比对。通常，此类不带空位的比对仅在相对短的残基数量上进行。
可以在整个氨基酸序列上测定序列的多肽同一性程度。适当地，可以在至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸、40个连续氨基酸、50个连续氨基酸、60个连续氨基酸或至少100个连续氨基酸上测定多肽序列的序列同一性百分比程度或序列相似性百分比程度。
可以在整个核苷酸序列上测定序列的多核苷酸同一性程度。适当地，在至少20个连续核苷酸，优选在至少30个连续核苷酸上，优选在至少40个连续核苷酸上，优选在至少50个连续核苷酸上，优选在至少60个连续核苷酸上，优选在至少100个连续核苷酸上测定核苷酸序列的序列同一性百分比程度或序列相似性百分比程度。
计算两个或更多个序列之间的最大序列同一性百分比或序列相似性百分比经常可能需要序列之间的最优比对。此类比对一般需要考虑空位罚分。在计算机软件已生成最优比对之后，则应当计算序列同一性百分比或序列相似性百分比。
用于执行此类最优比对的计算机程序的实例包括但不限于BLAST(参见Ausubelet al.1999 Short Protocols in Molecular Biology，4th Ed-Chapter 18)，和FASTA(Altschul et al.1990 J.Mol.Biol.403-410)，或者商业上可获得的程序，如基于算法的Vector NTI(Life Technologies)，类似于CLUSTAL(Higgins D G&Sharp P M(1988)，Gene73(1)，237-244)，等等。
通常，这些程序允许使用者修改空位罚分。然而，根据被比对的序列的具体复杂性、长度或数量，当使用此类软件程序时，优选使用默认值。
当计算机程序提供对“空位罚分”的考虑时，将产生具有尽可能少的空位的比对-反映两个比较序列之间的较高关联性-并因此与产生许多空位的比对方法相比将得到更高的分数。
“仿射空位成本(affine gap cost)”通常用于对空位的存在征收相对高的成本，而对空位中的每个随后残基征收较小的罚分。这是最常用的空位计分系统。高空位罚分当然产生具有较少空位的优化比对。
稳定剂
分离的多肽酶或酶混合物在未处于其天然细胞环境中时经常是不稳定的。如果不保持某些缓冲条件，分离的多肽可能不能正常起作用或者因蛋白酶解、聚集和未达到最优的缓冲条件而失去活性。各蛋白的存储最佳条件各不相同。
在一些方面，本公开的分离的多肽酶可进一步包含一种或多种稳定试剂，其保护包含该混合物的蛋白质免受环境应力，否则环境应力会导致酶失活、聚集和冻融损害。
可与本公开的分离的多肽酶或酶混合物一起使用的添加剂的实例包括但不限于：蛋白质稳定混合物(Protein Stabilizing Cocktail)溶液，用于延长在4℃或-20℃下储存的保质期。冷冻保护剂如最终浓度为大约25-50％的甘油或乙二醇通过防止在-20℃下形成冰晶而帮助稳定蛋白质。蛋白酶抑制剂防止蛋白质结构中的蛋白质二硫键发生蛋白酶裂解。抗微生物剂如最终浓度为大约0.02-0.05％(w/v)的叠氮化钠(NaN3)或最终浓度为大约0.01％(w/v)的硫柳汞抑制微生物生长。诸如EDTA的金属螯合剂，最终浓度范围为大约1-5mM，避免了金属诱导的-SH基团氧化并帮助保持蛋白质为还原状态。诸如二硫苏糖醇(DTT)和2-巯基乙醇(2-ME)的还原剂，最终浓度为1-5mM，通过防止半胱氨酸残基氧化也帮助保持蛋白质为还原状态。
可与本公开的分离的多肽酶或酶混合物一起使用的稳定试剂的实例包括但不限于：可包含例如甘油、乙二醇、海藻糖、甘油葡萄糖苷(glucosylglycerol)和葡萄糖基甘油酸(glucosylglycerate)、叠氮化物、汞。适合的稳定试剂还可以包含商业上可用的稳定试剂，如稳定混合物(Stabilizing Cocktails)，如蛋白稳定混合物(Pierce)乙二醇(Pierce)、SuperFreezeTM过氧化物酶偶联稳定剂(Pierce)、Guardian过氧化物酶偶联稳定剂/稀释剂(Pierce)、HaltTM含EDTA型蛋白酶抑制剂混合物试剂盒(Pierce)、HaltTM无EDTA型蛋白酶抑制剂混合物试剂盒(Pierce)、PMSF(苯甲基磺酰氟)(Pierce)、ThermoScientific蛋白质稳定混合物(Life technologies)、COMPLETE和PHOSSTOP(Roche)，以及蛋白质稳定化领域中已知或新的其他稳定试剂。
在该方法中，脂质酰基转移酶是其他酶的酶稳定剂，并且增加酶混合物的其他组分的半衰期，特别是脂质酰基转移酶增加具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶活性、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶活性的多肽的半衰期。
本公开的发明人惊讶地发现脂质酰基转移酶作为酶稳定剂起作用。这是表示这一酶稳定剂使PLC酶在水溶液中储存时保持80-90％的活性水平至少一年，并在油中保持PLC的活性为超过初始活性的80％至少6个小时。优选地，对本发明而言，所述酶稳定剂是来自肠棕气单胞菌的脂质酰基转移酶。酶稳定剂稳定其他酶，并增加酶混合物的其他组分的半衰期，特别是脂质酰基转移酶增加了具有磷脂酰肌醇特异性磷脂酶活性、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶活性的多肽的半衰期。
G.酶混合物
本公开提供了众多的酶混合物组合物，其包含如本文提供的分离的多肽酶。在一些方面，本公开提供了酶混合物，其中所述多肽酶自商业来源提供。在一些方面，本公开提供了包含商业上可获得的多肽酶和本文提供的分离的多肽酶的组合的酶混合物。
本公开提供了待储存和运送至油加工和精炼行业的消费者的分离的酶和混合物。本领域技术人员将理解，本公开的酶混合物可进一步包含稳定试剂或添加剂。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶(PI-PLC)、磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶(PC/PE-PLC)。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶(PI-PLC)、磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶(PC/PE-PLC)以及脂质酰基转移酶(LAT)。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶(PI-PLC)、磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶(PC/PE-PLC)以及脂质酰基转移酶(LAT)，其中该酶混合物不包含磷脂酶A(PLA)。在一些方面，所述脂质酰基转移酶是一种多肽，其与SEQ.ID.NO.：6、7、8、9或10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，在与粗油反应时，所述脂质酰基转移酶产生溶血磷脂和酰基固醇。
本公开提供了一种酶混合物，其包含磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：1具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：6具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：2具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：6具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：3具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：6具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：6的氨基酸序列具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：1具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：7具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：2具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：7具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：3具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：7具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：7具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：1具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：8具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：2具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：8具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：3具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：8具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：8具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：1具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：9的氨基酸序列具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：2具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：9具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：3具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：9具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：9的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：1具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：2具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：3具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：10的氨基酸序列具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：1具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：6具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：2具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：6具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：3具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：6具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：6具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：1具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：7具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：2具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：7具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：3具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：7具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：7具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：1具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：8具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：2具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：8具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：3具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：8具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：8具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：1具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：9具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：2具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：9具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：3具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：9具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：9具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：1具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：2具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：3具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种酶混合物，其包含：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶，其与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其中该脂质酰基转移酶与SEQ.ID.NO.：10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种用于油脱胶的酶混合物，其包含：与SEQ.ID.NO.：1具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；和与SEQ.ID.NO.：5具有40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种用于油脱胶的酶混合物，其包含：与SEQ.ID.NO.：2具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；和与SEQ.ID.NO：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种用于油脱胶的酶混合物，其包含：与SEQ.ID.NO.：3具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；和与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种用于油脱胶的酶混合物，其包含：与SEQ.ID.NO.：4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；和与SEQ.ID.NO：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种用于油脱胶的酶混合物，其包含：与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；和与SEQ.ID.NO.：6具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种用于油脱胶的酶混合物，其包含：与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和与SEQ.ID.NO：7具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽，其中该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种用于油脱胶的酶混合物，其包含：与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；和与SEQ.ID.NO：8具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种用于油脱胶的酶混合物，其包含：与SEQ.ID.NO：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；和与SEQ.ID.NO：9具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种用于油脱胶的酶混合物，其包含：与SEQ.ID.NO.：5具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽；和与SEQ.ID.NO：10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
酶混合物的应用
在一些方面，如本文提供的酶混合物或分离的多肽用于油组合物的油精炼。可将如本文提供的酶混合物或分离的多肽引入到化学或物理油精炼方法中。
在一些方面，本文提供的酶混合物或分离的多肽用于可食用油的油精炼。在一些方面，如本文提供的酶混合物或分离的多肽用于粗生物燃料的油精炼。在一些方面，在用于油的油精炼时，酶混合物可将可食用油中大于80％(w/w)的磷脂水解成二酰基甘油和磷酸酯。在一些方面，在用于油的油精炼时，与非酶法脱胶方法相比，酶混合物可使油产率增加了至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％。在一些方面，在用于油的油精炼时，与酶法脱胶方法相比，酶混合物可使油产率增加了至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％。在一些方面，在用于油的油精炼时，酶混合物不增加油组合物中的游离脂肪酸含量。在一些方面，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶以及磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶的酶混合物在用于油的油精炼时保持70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的活性水平。在一些方面，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶以及磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶的酶混合物在用于油的油精炼时保持在70％-75％、70％-80％、75％-80％、80％-85％、80％-90％、90％-95％范围内的活性水平。在一些方面，在用于油的油精炼时，与不含脂质酰基转移酶的酶法油脱胶方法相比，酶混合物的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶或磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺特异性磷脂酶具有更高的活性。在一些方面，实现了上述作用，其中酶混合物中提供的脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的酶法油脱胶方法的推荐浓度的十分之一。
在一些方面，如本文提供的酶混合物或分离的多肽用于粗油的油脱胶方法。在一些方面，如本文提供的酶混合物或分离的多肽用于可食用油的油脱胶方法。在一些方面，如本文提供的酶混合物或分离的多肽用于生物燃料的油脱胶方法。
本公开提供了一种用于消费性产品的油，其包含可检测量的与SEQ.ID.NOs：1、2、3或4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些方面，该消费性产品是食品、化妆品或用于交通工具的燃料。在一些方面，该油不包含可检测量的磷脂酶A。
本公开提供了一种用于消费性产品的油，其包含可检测量的与SEQ.ID.NOs：5、6、7、8、9或10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些方面，该消费性产品是食品、化妆品或用于交通工具的燃料。在一些方面，该油不包含可检测量的磷脂酶A。
H.油混合物
本公开提供了一种油混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C；和脂质酰基转移酶。在一些实施方式中，该油混合物不包含磷脂酶A。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶C。
在一些方面，该油混合物包含可食用油。在某些方面，该可食用油混合物包含：大豆油、油菜籽油、葵花籽油、米糠油、棕榈油、芝麻油、花生油、阿萨伊油、扁桃仁油、巴巴苏仁油、黑加仑籽油、琉璃苣籽油、芥花油、腰果油、蓖麻油、椰子油、芫荽油、玉米油、棉花籽油、海甘蓝油、亚麻籽油、葡萄籽油、榛果油、其他坚果油、大麻籽油、麻疯果油、荷荷巴油、亚麻仁油、澳洲坚果油、芒果核油、白芒花油、芥子油、牛蹄油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精油、山核桃油、松子油、阿月浑子树油、罂粟籽油、油菜籽油、米糠油、葵花籽油、山茶花油、乳木果油、妥尔油、椿油、胡桃油，或它们的组合。
在一些方面，该混合物的油包含生物燃料。在某些方面，该生物燃料油混合物包含：玉米油、植物油、富油新绿藻(Neochloris oleoabundans)油、二形栅藻(Scenedesmusdimorphus)油、纤细裸藻(Euglena gracilis)油、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)油、颗石藻(Pleurochrysis carterae)油、小三毛金藻(Prymnesium parvum)油、扁藻(Tetraselmis chui)油、四肩突四鞭藻(Tetraselmis suecica)油、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)油、微拟球藻(Nannochloropsis salina)油、布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)油、杜氏盐藻(Dunaliella tertiolecta)油、微球藻(Nannochloris species)油、螺旋藻(Spirulina species)油、绿藻(Chlorophycease)油、Bacilliarophy油，或它们的组合。
油混合物中的粗油可以是全粗油、部分粗油、部分精炼油或基本上精炼油。全粗油可自常规提供。粗油可包括已经过了一些加工或预处理的油。
本公开提供了一种粗油混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：1具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：6具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶C。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种粗油混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：2具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：6具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C或磷脂酶D。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种粗油混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：3具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：6具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C或磷脂酶D。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种粗油混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：6具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶C。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种粗油混合物，其包含：油组合物；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：1具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：7具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C或磷脂酶D。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种粗油混合物，其包含：油组合物；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：2具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：7具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C或磷脂酶D。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种油组合物混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：3具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：7具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C或磷脂酶D。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种油组合物混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：7具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C或磷脂酶D。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种油组合物混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：1具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：8具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C或磷脂酶D。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种粗油混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：2具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：8具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C或磷脂酶D。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种粗油混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：3具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：8的氨基酸序列具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C或磷脂酶D。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种粗油混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：8具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶C。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种粗油混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：1具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：9具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶C。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种粗油混合物，其包含：油组合物；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：2具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：9具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶C。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种油组合物混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：3具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：9具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶C。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种油组合物混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：9具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶C。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种油组合物混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：1具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶C。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种粗油混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：2具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶C。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种粗油混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：3具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶C。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
本公开提供了一种粗油混合物，其包含：粗油；磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，其与SEQ.ID.NO.：4具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和脂质酰基转移酶，其与SEQ.ID.NO.：10具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方式中，该油混合物可进一步包含磷脂酶C。在一些方面，该酶混合物不包含磷脂酶A。
实施例
实施例1：酶的生产
该实施例描述了生产和分离本公开提供的多肽和酶的方法。
使用下文所述的方案，可生成重组表达宿主细胞(例如GMO)，以表达本公开的一个或多个拷贝的SEQ.ID.NOs：1-10的示例性蛋白质或它们的组合。
简略地说，蛋白编码序列可被克隆到表达载体中。该基因可以在一个载体、多个载体上或者作为DNA表达盒。可以使用本领域已知的任何方法将基因插入到表达宿主细胞的基因组中。
在使用载体的应用中，可将表达载体转化至宿主细胞或转染到宿主细胞中。根据应用，可将载体独立转化或共转化至宿主细胞。
可使用任何微生物原核生物、真核生物、酵母、真菌、昆虫，举例来说，如大肠杆菌、其他革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌或本领域已知的以及如本文所提供的其他蛋白质表达系统，来构建宿主细胞表达菌株或GMO。
根据每种基因的拷贝数和启动子的类型，可以将宿主细胞或GMO工程化以表达不同比率的每种酶，以便使它们以期望的比率产生。
然后将宿主细胞培养在适当的培养基和条件下，以便允许宿主细胞生长和繁殖。
最后，使用本领域技术人员已知的任何方法可从培养肉汤中分离所表达的来自宿主细胞或GMO的酶。
最后，可将来自肉汤的纯化蛋白质储存在适当的储存缓冲和条件下以便使其保持期望的酶活性。
用于大肠杆菌的示例性方案
a)将编码本公开的多肽的核酸分子克隆到pET24b质粒(Novagen，USA)的NdeI-EcoRI位点中。
b)通过电穿孔将得到的质粒转化到BL21AI大肠杆菌菌株，并在含有50mg/L卡那霉素的LBA板中选择菌落。
c)在37℃下在100ml LB上生长重组克隆的菌落，直到细胞密度达到OD600＝2。
d)将上面获得的培养物转移到含有10升(L)HM培养基(在下文描述)的种子发酵罐，并在35℃下生长10小时。
e)将培养物转移到含有600L HM培养基的1000L发酵罐，并在35℃下生长，直到甘油耗尽。然后以足以保持比生长速率值为0.35h-1±0.05的速率开始含有80％w/v甘油和20g/L MgSO4的营养液的指数流加。当OD600达到值为80时，加入1mM IPTG，并以9±1L/h的恒定速率流加营养液10小时。必要时，通过富集具有纯氧的空气流使溶氧浓度保持为大于30％的饱和度。通过加入NH4OH使pH保持为pH 7。
f)在发酵方法结束时，肉汤在APV均质器中在1000bar下进行三次加压/解压循环来处理，以破坏大肠杆菌细胞。
g)将得到的液体在sharpless离心机中以5000g离心，直到澄清以分离固体物质。
h)向澄清的液体加入(NH4)2SO4至80％的饱和度，将混合物在8℃下孵育3小时，然后在sharpless离心机中以5000g离心。
i)小心地倾析出上清液留下团块。然后将包含该酶的褐色糊状团块再混悬于适当的缓冲液中。
实施例2：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶(PI-PLC)的生产
a-磷脂酰肌醇特异性磷脂酶(PI-PLC)的密码子优化的DNA序列的产生
磷脂酰肌醇特异性磷脂酶(PI-PLC)基因选自黄曲霉(SEQ ID NO 4)、赖氨酸芽孢杆菌(SEQ ID NO 1)、抗生素链霉菌(SEQ ID NO 2)和粪肠球菌(SEQ ID NO 3)，所有这些均具有保守的催化氨基酸序列。除了黄曲霉外，预测所有这些蛋白质具有来自Sec系统的N-端信号序列而被分泌，如采用Phobius软件(http：//phobius.sbc.su.se/)所测定的。因此，预测的成熟蛋白质被逆翻译，并使用密码子随机算法(Menzella，2011)对其进行密码子优化用于在大肠杆菌中表达。所得到的序列(SEQ.ID.NOs.：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQID NO：13和SEQ ID NO：14))进行合成并克隆在在BAD启动子控制下的表达质粒中，以分析它们的表达和活性。
为了测定构建体是否表达相应的可溶形式的PI-PLC蛋白质，将表达载体转化到大肠杆菌BL21(AI)菌株中进行表达测试，并通过SDS-PAGE分析所诱导细胞裂解产物的可溶部分和不可溶部分。
将携带不同表达质粒的菌株在LB上过夜生长。培养物在相同培养基中进行100倍稀释，并在37℃、震荡孵育。当OD600达到0.5时，用0.4g/L L-阿拉伯糖(Royal Cosun，Netherlands)在30℃诱导培养物6小时。通过离心分离细胞和培养物上清液。将细胞团块再混悬于含10mM HEPES pH 7.0和100mM NaCl的缓冲液中至最终OD600为4，并在GEX 600超声波处理器中在冰上进行破坏。将细胞提取物离心，通过SDS-PAGE在12％凝胶上分析，采用考马斯亮蓝染色，并使用扫描仪和牛血清白蛋白(BSA，Sigma)作为标准通过密度测定法进行定量。使用ImageJ软件来进行扫描图像的定量(图1)。
对于大多数工业用酶，生产成本是关键因素，并且期望高蛋白质表达水平。如图5中所示，通过密度法测定，PI-PLC赖氨酸芽孢杆菌(SEQ ID N°1)表达水平是PI-PLC蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的2.46倍。因为这两种酶在使用相似浓度时从粗油中移除胶的效率相同(图3)，PI-PLC赖氨酸芽孢杆菌有利于开发有成本效益的生产方法。
b-高细胞密度蛋白质生产方法
在含0.1L LB培养基的1L Erlenmeyer烧瓶中，通过在振荡式孵育器中在37℃和200rpm下培养，制备拥有pKCN233(pBAD：：pi-PLC赖氨酸芽孢杆菌)的大肠杆菌BL21(AI)的种子培养物。以50mg l-1的浓度加入卡那霉素以保持质粒稳定性。
在含有1L或12L的半合成HM培养基(Menzella et al.，2003)的3L或20L(NewBrunswick Bio Flo 115和Bio Flo 415，USA)中进行分批进料发酵。温度、搅拌和pH分别保持为37℃、1200rpm和7(通过加入25％NH4OH)。必要时通过改变纯氧百分比使溶氧水平控制在30％的空气饱和度。当培养基中存在的甘油被耗尽时，开始进料过程。根据通过方程式1(Lee，1996)确定的进料速率(F，ml h-1)以可变的方式加入含有800g l-1甘油和20g l- 1MgSO4·7H2O的溶液以使比生长速率保持为0.25h-1。
Figure BPA0000254504300001001
X0是开始进料时的生物质浓度(g l-1)，V0是初始体积(l)，μ是期望的比生长速率(h-1)，S0是进料溶液中的葡萄糖浓度(g l-1)，并且YX/S是物质产率。
当OD600达到100时，通过加入最终浓度为0.4g l-1的低成本诱导物L-阿拉伯糖诱导PI-PLC基因的表达。之后，使进料速率保持为10ml h-1。
在发酵过程之后，冷冻细胞培养物，并在1000巴下通过高压均质器(GEA NiroSoavi，Panda Plus 2000)两次。通过在连续流离心机(GEA Westfalia Separator FSD 1-06-107)中以10000rpm离心30分钟来分离细胞碎片。图6显示因为启动子渗漏，诱导时的PI-PLC赖氨酸芽孢杆菌的表达为大约3.5g l-1，并且其产量持续增加，直到在诱导12h后达到最大滴度15g l-1。为了进一步降低生产成本，使用来源于生物柴油厂的粗甘油作为碳源测试PI-PLC赖氨酸芽孢杆菌的产量，得到相同的结果。使用20l生物反应器放大该方法而没有损失产率。这些结果总结在表2中。
表2
Figure BPA0000254504300001011
在发酵运行结束时，在APV均质器中在1000bar下进行三次加压/解压循环来处理肉汤，以破坏大肠杆菌细胞。将得到的液体在sharpless离心机中以大约5000g离心，直到澄清以分离固体物质。向澄清的液体加入(NH4)2SO4至80％的饱和度，将混合物在8℃下孵育3小时，并在sharpless离心机中以5000g离心。小心地倾析出上清液留下团块。然后将包含该酶的褐色糊状团块再混悬于适当的缓冲液中。
实施例3：使用PI-PLC的酶法油脱胶
a-测试油中的磷脂酶活性
这一实施例举例说明了使用比较核磁共振分析(NMR)和无机磷酸盐定量，测试多肽在油或油混合物中的特异性磷脂酶C活性的方法。
使用Ultra-Turrax T8均质器(IKA)将包含在90μl包含柠檬酸钠50mM pH 6.2、1mMZnCl2的缓冲液中的3克包含大约15-45μg(SEQ.ID.NOs：1-4)的粗油的反应混合物均质化大约1min。
接着，在使用磁力震动搅拌器如VP 710磁力震动搅拌器(VP-Scientific)不断搅拌下将含有反应混合物的试管在大约50℃孵育。
在50℃下孵育2小时后，如下测定PLC活性：
油中PLC活性的测定
无机磷酸盐的定量
采用基于无机磷酸盐的定量的灵敏方法测量磷脂酶C的活性。通过用水溶液提取来回收来自油中已水解的磷脂的极性头基团(磷酸胆碱、磷酸乙醇胺或磷酸肌醇)，并通过碱性磷酸酶水解来生成无机磷酸盐。
采用改良的Sumner方法(Sumner，J.B.，Science 1944 196：413)来测定无机磷酸盐。
简单地说，将500μl含有在5％TCA中的0.025至0.25μmol无机磷酸盐的样品与500μl颜色试剂(4％FeSO4，1％(NH4)6MoO24.H2O，3.2％H2SO4)混合。在700nm下进行分光光度计读数，并根据标准曲线计算样品中无机磷酸盐的微摩尔。
粗油和PLC处理油的NMR分析
使用缓冲液作为对照或者如所述在50℃下酶处理2h进行油脱胶实验。使用Ultra-Turrax T-65均质器(IKA)使处理油乳化1min，然后取300mg样品进行进一步分析。在37℃、不断搅拌下在1h期间用900μl的NMR溶液(100mM Tris-HCl pH 10.5，50mM EDTA，2.5％脱氧胆酸钠)萃取油样品，并将得到的水相用600μl己烷萃取。最后，向水相加入50μl D2O。采用Bruker 300 Ultrashield设备获取31P NMR磷脂谱。使用磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸和磷脂酰肌醇样品作为标准。
图3和图4A所示的结果表明PI-PLC赖氨酸芽孢杆菌(SEQ.ID.NO 1)在50℃、工业油脱胶使用的条件下具有高效水解油包水型乳液中的磷脂酰肌醇PI的能力。10μg酶/g粗油足以水解含有3％磷脂(1200ppm磷酸酯)的粗大豆油中存在的PI，表明产量为15g l-1的蛋白质生产方法适合于开发工业规模的蛋白质生产。考虑到在下游过程中25％的蛋白质损失边界值，1升发酵液足够处理1吨粗油(1000-1500ppm磷酸酯)，这使得这种蛋白质成为目前为止描述的工业用途的最成本有效的替代物。我们还观察到使用10ug酶/g油，蛋白质SEQ IDNOs.2-4可从油中去除近乎100％的PI。
实施例4：使用PLC混合物的酶法油脱胶
使用Ultra-Turrax T8均质器(IKA)，将包含3克粗油和在90μl含柠檬酸钠50mM pH6.2、1mM ZnCl2的缓冲液中的大约10μg(SEQ.ID.NO 1)/g油或5μg(SEQ.ID.NO 5)/g油或10μg(SEQ.ID.NO 1)/g油和5μg(SEQ.ID.NO 5)/g油的混合物的反应混合物均质化大约1min。
接着，在使用磁力震动搅拌器如VP 710磁力震动搅拌器(VP-Scientific)不断搅拌下将含有反应混合物的试管在大约50℃下孵育。
在50℃下孵育2小时后，如上文所述测量无机磷酸盐来测定PLC活性(表3)。
我们观察到PC/PE-PLC、PI-PLC在合并在混合物时的酶活性并不具有叠加作用。参见图4D、表3和表4。
在酶处理后对油中剩余的磷脂的NMR分析显示，当两种酶组合时，PC、PI和PE不完全水解(图4D)。然而，当单独使用每种酶时，使用相同量的酶/g油，对于PI-PLC则观察到PI的完全水解(图4A)或者对于PC/PE-PLC则观察到PC和PE的完全水解(图4B)。
表3：
酶混合物 PLC活性单位(μM磷酸酯)
PC/PE-PLC 15,978
PI-PLC 6,132
PC/PE-PLC+PI-PLC 11,728
阴性对照 0
该结果表明当将两种酶(PC/PE-PLC和PI-PLC)一起加入到油中时，活性低于单独使用的PC/PE-PLC的活性。
表4：
Figure BPA0000254504300001031
Figure BPA0000254504300001041
为了分析在不同时间点连续加入的PC/PE-PLC和PI-PLC的混合物，在本实施例中，将栏1中示出的每种酶加入到3g粗大豆油(22.5μg PC/PE-PLC或30μg PI-PLC)中。在0min(对照)时或在1小时后将油在90℃下加热5min以使酶失活。此时，取油样品测定PLC活性(栏A)。接着加入第二酶(栏4)，并在50℃下孵育2小时后，如本文所述测定PLC活性(栏B)。栏B-A显示加入的第二酶的PLC活性。
这些结果表明，如果油先前用PI-PLC处理过，则PC/PE-PLC活性降低。类似地，如果油先前用PC/PE-PLC处理过，则PI-PLC活性降低(参见表4)。
实施例5：具有低浓度LAT作为酶稳定剂的二酶系统用于油脱胶：
本实施例显示与目前使用的其他酶法脱胶方法相比，使用低量脂质酰基转移酶(LAT)的油脱胶方法。
简单地说，将3克含有1200ppm磷酸酯的粗大豆油用10μg磷脂酰肌醇特异性磷脂酶(PI-PLC，SEQ ID NO 1)/g油、5ug磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶(PC/PE-PLC，SEQID NO 5)/g油和浓度为0.01TIPU的LAT(SEQ ID NO 10)/g油的酶稳定剂脱胶，在50℃下2小时后，如本文所述测定PLC活性。0.01TIPU/g油等于0.2ug蛋白质(SEQ ID NO 10)/g油。
本发明的这种脂质酰基转移酶的活性为50TIPU/mg蛋白质。
表5和图5A-C中的结果表明，以低浓度存在的LAT令人惊讶地改善了总体PLC活性。在本实施例中，可观察到当使用0.01TIPU/g油的LAT浓度时，PC/PE-PLC/PI-PLC组合获得最高的PLC活性增量。然而，即使是用更低的浓度如0.005或0.001TIPU/g油(分别等于0.1μg/g油或0.02μg/g油)，也可检测到该作用。
表5：
Figure BPA0000254504300001051
实施例6：具有LAT作为稳定剂的二酶方法用于在粗大豆油中进行油脱胶
使用本公开的具有LAT作为酶稳定剂的二酶系统除去大豆油中的胶vs.水脱胶
将40g含有1200PPf磷酸酯的粗油用以下物质进行处理：
·3％的水(H2O)
·含10μg磷脂酰肌醇特异性磷脂酶(PI-PLC，SEQ ID NO 1)/g油、5ug磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶(PC/PE-PLC，SEQ ID NO 5)/g油和0.01TIPU LAT(SEQ ID NO10)/g油的3％的水，或者
·含5ug磷脂酰胆碱和磷酸乙醇胺特异性磷脂酶(PC/PE-PLC，SEQ ID NO 5)/g油的3％的水。
将反应混合物在50℃、不断搅拌下于50℃孵育2小时。
将油混合物在85℃下孵育以使酶失活，并以5000g离心5min。将胶和离心过的油称重，并计算g胶/100g油。结果在图6A-C中示出。
在PC/PE-PLC+PI-PLC+LAT系统中观察到的胶的减少导致总油产率与使用水的对照相比增加了2.14％，与单独使用PC/PE-PLC相比增加了1.12％。
表6
Figure BPA0000254504300001061
实施例7-在采用PC/PE-PLC和PI-PLC的油脱胶中使用低浓度的溶血酰基转移酶(LAT)
反应混合物包含3克含有1200ppm磷酸酯的粗油和含有以下物质的3％的水：
(1)0.1TIPU LAT(SEQ ID NO 10)/g油(等于2μg LAT/g油)
(2)10μg(SEQ.ID.NO 1)/g油、5μg(SEQ.ID.NO 5)/g油和0.01TIPU LAT(SEQ ID NO10)/g油(等于0.2μg LAT/g油)
(3)无酶。
使用Ultra-Turrax T8均质器(IKA)将反应混合物均质化大约1min。
接着，在使用磁力震动搅拌器如VP 710磁力震动搅拌器(VP-Scientific)不断搅拌下将含有反应混合物的试管在大约50℃下孵育。
在50℃下孵育2小时后，如上文所述测定PLC活性并通过NMR分析剩余的磷脂。
粗油的NMR谱图显示对应于磷脂：磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(PI)的四个峰。在用溶血酰基转移酶(LAT)(0.1TIPU/g油)处理后(图7-1)，磷脂PC、PE和PI完全水解成溶血磷脂：溶血磷脂酰胆碱(L-PC)、溶血磷脂酰乙醇胺(L-PE)和溶血磷脂酰肌醇(L-PI)。在这些反应条件下大约50％的磷脂酸(PA)水解成溶血磷脂酸。
当用PC/PE-PLC(SEQ ID N°5)、PI-PLC(SEQ ID N°1)和低浓度(0.01TIPU/g)的溶血酰基转移酶(SEQ ID N°10)的混合物处理粗油时(图7-2)，磷脂磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)分别完全水解成二酰基甘油和极性头基团磷酸胆碱(p-CHO)、磷酸乙醇胺(p-ET)和磷酸肌醇(p-INO)。没有检测到溶血磷脂，表明溶血酰基转移酶在这些反应条件下不与磷脂反应。
表7
溶血磷脂(mg) PLC活性
阴性对照 0 0
PC/PE-PLC 0 15449
PC/PE-PLC+PI-PLC 0 10753
PC/PE-PLC+PI-PLC 10 10611
PC/PE-PLC+PI-PLC 30 12292
PC/PE-PLC+PI-PLC 100 13394
PC/PE-PLC+PI-PLC+LAT 0 18795
用10μg(SEQ.ID.NO 1)/g油、5μg(SEQ.ID.NO 5)/g油和添加的不同量(10-100mg)的溶血磷脂的混合物或用10μg(SEQ.ID.NO 1)/g油、5μg(SEQ.ID.NO 5)/g油和0.01TIPU的LAT(SEQ ID NO 10)/g油的混合物、PC/PE-PLC(SEQ ID N°5)处理粗油(表7)。加入溶血磷脂(LAT酶的催化活性的产物)对PC/PE-PLC和PI-PLC的相互抑制没有任何作用。相反，向PC/PE-PLC和PI-PLC混合物加入低量(0.01TIPU/g油)的LAT(SEQ ID N°10)显示测量的PLC活性显著增加。这一结果表明，LAT蛋白质不通过其催化活性施加其对增加PC/PE PLC和PI-PLC活性的作用。
实施例8：蛋白质稳定性增加
将PC/PE-PLC和PI-PLC酶制剂通过超滤浓缩并使用适当的缓冲液(20mM乙酸钠pH6，35％甘油)储存。将这两种酶单独地或组合(PC/PE-PLC、PI-PLC和LAT的混合物)储存。将样品储存在4℃或25℃直到365天，并使用描述的用于评价酶的稳定性的方法测量酶活性。如上所述使用比色测定法用O-(4-硝基苯基磷酰基)胆碱底物测量PC-PLC活性(图8)。
图8的结果表明当单独储存时(图8a)，在室温下50天后PC/PE-PLC酶制剂的活性损失大约50％。然而，当与PI-PLC和LAT组合储存时(图8B)，甚至在室温下365天后，酶制剂仍保持稳定。两种酶制剂在4℃下稳定至少365天。
图9中的结果显示在50℃(油脱胶温度)下PLC酶(PC/PE-PLC和PI-PLC)在油中的酶稳定性。在50℃下将酶PC/PE-PLC、PI-PLC或这两种酶与加入的LAT的混合物在1g精炼油(不含磷脂)中孵育所示时间(0作为对照或者1-2h)。进行这一孵育以评价添加的酶在油中的稳定性，未发生反应，因为不存在磷脂。这一孵育之后，加入2g粗油(含3％的磷脂)，并在50℃、不断搅拌下使脱胶反应进行2小时。如上所述测量无机磷酸盐来定量PI-PLC和PC-PLC反应。这两种酶如果在50℃下在油中单独孵育1或2小时则均失活(小于50％的回收活性)。然而，三种酶PC/PE-PLC、PI-PLC和LAT的混合物在测定条件下仍保持稳定，甚至是在50℃下预孵育两小时后仍回收100％的初始活性(0h，50℃孵育)。这一结果表明三种酶(PC/PE-PLC、PI-PLC和LAT)的混合物比任一种PLC单用均更稳定。综合来说，这些结果表明LAT通过稳定PC/PE-PLC和PI-PLC以低浓度发挥其作用，而不是因为其催化活性。图9
实施例9：含有15％磷脂和15-20％水的油组合物的酶处理
对从工业水脱胶的大豆油获得的湿胶样品进行分析并发现含有40.5％水、30％磷脂和29.5％TAG。
将150g湿胶与150g粗大豆油混合，产生300g含有15％磷脂和20％水的油组合物。将这一油组合物用PC/PE-PLC、PI-PLC和LAT的混合物处理6小时。使用不含酶的实验作为阴性对照。所用的酶浓度如下所示：
√CK1X：5ug/g油的PC/PE-PLC、10ug/g油的PI-PLC和0.01TIPU/g油的LAT。
√CK2X：10ug/g油的PC/PE-PLC、20ug/g油的PI-PLC和0.02TIPU/g油的LAT。
√CK4X：20ug/g油的PC/PE-PLC、40ug/g油的PI-PLC和0.04TIPU/g油的LAT。
√CK6X：30ug/g油的PC/PE-PLC、60ug/g油的PI-PLC和0.06TIPU/g油的LAT。
将反应在50℃下孵育4个或6个小时(如表7所示)并离心以分离剩余的胶与回收的油。根据方法AOCS Cd 11d-96：2009测定1，2-DAG和1，3 DAG的浓度。对应于90％磷脂水解的理论DAG浓度为9.45％。
结果在表8和图10中示出。
为了从通过酶处理油组合物从胶回收油中获得经济益处，在该方法中回收的额外的油的值必须大于酶成本加上工厂需要的额外的能量和资本费用。现有技术教导了使用极其高的酶浓度的处理，其消耗的费用远超于该方法的盈利能力。
在反应编号3(表8)中，在酶处理样品中回收了200g油，相比之下，阴性对照(反应编号7，表8)则回收了145g油。油收益表示为37％(计算为g回收的油/100g处理胶)。测量的总DAGs的量表明初始油组合物中存在的大于90％的总磷脂发生了水解。使用的酶量(30μg/g油的PC/PE-PLC、60μg/g油的PI-PLC和0.06TIPU/g油的LAT)远低于以前的报告。
表8.油收益表示为g回收的油/100g处理胶。将150g胶与150g粗油一起孵育。总回收的油在栏4中示出。
Figure BPA0000254504300001091
Figure BPA0000254504300001101
实施例10：含30％磷脂和40％水的油组合物的酶处理
对从工业水脱胶的大豆油获得的湿胶样品进行分析并发现含有40.5％水、30％磷脂和29.5％TAG。
将300g湿胶用PC/PE-PLC、PI-PLC和LAT的混合物处理6小时。使用不含酶的实验作为阴性对照。所用的酶浓度如下所示：
CK6X：30μg/g油的PC/PE-PLC、60μg/g油的PI-PLC和0.06TIPU/g油的LAT。
将反应在50℃下孵育6个小时并离心以分离剩余的胶与回收的油。在酶处理样品中回收了59.4g油，相比之下，阴性对照回收了0g油，产生19.8％的油收益(计算为g回收的油/100g处理胶)。图10。
Figure ISB0000171769940000011
Figure ISB0000171769940000021
Figure ISB0000171769940000031
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Figure ISB0000171769940000071
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Figure ISB0000171769940000091
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Figure ISB0000171769940000141
Figure ISB0000171769940000151
Figure ISB0000171769940000161

Claims (10)

1.一种使油组合物脱胶的方法，所述油组合物含有1％-40％w/w的磷脂和1％-30％w/w的水，其中所述方法包括：
使所述油组合物与酶混合物接触，所述酶混合物由SEQ.ID.NO：1、SEQ.ID.NO：5和SEQ.ID.NO：10的多肽组成，其中SEQ.ID.NO：10的多肽的浓度为不大于0.06TIPU/g油；并且其中溶血磷脂和游离脂肪酸的浓度保持为它们的初始水平±10％。
2.权利要求1所述的方法，其中所述酶混合物将所述油组合物中存在的大于70重量％的磷脂水解成二酰基甘油和磷酸酯。
3.权利要求1所述的方法，其中所述油组合物是粗油和湿胶的混合物，其含有最终浓度为10％-30％的磷脂，以及所述油组合物与所述酶混合物接触至少4小时，并且初始湿胶中存在的大于70％的总磷脂被水解；油收益为至少34g回收油/100g处理胶。
4.权利要求1所述的方法，其中所述SEQ.ID.NO：1的多肽和所述SEQ.ID.NO：10的多肽之间的重量关系为至少50∶1。
5.权利要求1所述的方法，其中所述油组合物是可食用油，其中所述可食用油选自大豆油、油菜籽油、葵花籽油、米糠油、芝麻油、玉米油、棕榈油或花生油。
6.权利要求1所述的方法，其中所述油组合物是粗油和湿胶的混合物，其含有最终浓度为10-30％的磷脂，以及所述油组合物与所述酶混合物接触至少4小时，并且初始湿胶中存在的大于70％的总磷脂被水解；油收益为至少34g回收油/100g处理胶；所述SEQ.ID.NO：1的多肽的浓度为低于80μg/g油；所述SEQ.ID.NO：5的多肽的浓度为低于40μg/g油；并且所述SEQ.ID.NO：10的多肽的浓度为低于1.2μg/g油。
7.一种用于精炼油组合物的酶混合物，其由以下组分组成：SEQ.ID.NO：1的多肽；SEQ.ID.NO：5的多肽；和浓度为不大于1.2μg/g油的SEQ.ID.NO：10的多肽。
8.权利要求7所述的酶混合物，其中所述SEQ.ID.NO：1的多肽和所述SEQ.ID.NO：10的多肽之间的重量关系为至少50∶1。
9.一种使可食用油脱胶的方法，包括：
(a)提供SEQ.ID.NO：1的多肽；
(b)提供SEQ.ID.NO：5的多肽；
(c)提供SEQ.ID.NO：10的多肽，其中所述SEQ.ID.NO：10的多肽的浓度为不大于1.2μg/g油；和
(d)使包含磷脂的所述可食用油与步骤(a)、(b)和(c)的多肽混合，从而使所述可食用油脱胶，
(i)其中所述方法将油中大于70重量％的磷脂水解成二酰基甘油和磷酸酯；
(ii)其中所述油组合物中游离脂肪酸含量不增加；
(iii)其中所述SEQ.ID.NO：1的多肽以及所述SEQ.ID.NO：5的多肽的活性保持在初始活性水平的80％-90％。
10.权利要求9所述的方法，其中所述SEQ.ID.NO：10的多肽的浓度为不大于0.2μg/g油。
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