CN113215205B - 一种制备羟基脂肪酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备羟基脂肪酸的方法，将脱胶副产物溶解在乙腈中，超声分散，离心去除沉淀，得到有机相，将磷脂酶B、磷脂酶D、非特异性过氧合酶和胆碱氧化酶溶于缓冲液中，将有机相与复合酶液混合，反应至少1h，制得羟基脂肪酸。本发明为催化合成羟基脂肪酸提供了新思路，实现了油脂脱胶副产物的循环利用，减少了工业浪费。

Description

一种制备羟基脂肪酸的方法
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体涉及一种多酶联用制备羟基脂肪酸的方法。
背景技术
羟基脂肪酸是一类脂肪酸上的烃基链中一个或若干个氢原子被羟基取代的有机化合物，其分子中同时含有羟基和羧基，如果使羟基和羧基发生各种各样的化学反应，即可制备金属加工油剂、表面活性剂、化妆品基剂等，应用十分广泛。羟基脂肪酸的合成方法有化学法和酶法合成。化学法通过取代反应直接将脂肪酸中的烃基链中的氢原子取代为羟基。相较于化学法，酶法制备有高效节能，清洁环保等优势。采用非特异性过氧合酶，以过氧化氢和脂肪酸为原料催化合成羟基脂肪酸是近年来研究的热点。
油脂脱胶是指将毛油中胶溶性杂质去除，杂质包括：磷脂、蛋白质、糖类等。脱胶副产物中的主要成分是磷脂，包括磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸等。油脂脱胶副产物中成分丰富，但是分离提取困难，一般直接丢弃，造成了资源的浪费。磷脂酶B(PLB)和磷脂酶D(PLD)是磷脂酶家族中的成员，其中磷脂酶B能将磷脂水解产生脂肪酸，而磷脂酶D能将磷脂酰胆碱的磷酸酯连接的胆碱基团水解下来成为游离的胆碱分子，在胆碱氧化酶(CHoX)的进一步催化下能生产过氧化氢分子，这样便为非特异性过氧合酶(UPO)催化法提供了原料。
发明内容
本发明采用磷脂酶B(PLB)、磷脂酶D(VpPLD)、胆碱氧化酶(CHoX)和非特异性过氧合酶(UPO)联用的方法，以油脂脱胶副产物为唯一原料，采用一锅一次法，在四种酶的同时作用下生产羟基脂肪酸。
本发明的技术路线如下所示：
本发明通过以下技术方案实现：
一种制备羟基脂肪酸的方法，包括以下步骤：
(1)将脱胶副产物溶解在乙腈中，超声分散，离心去除沉淀，得到有机相；
(2)将复合酶溶于缓冲液中，得到复合酶液，复合酶为PLB:VpPLD:UPO:CHoX；
(3)将有机相与复合酶液混合，反应至少1h，制得羟基脂肪酸。
优选地，步骤(2)的PLB:VpPLD:UPO:CHoX的酶活比为(1～10):(1～10):(2～10):(2～10)；PLB和VpPLD按底物质量100-1000U/g添加，UPO按底物质量200-1000U/g添加，CHoX按底物质量200-1000U/g添加。
优选地，步骤(2)的PLB:VpPLD:UPO:CHoX的酶活比为5:5:6:7，PLB和VpPLD按底物质量200U/g添加，UPO按底物质量300U/g添加，CHoX按底物质量350U/g添加。
优选地，有机相和复合酶液的体积比为1:2-1:20。
优选地，有机相和复合酶液的体积比为1:4。
优选地，步骤(3)反应的条件为：反应温度为30-60℃，反应时间为2-8h，转速为500rpm-1000rpm。
优选地，步骤(3)反应的条件为：反应温度为30℃，反应时间为2h，转速为500rpm。
优选地，步骤(3)反应为油浴反应。
优选地，步骤(2)缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，pH值为7.0-9.0，浓度为0.1M。
优选地，步骤(1)脱胶副产物的制备方法，包括以下步骤：
(1)毛油加热至80±20℃，加入毛油质量2±1％的磷酸，高速搅拌至产生颗粒物；
(2)持续搅拌并冷却，加水，继续搅拌，静置分层；
(3)离心，收集下层沉淀，即脱胶副产物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用一锅一次法，四种酶同时催化油脂脱胶副产物生产羟基脂肪酸，为催化合成羟基脂肪酸提供了新思路；同时解决了的资源浪费，变废为宝，实现了油脂脱胶副产物的循环利用，减少了工业浪费。
附图说明
图1为C-12脂肪酸标准品衍生化后GC-MS图谱。
图2为实施例3制备的羟基脂肪酸标品衍生化后GC-MS图谱。
图3为不加酶的空白组衍生化后GC-MS图谱。
图4为pET21a质粒图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
(1)菌体培养：
菌株：VpPLD-pET21a BL21，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
VpPLD的氨基酸序列如下：
ACSSIESNQPSEKSTTFHFGYQQDSVLAHYFEAYGEDPKTITGFYPLNQGHDALLARTSLIESARKSLDLQYYIYRGDETSQLITWRLYEAAKRGVRIRLLLDDMQKRNDNVMAALNAHPNIEIRLFNPHQYRSARIFALTSDFERLNRRMHNKSLIADSVSAIVGGRNIGNEYFSFESEVEFGDFDLLLYGEAVQQTADQFDLYWNSVHAVPMEWISPESQSVSDAAIQKQVTKLNLQEKFSSGRYDFTALDMYQDLKQGKLNLYWGDGQVWFDLPDKVTTHDSQLVGNLTELLKSVEHSFVLISPYFIPTEAGTKALTNAAKRGVDITIVTNSLASNDVFAVHGWYAKYREDLLESGIKLWEVKSSAKLKSKWSLTGSSRASLHAKAMTIDDKTLFVGSMNWDPRSAALNTEMAVVIEQPEYVQTFLAKLPSQLKDNAYRLTLRDGDIVWTNTKTGEEYDSEPEAGVFRRLGAWFSGILPIEDQL
将保种的VpPLD-pET21a BL21的表达菌株在喊氨苄青霉素的平板上划线，挑取单克隆。一级种子液：挑单菌落接种至5mL LB液体培养基，37℃和220rpm过夜培养。二级种子液：一级种子液按1％接种量接种至100mL的LB液体培养基，37℃和220rpm培养2～3h，至菌体浓度OD600达到0.6～0.8。二级种子按5％的接种量至500mL LB培养基中(LB液体培养基：称取5g酵母提取物、10g蛋白胨和5g氯化钠，溶于1L去离子水中，灭菌备用)，37℃和220rpm培养2～3h，加入IPTG至终浓度为0.1M并降温至16℃，开始诱导，16～18h后4℃，4500rpm，30min离心收集菌体。
(2)蛋白纯化
细胞破碎，收集的菌体以质量三倍的缓冲溶液重悬，将高压匀浆细胞破碎仪参数调至4℃和1200bar压强，循环高压匀浆破碎两次，得到破碎液。4℃，10000rpm离心收集上清。上清液用0.45μm的滤膜抽滤。镍离子亲和层析柱：柱填料为Ni+-NTA，通过AKTA以4mL/min的流速的Buffer A冲洗柱子中含有的乙醇，当检测到数值平衡后，将上清液以4mL/min流经镍柱。待上样完成后继续用Buffer A冲洗柱子直至紫外吸收曲线和盐离子浓度线平衡为止。洗脱：用Buffer B设置梯度洗脱，流速为4mL/min，收集出峰组分，即VpPLD，于4℃保藏。
BufferA：称取2.84g Tris和29.22g氯化钠溶于900mL去离子水中，用盐酸调pH至8.0，再用去离子水定容至1000mL，用0.45μm滤膜过滤，常温保存备用。
BufferB：称取2.84g Tris、29.22g氯化钠和34.04g咪唑溶于900mL去离子水中，用盐酸酸调pH至8.0，再用去离子水定容至1000mL，用0.45μm滤膜过滤，常温保存备用。
PLB按照文章中的方法制备得到。Durrani R,Khan F I,Ali S,etal.AThermolabile Phospholipase B from Talaromyces marneffei GD-0079:Biochemical Characterization and Structure Dynamics Study[J].Biomolecules,2020,10(2):231-249.
UPO按照文章中的方法制备得到。Ullrich R,J Nüske,Scheibner K,et al.NovelHaloperoxidase from the Agaric Basidiomycete Agrocybe aegerita Oxidizes ArylAlcohols and Aldehydes[J].Applied&Environmental Microbiology,2004,70(8):4575-4581.
CHoX按照文章中的方法制备得到。Ribitsch D,Karl W,EWehrschütz-Sigl,etal.Heterologous expression and characterization of Choline Oxidase from thesoil bacterium Arthrobacter nicotianae[J].Appl Microbiol Biotechnol,2009,81(5):875-886.
缓冲液：
0.1M磷酸盐缓冲液：称取0.1M的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠溶于1L去离子水中，用KOH/磷酸调节pH。
0.1M Tris-HCl缓冲液：称取12.1g的Tris溶于1L的去离子水中，用HCl调节pH。
实施例1
脱胶副产物的制备。将毛油加热至80℃，加入毛油质量2％的磷酸，高速搅拌，产生颗粒物时，持续搅拌并降温至25℃，加入等温清水，继续搅拌10min，静置分层，离心，提取上清油脂后，下层沉淀即为脱胶副产物，其主要成分为磷脂。
实施例2
制备羟基脂肪酸，包括如下步骤：
(1)将实施例1中得到的脱胶副产物溶解在乙腈中，超声使脱胶副产物中的磷脂分散，分散后离心去除不溶沉淀，得到底物有机相。
(2)酶的处理：将VpPLD、PLB、UPO、CHoX溶于pH7.0-9.0的缓冲液中，得到复合酶液的水相，其中VpPLD和PLB按底物质量200U/g添加，UPO按底物质量300U/g添加，CHoX按底物质量350U/g添加，复合酶中PLB:VpPLD:UPO:CHoX的酶活比＝5:5:6:7。
(3)反应条件：将底物有机相与复合酶液的水相以1:4的体积比混合，30℃，500rpm油浴锅中旋转反应2h。
实施例3
对实施例2中得到的羟基脂肪酸母液进行GC-MS检测。
标准品的制备：将现有羟基脂肪酸标品衍生化后进GC-MS检测
标品处理方法：25mM羟基脂肪酸母液(乙腈溶解)1mL，加等量甲基叔丁基醚萃取，离心，取上层有机相，加无水硫酸钠除水。随后取400uL处理后样品于色谱瓶中，加入100uLN,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺(含三甲基氯硅烷)进行衍生化反应(此步迅速，因衍生试剂遇水分解)，反应温度70℃，衍生2h。
本实验采用的气相柱和程序如下所示：
柱子：Sh-Rxi-5sil-MS柱(30*0.25*0.25)
分流比：200:1
溶剂延迟时间：5min
升温程序：初始50℃，保留2min，随后以20℃/min升至280℃，保留7min。
实验中在设置了不加酶液以同等缓冲液取代的空白组。
图1为C-12脂肪酸标准品，出峰时间为12.5min左右；由图2可知，实施例2制备得到的反应产物在12.5min左右出现与图1类似的目标峰，证明通过四酶联用法可制备得到羟基脂肪酸；图3为不加酶的空白组，没有产物峰。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种制备羟基脂肪酸的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Cys Ser Ser Ile Glu Ser Asn Gln Pro Ser Glu Lys Ser Thr Thr
1 5 10 15
Phe His Phe Gly Tyr Gln Gln Asp Ser Val Leu Ala His Tyr Phe Glu
20 25 30
Ala Tyr Gly Glu Asp Pro Lys Thr Ile Thr Gly Phe Tyr Pro Leu Asn
35 40 45
Gln Gly His Asp Ala Leu Leu Ala Arg Thr Ser Leu Ile Glu Ser Ala
50 55 60
Arg Lys Ser Leu Asp Leu Gln Tyr Tyr Ile Tyr Arg Gly Asp Glu Thr
65 70 75 80
Ser Gln Leu Ile Thr Trp Arg Leu Tyr Glu Ala Ala Lys Arg Gly Val
85 90 95
Arg Ile Arg Leu Leu Leu Asp Asp Met Gln Lys Arg Asn Asp Asn Val
100 105 110
Met Ala Ala Leu Asn Ala His Pro Asn Ile Glu Ile Arg Leu Phe Asn
115 120 125
Pro His Gln Tyr Arg Ser Ala Arg Ile Phe Ala Leu Thr Ser Asp Phe
130 135 140
Glu Arg Leu Asn Arg Arg Met His Asn Lys Ser Leu Ile Ala Asp Ser
145 150 155 160
Val Ser Ala Ile Val Gly Gly Arg Asn Ile Gly Asn Glu Tyr Phe Ser
165 170 175
Phe Glu Ser Glu Val Glu Phe Gly Asp Phe Asp Leu Leu Leu Tyr Gly
180 185 190
Glu Ala Val Gln Gln Thr Ala Asp Gln Phe Asp Leu Tyr Trp Asn Ser
195 200 205
Val His Ala Val Pro Met Glu Trp Ile Ser Pro Glu Ser Gln Ser Val
210 215 220
Ser Asp Ala Ala Ile Gln Lys Gln Val Thr Lys Leu Asn Leu Gln Glu
225 230 235 240
Lys Phe Ser Ser Gly Arg Tyr Asp Phe Thr Ala Leu Asp Met Tyr Gln
245 250 255
Asp Leu Lys Gln Gly Lys Leu Asn Leu Tyr Trp Gly Asp Gly Gln Val
260 265 270
Trp Phe Asp Leu Pro Asp Lys Val Thr Thr His Asp Ser Gln Leu Val
275 280 285
Gly Asn Leu Thr Glu Leu Leu Lys Ser Val Glu His Ser Phe Val Leu
290 295 300
Ile Ser Pro Tyr Phe Ile Pro Thr Glu Ala Gly Thr Lys Ala Leu Thr
305 310 315 320
Asn Ala Ala Lys Arg Gly Val Asp Ile Thr Ile Val Thr Asn Ser Leu
325 330 335
Ala Ser Asn Asp Val Phe Ala Val His Gly Trp Tyr Ala Lys Tyr Arg
340 345 350
Glu Asp Leu Leu Glu Ser Gly Ile Lys Leu Trp Glu Val Lys Ser Ser
355 360 365
Ala Lys Leu Lys Ser Lys Trp Ser Leu Thr Gly Ser Ser Arg Ala Ser
370 375 380
Leu His Ala Lys Ala Met Thr Ile Asp Asp Lys Thr Leu Phe Val Gly
385 390 395 400
Ser Met Asn Trp Asp Pro Arg Ser Ala Ala Leu Asn Thr Glu Met Ala
405 410 415
Val Val Ile Glu Gln Pro Glu Tyr Val Gln Thr Phe Leu Ala Lys Leu
420 425 430
Pro Ser Gln Leu Lys Asp Asn Ala Tyr Arg Leu Thr Leu Arg Asp Gly
435 440 445
Asp Ile Val Trp Thr Asn Thr Lys Thr Gly Glu Glu Tyr Asp Ser Glu
450 455 460
Pro Glu Ala Gly Val Phe Arg Arg Leu Gly Ala Trp Phe Ser Gly Ile
465 470 475 480
Leu Pro Ile Glu Asp Gln Leu
485

Claims (3)

1.一种制备羟基脂肪酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将脱胶副产物溶解在乙腈中，超声分散，离心去除沉淀，得到有机相；
（2）将复合酶溶于缓冲液中，得到复合酶液，所述复合酶为PLB、VpPLD、UPO和CHoX；
（3）将所述有机相与所述复合酶液混合，反应至少1h，制得羟基脂肪酸；
步骤（2）所述的PLB: VpPLD: UPO: CHoX的酶活比为5:5:6:7，PLB和VpPLD按底物质量200U/g添加，UPO按底物质量300U/g添加，CHoX按底物质量350U/g 添加；
所述有机相和复合酶液的体积比为1:4；
所述VpPLD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，pH值为7.0-9.0，浓度为0.1M；
步骤（3）所述反应为油浴反应；
步骤（1）所述脱胶副产物的制备方法，包括以下步骤：
（1）毛油加热至80±20℃，加入毛油质量2±1%的磷酸，高速搅拌至产生颗粒物；
（2）持续搅拌并冷却，加水，继续搅拌，静置分层；
（3）离心，收集下层沉淀，即脱胶副产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述反应的条件为：反应温度为30-60℃，反应时间为2-8h，转速为500rpm -1000rpm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述反应的条件为：反应温度为30℃，反应时间为2h，转速为500rpm。
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