CN111088240B

CN111088240B - 一种酯酶及其编码基因和应用

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Publication number: CN111088240B
Application number: CN201911396295.8A
Authority: CN
Inventors: 周明扬; 刘健敏; 邢澍; 刘文杰; 刘晓雨; 武涛; 吴汉夔
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Shandong Yangcheng Xieying Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN111088240A

Abstract

本发明提供一种酯酶及其编码基因和应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明通过从南极土壤中筛选克隆获得编码酯酶E31‑4922的基因，通过对其表达蛋白研究发现，其对短链的酯类表现出较强的降解活性，最适pH为7.5，且在7.0‑8.0内稳定存在。最适酶活温度为80℃，且在60‑90℃范围内有保持超过80％的活力。其为热稳定酯酶，对超过60℃的高温环境表现出较高的耐受性。对丰富酯酶家族成员特别是耐高温酯酶家族成员具有重要意义。

Description

一种酯酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种酯酶及其编码基因和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

酯酶(esterases)又称为羧酸酯酶，是一种既可以催化水解酯键又可以催化合成酯键的酶类。在其水解酯键时，会使酯键断裂，产物为酸类和醇类；合成酯键时，会使酸的羧基和醇的羟基脱水缩合，产物为酯类和其他香味物质。酯酶作为一种工业用酶，在工业生产中有着重要的利用价值，可以催化酯交换、酯合成和内酯合成等多种反应，而且反应不需要辅酶、反应条件温和选择性高等优点，因此，酯酶被广泛的应用于食品行业、医药行业、洗涤行业和环保行业等多个行业。酯酶的来源非常广泛，存在于动物、植物和微生物中，尤其在微生物的真菌、细菌和酵母菌中存在居多，其中真菌中有曲霉菌、青霉菌和链孢霉菌等12属23种；细菌中有芽孢杆菌、微球菌和乳酸菌等；酵母类中红酵母和毕赤酵母等。这些产酯酶的微生物分布环境也是多种多样的，如植物油加工场，工厂废弃物等等。

目前，有关化学合成制备所需反应物存在诸多的缺点，其制备工艺比较复杂、反应条件特殊、依赖有毒物质且不环保，对资源会形成浪费，成本会增加；用酯酶法进行所需物质的生产，既方便又环保，克服了化学合成步骤中的许多缺点，对产物的生成有一定的针对性。因此，国际上对微生物酶法的运用越来越广泛，与此同时采用生物合成呈香物质的方法成为研究热点。

南极土壤的微生物为了适应极端环境而生存，具有特殊的结构、机能及遗传基因。温度等环境因素是影响微生物生存的重要因素，这使得南极土壤成为低温菌资源基地，同时也为获得性质独特，有针对性用途的工业潜力的酯酶提供了巨大的来源。分子生物学、基因组测序技术和宏基因组测序技术的快速发展，大大加快了南极土壤有潜在价值的酯酶的发现与研究，这会使得克隆酯酶基因，庞大有价值的高产基因工程菌的构建，以及后续的工业化生产奠定了坚实的基础。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种酯酶及其编码基因和应用。本发明通过从南极土壤中筛选克隆获得编码酯酶E31-4922的基因，通过对其表达蛋白研究发现，其对短链的酯类表现出较强的降解活性，最适pH为7.5，且在7.0-8.0内稳定存在。最适酶活温度为80℃，且在60-90℃范围内有保持超过80％的活力。其为热稳定酯酶，对超过60℃的高温环境表现出较高的耐受性。对丰富酯酶家族成员特别是耐高温酯酶家族成员具有重要意义。

本发明的第一个方面，提供一种酯酶E31-4922，所述酯酶E31-4922是具有如下(a1)或(a2)特征的蛋白质：

(a1)其氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列一致；

(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的突变体，该突变体具有与SEQ ID NO.1所示的蛋白序列至少90％以上的同源性及至少90％以上的酯酶活性。

其中，SEQ ID NO.1由299个氨基酸残基组成。

本发明第二个方面，提供一种编码所述酯酶E31-4922的基因。所述酯酶E31-4922的编码基因从南极土壤中筛选克隆获得。

其中，所述基因具有(b1)-(b3)中任一所述核苷酸序列：

(b1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(b2)与(b1)互补的核苷酸序列；

(b3)与(b1)或(b2)所示的核苷酸序列具有≥90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明的第三个方面，提供一种核酸构建体，其包含与一种或多种调控序列可操作地连接的上述编码基因，所述调控序列在合适的表达宿主中指导所述酯酶的产生。

本发明的第四个方面，提供一种重组表达载体，其包含上述的核酸构建体。

所述的载体为原核表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1；或动物细胞表达载体pSVK3、pMSG。

进一步优选为pET系列载体，如pET22b。

本发明的第五个方面，提供一种宿主，其由上述重组表达载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。

所述宿主，其为细菌、酵母或哺乳动物细胞；优选为细菌，进一步优选为大肠杆菌。

本发明的第六个方面，提供一种生产上述酯酶的方法，其包括：

(1)、在有助于产生酯酶的条件下培养上述宿主，其中所述宿主细胞包含SEQ IDNO.2所示核苷酸；

(2)、回收上述酯酶。

本发明的第七个方面，提供上述酯酶或上述宿主在水解制备酯类及其衍生物中的应用。

所述酯类为短链和中长链酯类，进一步优选为短链酯类，所述短链酯类具体为碳链长度为2～4个碳原子的酯类化合物。

上述应用可以在高温环境下进行。所述高温环境为不低于60℃。

本发明有益技术效果：

1、本发明所述的南极土壤来源的酯酶E31-4922能高效降解短链的pNP酯类(C2-C4)，具有通过分解转化生成短链潜在的应用价值。

2、本发明所述的南极土壤来源的酯酶E31-4922在60-90℃和pH7.0-8.0范围内有较高酶活性，且对高温有很高的耐受性，这对高温条件下的工业生产有巨大的应用潜力。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1、本发明实施例2中经过镍柱亲和层析纯化后的纯酯酶E31-4922电泳图，M、蛋白质分子量标记(marker)；

图2、本发明实施例3中酯酶E31-4922的降解底物活性分析柱状图；

图3、本发明实施例3中酯酶E31-4922的酶活温度曲线图；

其中：(A)温度对酶活性的影响曲线图；(B)温度对酶稳定性的影响曲线图；

图4、本发明实施例3中酯酶E31-4922的酶活pH曲线图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明的一个具体实施方式中，提供一种酯酶E31-4922，所述酯酶E31-4922是具有如下(a1)或(a2)特征的蛋白质：

(a1)其氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列一致；

其中，SEQ ID NO.1由299个氨基酸残基组成。

本发明的又一具体实施中，提供一种编码所述酯酶E31-4922的基因。所述酯酶E31-4922的编码基因从南极土壤中筛选克隆获得。

其中，所述基因具有(b1)-(b3)中任一所述核苷酸序列：

(b1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(b2)与(b1)互补的核苷酸序列；

本发明的又一具体实施中，提供一种核酸构建体，其包含与一种或多种调控序列可操作地连接的上述编码基因，所述调控序列在合适的表达宿主中指导所述酯酶的产生。所述编码基因与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。利用基因克隆技术，可将克隆到的编码基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备酯酶E31-4922。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等，优选采用原核表达系统E.coli。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种重组表达载体，其包含上述的核酸构建体。合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体，包括原核表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1；或动物细胞表达载体pSVK3、pMSG。

优选为pET系列载体，如pET22b。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种宿主，其由上述重组表达载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。

所述宿主，其为细菌、酵母或哺乳动物细胞；优选为细菌，进一步优选为大肠杆菌。一个优选的例子是将本发明筛选到的酯酶基因E31-4922连接到大肠杆菌表达载体pET22b上，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经诱导表达出高活性的重组酶。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种生产上述酯酶的方法，其包括：

(2)、回收上述酯酶。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述酯酶或上述宿主在水解制备酯类及其衍生物中的应用。

上述应用可以在高温环境下进行。所述高温环境为不低于60℃，例如60℃-100℃；更进一步为70-90℃，例如70℃-75℃、75-80℃、80℃-85℃、85℃-90℃或更高的温度，或者70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、99℃、99℃、100℃)。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

培养基：

LB液体培养基：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸馏水配制。

LB固体培养基：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％琼脂，蒸馏水配制。

实施例1：南极土壤来源酯酶E31-4922编码基因序列的获取及其序列分析

菌种来源：南极长城站附近区域位点E2的土壤样品宏基因组文库中大肠杆菌EPI300克隆子E31-4922。

具体步骤如下：

1.1亚克隆文库的构建

用OMEGA公司的BAC/PAC DNA提取试剂盒按照其说明提取大肠杆菌EPI300克隆子E31-4922中的大片段质粒fosmid。然后用限制性内切酶Sau3AI(购自Fermentas公司)对提取到的fosmid进行部分消化，以获取2,000-5,000bp的DNA片段，将其连接到经BamHI消化及去磷酸化处理的pUC19质粒(购自NEB公司)上。连接反应液电转E.coli Top10感受态细胞，涂布含有100μg/ml氨苄青霉素和1％(v/v)三丁酸甘油酯(购自Sigma公司)的LB固体平板，37℃倒置培养12～16h，构建成克隆子E31-4922的fosmid DNA的亚克隆文库。

1.2酯类水解酶基因序列的确定

选取固体平板上产生透明降解圈的亚克隆，提取质粒并进行测序。用NCBIORFFinder软件预测DNA序列上可能的开放阅读框架。用BLASTX在NCBI nr库中对预测的开放阅读框架进行相似性搜索，以确定克隆子E31-4922上携带的酯酶基因序列E31-4922，基因E31-4922共900bp，其中含有一个900bp的开放阅读框架，其编码南极土壤来源酯酶E31-4922，起始密码子位于1bp，终止密码子位于898bp，共编码299个氨基酸的蛋白。南极土壤来源酯酶E31-4922的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。获得的南极土壤来源酯酶E31-4922编码基因E31-4922的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

1.3南极土壤来源酯酶的序列分析

GenBank中，与南极土壤来源E31-4922最相似的序列为来源于Pseudomonasarsenicoxydans(QAY85599.1)，序列相似性为99％。同时，BLAST给出的序列与南极土壤来源酯酶E31-4922相似度在85％-99％之间，均为基于基因序列预测的基因，生化性质均尚未被研究。

实施例2：酯酶的克隆、异源表达及分离纯化

2.1利用PCR对基因序列进行扩增

(1)根据基因E31-4922序列设计两条特异性引物：

4922F:aagaaggaga tatacatatg agctacccgg ctatcggtta ctg(SEQ ID NO.3)；

4922R:tcgagtgcgg ccgcaagctt caggtgagaa cggctttccg agc(SEQ ID NO.4)；

引物由济南铂尚生物技术有限公司合成。

(2)以4922F和4922R为引物，以基因E31-4922所在的fosmid为模板，用FastPfuDNA聚合酶(购自Transgen公司)扩增目的基因片段；

PCR反应条件为：95℃预变性2min；然后95℃变性20sec，50℃退火20sec，72℃延伸1min，30个循环后；72℃延伸10min。

(3)对PCR扩增产物进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，结果表明获得一条约1,000bp的DNA片段。然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。

(4)使用无缝克隆试剂盒(购自近岸蛋白质科技有限公司)将回收的E31-4922基因片段连接到pET22b载体上。

(5)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态。

(6)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pET22b载体转至大肠杆菌DH5α感受态。

(7)转化的大肠杆菌DH5α涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养。挑选阳性克隆子，转接至LB液体培养基中培养，提取质粒。

上述LB固体培养基组分如下：

1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％琼脂，蒸馏水配制。

上述LB液体培养基组分如下：

1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸馏水配制。

2.2重组表达载体pET22b-E31-4922转化到E.coli BL21(DE3)中

(1)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌BL21感受态；

(2)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将测序正确的重组载体pET22b-E31-4922转至大肠杆菌BL21感受态；

(3)将转化的大肠杆菌BL21涂于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。

2.3基因E31-4922在南极土壤微生物中诱导表达与纯化

(1)在平板上刮取菌苔，接于100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养2～3h；

(2)按1％(v/v)接种量转接到1,000ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.1mM，继续在16℃摇床培养24h；

(3)收集经过IPTG诱导表达的LB培养液，4℃，11,000rpm离心5min，收集菌体；

(4)用含100mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)悬浮菌体；

(5)将重新悬浮的菌液进行超声破碎；

(6)将破碎后的菌液4℃，11,000rpm离心30min，收集上清液；

(7)收集上清，4℃，11,000rpm离心20min，收集上清22μm滤膜过滤。

(8)将上清液按照说明书的要求进行镍柱亲和层析；

(9)层析后收集的样品用SDS-PAGE检测纯度，证明已经获得南极酯酶E31-4922的电泳纯酶(如图1)。通过透析除去咪唑，最后置于-20℃保存备用。

实施例3:南极酯酶E31-4922的性质测定

3.1底物特异性分析

用异丙醇配制不同碳链长度的pNP酯底物C2、C4、C8、C10、C12、C14(购自Sigma公司)。

标准反应为：

20μl 10mM pNPC4底物与960μl 50mM Tris-HCl(pH 8.0)混合液于40℃预热3min后，加入20μl稀释好的酶液并于40℃反应10min，立即加100μl 20wt％SDS(十二烷基硫酸钠)终止反应，测定OD405值。以不加酶液的反应作为空白对照。标准曲线以不同浓度的pNP(购自Sigma公司)来绘制。

酶活力定义为，在一定温度下，每分钟催化pNP酯底物水解产生1μM pNP所需的酶量为一个酶活力单位(U)。结果表明，南极土壤来源的酯酶E31-4922能高效降解短链的pNP酯底物(C2～C4)，其中对C2底物的降解能力最强，比活力为4167U/mg(如图2)。

3.2最适温度及温度稳定性分析

最适反应温度的测定：以pNPC2为底物，在50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，分别检测南极酯酶E31-4922在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃下的酶活。最高酶活定义为100％，结果表明该酶的最适酶活温度为80℃，其在50～100℃保留超过70％的高活力(如图3A)。

温度稳定性分析：酶液在80℃和95℃温育，2小时内每隔15min取出相同酶量检测南极酯酶E231-4922在40℃、50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中的残余活力。0℃酶活定义为100％。

结果表明，南极酯酶E231-4922为热稳定酶，在95℃中2h仍保持80％以上酶活(如图3B)。

3.3最适pH及pH稳定性分析

最适反应pH的测定：配制pH值在4.0～10.0范围内、间隔1个或0.5个pH单位的Britton-Robinson缓冲液。测定南极酯酶E31-4922在40℃、不同pH条件下的酶活，最高酶活定义为100％。结果表明南极土壤来源的酯酶E31-4922是高温中性酯酶，其最适pH为7.5(如图4)。

结果

通过构建亚克隆文库和后期测序，确定了大肠杆菌克隆子E31-4922中fosmid上所携带的酯酶基因E31-4922的核酸序列。根据E31-4922基因序列设计特异性引物，利用PCR技术从E31-4922克隆子的fosmid DNA克隆了编码南极土壤来源的酯酶E31-4922的基因片段，构建了含南极土壤来源酯酶基因E31-4922的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞。

基因E31-4922含有一个900bp的开放阅读框架，其编码南极土壤来源酯酶E31-4922，起始密码子位于1bp，终止密码子位于898bp，共编码299个氨基酸的前体蛋白。将基因E31-4922在大肠杆菌中进行异源表达和纯化，获得成熟有活性的酯酶E31-4922。

对纯化的酯酶E31-4922进行性质测定。结果表明该酶对碳链长度在2～4个碳原子的短链酯类表现出较强的降解活性(图2)。其在60℃～90℃范围内保持很高的酶活力，且能在不低于于60℃条件下稳定存在(图3)。最适pH为7.5，且在pH 7.0～8.0范围内稳定存在(图4)。上述结果表明南极土壤来源的酯酶E31-4922是热稳定性的、新型高温中性酯酶。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁工业大学

<120> 一种酯酶及其编码基因和应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Tyr Pro Ala Ile Gly Tyr Trp Leu Tyr Asp Leu Asp Ala Ala

1 5 10 15

Leu Glu Ala Lys Leu Tyr Arg Leu His Lys Ile Val Val Pro Ile Ala

20 25 30

Glu Met Thr Val Ser Thr Trp Gln Gly Gly Pro Tyr Glu Ala Ser Ser

35 40 45

Ser Val Leu Met Leu His Gly Phe Ser Ala Asp Lys Asn Ile Trp Leu

50 55 60

Arg Phe Ala Arg His Phe Val Gly Asn Tyr Arg Val Ile Ile Pro Asp

65 70 75 80

Ile Ala Gly His Gly Glu Thr Gly Phe Lys Ala Gly Gly Gly Tyr Asp

85 90 95

Ile Pro Leu Gln Ala Lys Arg Met Ile Gln Leu Leu Asp Val Cys Gly

100 105 110

Val Asp Lys Val His Val Ile Gly Asn Ser Met Gly Gly Tyr Met Ala

115 120 125

Ala Trp Leu Ala Ala Thr Tyr Pro Glu Arg Ile Ala Ser Val Ala Leu

130 135 140

Ile Asp Pro Ala Gly Val Thr Ala Pro Glu Ala Ser Asp Leu Glu Arg

145 150 155 160

His Leu Ala Lys Gly His Asn Pro Phe Leu Ile His Ser Arg Glu Glu

165 170 175

Phe Arg Arg Phe Tyr Ala Met Thr Met Ala Glu Pro Pro Trp Val Pro

180 185 190

Asn Val Val Leu Asp Ala Val Ala Gln Arg Tyr Glu Gln Ser Arg Glu

195 200 205

Glu Leu Glu Glu Ile Phe Asn Asp Phe Arg Ala Ser Pro Pro Met Glu

210 215 220

Pro Lys Leu Pro Asp Ile Lys Cys Pro Ala Leu Leu Leu Trp Gly His

225 230 235 240

Lys Asp Arg Leu Ile Asp Val Ser Ser Val Ala Val Trp Ser Lys Gly

245 250 255

Ile Ala Asp Leu Arg Val Val Ile Trp Asp His Ser Gly His Met Pro

260 265 270

Met Val Glu Gln Pro Thr Asn Thr Ala Arg Leu Tyr Arg Glu Phe Leu

275 280 285

Gly Ser Leu Arg Ser Glu Ser Arg Ser His Leu

290 295

<210> 2

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttgagctacc cggctatcgg ttactggctg tatgacttgg acgcagccct ggaggccaag 60

ctgtatcggc tgcacaagat cgttgtgccg atcgccgaaa tgaccgtgtc gacctggcaa 120

ggcgggccct acgaagcgtc cagcagcgtg ctgatgctgc atggcttcag cgccgacaag 180

aacatctggc tacgtttcgc ccggcatttt gtcggcaact atcgcgtgat catccccgac 240

atcgccggtc atggcgaaac cggcttcaag gccgggggcg gctacgacat ccccttgcag 300

gccaaacgaa tgatccagct tctggatgtc tgcggggtcg ataaggtcca tgtaatcggc 360

aactcgatgg gcggctacat ggcggcatgg ctggcggcaa cgtatccgga gcggattgcc 420

tccgtcgcgc tgatcgatcc ggccggcgtg accgcccccg aagccagcga cctggaacga 480

cacctggcca agggacataa cccgtttctg attcattcgc gggaggaatt ccggcgcttc 540

tacgccatga ccatggccga accaccgtgg gtgccgaacg tggtgctgga cgccgttgcg 600

cagcgctatg aacagagtcg tgaggaactg gaggaaatct tcaacgattt ccgtgccagc 660

ccgccgatgg agcccaaatt gcccgacatc aaatgcccgg ccctgttgct atggggccac 720

aaggaccgct tgatcgatgt cagcagtgtg gccgtgtgga gtaaaggcat cgctgatttg 780

cgagtggtca tctgggacca cagcggccat atgccaatgg tcgaacagcc gaccaatacc 840

gcgcgcttgt accgggagtt cctcggatcg ctgcgctcgg aaagccgttc tcacctgtaa 900

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagaaggaga tatacatatg agctacccgg ctatcggtta ctg 43

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcgagtgcgg ccgcaagctt caggtgagaa cggctttccg agc 43

Claims

1.一种酯酶E31-4922在水解酯类中的应用；

所述酯类为短链酯类，所述短链酯类具体为碳链长度为2~4个碳原子的酯类化合物；所述应用在60~100℃环境下进行，所述酯酶E31-4922氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用在80℃环境下进行。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述酯酶E31-4922的基因具有（b1）或（b2）所述核苷酸序列：

（b1）SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

（b2）与（b1）所示的核苷酸序列具有≥90%一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因与一种或多种调控序列可操作地连接构建核酸构建体，所述调控序列在表达宿主中指导所述酯酶的产生。

5.一种宿主在水解酯类中的应用；

所述酯类为短链酯类，所述短链酯类具体为碳链长度为2~4个碳原子的酯类化合物；所述应用在60~100℃环境下进行，宿主由重组表达载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到，所述重组表达载体为包含权利要求4中核酸构建体的重组表达载体。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体的载体为原核表达载体、酵母表达载体或动物细胞表达载体。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述原核表达载体，包括pET系列载体，pQE系列载体；所述酵母表达载体，包括pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1；所述动物细胞表达载体，包括pSVK3、pMSG。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体的载体为pET系列载体。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体的载体为pET22b。

10.如权利要求5所述的应用，其特征在于，宿主为细菌、酵母或哺乳动物细胞。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，宿主为大肠杆菌。

12.如权利要求5所述的应用，其特征在于，生产酯酶的方法包括：

(1)、在有助于产生酯酶的条件下培养所述宿主，其中所述宿主细胞包含如SEQ IDNO.2所示核苷酸；

(2)、回收酯酶。