CN101978037A - 使用脂质酰基转移酶精炼食用油的方法 - Google Patents

使用脂质酰基转移酶精炼食用油的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及食用油(优选未加工食用油)的水脱胶方法，所述方法包括以下步骤：a)将约0.1-5％w/w水与食用油(优选未加工食用油)和脂质酰基转移酶混合，b)将混合物在约45℃至约90℃下搅动约10分钟至180分钟，和c)分离油相和胶相。优选所述脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，所述多肽是通过表达SEQ ID No.49所示的核苷酸序列或与其具有70％或更高同一性的核苷酸序列获得的；和/或通过表达在中度严谨条件下与包含SEQ ID No.49所示核苷酸序列的核酸探针杂交的核酸获得的；和/或是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，所述多肽包含SEQ ID No.68所示的氨基酸序列或与其具有70％或更高同一性的氨基酸序列。在一个实施方式中，优选将所述脂质酰基转移酶与磷脂酶C组合使用。本发明还教导了使用脂质酰基转移酶改进脱胶油的胶相的方法。

Description

使用脂质酰基转移酶精炼食用油的方法
相关申请的引用
本发明参考以下相关申请：US 2002-0009518、US 2004-0091574、WO2004/064537、WO2004/064987、WO2005/066347、WO2005/066351、2006年2月2日提交的美国申请第60/764,430号、WO2006/008508、国际专利申请号PCT/IB2007/000558和美国申请第11/671,953号。这些申请中的每一个以及各申请中所引用的每篇文献(“申请引用的文献”)，和申请引用的文献中所参考或引用的每篇文献(无论是出现在这些申请的正文中或是在审查过程中)以及在所述审查中用以支持先进专利性的论据，均通过引用并入本文。在本文的正文中还引用了多篇文献(“本文所引用文献”)。每篇本文所引用文献以及本文所引用文献中所引用或参考的每篇文献均通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及使用脂质酰基转移酶精炼食用油(优选植物油)的方法。本发明还涉及使用脂质酰基转移酶处理食用油(优选未加工食用油(crude edibleoil)，例如植物油)和/或食用油(优选植物油)胶相的方法。
背景技术
已知脂质酰基转移酶在食品应用中具有优点。已经发现脂质酰基转移酶在食物中具有显著的酰基转移酶活性。这种活性在食物的制备方法中有令人惊奇的有益应用。
例如，WO 2004/064537公开了通过使用脂质酰基转移酶来原位制备乳化剂的方法和与其相关的优点。
国际专利申请No.PCT/IB2001/000558教导了脂质酰基转移酶在(异源)宿主细胞中的表达，并且该申请通过引用并入本文。
精炼食用油的目的是为了除去影响品质(例如，口感、气味和外观)和贮存能力的不良杂质。
由于各种不同杂质，如游离脂肪酸、金属离子、有色化合物、气味、胶等的存在，通常采用一系列的化学和物理性方法进行精炼(参见，例如Bailey的Industrial Oil and Fat Products-2006 John Wiley & Sons-第六版)。
通常用于油脱胶的两种方法为物理脱胶法和化学脱胶法。
在所谓化学精炼中，通过使用大量过量NaOH的初步处理除去几乎所有的游离脂肪酸成分。还将磷脂含量降低至通常低于10ppm的磷水平。随后，将油脱色并除臭。
所谓物理精炼通常由水脱胶步骤，以及其后的酸脱胶、中和、脱色、气提以除去游离脂肪酸和除臭步骤组成。
在物理精炼期间，开发了用于代替使用酸脱胶的酶促脱胶。
酶促脱胶法的开发以胰腺磷脂酶的应用为基础。由于这种酶并不适合，最终由微生物磷脂酶A1(Lecitase UltraTM-Novozymes，Denmark)取代了磷脂酶(Oil Mill Gazetteer，VoI 111 July 2005 pp2-4)。
酶促法具有优于化学或物理脱胶法的多个优点，包括节约成本、产量高并且是更为环保的方法。
酶促油脱胶法的基础是向已经水脱胶的油中添加磷脂酶。
WO2006/008508中教导了将脂质酰基转移酶用于食用油酶促脱胶。WO2006/008508教导了向经水脱胶的油中添加脂质酰基转移酶，或向未加工油(crude oil)中添加脂质酰基转移酶而无需对油进行水脱胶过程。
通常可通过常规“水脱胶法”获得“经水脱胶的油”，其中所述“水脱胶法”包括将1-2％w/w的热软水与温(70-90℃)的未加工油混合(AOCS Introduction to the Processing of Fats and Oils-Table 8-Degumming Processes-http://www.aocs.org/meetings/education/mod3sample.pdf)。根据经验法则，向未加工油中添加的水量通常约等于未加工油中的磷脂量。通常的处理时间为30-60分钟。水脱胶步骤除去在水合时在油中变为不溶的磷脂和粘胶。可通过沉降、过滤或离心从油分离水合磷脂和胶，其中离心的应用较为普遍。上述水脱胶法的主要目的是为了从油中分离水合磷脂。如上所述，在本文中应当将热水与油的混合广义地理解为按照本领域中的标准水脱胶程序将水溶液与油混合。
在传统的水脱胶法中，大部分磷脂转移到重胶相中。在水脱胶法结束时，将胶相与油相分离。尽管可将胶相进一步加工成商品，但通常将胶相视为油精炼的副产品。具有商业重要性的是油相。然而，因为磷脂能够成为良好的乳化剂，所以一些油在水脱胶期间不可避免地损失到胶相中。这导致水脱胶后油相中的油产量下降。
随着油价的上涨，以及对作为生物柴油的植物油需求增加，优化食用油的加工以获得高油产量具有重要意义。
发明内容
本发明的各个方面体现于权利要求书和以下说明中。
现已惊奇地发现，通过在进行水脱胶方法期间或之前向未加工食用油中添加一种或多种脂质酰基转移酶，可以显著提高油相中的油产量。也就是说，可以显著减少油损失在胶相中。
此外，还令人惊奇地发现，通过在进行水脱胶方法期间或之前向未加工食用油中添加一种或多种脂质酰基转移酶，所得胶相的粘度降低很多。这可允许使用更有利的离心参数。
还令人惊奇地发现，通过在进行水脱胶方法期间或之前向未加工食用油中添加一种或多种脂质酰基转移酶，将由此方法获得的胶相温育或贮存，(由于残留的活性脂质酰基转移酶)可观察到胶相中磷脂的进一步水解。随后，本发明的发明人发现可以分离胶相中含有游离脂肪酸(酸性油)和剩余甘油三酯的油相。此酸性油可以以高于添加到膳食(meal)中的通常胶相的价格销售。此外，还令人惊奇地发现(分离酸性油后)剩余的固相具有高于通常胶的磷水平，由此可以用作有机磷源。
还令人惊奇地发现，一种或多种脂质酰基转移酶和一种或多种磷脂酶C(PLC)的组合当用于食用油(例如植物油)脱胶时产生了协同作用。
发明详述
根据本发明的第一方面，本文提供了食用油(优选未加工食用油)的水脱胶方法，所述方法包括以下步骤：a)将约0.1-5％w/w水与食用油(优选未加工食用油)和脂质酰基转移酶混合，b)将混合物在约45℃至约90℃下搅动(agitate)约10分钟至180分钟，和c)分离油相和胶相。
根据本发明的第二方面，本文提供了脂质酰基转移酶在食用油的水脱胶期间(优选在未加工食用油的水脱胶期间)用于提高在水脱胶过程完成后油相中的油产量的应用。
根据本发明的第三方面，本文提供了脂质酰基转移酶在食用油的水脱胶期间(优选在未加工食用油的水脱胶期间)用于降低在水脱胶过程完成后胶相的粘度的应用。
所述产量提高和/或粘度下降是与(用水脱胶和酶促水脱胶)而没有使用脂质酰基转移酶脱胶的相当的油(comparable oil)的油相和/或胶相进行比较。
根据本发明的第四方面，本文提供了食用油(优选未加工食用油)的水脱胶方法，所述方法包括以下步骤：a)将约0.1-5％w/w水与食用油(优选未加工食用油)和脂质酰基转移酶混合，b)将混合物在约45℃至约90℃下搅动约10分钟至180分钟，c)分离油相和胶相，d)温育包含活性脂质酰基转移酶的胶相最少约2小时至最长7天的时间(适合地长达约1-2天)，和e)(例如通过离心)从胶相分离油。
本发明还提供了用于处理胶相(优选可通过食用油的脱胶获得或通过食用油的脱胶获得，所述脱胶例如水脱胶或酶促脱胶或其组合)的方法，其中将胶相与一种或多种(活性)脂质酰基转移酶(单独的，或与一种或多种磷脂酶C组合的)一起温育最少约2小时至最长7天的时间(适合地长达约1-2天)，和(例如通过离心)从胶相分离油。
本发明还进一步提供了脂质酰基转移酶(单独，或与磷脂酶C组合)在胶相(可通过食用油脱胶获得或通过食用油脱胶获得，所述脱胶例如水脱胶或酶促脱胶或其组合)温育中用于提高油产量和/或(在分离酸性油后)产生磷水平比通常胶改进的固相的应用。
因为酸性油可以用于生产脂肪酸，所以酶的应用提高了酸性油与胶相比的价值。与添加到膳食中的胶相比，脂肪酸具有更高的价值。
所述改进和/或提高是与未经脂质酰基转移酶(单独，或与磷脂酶C组合)处理的胶相进行比较。
适合地，胶相中的一种或多种脂质酰基转移酶可具有残余的活性酶，其可在食用油的酶促脱胶后被转移到胶相。或者，胶相中的脂质酰基转移酶可以是添加的脂质酰基转移酶，该酶可以在胶相的温育开始时或进行期间添加。
值得注意地，在第四方面中所述方法(以及胶相的其他处理)结束时的油是“酸性油”。此酸性油的销售价高于添加到膳食中的通常胶相。剩余的胶相(在分离酸性油后)有时也被称作固相。还令人惊奇地发现剩余的固相(分离酸性油后)具有高于通常胶的磷水平，由此可以用作有机磷源。
适合地，可将胶相与脂质酰基转移酶(单独，或与一种或多种磷脂酶C组合)一起在约30℃至约70℃温育，优选约40℃至约60℃温育，优选约40℃至约50℃温育，优选约40℃至约45℃温育。
优选地，可将由脂质酰基转移酶对未加工油进行酶促水脱胶而获得的胶相在约30℃至约70℃温育，优选约40℃至约60℃温育，优选约40℃至约50℃温育，优选约40℃至约45℃温育。
适合地，所述脂质酰基转移酶是按照酶命名法分类而归类的酶(E.C.2.3.1.43)。
在一个实施方式中，优选将脂质酰基转移酶与磷脂酶C(E.C.3.1.4.3)组合使用。
在一个优选的实施方式中，将脂质酰基转移酶(E.C.2.3.1.43)与磷脂酶C(E.C.3.1.4.3)组合使用。
因此，根据本发明的一个方面，本文提供了食用油(优选未加工食用油)的水脱胶方法，所述方法包括以下步骤：a)将约0.1-5％w/w水与食用油(优选未加工食用油)和脂质酰基转移酶和磷脂酶C的组合混合，b)将混合物在约45℃至约90℃下搅动约10分钟至180分钟，和c)分离油相和胶相。
尽管不希望受到理论束缚，但已令人惊奇地发现脂质酰基转移酶能够使用(通过磷脂酶C的反应产生的)甘油二酯作为受体分子以产生甘油三酯。因此，将脂质酰基转移酶与磷脂酶C组合使用时，这些酶之间的相互作用导致与包含任意单独一种酶的相当的油或不含酶的相当的油相比，包含这两种酶的油中的甘油三酯的量协同的增加(synergistic increase)。有利地，将脂质酰基转移酶与磷脂酶C组合使用时，这些酶之间的相互作用导致与包含任意单独一种酶的相当的油或不含酶的相当的油相比，包含这两种酶的油中的甘油二酯的量协同的降低。将脂质酰基转移酶与磷脂酶C组合使用时，这些酶之间的相互作用导致与包含其中任意单独一种的相当的油或不含酶的相当的油相比，包含这两种酶的油中的油产量协同的增加。
因为甘油二酯对油的“发烟点”具有不利影响和/或会对较多饱和脂肪源的结晶性质产生不利影响，因此甘油二酯在油中的累积(其可在单独使用磷脂酶C时发生)会对油有害，所以使用这些酶的组合具有优于单独使用磷脂酶C的显著优点。
因此，在本发明中使用脂质酰基转移酶(特别是在与磷脂酶C组合时)的另一个优点是能够使油中甘油二酯的量比不含脂质酰基转移酶的相当的油和/或特别是单独使用磷脂酶C处理的相当的油减少。
根据本发明的另一方面，本文提供了脂质酰基转移酶与磷脂酶C的组合在食用油的水脱胶期间(优选在未加工食用油的水脱胶期间)用于提高油产量和/或提高水脱胶过程完成后油相中的甘油三酯水平和/或降低在水脱胶过程完成后油相中的甘油二酯水平的应用。
根据本发明的另一方面，本文提供了脂质酰基转移酶与磷脂酶C的组合在食用油的水脱胶期间(优选在未加工食用油的水脱胶期间)用于降低在水脱胶过程完成后胶相的粘度的应用。
这些提高和/或降低是与未经脂质酰基转移酶与磷脂酶C的组合处理的相当的脱胶食用油进行比较。
通常，本文讨论的所述提高和/或降低是与未经脂质酰基转移酶(单独，或与磷脂酶C组合)处理的相当的方法或相当的油进行比较。
根据本发明的另一方面，本文提供了食用油(优选未加工食用油)的水脱胶方法，所述方法包括以下步骤：a)将约0.1-5％w/w水与食用油(优选未加工食用油)和脂质酰基转移酶和磷脂酶C的组合混合，b)将混合物在约45℃至约90℃下搅动约10分钟至180分钟，c)分离油相和胶相，d)温育包含活性脂质酰基转移酶的胶相最少约2小时至最长7天的时间(适合地长达约1-2天)，和e)(例如通过离心)从胶相分离油。
将磷脂分解酶(优选脂质酰基转移酶)与磷脂酶C组合使用时，可在添加脂质酰基转移酶之前、同时或之后添加磷脂酶C。
在一个实施方式中，优选在脂质酰基转移酶之前添加磷脂酶C。
已令人惊奇地发现，使用脂质酰基转移酶与磷脂酶C的组合显著提高了水脱胶过程完成后油相中的油产量。
尽管不希望被理论束缚，但设想磷脂酶C将磷脂(例如磷脂酰胆碱)水解成甘油二酯(例如1，2-甘油二酯)和磷酸部分(例如磷酸胆碱)，随后脂质酰基转移酶将脂肪酸转移到由磷脂酶C产生的甘油二酯，从而形成更多的甘油三酯并提高油产量。这种作用导致油产量的协同的(即优选多于加和的)增加。
在一个实施方式中，适合地，本发明的食用油脱胶方法和/或应用可在约45-90℃之间进行，优选在约45至约70℃之间。
在另一个实施方式中，合适地，本发明的食用油脱胶方法和/或应用可在约44℃以上进行，更优选在约45℃以上进行，更优选约50℃以上进行。
在另一个实施方式中，合适地，本发明的方法和/或应用可在低于约60℃进行，优选在低于约65℃进行，优选低于约70℃进行。
在另一个实施方式中，合适地，本发明的方法和/或应用可在约45-70℃之间进行，优选在约45-68℃之间进行，更优选低于约50-65℃之间进行。
适合地，在与酶混合时，油和/或水的温度可在期望的反应温度。
可在添加酶之前和/或期间，将油和/或水加热和/或冷却到期望的温度。因此，在一个实施方式中，设想本发明的另一个步骤可以是将油和/或水冷却和/或加热。
优选用于本发明方法的水含量可以在约0.1-4％w/w之间，更优选在约0.1-3％w/w之间，更优选约0.5-3％w/w之间。
在一个实施方式中，用于本发明方法的水含量可在约1-3％w/w之间。
在一个实施方式中，用于本发明方法的水含量可以小于约3％w/w，适合地小于约2％。
在一个实施方式中，用于本方法的水含量可以小于1％。将水量减少至小于约1％能够导致水脱胶方法中的显著成本优势。因此，如果能够将水量减少至约1％，就能够产生显著的成本下降。
适合地，反应时间(即搅动混合物的时间)可以在约10分钟至约180分钟之间，优选约15分钟至约180分钟之间，更优选约15分钟至60分钟之间，更优选约15分钟至约35分钟之间。
在一个实施方式中，适合的反应时间可在约30分钟至约180分钟之间，优选在约30分钟至约60分钟之间。
在一个实施方式中，所述方法优选在约pH 4.5以上，约pH 5以上或约pH 6以上进行。
所述方法优选在约pH 4.6至约pH 10.0之间进行，更优选约pH 5.0至约pH 10.0之间，更优选约pH 6.0至约pH 10.0之间，更优选约pH 5.0至约pH 7.0之间，更优选约pH 5.0至约pH 6.5之间，甚至更优选约pH 5.5和pH6.0之间。
在一个实施方式中，所述方法可在约pH 5.3-8.3之间的pH下进行。
在一个实施方式中，所述方法可在约pH 6-6.5之间的pH下进行，优选约6.3。
适合地，在本发明的方法和/或应用中的pH可以是中性(约pH 5.0-约pH7.0)。
优选在脱胶过程期间进行酶处理，而不对油和/或水进行pH调节。因此，pH通常为约5.5-7.5。
这样获得了优于使用磷脂酶A的现有技术方法的显著优点，其中磷脂酶A通常仅在酸性pH条件，即pH 4-5具有高度活性。因此，在现有技术方法(例如使用磷脂酶A)中，必须将油的pH调整到更为酸性的条件。
此外，与使用所述磷脂酶A和磷脂酶C相比，使用脂质酰基转移酶与磷脂酶C具有显著的优势，这是因为脂质酰基转移酶的最适pH通常与磷脂酶C的最适pH更好地符合。因此，在将脂质酰基转移酶与磷脂酶C组合使用时，通常没有“pH冲突”。这与将磷脂酶A与磷脂酶C组合使用的情况截然相反。因此，由于脂质酰基转移酶与磷脂酶C能够在其最佳pH范围内同时发挥作用，这两种酶的组合应用提供了显著的改进。
可通过任意常规分离方法进行油相和胶相的分离。优选通过离心进行分离。
使用脂质酰基转移酶(单独的，或优选与磷脂酶C组合)的一个显著的优点在于，酶处理使其能够调整离心过程以控制最终油中的磷含量。尽管不希望被理论束缚，其实现的原因在于，与未经脂质酰基转移酶(单独的，或优选与磷脂酶C组合)处理的油相比，油的粘度显著下降。这是优于现有技术方法的显著进步。在常规脱胶方法中，离心通常使油中的磷水平为约50ppm。实际上，根据食用油中磷水平的规格指导说明，食用油中磷水平应低于200ppm。实际上，最好使油的磷水平尽可能地接近200ppm的水平。使用脂质酰基转移酶(单独的，或优选与磷脂酶C组合)可以获得经离心后约100-200ppm磷水平的油品，优选约170-190ppm，更优选约180ppm。在本发明之前，这样的磷水平很难通过调整离心而实现，因此这也构成了本发明显著改进方面。
适合地，可在与酶混合之前或同时，将水与食用油混合。或者可在与水混合之前，将食用油与酶混合。
在一个实施方式中，可将油、水和酶流同时或基本同时通过混合器泵入并进入存储罐中。
适合地，可在所述方法期间和/或结束时将酶灭活。
可在油相与胶相分离之前或之后将酶灭活。
适合地，可通过在75-85℃之间或在92℃以上加热10分钟，将酶热灭活。
在一个实施方式中，适合地，胶相中的酶可以不进行灭活。因此，在收集并温育胶相时，酶可进一步分解胶相中的磷脂。在将胶相延期温育后，可进行进一步的分离(例如，通过离心)以从胶相回收更多的油。这可进一步提高油的产量。
尽管不希望被理论束缚，但认为酶将胶相中的磷脂降解成游离脂肪酸，由此释放此前被磷脂乳化的三酰甘油。这降低了胶相的粘度，并且允许例如通过离心分离三酰甘油和游离脂肪酸。
在一个实施方式中，适合地，可实施本发明方法而不添加碱，例如NaOH。
在另一个实施方式中，适合地，在存在碱，例如NaOH的情况下实施本发明的方法。在添加NaOH时，优选其添加量不超过每100g油中约0.2ml(4％溶液)NaOH。
适合用于本发明方法和/或应用的酶可具有使用以下“转移酶试验(胆固醇∶磷脂)(TrU)”测定的脂质酰基转移酶活性。
转移酶活性的测定：转移酶试验(胆固醇∶磷脂)(TrU)
底物：将50mg胆固醇(Sigma C8503)和450mg大豆卵磷脂(PC)，Avanti#441601溶于氯仿，并在40℃真空蒸发氯仿。
在40℃，将300mg PC∶胆固醇(9∶1)分散在10ml 50mM HEPES缓冲液(pH 7)中。
酶解：
在40℃，将250μl底物添加到带盖玻璃器中。
添加25μl酶溶液，并在搅动下于40℃温育10分钟。
在试验中，所添加的酶应当将2-5％的胆固醇酯化。
此外，同样分析使用25μl水代替酶溶液的空白对照。
10分钟后，添加5ml己烷∶异丙醇(3∶2)。
使用胆甾醇硬脂酸酯(Sigma C3549)作为校准标准品，通过HPTLC分析胆固醇酯的量。
计算在试验条件下每分钟形成的胆固醇酯量，作为转移酶活性。
一个转移酶单位(TrU)被定义为根据上文所述的转移酶试验，在40℃，pH 7的条件下，酶分钟产生胆固醇酯的μmol数。
优选在本发明方法和应用中使用的脂质酰基转移酶具有至少25TrU/mg酶蛋白的每mg酶比转移酶单位(TrU)。
适合地，用于本发明的脂质酰基转移酶的加入量为每g油中0.05～50TrU，适合地为每g油中0.5～5TrU。
更优选地，适合用于本发明方法和/或应用的酶可具有通过以下方案限定的脂质酰基转移酶活性：
用于测定酰基转移酶活性％的方案：
在酶反应后，可使用CHCl3∶CH3OH(2∶1)提取添加了本发明脂质酰基转移酶的食用油，分离包含脂质材料的有机相，并按照下文详述的方法通过GLC和HPLC分析所述有机相。根据GLC和HPLC分析测定游离脂肪酸以及一种或多种甾醇酯/甾烷醇酯的量。以相同的方式分析没有添加本发明酶的对照食用油。
计算：
根据GLC和HPLC分析的结果，可按照下式计算游离脂肪酸和甾醇/甾烷醇酯的增加：
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸(酶)-％脂肪酸(对照)；
Mv脂肪酸＝脂肪酸的平均分子量；
A＝Δ％甾醇酯/Mv甾醇酯(其中Δ％甾醇酯＝％甾醇酯/甾烷醇酯(酶)-％甾醇酯/甾烷醇酯(对照)，且Mv甾醇酯＝甾醇酯/甾烷醇酯的平均分子量)；
计算作为总酶活性的百分比的转移酶活性：
Figure BPA00001204796900111
如果食用油中的游离脂肪酸增加，优选其没有明显增加，即没有增加到显著的程度。也就是说，游离脂肪酸的增加没有对食用油的品质产生不良影响。
用于酰基转移酶试验的食用油优选是补充了植物甾醇(1％)和磷脂酰胆碱(2％)的大豆油，并使用以下方法进行：
通过在搅动下加热至95℃，将植物甾醇和磷脂酰胆碱溶解在大豆油中。随后，将油冷却至40℃，并添加酶。添加水到油相5％的总浓度。在磁力搅拌下，将样品保持在40℃，并在4和20小时后取出样品，并通过TLC分析。
对于本试验，所使用的酶剂量优选为0.2 TIPU-K/g油，更优选0.08TIPU-K/g油，优选0.01 TIPU-K/g油。优选在0.5、1、2、4和20小时后，更优选在20小时后测定油中存在的磷脂水平和/或甾醇转化％。
当所使用的酶是脂质酰基转移酶时，优选温育时间能够确保至少5％的转移酶活性，优选至少10％的转移酶活性，优选至少15％、20％、25％、26％、28％、30％、40％、50％、60％或75％转移酶活性。
可通过上述教导的方案测定转移酶活性％(即，作为总酶活性百分数的转移酶活性)。
在本发明的某些方面，本文使用的术语“基本没有增加游离脂肪酸”表示用本发明的脂质酰基转移酶处理的食用油中游离脂肪酸的量小于用不是本发明的脂质酰基转移酶的酶处理的食用油中产生的游离脂肪酸的量，例如小于用常规磷脂酶，例如，Lecitase UltraTM(Novozymes A/S，Denmark)时产生的游离脂肪酸的量。
此外，或作为替代，也可采用下文标题为“鉴定用于本发明的脂质酰基转移酶的方法”评估(上述)油中的转移酶活性％，以鉴定最优选用于本发明方法的脂质酰基转移酶。
鉴定脂质酰基转移酶的方法
本发明的脂质酰基转移酶是产生以下结果的酶：
i)去除在补充了植物甾醇(1％)和磷脂酰胆碱(2％)的大豆油中存在的磷脂(使用以下方法进行：通过在搅动下加热至95℃，将植物甾醇和卵磷脂溶解在大豆油中。随后，将油冷却至40℃，并添加酶。在磁力搅拌下，将样品保持在40℃，并在0.5、1、2、4和20小时后取出样品，并通过TLC分析)；
和/或
ii)所添加甾醇到甾醇酯的转化(转化％)(使用上述i)中教导的方法)。可使用如实施例2中教导的用于测定甾醇和甾醇酯的GLC方法。
对于本试验，所使用的酶剂量可以是0.2 TIPU-K/g油，优选0.08TIPU-K/g油，优选0.01 TIPU-K/g油。优选在0.5、1、2、4和20小时后，更优选在20小时后测定油中存在的磷脂水平和/或甾醇的转化(转化％)。
在用于鉴定脂质酰基转移酶的方法中，在酶处理后，优选添加5％的水，并与油彻底混合。随后，使用离心将油分离成油相和水相(参见，″Enzyme-catalyzed degumming of vegetable oils″by Buchold，H.and Laurgi A.-G.，Fett Wissenschaft Technologie(1993)，95(8)，300-4，ISSN：0931-5985)，然后使用以下方法(“磷含量试验”)分析油相的磷含量：
磷含量试验
水脱胶后油中存在的磷脂水平的测定如下：首先根据AOAC Official Method 999.10中教导的样品制备方法(＞Lead，Cadmium，Zinc，Copper，and Iron in Foods Atomic Absorption Spectrophotometry after Microwave Digestion，First Action 1999 NMKL-AOAC Method)制备油样品。随后，根据AOAC Official Method Ca 20-99：Analysis of Phosphorus in oil by inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy通过分析油样品中的磷含量测定油中的磷脂量。
使用本发明后油相中存在的磷量通常与常规水脱胶(即没有酶)后油相中的磷含量没有显著区别。
与使用常规水脱胶法(即没有酶)后的油相相比，使用本发明的油相中本发明的油产量通常明显增加。适合地，与进行没有添加酶的相同水脱胶法处理的相同油相比，本发明的方法和/或应用使产量提高约0.25％～7％，例如约0.25％～3％，或约0.5～2％，或约1～2％。
令人惊奇地发现，与使用没有添加酶的相当的水脱胶方法获得的相当的油相相比，在本发明方法中添加的酶使油相中的油产量显著提高，但并不一定显著减少油相的磷含量。
适合地，根据本发明的方法或应用处理油时，油相中的磷含量可以比使用没有添加酶的相当的水脱胶法获得的油相的磷含量少0-80％，适合地少0-50％，适合地少0-10％，适合地少0-1％。
值得注意地，可将本发明方法获得的油相进一步脱胶以除去磷脂(phospholipid)和/或磷脂质(phosphatide)。例如，可对油相进行酶促脱胶和/或酸脱胶。
油中存在的甾醇的转化％为至少1％，优选至少5％，优选至少10％，优选至少20％，优选至少30％，优选至少40％，优选至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％，优选至少95％。
在一个实施方式中，油中存在的甾醇的转化％为至少5％，优选至少20％。
在某些方面，用于本发明任一方法和/或应用的脂质酰基转移酶可以包含GDSx基序和/或GANDY基序。
优选地，将所述脂质酰基转移酶表征为具有酰基转移酶活性并包含氨基酸序列基序GDSX的酶，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列或脂质酰基转移酶可以获自于，优选获自于以下一个或多个属的生物：气单孢菌属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、分支杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrionaceae)、木杆菌属(Xylella)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、李斯特菌属(Listeria)、奈瑟菌属(Neisseria)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和念珠菌属(Candida)。优选地，所述脂质酰基转移酶可以获自于，优选获自于气单孢菌属的生物。
在本发明的一些方面，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂质酰基转移酶在对应于SEQ ID No.35所示的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)脂质酰基转移酶的氨基酸序列中的N-80位置上包含天冬氨酸残基。
在本发明的一些方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是在对应于SEQ ID No.35所示的嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶的氨基酸序列中的N-80位置上包含天冬氨酸残基的脂质酰基转移酶。
此外或可选地，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列编码的脂质酰基转移酶可以包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列，或与其具有75％或更高同一性的氨基酸序列。适合地，编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂质酰基转移酶可以包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列。
此外或可选地，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列编码的脂质酰基转移酶可以包含SEQ ID No.68所示的氨基酸序列，或与其具有75％或更高同一性的氨基酸序列。适合地，编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂质酰基转移酶可以包含SEQ ID No.68所示的氨基酸序列。
在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶具有SEQ ID No.16或SEQ ID No.68所示的氨基酸序列，或者具有与其具有至少75％的同一性，优选与其具有至少80％，优选至少85％，优选至少95％，优选至少98％的同一性的氨基酸序列。
在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶由SEQ ID No.49所示的核苷酸序列编码，或者由与SEQ ID No.49具有至少75％的同一性，优选与其具有至少80％，优选至少85％，优选至少95％，优选至少98％的同一性的核苷酸序列编码。
在一个实施方式中，优选用于本发明任一方法和/或应用的脂质酰基转移酶是通过使用SEQ ID No.1所示核苷酸序列或与其具有至少75％同一性(更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少95％，更优选至少98％同一性)的核苷酸序列转化的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，培养所述地衣芽孢杆菌，并分离其中产生的脂质酰基转移酶，从而由地衣芽孢杆菌表达的脂质酰基转移酶。
本文所用的术语“食用油”可包括植物油。
优选在本发明处理前的食用油是未加工食用油，其包含约50-3000ppm的非水合磷含量，更优选在约50-1400ppm的范围，更优选在约200-1400ppm的范围，更优选在约400-1200ppm的范围。
一方面，在实施本发明方法之前，所述未加工食用油具有350ppm以上的磷含量，更优选400ppm以上，更优选500ppm以上，最优选600ppm以上。
优选地，所述食用油是植物油。
本发明方法所涵盖的油可包括，但不限于大豆油、菜籽油(canola oil)、玉米油、棉籽油、棕榈油、椰子油、米糠油、花生油、橄榄油、红花油、棕榈仁油、油菜籽油(rape seed oil)和葵花油中的一种或多种。
优选所述油是大豆油、玉米油、葵花油和油菜籽油(有时也称作菜籽油)中的一种或多种。
更优选所述油是大豆油、葵花油或油菜籽油中的一种或多种。
更优选所述油是大豆油。
本文所用的“未加工油”(本文中也称作未脱胶油)可以是压榨油或提取油或其混合物。
未加工油中的磷脂含量可在0.5-3％w/w之间变化，对应的磷含量在200-1200ppm的范围，更优选在250-1200ppm的范围。
除磷脂外，未加工油还可包含低浓度的碳水化合物、糖化合物以及Ca、Mg和Fe的金属/磷脂酸复合物。
有利的是，本发明的方法和应用能够在低水(＜5％，优选小于2％，更优选小于1％)环境中进行食用油的脱胶。因此，可在加水量少于使用常规水脱胶方法的情况下进行水脱胶。
本发明的另一个优点是在油相中产生甾醇酯。
适合地，酶的剂量可以在约0.01-10TIPU-K/g油的范围，适合地，酶的剂量可以在约0.05-1.5TIPU-K/g油的范围，更优选0.2-1TIPU-K/g油。
当所述酶是脂质酰基转移酶时，合适地，其剂量可以在约0.01TIPU-K单位/g油至5TIPU-K单位/g油的范围。在一个实施方式中，脂质酰基转移酶的剂量可在约0.1至约1TIPU-K单位/g油的范围，更优选脂质酰基转移酶的剂量在约0.1至约0.5TIPU-K单位/g油的范围，更优选脂质酰基转移酶的剂量在约0.1至约0.3TIPU-K单位/g油的范围。
当所述酶是磷脂酶时，合适地，其适合的剂量在约0.5-10TIPU-K单位/g油的范围。在一个实施方式中，磷脂酶的剂量可在约0.5-5TIPU-K单位/g油的范围，优选磷脂酶的剂量在约0.5-1.5TIPU-K单位/g油的范围。适合地，磷脂酶的剂量在约1.0-3TIPU-K单位/g油的范围。
磷脂酶活性，TIPU-K：
底物：1.75％L-植物磷脂酰胆碱95％(441601，Avanti Polar Lipids)、6.3％Triton X-100(#T9284，Sigma)和溶于50mm Hepes(pH 7.0)的5mM CaCl2。试验方法：将样品、标准品和对照稀释到10mM HEPES(pH 7.0)、0.1％ Triton X-100(#T9284，Sigma)中。使用Konelab Autoanalyzer(Thermo，Finland)进行分析。试验在30℃进行。在添加4μL样品前，将34μL底物热稳定180秒。酶解持续600秒。在酶解期间使用NEFA C kit(999-75406，WAKO，Germany)测量释放的游离脂肪酸量。添加56μL NEFA A，并将混合物温育300秒。然后，添加113μL NEFAB，并将混合物温育300秒。随后测量OD 520nm。基于标准酶制剂计算酶活性(μmol FFA/minmL)。
计算在试验条件下每分钟产生的游离脂肪酸(FFA)微摩尔数，作为酶活性TIPU-K。
在本发明中，优选此方法不是碱中和方法(即，不是酸-水脱胶法和/或不是酸-碱脱胶法)。也就是说，此方法优选不包括添加酸(例如磷酸、柠檬酸、抗坏血酸、硫酸、富马酸、马来酸、盐酸和/或乙酸)或碱(例如，KOH和NaOH)，或不包括添加大量的酸或碱。也就是说，如果在本发明的方法中添加酸和/或碱，其添加量小于0.004％。
为了便于参考，在适合的部分标题下讨论本发明的这些和其他方面。然而，在每个部分中的教导并不一定局限于每个具体的部分。
磷脂酶C
如上所述，磷脂分解酶(优选脂质酰基转移酶)可以与磷脂酶C(E.C.3.1.4.3)组合使用。
磷脂酶C可以是任何可获得的磷脂酶C，并且可选自以下磷脂酶C中的一种或多种：Purifine
Figure BPA00001204796900171
(可得自于Verenium，US)；来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的磷脂酶C(例如，可得自于Sigma，RefP7633的磷脂酶C)；来自蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的磷脂酶C(例如，可得自于Sigma，RefP6621的磷脂酶C)；WO2008/036863(并入本文作为参考)中教导的磷脂酶C。
优点
本发明的一个优点是在水脱胶过程结束时获得的油产量提高。所述油产量的增加是与未添加本发明酶的相当的水脱胶方法进行比较的。
尽管不希望被理论束缚，所述产量增加可能是由于磷脂向胶相的转移而导致乳化作用降低造成的。磷脂是良好的乳化剂，并可与三酰甘油一起乳化，因此，当磷脂被转移到胶相时，三酰甘油(油)形式的一些油也被转移。由磷脂的降解导致的胶相粘度的降低有助于防止油损失到胶相中(由于分离的是胶相，而油更容易)。
此外或可选地(不希望被理论束缚)，按照本发明使用脂质酰基转移酶时，通过将脂肪酸部分从磷脂转移到甾醇而形成甾醇酯。在油相中发现了通过脂质酰基转移酶反应而与甾醇酯化的脂肪酸部分，但在胶相中没有发现。在常规的水脱胶方法(没有添加脂质酰基转移酶)中，这些脂肪酸部分损失到胶相中。
本发明的另一个优点是，在使用脂质酰基转移酶时，无需调节水脱胶过程中的pH(约pH 5.0或5.5，或约pH 6.5或7)。此pH导致脂质酰基转移酶的高反应性。
本发明的另一个优点是，当使用脂质酰基转移酶时，来自磷脂的脂肪酸被转移到甾醇上，形成甾醇酯。这可以独立地在油相中产生0.1-0.15％的产量增加。
本发明(特别是使用脂质酰基转移酶时)的另一个优点是与没有添加本发明酶的相当的水脱胶方法相比，胶相的粘度更低。胶相粘度较低导致更易于其与油相分离，即通过离心分离。
此外，胶相可具有较少的含水量，因此，更易于干燥。
本发明的另一个优点是胶相中甘油三酯的浓度降低。
本发明的方法可在加工厂中产生较少的污垢。这意味着工厂的清洗更加容易。
尽管不希望受到理论束缚，但已令人惊奇地发现脂质酰基转移酶能够使用(通过磷脂酶C的反应产生的)甘油二酯作为受体分子以产生甘油三酯。因此，将脂质酰基转移酶与磷脂酶C组合使用时，这些酶之间的相互作用导致与包含其中任意单独一种的相当的油或不含酶的相当的油相比，包含这两种酶的油中的甘油三酯的量协同的增加。将脂质酰基转移酶与磷脂酶C组合使用时，这些酶之间的相互作用导致与包含其中任意单独一种的相当的油或不含酶的相当的油相比，包含这两种酶的油中的油产量协同的增加。
因为甘油二酯对油的“发烟点”具有不利影响和/或会对较多饱和脂肪源的结晶性质产生不利影响，甘油二酯在油中的累积(其可在单独使用磷脂酶C时发生)会对油有害，所以使用这些酶的组合具有优于单独使用磷脂酶C的显著优点。
因此，在本发明中使用脂质酰基转移酶(特别是在与磷脂酶C组合时)的另一个优点是能够使油中甘油二酯的量比不含脂质酰基转移酶的相当的油和/或特别是单独使用磷脂酶C处理的相当的油减少。
使用本发明的酶能够将方法中所需的水量减少到小于约1％。这能够在水脱胶过程中产生显著的经济优势。因此，如果能够将水量减少至约1％，就能够产生显著的成本下降。
优选在脱胶过程期间进行酶处理，而不对油和/或水进行pH调节。这产生了由于使用磷脂酶A的现有技术方法的显著优势，其中所述磷脂酶A通常仅在酸性pH条件下具有高度活性。在现有技术方法(例如使用磷脂酶A)中，必须在脱胶过程之前和/或期间调整油的pH。这对于本发明不是必须的。
此外，与使用所述磷脂酶A和磷脂酶C相比，使用脂质酰基转移酶与磷脂酶C的组合具有显著的优势，这是因为脂质酰基转移酶的最适pH通常与磷脂酶C的最适pH更好的符合。因此，在将脂质酰基转移酶与磷脂酶C组合使用时，通常没有“pH冲突”。这与将磷脂酶A与磷脂酶C组合使用的情况截然相反。因此，由于脂质酰基转移酶与磷脂酶C能够在其最佳pH范围内同时发挥作用，因此，这两种酶的组合应用提供了显著的改进。
值得注意地，在包括使用脂质酰基转移酶(单独的，或与磷脂酶C组合)处理胶相的方法中，在此方法结束时产生的“酸性油”可以以高于添加到膳食中的通常胶相的价格销售。此外，还令人惊奇地发现剩余的固相(分离酸性油后)具有高于通常胶的磷水平，由此可以用作有机磷源。
宿主细胞
所述宿主生物可以是原核或真核生物。
在本发明的一个实施方式中，本发明的脂质酰基转移酶在宿主细胞中表达，例如在细菌细胞中，例如在芽孢杆菌，例如在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)宿主细胞中表达。
可选择的宿主细胞有，例如真菌、酵母或植物。
已经发现与其它生物如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)相比，使用地衣芽孢杆菌宿主细胞可使脂质酰基转移酶的表达增加。
已经将来自于杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的脂质酰基转移酶插入到多个常规表达载体中，所述表达载体经设计分别最适宜在枯草芽孢杆菌、多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)中表达。然而，在多型汉逊酵母、粟酒裂殖酵母和塔宾曲霉中仅检测到极低的水平。这些表达水平低于1μg/ml，因此不可能选择出产生足量蛋白以起始商业生产的细胞(结果未显示)。相反，地衣芽孢杆菌能够产生对商业可行的生产具有吸引力的蛋白水平。
具体而言，已经发现地衣芽孢杆菌中的表达比在aprE启动子控制下的枯草芽孢杆菌表达高约100倍，或比在A4启动子控制下并与纤维素融合时变铅青链霉菌(S.lividans)中的表达高约100倍(结果未显示在本文中)。
除枯草芽孢杆菌外，所述宿主细胞还可以为任何芽孢杆菌细胞。优选地，所述芽孢杆菌宿主细胞可以是以下物种中的一种：地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)或嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)。
本发明涉及的术语“宿主细胞”包括具有以下特征的任何细胞：包含本文所定义的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列或本文所定义的表达载体，且用于重组制备具有如本文所定义的特异性质的脂质酰基转移酶。
适合地，所述宿主细胞可以是蛋白酶缺陷或蛋白酶阴性细胞株(protease minus strain)和/或α-淀粉酶缺陷或α-淀粉酶阴性细胞株(α-amylase minus strain)。
本文所用的术语“异源”是指源自分离的遗传资源或物种的序列。异源序列是非宿主序列、修饰的序列、来自不同宿主细胞株的序列、或来自宿主细胞的不同染色体位置的同源序列。
“同源”序列是指在相同遗传资源或物种中发现的序列，即其天然存在于宿主细胞的相关物种中。
本文所用的术语“重组脂质酰基转移酶”是指已经通过遗传重组的方式制备的脂质酰基转移酶。例如，将编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列插入克隆载体，得到以存在异源脂质酰基转移酶为特征的地衣芽孢杆菌细胞。
调控序列
在一些应用中，可通过如下获得用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶序列：将其编码序列可操作地连接到能够通过例如所选宿主细胞(如地衣芽孢杆菌细胞)提供核苷酸序列表达的调控序列。
例如，可以使用包含可操作地连接到此调控序列的本发明核苷酸序列的载体，即所述载体是表达载体。
术语“可操作地连接”是指并列放置(juxtaposition)，其中所述组件的关系允许它们能以其希望的方式发挥功能。“可操作地连接”到编码序列的调控序列的连接方式使其能在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
术语“调控序列”包括启动子和增强子以及其它表达调控信号。
所用的术语“启动子”为本领域的一般含义，如RNA聚合酶结合位点。
也可以通过选择调控区(如启动子、分泌引导子和终止子区)来实现编码具有如本文所定义的特定性质的酶的核苷酸序列的增强表达，其中所述终止子区本质上不是编码所述酶的核苷酸序列的调控区。
适合地，可以将本发明的核苷酸序列至少可操作地连接到启动子。
适合地，编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以可操作地连接编码终止子序列的核苷酸序列。用于本发明载体、宿主细胞、方法和/或应用中任一项的适合的终止子序列的实例包括：α-淀粉酶终止子序列(例如，CGGGACTTACCGAAAGAAACCATCAATGATGGTTTCTTTTTTGTTCATAAA-SEQ ID No.64)、碱性蛋白酶终止子序列(例如，CAAGACTAAAGACCGTTCGCCCGTTTTTGCAATAAGCGGGCGAATCTTACATAAAAATA-SEQ ID No.65)、谷氨酸特异性终止子序列(例如，ACGGCCGTTAGATGTGACAGCCCGTTCCAAAAGGAAGCGGGCTGTCTTCGTGTAT TATTGT-SEQ ID No.66)、果聚糖酶终止子序列(例如，TCTTTTAAAGGAAAGGCTGGAATGCCCGGCATTCCAGCCACATGATCATCGTTT-SEQ ID No.67)和枯草杆菌蛋白酶E终止子序列(如，GCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGGAGGAACCTGCTTCTTTTTACTATTATTG)。适合地，可以将编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可操作地连接到α-淀粉酶终止子，如地衣芽孢杆菌α-淀粉酶终止子。
启动子
根据本发明所用的启动子序列可以与编码脂质酰基转移酶的序列异源或同源。
所述启动子序列可以是能够指导脂质酰基转移酶在所选宿主细胞中表达的任何启动子序列。
适合地，所述启动子序列可以与芽孢杆菌(如地衣芽孢杆菌)同源。优选地，所述启动子序列与所选宿主细胞同源。
适合地，所述启动子序列可以与宿主细胞同源。“与宿主细胞同源”是指来源于宿主生物内；即，在宿主生物中自然发现的启动子序列。
适合地，所述启动子序列可以选自由编码以下启动子的核苷酸序列组成的组：α-淀粉酶启动子、蛋白酶启动子、枯草杆菌蛋白酶启动子、谷氨酸特异性蛋白酶启动子和果聚糖蔗糖酶启动子。
适合地，所述启动子序列可以是编码以下启动子的核苷酸序列：LAT(如，来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子，也称作AmyL)、AprL(如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg启动子)、EndoGluC(如，来自地衣芽孢杆菌的谷氨酸特异性启动子)、AmyQ(如，来自解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶启动子的α-淀粉酶启动子)和SacB(如，枯草芽孢杆菌的果聚糖蔗糖酶启动子)。
适合在本发明方法中指导核酸序列转录的启动子的其它实例包括：缓慢芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)的启动子、枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyE)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子、和/或苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种(Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis)CryIIIA基因的启动子。
在优选的实施方式中，所述启动子序列为α-淀粉酶启动子(如地衣芽孢杆菌α-淀粉酶启动子)。优选地，所述启动子序列包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶启动子的-35至-10序列(参见图53和图55)。
所述“-35至-10序列”描述的是相对于转录起始位点的位置。“-35”和“-10”均为框，即多个核苷酸，各包含6个核苷酸，且这些框被17个核苷酸分开。这17个核苷酸通常被称为“间隔子”。图55对此进行了说明，其中-35框和-10框被加下划线。为了避免混淆，本文所用的“-35至-10序列”是指从-35框的起点至-10框的终点的序列，即包括-35框、长度为17个核苷酸的间隔子和-10框。
信号肽
根据所用的序列和/或载体，通过由宿主细胞表达编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所产生的脂质酰基转移酶可以被分泌出或包含在细胞内。
信号序列可以用于指导编码序列分泌通过特定的细胞膜。所述信号序列对脂质酰基转移酶编码序列来说可以是天然的或外源的。例如，所述信号肽编码序列可以是从芽孢杆菌，优选从地衣芽孢杆菌获得的淀粉酶或蛋白酶基因。
可以由一种或多种以下基因获得适合的信号肽编码序列：麦芽糖α-淀粉酶基因、枯草杆菌蛋白酶基因、β-内酰胺酶基因、中性蛋白酶基因、prsA基因和/或酰基转移酶基因。
优选地，所述信号肽为地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号肽、气单孢菌酰基转移酶的信号肽(如，mkkwfvcllglialtvqa-SEQ ID No.21)、枯草芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的信号肽(如，mrskklwisllfaltliftmafsnmsaqa-SEQ ID No.22)或地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的信号肽(如，mmrkksfwfgmltafmlvftmefsdsasa-SEQ ID No.23)。适合地，所述信号肽可以为地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号肽。
然而，可以使用能够指导所表达的脂质酰基转移酶进入所选芽孢杆菌宿主细胞(优选为地衣芽孢杆菌宿主细胞)分泌途径的任何信号肽编码序列。
在本发明的一些实施方式中，可以将编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接到编码所选脂质酰基转移酶的核苷酸序列。
所选脂质酰基转移酶可以在本文所定义的宿主细胞中作为融合蛋白表达。
表达载体
术语“表达载体”是指能够在体内或体外表达的构建体。
优选地，所述表达载体被引入到生物(如地衣芽孢杆菌宿主)的基因组中。术语“引入”优选涵盖稳定的引入到基因组中。
如本文所定义的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以存在于载体中，在该载体中所述核苷酸序列可操作地连接到调控序列，使得所述调控序列能够通过适合的宿主生物(如地衣芽孢杆菌)表达所述核苷酸序列，即所述载体是表达载体。
本发明的载体可以被转化到上述的适合宿主细胞中，以表达具有如本文所定义的脂质酰基转移酶活性的多肽。
通常根据其将被引入的宿主细胞来选择载体(如质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体、基因组插入物)。本发明可以涵盖发挥等同功能且本领域已知或可知的其它形式的表达载体。
一旦转化到所选择的宿主细胞中，载体可以不依赖宿主细胞的基因组而复制并发挥功能，或可以自行整合进入基因组。
所述载体可以包含一个或多个选择性标记基因，如提供抗生素抗性的基因，如提供氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四环素抗性的基因。或者，也可以通过共转化完成选择(如WO91/17243中所述)。
载体可以在体外使用，例如，用于制备RNA或用于转染或转化宿主细胞。
所述载体可以进一步包含能使该载体在所述宿主细胞中复制的核苷酸序列。所述序列的实例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
脂质酰基转移酶
用于本发明任一方法和/或应用的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可编码天然脂质酰基转移酶或脂质酰基转移酶变体。
用于本发明任一方法和/或应用的脂质酰基转移酶可以是天然脂质酰基转移酶或脂质酰基转移酶变体。
例如，用于本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是WO2004/064537、WO2004/064987、WO2005/066347或WO2006/008508中所述的一种。这些文献通过引用并入本文。
本文所用的术语“脂质酰基转移酶”优选地是指具有酰基转移酶活性的酶(通常被归类为E.C.2.3.1.x，如2.3.1.43)，其中所述酶能够将酰基基团从脂质转移到一个或多个受体底物，例如以下的一种或多种：甾醇；甾烷醇(stanol)；碳水化合物；蛋白；蛋白亚基；糖醇，如抗坏血酸和/或甘油，优选甘油和/或甾醇，如胆固醇。
优选地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是能够将酰基基团从磷脂(如本文所定义)转移到糖醇(如抗坏血酸和/或甘油和/或甾醇，优选甘油或甾醇，最优选甾醇(例如胆固醇))的脂质酰基转移酶。
在一些方面，本发明的“酰基受体”可以是包含羟基基团(-OH)的任何化合物，例如多元醇，包括甘油；甾醇；甾烷醇；碳水化合物；羟酸，包括果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸和抗坏血酸；蛋白或其亚基，如氨基酸、蛋白水解产物和肽(部分水解的蛋白)；和其混合物和衍生物。优选地，根据本发明的“酰基受体”不是水。
优选地，所述酰基受体不为甘油单酯。
在一个实施方式中，所述酰基受体可以是甘油二酯。
一方面，优选用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶能够将酰基基团从脂质转移到甾醇和/或甾烷醇。
另一方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶能够将酰基基团从脂质转移到甾醇和/或甾烷醇，此外还能够将酰基基团从脂质转移到以下的一种或多种物质：碳水化合物、蛋白、蛋白亚基、甘油、脂肪醇。
适合地，所述酰基受体可以天然存在于油中。或者，可向油中添加所述酰基受体(例如，所述酰基受体对于油而言是外源的)。例如，在一些实施方式中，在脱胶过程之前或期间向油中添加甾醇和/或甾烷醇。如果酰基受体的量限制酰基转移酶反应的速率，这一点特别重要。与没有添加额外酰基受体的油相比，添加酰基受体可导致游离脂肪酸减少和/或形成更多的酰基受体酯。
优选地，脂质酰基作用的脂质底物是以下脂质中的一种或多种：磷脂，如卵磷脂，如磷脂酰胆碱和/或磷脂酰乙醇胺。
所述脂底物在本文中可以被称为“脂质酰基供体”。本文所用的术语卵磷脂涵盖磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。
用于本发明的优选脂质酰基转移酶是鉴定为具有高活性，例如在油环境中对磷脂具有高磷脂水解活性或高磷脂转移酶活性的那些，用于本发明的最优选的脂质酰基转移酶具有磷脂到甾醇的高转移酶活性。
如上所述，可通过与pFam00657共有序列(SEQ ID No.1)比对，和/或与GDSx酰基转移酶例如SEQ ID No.28比对，鉴定GDSx、GANDY和HPT区的存在，从而鉴定适合用于本发明方法的其他酰基转移酶。为了评估其用于脱胶的适宜性，即鉴定这些酶是否具有占总酶活性至少5％的转移酶活性，更优选至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少98％的转移酶活性，使用上文详述的“用于测定酰基转移酶活性％的方法”试验测试此类酰基转移酶。
在一些方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶优选为不能或基本不能作用于甘油三酯和/或1-甘油单酯和/或2-甘油单酯的脂质酰基转移酶。
在一些方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶优选为不表现出三酰甘油(triacylglycerol)脂肪酶活性(E.C.3.1.1.3)或不表现出显著的三酰甘油脂肪酶活性(E.C.3.1.1.3)的脂质酰基转移酶。
水解甘油三酯的能力(E.C.3.1.1.3活性)可以根据Food Chemical Codex(3rd Ed.，1981，pp 492-493)(其中修改为以葵花油，pH 5.5替代橄榄油，pH 6.5)测定的脂肪酶活性来测定。脂肪酶活性以LUS(葵花油的脂肪酶单位)来计量，其中将1LUS定义为在以上试验条件下每分钟可以从葵花油中释放1μmol脂肪酸的酶量。或者，也可以使用如WO9845453中定义的LUT试验。此文献通过引用并入本文。
用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以为基本上不能作用于甘油三酯的脂质酰基转移酶，所述脂质酰基转移酶的LUS/mg可以小于1000，如小于500、如小于300，优选为小于200、更优选为小于100、更优选为小于50、更优选为小于20、更优选为小于10，如小于5、小于2、更优选为小于1LUS/mg。或者，LUT/mg活性小于500，如小于300，优选为小于200、更优选为小于100、更优选为小于50、更优选为小于20、更优选为小于10，如小于5、小于2、更优选为小于1LUT/mg。
用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是基本上不能作用于甘油单酯的脂质酰基转移酶。所述脂质酰基转移酶可以在LUS试验中使用单油酸酯(M7765 1-油酰-rac-甘油99％)以替代葵花油来测定。将1MGHU定义为在所述试验条件下每分钟可以从甘油单酯中释放1μmol脂肪酸的酶量。
用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是优选基本上不能作用于甘油三酯的脂质酰基转移酶，所述脂质酰基转移酶具有的MGHU/mg可以小于5000，如小于1000、如小于500、如小于300，优选为小于200、更优选为小于100、更优选为小于50、更优选为小于20、更优选为小于10，如小于5、小于2，更优选为小于1MGHU/mg。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是可以表现出一种或多种以下磷脂酶活性的脂质酰基转移酶：磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)和/或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。所述脂质酰基转移酶也可以具有磷脂酶B活性(E.C.3.1.1.5)。
适合地，在一些方面，所述脂质酰基转移酶可以能够将酰基基团从磷脂转移到甾醇和/或甾烷醇，优选为胆固醇。
在一些方面，优选用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶编码能够将酰基基团从磷脂转移到甾醇和/或甾烷醇以至少形成甾醇酯和/或甾烷醇酯的脂质酰基转移酶。
因此，在一个实施方式中，本发明的“酰基受体”可以为植物甾醇和/或甾烷醇。
优选地，所述脂质酰基转移酶可以使用以下标准进行表征：
所述酶具有可以被定义为酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将
脂质酰基供体的原始酯键的酰基部分转移到酰基受体以形成新的酯；和
所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中
的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
优选地，GDSX基序的X为L或Y。更优选地，GDSX基序的X为L。因此，优选本发明的酶包含氨基酸序列基序GDSL。
GDSX基序由四个保守的氨基酸构成。优选地，该基序中的丝氨酸为所述脂质酰基转移酶的催化丝氨酸。适合地，GDSX基序的丝氨酸的位置对应于Brumlik和Buckley(Journal of Bacteriology Apr.1996，Vol.178，No.7，p2060-2064)中教导的嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶的Ser-16。
为了测定蛋白是否具有本发明的GDSX基序，优选使用WO2004/064537或WO2004/064987(均通过引用并入本文)中公开的方法，将序列与pfam数据库的隐马尔可夫模型谱(hidden markov model profile)(HMM谱)进行比较。
优选地，所述脂质酰基转移酶可以使用Pfam00657共有序列进行比对(有关完整的解释可参见WO2004/064537或WO2004/064987)。
优选地，与pfam00657结构域家族的隐马尔可夫模型谱(HMM谱)的阳性匹配表示存在本发明的GDSL或GDSX结构域。
优选地，当与Pfam00657共有序列进行比对时，用于本发明方法和/或应用的脂质酰基转移酶可以具有至少一个，优选为多于一个、更优选为多于两个的下述区(block)：GDSx区、GANDY区、HPT区。适合地，所述脂质酰基转移酶可以具有GDSx区和GANDY区。或者，所述酶可以具有GDSx区和HPT区。优选地，所述酶至少包含GDSx区。更多细节请参见WO2004/064537或WO2004/064987。
优选地，GANDY基序的残基选自GANDY、GGNDA、GGNDL，最优选为GANDY。
优选地，当与Pfam00657共有序列进行比对时，与嗜水气单胞菌多肽参考序列即SEQ ID No.1相比，用于本发明方法和/或应用的酶具有以下氨基酸残基中的至少一个，优选多于两个，优选多于三个，优选多于四个，优选多于五个，优选多于六个，优选多于七个，优选多于八个，优选多于九个，优选多于十个，优选多于十一个，优选多于十二个，优选多于十三个，优选多于十四个：28hid、29hid、30hid、31hid、32gly、33Asp、34Ser、35hid、130hid、131Gly、132Hid、133Asn、134Asp、135hid、309His。
pfam00657 GDSX结构域是区分有此结构域的蛋白和其它酶的独特标志。
图3中显示了pfam00657共有序列(SEQ ID No.2)。其源自于对第6版数据库pfam家族00657(在本文中也可以称为pfam00657.6)的鉴定。
所述共有序列可以通过使用较新版pfam数据库来升级(如参见WO2004/064537或WO2004/064987)。
在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是可以使用以下标准进行表征的脂质酰基转移酶：
(i)所述酶具有可以被定义为酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将脂质酰基供体的原始酯键的酰基部分转移到酰基受体以形成新的酯；
(ii)所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S；
(iii)所述酶包含His-309或在对应于图2和4(SEQ ID No.1或SEQ IDNo.3)中所示的嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中His-309的位置上包含组氨酸残基。
优选地，所述GDSX基序的氨基酸残基为L。
在SEQ ID No.3或SEQ ID No.1中，起始的18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(即包含信号序列的蛋白)中的His-309等同于蛋白的成熟部分(即不含信号序列的序列)中的His-291。
在一个实施方式中，用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶为包含以下催化三联体的脂质酰基转移酶：Ser-34、Asp-306和His-309，或在分别对应于图4(SEQ ID No.3)或图2(SEQ ID No.1)中所示嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中Ser-34、Asp-306和His-309的位置上包含丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。如上所述，在SEQ ID No.3或SEQ ID No.1所示的序列中，起始的18个氨基酸残基形成信号序列。长序列(即包含信号序列的蛋白)中的Ser-34、Asp-306和His-309等同于蛋白的成熟部分(即不含信号序列的序列)中的Ser-16、Asp-288和His-291。在图3(SEQ ID No.2)所示的pfam00657共有序列中，活性位点残基相应于Ser-7、Asp-345和His-348。
在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是可以使用以下标准进行表征的脂质酰基转移酶：
所述酶具有可以被定义为酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将第一脂质酰基供体的原始酯键的酰基部分转移到酰基受体以形成新的酯；和
所述酶至少包含Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-134和His-309，或在分别对应于SEQ ID No.3或SEQ ID No.1所示的嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-306和His-309的位置上包含甘氨酸残基、天冬氨酸残基、丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以由以下核苷酸序列中之一编码：
(a)SEQ ID No.36所示的核苷酸序列(参见图29)；
(b)SEQ ID No.38所示的核苷酸序列(参见图31)；
(c)SEQ ID No.39所示的核苷酸序列(参见图32)；
(d)SEQ ID No.42所示的核苷酸序列(参见图35)；
(e)SEQ ID No.44所示的核苷酸序列(参见图37)；
(f)sEQ ID No.46所示的核苷酸序列(参见图39)；
(g)SEQ ID No.48所示的核苷酸序列(参见图41)；
(h)SEQ ID No.49所示的核苷酸序列(参见图57)；
(i)SEQ ID No.50所示的核苷酸序列(参见图58)；
(j)SEQ ID No.51所示的核苷酸序列(参见图59)；
(k)SEQ ID No.52所示的核苷酸序列(参见图60)；
(1)SEQ ID No.53所示的核苷酸序列(参见图61)；
(m)SEQ ID No.54所示的核苷酸序列(参见图62)；
(n)SEQ ID No.55所示的核苷酸序列(参见图63)；
(o)SEQ ID No.56所示的核苷酸序列(参见图64)；
(p)SEQ ID N0.57所示的核苷酸序列(参见图65)；
(q)SEQ ID No.58所示的核苷酸序列(参见图66)；
(r)SEQ ID No.59所示的核苷酸序列(参见图67)；
(s)SEQ ID No.60所示的核苷酸序列(参见图68)；
(t)SEQ ID No.61所示的核苷酸序列(参见图69)；
(u)SEQ ID No.62所示的核苷酸序列(参见图70)；
(v)SEQ ID No.63所示的核苷酸序列(参见图71)；或
(w)与SEQ ID No.36、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQID No.44、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ IDNo.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62或sEQ ID No.63中所示的任一序列具有70％或更高，优选为75％或更高同一性的核苷酸序列。
适合地，所述核苷酸序列可以与SEQ ID No.36、SEQ ID No.38、SEO IDNo.39、SEQ ID No.42、SEQ ID No.44、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ IDNo.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62或SEQ ID No.63中所示的任一序列具有80％或更高，优选为85％或更高，更优选为90％或更高，更优选为95％或更高同一性。
在一个实施方式中，编码用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶的核苷酸序列为与SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.62和SEQ ID No.63中所示的任一序列具有70％或更高，优选为75％或更高同一性的核苷酸序列。适合地，所述核苷酸序列可以与SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.62和SEQ ID No.63中所示的任一序列具有80％或更高，优选为85％或更高，更优选为90％或更高，更优选为95％或更高同一性。
在一个实施方式中，编码用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶的核苷酸序列为与SEQ ID No.49中所示的序列具有70％或更高，75％或更高，80％或更高，优选为85％或更高，更优选为90％或更高，更优选为95％或更高同一性的核苷酸序列。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以为包含一个或多个以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶：
(i)SEQ ID No.68所示的氨基酸序列
(ii)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列
(iii)SEQ ID No.4所示的氨基酸序列
(iv)SEQ ID No.5所示的氨基酸序列
(v)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列
(vi)SEQ ID No.7所示的氨基酸序列
(vii)SEQ ID No.8所示的氨基酸序列
(viii)SEQ ID No.9所示的氨基酸序列
(ix)SEQ ID No.10所示的氨基酸序列
(x)SEQ ID No.11所示的氨基酸序列
(xi)SEQ ID No.12所示的氨基酸序列
(xii)SEQ ID No.13所示的氨基酸序列
(xiii)SEQ ID No.14所示的氨基酸序列
(xiv)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列
(xv)SEQ ID No.15所示的氨基酸序列
(xvi)SEQ ID No.16所示的氨基酸序列
(xvii)SEQ ID No.17所示的氨基酸序列
(xix)SEQ ID No.18所示的氨基酸序列
(x)SEQ ID No.34所示的氨基酸序列
(xx)SEQ ID No.35所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID No.68、SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14或SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.34或SEQ ID No.35中所示的任一序列具有75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高同一性的氨基酸序列。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.68或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ ID No.1或SEQ ID No.15或SEQ ID No.16或SEQ ID No.34或SEQ ID No.35所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID No.68所示的氨基酸序列，或与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，或与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，或与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID No.15所示的氨基酸序列，或与SEQ ID No.16所示的氨基酸序列，或与SEQ ID No.34所示的氨基酸序列，或与SEQ ID No.35所示的氨基酸序列具有75％或更高，优选为80％或更高，优选为85％或更高，优选为90％或更高，优选为95％或更高同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含与SEQ ID No.68、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SFQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.34或SEQ ID No.35中所示的任一序列具有80％或更高，优选为85％或更高，更优选为90％或更高，更优选为95％或更高的同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含一个或多个以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶：
(a)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基1-100所示的氨基酸序列；
(b)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基101-200所示的氨基酸序列；
(c)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基201-300所示的氨基酸序列；或
(d)与以上(a)至(c)中所定义的氨基酸序列中任一序列具有75％或更高，优选为85％或更高，更优选为90％或更高，更优选为95％或更高的同一性的氨基酸序列。
适合地，用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以包含一个或多个以下氨基酸序列：
(a)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基28-39所示的氨基酸序列；
(b)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基77-88所示的氨基酸序列；
(c)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基126-136所示的氨基酸序列；
(d)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基163-175所示的氨基酸序列；
(e)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基304-311所示的氨基酸序列；或
(f)与以上(a)至(e)中所定义的氨基酸序列中任一序列具有75％或更高，优选为85％或更高，更优选为90％或更高，更优选为95％或更高的同一性的氨基酸序列。
一方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是如EP 1 275 711中教导的来自于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的脂质酰基转移酶的脂质酰基转移酶。因此，一方面，用于本发明方法和应用中的脂质酰基转移酶可以为包含SEQ ID No.17或SEQ ID No.18所教导的氨基酸序列之一的脂质酰基转移酶。
优选地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是可以为包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，或者包含与SEQID No.16具有75％或更高，优选为85％或更高，更优选为90％或更高，更优选为95％或更高，更优选为98％或更高、或更优选为99％或更高的同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶的脂质酰基转移酶。该酶可以认为是酶变体。
一方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是可以为卵磷脂∶胆固醇酰基转移酶(LCAT)或其变体(如由分子进化产生的变体)的脂质酰基转移酶。
适合的LCAT为本领域已知的，且可以获自于一种或多种如下的生物，如：哺乳动物、大鼠、小鼠、鸡、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、植物(包括拟南芥(Arabidopsis)和水稻(Oryza sativa))、线虫、真菌和酵母。
在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是这样的脂质酰基转移酶，其可以是可获自于，优选获自于含有pPet12aAhydro和pPet12aASalmo的大肠杆菌株TOP 10的脂质酰基转移酶，其中所述大肠杆菌株TOP 10由丹麦哥本哈根K，DK-1001，Langebrogade 1的丹尼斯科公司(Danisco A/S of Langebrogade 1，DK-1001 Copenhagen K，Denmark)根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约保藏在英国苏格兰阿伯丁圣马恰尔街23号英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心(National Collection of Industrial，Marine and Food Bacteria(NCIMB)23 St.Machar Street，Aberdeen Scotland，GB)，保藏日为2003年12月22日，保藏号分别为NCIMB 41204和NCIMB 41205。
用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是磷脂甘油酰基转移酶。磷脂甘油酰基转移酶包括分离自气单孢菌，优选为嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌，最优选为杀鲑气单胞菌或其变体的磷脂甘油酰基转移酶。
用于本发明的最优选脂质酰基转移酶由SEQ ID No.1、3、4、15、16、34和35编码。本领域技术人员可以理解，优选酰基转移酶的信号肽在转移酶的表达过程中已被切割掉。SEQ ID No.1、3、4、15和16的信号肽为氨基酸1-18。因此，最优选的区域为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3(嗜水气单胞菌)中的氨基酸19-335，和SEQ ID No.4、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16(杀鲑气单胞菌)中的氨基酸19-336。当用于测定氨基酸序列同一性的同源性时，优选使用成熟序列进行本文所述的比对。
在一个实施方式中，适合用于本发明的脂质酰基转移酶包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列(或由SEQ ID No.16所示的氨基酸序列组成)，或包含与SEQ ID No.16具有至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的氨基酸序列(或由与SEQ ID No.16具有至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的氨基酸序列组成)。
在一个实施方式中，适合用于本发明的脂质酰基转移酶由编码SEQ ID No.68所示氨基酸序列(或由SEQ ID No.68所示氨基酸序列组成)的氨基酸序列的核苷酸序列编码，或包含与SEQ ID No.68具有至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的氨基酸序列或由与SEQID No.68具有至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的氨基酸序列组成。
因此，确定同源性(同一性)的最优选区域为SEQ ID No.1和3(嗜水气单胞菌)中的氨基酸19-335，和SEQ ID No.4、15和16(杀鲑气单胞菌)中的氨基酸19-336。SEQ ID No.34和35是来分别来自嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶的成熟蛋白序列，其可以经历或可以未经历翻译后修饰。
用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是还可分离自喜热裂孢菌(Thermobifida)，优选为褐色喜热裂孢菌(T.fusca)，最优选由SEQ ID No.28编码的脂质酰基转移酶。
适合本发明应用和/或本发明方法的脂质酰基转移酶可以包含以下任一氨基酸序列和/或由以下核苷酸序列编码：
a)核酸，其编码表现出脂质酰基转移酶活性和与SEQ ID No.16所示的多肽序列或与SEQ ID No.68所示的多肽序列具有至少70％同一性(优选至少80％同一性，更优选至少90％同一性)的多肽；
b)(分离的)多肽，其包含SEQ ID No.16或SEQ ID No.68所示的氨基酸序列(或由SEQ ID No.16或SEQ ID No.68所示的氨基酸序列组成)，或包含与SEQ ID No.16或SEQ ID No.68具有至少70％同一性(优选至少80％同一性，更优选至少90％同一性)的氨基酸序列(或由与SEQ ID No.16或SEQ ID No.68具有至少70％同一性(优选至少80％同一性，更优选至少90％同一性)的氨基酸序列组成)；
c)编码脂质酰基转移酶的核酸，所述核酸包含SEQ ID No.49所示的核苷酸序列(或由SEQ ID No.49所示的核苷酸序列组成)，或包含与SEQ ID No.49所示的核苷酸序列具有至少70％同一性(优选至少80％同一性，更优选至少90％同一性)的核苷酸序列(或由与SEQ ID No.49所示的核苷酸序列具有至少70％同一性(优选至少80％同一性，更优选至少90％同一性)的核苷酸序列组成)；
d)核酸，所示核酸在中等或高严谨条件下与包含SEQ ID No.49所示核苷酸序列的核酸探针杂交，且编码表现出脂质酰基转移酶活性的多肽；
e)核酸，其是a)、c)或d)所指核酸序列的片段；或
f)多肽，其是b)所指多肽的片段。
用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是还可分离自链霉菌属，优选为阿维链霉菌(S.avermitis)，最优选由SEQ ID No.32编码的脂质酰基转移酶。用于本发明的来自链霉菌的其它可能的酶包括由SEQ ID No.5、6、9、10、11、12、13、14、31和33编码的那些酶。
用于本发明的酶也可以分离自棒状杆菌属(Corynebacterium)，优选为C.efficiens，最优选由SEQ ID No.29编码。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.37、38、40、41、43、45或47所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，或可以由SEQ ID No.36、39、42、44、46或48所示的任一核苷酸序列所编码，或由与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列所编码。
在一个实施方式中，编码用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶的核苷酸序列选自由以下组成的组：
a)包含SEQ ID No.36所示的核苷酸序列的核酸；
b)由于遗传密码简并性而与SEQ ID No.36的核苷酸序列相关的核酸；和
c)包含与SEQ ID No.36所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是包含SEQ ID No.37所示的氨基酸序列或与其具有至少60％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在另一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.37、38、40、41、43、45或47所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，或由SEQ ID No.39、42、44、46或48所示的任一核苷酸序列所编码，或由与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列所编码。
在另一实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.38、40、41、45或47所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，以用于本发明所述的应用。
在另一实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.38、40或47所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列脂质酰基转移酶，以用于本发明所述的应用。
更优选地，在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.47所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在另一实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.43或44所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在另一实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ ID No.41所示的氨基酸序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以由选自以下组成的组的核酸编码：
a)包含SEQ ID No.36所示核苷酸序列的核酸；
b)由于遗传密码简并性而与SEQ ID No.36的核苷酸序列相关的核酸；和
c)包含与SEQ ID No.36所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
在一个实施方式中，根据本发明的脂质酰基转移酶可以是可获自于，优选获自于链霉菌株L130或L131的脂质酰基转移酶，所述链霉菌株L130或L131由丹麦哥本哈根K，DK-1001，Langebrogade 1的丹尼斯科公司(Danisco A/S of Langebrogade 1，DK-1001 Copenhagen K，Denmark)根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约保藏在英国苏格兰阿伯丁圣马恰尔街23号英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心(National Collection of Industrial，Marine and Food Bacteria(NCIMB)23 St.Machar Street，Aberdeen Scotland，GB)，保藏日为2004年6月25日，保藏号分别为NCIMB 41226和NCIMB 41227。
适合地，编码用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是编码脂质酰基转移酶(SEQ ID No.16或SEQ ID No.68)的多核苷酸；或可以编码脂质酰基转移酶(SEQ ID No.16或SEQ ID No.68)的氨基酸序列。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是可使用Align X(使用默认设置的VectorNTI的Clustal W成对比对算法)通过与L131(SEQ ID No.37)序列的比对而鉴定的氨基酸序列。
L131与来自灰色链霉菌(S.avermitilis)和褐色喜热裂孢菌的同源物的比对说明了GDSx基序(L131以及灰色链霉菌和褐色喜热裂孢菌中为GDSY)、GANDY框(其为GGNDA或GGNDL)和HPT区(被认为是保守的催化组氨酸)的保守性。这三个保守区突出标记在图42中。
与pfam Pfam00657共有序列(如WO04/064987中所述)和/或本文公开的L131序列(SEQ ID No.37)比对时，可以鉴定出三个保守区，GDSx区、GANDY区和HTP区(更多细节请参见WO04/064987)。
与pfam Pfam00657共有序列(如WO04/064987中所述)和/或本文公开的L131序列(SEQ ID No.37)比对时，
i)用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是具有GDSx基序，更优选为选自GDSL或GDSY基序的GDSx基序的脂质酰基转移酶；
和/或
ii)用于本发明任一方法和应用中的编码脂质酰基转移酶可以是具有GANDY区，更优选包含氨基GGNDx(更优选为GGNDA或GGNDL)的GANDY区的脂质酰基转移酶；
和/或
iii)用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是优选具有HTP区的脂质酰基转移酶；
和优选地，
iv)用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是优选具有GDSx或GDSY基序，和包含氨基GGNDx(优选为GGNDA或GGNDL)的GANDY区，和HTP区(保守的组氨酸)的脂质酰基转移酶。
在一个实施方式中，本发明的酶优选不是磷脂酶，如被归类为E.C.3.1.1.32的磷脂酶A1或被归类为E.C.3.1.1.4的磷脂酶A2。
脂质酰基转移酶变体
在优选的实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂质酰基转移酶可以是脂质酰基转移酶变体。
可以使用对磷脂的活性增加的变体，如对磷脂的水解活性增加和/或转移酶活性增加的变体，优选为对磷脂的转移酶活性增加的变体。
优选地，通过如上定义的脂质酰基转移酶的一个或多个氨基酸修饰来制备所述脂质酰基转移酶变体。
适合地，当用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以为脂质酰基转移酶变体的脂质酰基转移酶，在此情况中，所述酶的特征为所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一种或多种，且其中所述酶变体相对于亲本序列在第2组、第4组、第6组或第7组(如WO2005/066347和下文所定义)限定的一个或多个氨基酸残基处包含任意一个或多个氨基酸修饰。
例如，脂质酰基转移酶变体可以被表征为所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S，且其中酶变体相对于亲本序列在第2组、第4组、第6组或第7组(如WO2005/066347和下文所定义)限定的一个或多个氨基酸残基处包含任意一个或多个氨基酸修饰，其中所述组是通过所述亲本序列与本文定义的P10480结构模型的结构比对而鉴定出来的，其优选是通过P10480晶体结构等同物(crystal structure coordinates)与如WO2005/066347和下文所定义的1IVN.PDB和/或1DEO.PDB的结构比对而获得的。
在另一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是脂质酰基转移酶变体，其可以被表征为所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S，且其中酶变体相对于亲本序列在第2组所教导的一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸修饰，所述第2组是在将所述亲本序列与pfam共有序列(SEQ ID No.2-图3)比对时被鉴定出来的，并根据P10480的结构模型进行修饰以确保如WO2005/066347和下文所定义的最佳匹配重叠(best fit overlap)。
适合地，用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是包含以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶变体，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No.68、SEQ ID No.16、SEQ ID No.34、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33或SEQ ID No.35所示，但在如WO2005/066347和下文所定义的第2组、第4组、第6组或第7组限定的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰，所述组是通过与SEQ ID No.34的序列比对而鉴定出来的。
或者，所述脂质酰基转移酶可以是包含以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶变体，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No.34、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.16、SEQ ID No.68、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33或SEQ ID No.35所示，但在如WO2005/066347和下文所定义的第2组、第4组、第6组或第7组限定的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰，所述组是通过所述亲本序列与本文定义的P10480的结构模型的结构比对而鉴定出来的，其优选是通过P10480晶体结构等同物与如WO2005/066347和下文所教导的1IVN.PDB和/或1DEO.PDB的结构比对而获得的。
或者，所述脂质酰基转移酶可以是包含以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶变体，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No.34、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.16、SEQ ID No.68或SEQ ID No.35所示，但在第2组所教导的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰，所述第2组是在将所述亲本序列与pfam共有序列(SEQ ID No.2)比对时被鉴定出来的，并根据P10480的结构模型进行修饰以确保如WO2005/066347和下文所教导的最佳匹配重叠。
优选地，所述亲本酶是包含SEQ ID No.34和/或SEQ ID No.15和/或SEQ ID No.35所示氨基酸序列或与它们同源的酶。
优选地，所述脂质酰基转移酶可以是包含以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶变体，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No.34或SEQ ID No.35所示，但在如WO2005/066347和下文所定义的第2组、第4组、第6组或第7组限定的任意一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰。
组的定义
第1组氨基酸：
第1组氨基酸(注意这些是图53和图54的1IVN中的氨基酸)
Gly8、Asp9、Ser10、Leu11、Ser12、Tyr15、Gly44、Asp45、Thr46、Glu69、Leu70、Gly71、Gly72、Asn73、Asp74、Gly75、Leu76、Gln106、Ile107、Arg108、Leu109、Pro110、Tyr113、Phe121、Phe139、Phe140、Met141、Tyr145、Met151、Asp154、His157、Gly155、Ile156、Pro158
高度保守的基序，如GDSx和催化残基从第1组中取消选定(标有下划线的残基)。为了避免争议，第1组定义了在1IVN模型活性位点中的甘油中心碳原子
Figure BPA00001204796900421
以内的氨基酸残基。
第2组氨基酸：
第2组氨基酸(注意氨基酸的编号是指P10480成熟序列中的氨基酸)
Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289和Val290。
第1组中所选残基与第2组的比较表
Figure BPA00001204796900431
Figure BPA00001204796900441
第3组氨基酸：
第3组氨基酸与第2组相同，但是是指杀鲑气单胞菌(SEQ ID No.4)的编码序列，即第3组中的氨基酸残基编号要大18，这反映了成熟蛋白(SEQ ID No.34)与包含信号序列的蛋白(SEQ ID No.25)中氨基酸编号之间的差异。
杀鲑气单胞菌GDSX(SEQ ID No.4)和嗜水气单胞菌GDSX(SEQ ID No.34)的成熟蛋白有五个氨基酸不同。它们是Thr3Ser、Gln182Lys、Glu309Ala、Ser310Asn和Gly318-，其中杀鲑气单胞菌的残基列在前面，而嗜水气单胞菌的残基列在后面。嗜水气单胞菌蛋白的长度只有317个氨基酸，且在第318位上缺少残基。与嗜水气单胞菌蛋白相比，杀鲑气单胞菌GDSX对极性脂(如半乳糖脂底物)具有相当高的活性。对全部五个氨基酸位置进行了位点扫描。
第4组氨基酸：
第4组氨基酸是S3、Q182、E309、S310和-318。
第5组氨基酸：
F13S、D15N、S18G、S18V、Y30F、D116N、D116E、D157N、Y226F、D228N、Y230F。
第6组氨基酸：
第6组氨基酸是Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、-318。
第6组中的氨基酸的编号是指P10480(SEQ ID No.25)中的氨基酸残基，其它序列骨架上的相应氨基酸可以通过与P10480和/或1IVN的同源比对和/或结构比对来确定。
第7组氨基酸：
第7组氨基酸是Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、-318、Y30X(其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W)、Y226X(其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W)、Y230X(其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W)、S18X(其中X选自A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y)、D157X(其中X选自A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y)。
第7组中氨基酸的编号是指P10480(SEQ ID No.25)中的氨基酸残基，其它序列骨架上的相应氨基酸可以通过与P10480和/或1IVN的同源比对和/或结构比对来确定。
适合地，与亲本酶相比，所述酶变体包含一种或多种以下氨基酸修饰：
S3E、A、G、K、M、Y、R、P、N、T或G
E309Q、R或A，优选为Q或R
-318Y、H、S或Y，优选为Y。
优选地，GDSX基序的X是L。因此，优选所述亲本酶包含氨基酸基序GDSL。
适合地，所述第一亲本脂质酰基转移酶可以包含任何一种以下氨基酸序列：SEQ ID No.34、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33或SEQ ID No.35。
适合地，所述第二相关脂质酰基转移酶可以包含任何一种以下氨基酸序列：SEQ ID No.3、SEQ ID No.34、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33或SEQ ID No.35。
与所述亲本酶相比，所述酶变体必须包含至少一个氨基酸修饰。在一些实施方式中，与亲本酶相比，所述酶变体可以包含至少2个，优选为至少3个，优选为至少4个，优选为至少5个，优选为至少6个，优选为至少7个，优选为至少8个，优选为至少9个，优选为至少10个氨基酸修饰。
当在本文中提及具体的氨基酸残基时，编号是从序列变体与SEQ ID No.34或SEQ ID No.35所示的参考序列的比对获得的。
一方面，优选酶变体包含一种或多种以下氨基酸取代：
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或
L17A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
S18A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y；和/或
K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y30A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
G40A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
K82A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
W111A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
A114C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y117A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
L118A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
P156A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
G159A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Q160A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或
N161A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
P162A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
S163A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或
A164C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
R165A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y；和/或
S166A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或
Q167A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或
K168A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
V169A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
V170A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
E171A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
A172C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N181A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Q182A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y，优选为K；和/或
M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Y226A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或
K284A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
M285A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或
V290A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或
E309A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或
S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y。
此外或可选地，可以有一个或多个C末端延伸。优选地，所述附加的C末端延伸由一个或多个脂肪族氨基酸构成，优选为非极性氨基酸，更优选为I、L、V或G。因此，本发明进一步提供了包含以下C末端延伸中的一个或多个的酶变体：318I、318L、318V、318G。
优选的酶变体可以具有降低的对磷脂如磷脂酰胆碱(PC)的水解活性，还可具有升高的对磷脂的转移酶活性。
优选的酶变体可以具有升高的对磷脂如磷脂酰胆碱(PC)的转移酶活性，也可以升高的对磷脂的水解活性。
一个或多个以下残基的修饰可以产生对磷脂的绝对转移酶活性升高的酶变体：S3、D157、S310、E309、Y179、N215、K22、Q289、M23、H180、M209、L210、R211、P81、V112、N80、L82、N88、N87。
可以提供对磷脂的转移酶活性改善的酶变体的优选具体修饰可以选自以下一种或多种：
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，优选为N、E、K、R、A、P或M，最优选为S3A；
D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为D157S、R、E、N、G、T、V、Q、K或C；
S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，优选为S310T、-318E；
E309A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y，优选为E309R、E、L、R或A；
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W，优选为Y179D、T、E、R、N、V、K、Q或S，更优选为E、R、N、V、K或Q；
N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为N215S、L、R或Y；
K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为K22E、R、C或A；
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y，优选为Q289R、E、G、P或N；
M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为M23K、Q、L、G、T或S；
H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为H180Q、R或K；
M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为M209Q、S、R、A、N、Y、E、V或L；
L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为L210R、A、V、S、T、I、W或M；
R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y，优选为R211T；
P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为P81G；
V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y，优选为V112C；
N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；优选为N80R、G、N、D、P、T、E、V、A或G；
L82A、C、D、E、F、G、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为L82N、S或E；
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为N88C；
N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y，优选为N87M或G；
一个或多个以下残基的优选修饰产生对磷脂的绝对转移酶活性升高的酶变体：
S3 N、R、A、G
M23 K、Q、L、G、T、S
H180 R
L82 G
Y179 E、R、N、V、K或Q
E309 R、S、L或A
一个优选的修饰是N80D。特别地，当使用参考序列SEQ ID No.35作为骨架时更是如此。因此，参考序列可以为SEQ ID No.16。所述修饰可以与一个或多个其它修饰组合。因此，在本发明的优选实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂质酰基转移酶可以包含SEQ ID No.35，或与SEQ ID No.35具有75％或更高，优选为85％或更高，更优选为90％或更高，更优选为95％或更高，更优选为98％或更高，或更优选为99％或更高同一性的氨基酸序列。
如上指出，当在本文中提及具体氨基酸残基时，其编号是通过序列变体与SEQ ID No.34或SEQ ID No.35所示的参考序列的比对获得的。
优选地，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以编码包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列或SEQ ID No.68所示的氨基酸序列的脂质，或包含与SEQ ID No.16或SEQ ID No.68具有70％或更高，优选为75％或更高，优选为85％或更高，更优选为90％或更高，更优选为95％或更高，更优选为98％或更高，或更优选为99％或更高同一性的氨基酸序列的脂质。该酶可以认为是酶变体。
出于本发明的目的，同一性的程度以相同序列元件(element)的数目为基础。根据本发明，可以通过本领域已知的计算机程序的方法(如Vector NTI 10(Invitrogen Corp.))来适当地确定氨基酸序列的同一性程度。对于成对比对，所用的评分优选为空位开放罚分为10.0、空位延伸罚分为0.1的BLOSUM62。
适合地，关于氨基酸序列的同一性程度，在至少20个连续的氨基酸内，优选为至少30个连续的氨基酸内，优选为至少40个连续的氨基酸内，优选为至少50个连续的氨基酸内，优选为至少60个连续的氨基酸内进行测定。
适合地，可以在全序列中测定氨基酸序列的同一性程度。
适合地，用于本发明的脂质酰基转移酶和编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可获自于，优选获自于一种或多种以下属的生物：气单孢菌属、链霉菌属、酵母菌属、乳球菌属、分支杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、脱亚硫酸菌属、芽孢杆菌、弯曲菌属、弧菌属、木杆菌属、硫化叶菌属、曲霉属、裂殖酵母属、李斯特菌属、奈瑟菌属、中慢生根瘤菌属、雷尔氏菌属、黄单胞菌属、念珠菌属、喜热裂孢菌属和棒状杆菌属。
适合地，用于本发明的脂质酰基转移酶和编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可获自于，优选获自于一种或多种以下生物：嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)、分支杆菌、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、化脓性链球菌、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、Streptomyces thermosacchari、灰色链霉菌、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、脱卤脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium dehalogenans)、芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、弧菌、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、土霉菌(Aspergillus terreus)、粟酒裂殖酵母、无害李斯特菌(Listeria innocua)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、近平滑假丝酵母、褐色喜热裂孢菌和Corynebacterium efficiens。
一方面，优选用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂质酰基转移酶可获自于，优选获自或来自于气单孢菌、嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌中的一种或多种。
一方面，优选用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是可获自于，优选获自或来自于气单孢菌、嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌中一种或多种的脂质酰基转移酶。
本文使用的术语“转移酶”可以与术语“脂质酰基转移酶”互换。
适合地，本文定义的脂质酰基转移酶催化以下一种或多种反应：酯交换、酯基转移、醇解、水解。
术语“酯交换”表示酰基基团在脂质供体和脂质受体之间的酶催化转移，其中所述脂质供体不是游离的酰基基团。
本文使用的术语“酯基转移”表示酰基基团从脂质供体(除游离脂肪酸)向酰基受体(除水)的酶催化转移。
本文使用的术语“醇解”表示通过与醇ROH的反应对酸衍生物的共价键的酶切割，从而使一个产物与醇的H结合，另一个产物与醇的OR基团结合。
本文使用的术语“醇”表示包含羟基基团的烷基化合物。
本文使用的术语“水解”表示酰基基团从脂质向水分子的OH基团的酶催化转移。
本文使用的术语“没有增加或基本没有增加游离脂肪酸”表示，本发明的脂质酰基转移酶优选具有100％转移酶活性(即，将来自酰基供体的100％酰基基团转移到酰基受体上，而没有水解活性)；然而，所述酶可以将脂质酰基供体中存在的小于100％的酰基基团转移到酰基受体。在这种情况下，优选所述酰基转移酶活性占总酶活性的至少5％，更优选至少10％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少98％。可以按照上述“转移酶活性试验”测定％转移酶活性(即以总酶活性的百分数表示的转移酶活性)。
在本发明的某些方面，本文使用的术语“基本没有增加游离脂肪酸”表示用本发明的脂质酰基转移酶处理的食用油中游离脂肪酸的量小于用除本发明的脂质酰基转移酶以外的酶处理的食用油中产生的游离脂肪酸的量，例如小于用常规磷脂酶，例如，Lecitase UltraTM(Novozymes A/S，Denmark)时产生的游离脂肪酸的量。
当用于表示产品或组合物时，本文使用的术语“基本由......组成”优选表示所述产品或组合物可以由其它产品或组合物组成，但仅限于其最大浓度优选为10％，例如5％、例如3％、例如2％或1％、或0.5％或0.1％时。
在一个优选实施方式中，与脂酶组合使用的脂质酰基转移酶具有一种或多种以下酶活性：糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)，磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)，磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。适宜地，脂酶在本领域是公知的，并包括下列用举例方式说明的脂酶：磷脂酶A1 LECITASE
Figure BPA00001204796900551
ULTRA(Novozymes A/S，丹麦)、磷脂酶A2(例如磷酯酶A2来自Biocatalysts的LIPOMODTM 22L，来自Genecor的LIPOMAXTM和LysoMax PLA2TM、LIPOLASEO
Figure BPA00001204796900552
(Novozymes A/S，丹麦)。
在一些实施方式中，组合使用脂质酰基转移酶和磷脂酶(例如磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C和/或磷脂酶D)也可能是有益的。
所述组合使用可以依次或同时进行，例如脂质酰基转移酶处理可以在所述额外酶处理前或者处理过程中进行。或者，所述额外酶处理也可以在脂质酰基转移酶处理之前或处理过程中进行。
在依次酶处理的情况下，在一些实施方式中，在利用第二个(和/或第三个等)酶处理前，例如通过失活或者通过使用固定化酶除去所使用的第一个酶可能是有益的。
转录后和翻译后修饰
适合地，本发明的脂质酰基转移酶可以由本文公开的任一个核苷酸序列编码。
根据所使用的宿主细胞，可以进行转录后和/或翻译后修饰。设想用于本发明方法和/或应用的脂质酰基转移酶包括已经接受转录后和/或翻译后修饰的脂质酰基转移酶。
仅作为举例而言，本文SEQ ID No.49(参见图57)所示的核苷酸序列在宿主细胞(例如地衣芽孢杆菌)中的表达引起转录后和/或翻译后修饰，从而产生本文SEQ ID No.68(参见图73)所示的氨基酸序列。
SEQ ID No.68与SEQ ID No.16(本文图1所示)相同，只是SEQ ID No.68经历了翻译后和/或转录后修饰从而除去了38个氨基酸。
分离的
一方面，所述脂质酰基转移酶是回收的/分离的脂质酰基转移酶。因此，所制备的脂质酰基转移酶可以是分离的形式。
另一方面，用于本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是分离的形式。
术语“分离的(或分离)”是指序列或蛋白至少基本不包含至少一种其它成分，这些成分原本与所述序列或蛋白天然结合，并且原本在一起发现。
纯化的
一方面，所述脂质酰基转移酶可以是纯化的形式。
另一方面，用于本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是纯化的形式。
术语“纯化的”是指序列处于相对纯的状态，如至少约51％纯，或至少约75％纯，或至少约80％纯，或至少约90％纯，或至少约95％纯，或至少约98％纯。
克隆编码本发明多肽的核苷酸序列
编码具有如本文所定义的特定性质的多肽或适合修饰的多肽的核苷酸序列可以从产生所述多肽的任何细胞或生物中分离得到。用于分离核苷酸序列的各种方法都是本领域熟知的。
例如，可以使用产生所述多肽的生物的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果所述多肽的氨基酸序列是已知的，可以合成经标记的寡核苷酸探针，并将其用于从由该生物制备的基因组文库中鉴定编码多肽的克隆。或者，也可以使用包含与另一已知多肽基因同源的序列的经标记寡核苷酸探针来鉴定编码多肽的克隆。在后一种情况下，使用严谨性较低的杂交和清洗条件。
或者，可以通过如下方式鉴定编码多肽的克隆：将基因组DNA的片段插入到表达载体(如质粒)中，使用所得的基因组DNA文库转化酶为阴性的细菌，并随后将转化的细菌涂布在包含被所述多肽抑制的酶的琼脂上，由此可以鉴定出表达所述多肽的克隆。
再者，也可以通过成熟的标准方法通过合成来制备编码所述多肽的核苷酸序列，如Beucage S.L.等(1981)Tetrahedron Letters 22，p 1859-1869描述的亚磷酰胺法，或Matthes等(1984)EMBO J.3，p 801-805描述的方法。在亚磷酰胺法中，在如自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，然后将其纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。
所述核苷酸序列可以是源自混合的基因组和合成来源、混合的合成和cDNA来源、或混合的基因组和cDNA来源，其根据标准技术通过连接源自合成的、基因组的或cDNA的片段(根据需要)而制得。每个连接的片段对应于整个核苷酸序列的不同部分。所述DNA序列也可以使用特定引物通过聚合酶链式反应(PCR)来制备，如US 4,683,202或Saiki R K等(Science(1988)239，pp 487-491)中所述。
核苷酸序列
本发明还涵盖编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。本文所用的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列和其变体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。所述核苷酸序列可以是源自基因组或合成物或重组物，其可以是双链的或单链的(无论其代表正义链还是反义链)。
本发明的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。优选地，其指DNA，更优选为编码序列的cDNA。
在优选的实施方式中，编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列本身不涵盖在其天然环境中存在的天然核苷酸序列，此时该序列与同处于其天然环境中其天然结合序列相连接。为了便于参考，我们将此优选实施方式称为“非天然核苷酸序列”。由此，术语“天然核苷酸序列”是指与处于其天然环境中并与其天然结合的完整启动子(同处于其天然环境中)可操作地连接的完整核苷酸序列。因此，可以利用核苷酸序列在其天然生物中表达本发明的多肽，但是其中所述核苷酸序列不受所述生物中与其天然结合的启动子的控制。
优选地，所述多肽不是天然多肽。关于这一点，术语“天然多肽”是指处于其天然环境中并已经由其天然核苷酸序列表达的完整多肽。
通常，使用重组DNA技术(即重组的DNA)制备编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。然而，在本发明的另一个可选实施方式中，可以使用本领域已知的化学方法来合成全部或部分核苷酸序列(参见Caruthers MH等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
分子进化
分离出编码酶的核苷酸序列或鉴定出编码假定酶的核苷酸序列后，可能需要对所选择的核苷酸序列进行修饰，例如可能需要对所述序列进行突变以制备本发明的酶。
可以使用合成的寡核苷酸来引入突变。这些寡核苷酸包含目标突变位点侧翼的核苷酸序列。
Morinaga等(Biotechnology(1984)2，p646-649)中公开了适合的方法。Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p 147-151)中描述了向编码酶的核苷酸序列中引入突变的另一种方法。
代替如上文所述的定点诱变，可以随机引入突变，如使用商品试剂盒，如来自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒，或来自Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒。EP 0 583 265提到基于PCR的诱变的优化方法，其也可以结合使用DNA突变类似物，如EP 0 866 796中所述的那些。易错PCR技术也适用于制备具有优选性质的脂质酰基转移酶变体。WO0206457提到了脂肪酶的分子进化。
获得新型序列的第三种方法是使用任何数量的限制性酶或如Dnase I的酶将不同的核苷酸序列片段化，并重新组装成编码功能性蛋白的全长核苷酸序列。或者，可以使用一个或多个不同的核苷酸序列，并在重新组装全长核苷酸序列时引入突变。DNA改组(shuffling)和家族改组技术适用于制备具有优选性质的脂质酰基转移酶变体。适合进行“改组”的方法可以参见EP0 752008、EP1 138 763、EP1 103 606。改组也可以与如US 6,180,406和WO 01/34835中所述的其它形式的DNA诱变相结合。
因此，有可能在体内或体外在核苷酸序列中产生大量定点突变或随机突变，并随后通过多种手段筛选功能性得到改进的编码多肽。可以使用例如计算机分析(in silico)和核酸外切酶介导(exo-mediated)的重组方法(参见WO 00/58517、US 6,344,328、US 6,361,974)进行分子进化，其中所产生的变体保留了与已知酶或蛋白的很低的同源性。由此获得的所述变体可与已知的转移酶具有显著的结构类似性，但却具有很低的氨基酸序列同源性。
此外，如在非限定性实例中，多核苷酸序列的突变体或天然变体也可以与野生型或其它突变体或天然变体重组以生产新的变体。也可以筛选所述新的变体以获得功能性得到改进的编码多肽。
应用以上以及类似的分子进化方法能够在没有关于蛋白结构或功能的任何现有知识的情况下鉴定和选择具有优选特性的本发明的酶变体，并能够产生不可预测的但有益的突变体或变体。在本领域中应用分子进化来优化或改变酶活性的实例有很多，所述实例包括但不限于以下的一种或多种：优化在宿主细胞或体外的表达和/或活性、增加酶活性、改变底物和/或产物特异性、增加或降低酶稳定性或结构稳定性、改变在优选环境条件(如温度、pH、底物)中酶的活性/特异性。
使用分子进化工具可以改变酶以提高该酶的功能性，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
适合地，用于本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以编码脂质酰基转移酶变体，即当与亲本酶比较时，所述脂质酰基转移酶可以包含至少一个氨基酸的取代、缺失或添加。变体酶与亲本酶保持至少1％、2％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％的同源性。适合的亲本酶可以包括具有酯酶或脂肪酶活性的任何酶。优选地，亲本酶与pfam00657共有序列相比对。
在优选的实施方式中，脂质酰基转移酶变体保留或加入了在GDSx、GANDY和HPT区中发现的至少一个或多个pfam00657共有序列氨基酸残基。
可以使用分子进化工具使酶(如在含水环境中没有或具有低脂质酰基转移酶活性的脂肪酶)突变，以引入或增强转移酶活性，由此生产适合用于本发明的组合物和方法的具有显著转移酶活性的脂质酰基转移酶。
适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以编码脂质酰基转移酶变体，与亲本酶相比，该变体对极性脂质(优选为磷脂和/或糖脂)具有增强的酶活性。优选地，所述变体还可以对溶血极性脂质(lyso polar lipid)具有低活性或无活性。对极性脂质、磷脂和/或糖脂的活性增强可能是由于水解和/或转移酶活性或二者组合的结果。
与亲本酶相比，所述脂质酰基转移酶变体可以对甘油三酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯具有降低的活性。
适合地，所述酶变体可以没有对甘油三酯、和/或甘油单酯和/或甘油二酯的活性。
或者，所述酶变体可以具有提高的热稳定性。
所述酶变体可以对以下的一种或多种具有提高的活性：极性脂质、磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱、糖脂、二半乳糖基甘油单酯、单半乳糖基甘油单酯。
脂质酰基转移酶变体是已知的，且一种或多种所述变体可以适用于本发明的方法和应用，和/或本发明的酶组合物。仅举例来说，根据本发明可以使用以下文献中阐述的脂质酰基转移酶变体：Hilton & Buckley J Biol.Chem.1991 Jan 15：266(2)：997-1000；Robertson等J.Biol.Chem.1994 Jan 21；269(3)：2146-50；Brumlik等J.Bacteriol 1996 Apr；178(7)：2060-4；Peelman等Protein Sci.1998 Mar；7(3)：587-99。
氨基酸序列
本发明还涵盖由用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
本文所使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在一些实例中，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。
所述氨基酸序列可以从适合的来源制备/分离，或其可以通过合成制备、或其可以使用重组DNA技术制备。
适合地，所述氨基酸序列可以通过标准技术从本文教导的分离多肽获得。
一种适合测定分离多肽的氨基酸序列的方法如下：
可以将纯化的多肽冻干，并将100μg的冻干原料溶解于8M尿素和0.4M碳酸氢铵(pH 8.4)的50μl混合物中。在覆盖氮气并加入5μl 45mM二硫苏糖醇后，可以将溶解的蛋白在50℃变性并还原15分钟。冷却至室温后，可以加入5μl 100mM碘乙酰胺，从而使半胱氨酸残基在室温、避光和氮气下衍生15分钟。
可以向以上反应混合物中加入135μl水和含5μg内切蛋白酶Lys-C的5μl水溶液，并在37℃氮气保护下消化24小时。
可以使用溶剂A(0.1％TFA的水溶液)和溶剂B(0.1％TFA的乙腈溶液)在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The Separation Group，Califomia，USA)上通过反相HPLC分离所得到的肽。在N-末端测序前，可以使用相同的溶剂体系在Develosil C18柱上对所选择的肽进行重新层析。可以使用Applied Biosystems 476A测序仪，根据生产商的说明书(Applied Biosystems，California，USA)使用脉冲液态快速循环来完成测序。
序列同一性或序列同源性
在此，术语“同源物”是指与目标氨基酸序列和目标核苷酸序列具有一定同源性的实体。在此，术语“同源性”可以等同于“同一性”。
所述同源氨基酸序列和/或核苷酸序列可以提供和/或编码保留所述酶的功能活性和/或增强所述酶的活性的多肽。
在本文中，认为同源序列包括可以与目标序列有至少75％、85％或90％同一性，优选为至少95％或98％同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包含与目标氨基酸序列相同的活性位点等。虽然同源性也可以被视为相似性(即氨基酸残基具有相似的化学性质/功能)，但是在本发明的内容中，优选同源性表达序列的同一性。
在本文中，认为同源序列包括可以与编码本发明多肽的核苷酸序列(目标序列)有至少75％、85％或90％同一性的核苷酸序列，优选为至少95％或98％同一性的核苷酸序列。通常，同源物将包括与目标序列相同的活性位点编码序列等。虽然同源性也可以被视为相似性(即氨基酸残基具有相似的化学性质/功能)，但是在本发明的内容中，优选同源性表达序列的同一性。
可以通过目测进行同源性比较，或者更通常是借助易于获得的序列比较程序进行同源性比较。这些商业性计算机程序可以计算两个或多个序列间的同源性％。
可以在连续的序列中计算同源性％，即一个序列与其它序列比对，且将一个序列中的每个氨基酸与其它序列中的相应氨基酸直接比较，每次比较一个残基。这被称为“无缺口”比对。通常所述无缺口比对仅在数量相对少的残基中进行。
虽然这是非常简单且稳定的方法，但是其未能考虑到如在其它方面相同的成对序列中，一个插入或缺失将引起随后的氨基酸残基无法比对，因此可能导致在进行整体比对时的同源性％大大降低。因此，大部分序列比对方法被设计成产生考虑了可能的插入和缺失而不过度地惩罚整体同源性得分的最佳比对。这可以通过在比对序列中插入“缺口”以试图使局部同源性最大化而实现。
然而，这些更加复杂的方法给比对中出现的每个缺口赋予“缺口罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽量少缺口的序列比对(反映了两个比较的序列间更高的相关性)将比具有更多缺口的序列比对具有更高的得分。通常使用“仿射缺口罚分”(Affine gap cost)，即对缺口的存在处以较高罚分，而对缺口中的每个后续残基处以较小罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分将无疑产生具有更少缺口的优化比对。大多数比对程序允许修正缺口罚分。然而，当使用所述软件进行序列比较时，优选使用默认值。
因此，最大同源性％的计算首先需要在考虑缺口罚分下产生最佳的比对。适合用于进行所述比对的计算机程序为Vector NTI(Invitrogen Corp.)。可以进行序列比较的其它软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等1999 Short Protocols in Molecular Biology，4th Ed，Chapter 18)和FASTA(Altschul等1990 J.Mol.Biol.403-410)。BLAST和FASTA均可进行离线和在线搜索(参见Ausubel等1999，7-58页至7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用Vector NTI程序。也可以将称为BLAST 2 Sequences的新型工具用于比较蛋白和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
虽然可以根据同一性来测定最终的同源性％，但是比对方法本身通常不是基于全是或全非的成对比较。作为代替，通常使用尺度相似性评分矩阵(scaled similarity score matrix)，基于化学相似性或进化距离对每对比较评分。通常所用的此矩阵的实例为BLOSUM62矩阵(BLAST程序套的默认矩阵)。Vector NTI程序通常使用公开的默认值，或者也可能使用所提供的自定义符号比较表(详见用户手册)。对于一些应用，优选使用Vector NTI软件包的默认值。
或者，也可以使用基于与CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)类似的算法的Vector NTI(Invitrogen Corp.)中的多重比对特征来计算同源性％。
一旦软件生成了最佳比对，就可以计算同源性％，优选为序列同一性％。软件通常将其作为序列比较的一部分来执行，并生成数值结果。
如果在测定序列同一性时使用缺口罚分，随后优选使用以下参数进行成对比对：
  BLAST
  缺口开口   0
  缺口延伸   0
  CLUSTAL   DNA   蛋白
  字长(WORD SIZE)   2   1   K三联体
  缺口罚分   15   10
  缺口延伸   6.66   0.1
在一个实施方式中，优选使用具有以上定义的缺口罚分和缺口延伸设定的CLUSTAL来测定核苷酸序列的序列同一性。
适合地，在至少20个连续的核苷酸中，优选为在至少30个连续的核苷酸中，优选为在至少40个连续的核苷酸中，优选为在至少50个连续的核苷酸中，优选为在至少60个连续的核苷酸中，优选为在至少100连续的核苷酸中测定核苷酸序列的同一性程度。
适合地，在全序列中测定核苷酸序列中的同一性程度。
在一个实施方式中，本发明氨基酸序列的同一性程度可以通过本领域已知的计算机程序的方法，如Vector NTI 10(Invitrogen Corp.)来适当地测定。对于成对比对，所用的矩阵优选为缺口开口罚分为10.0且缺口延伸罚分为0.1的BLOSUM62。
适合地，在至少20个连续的氨基酸中，优选为在至少30个连续的氨基酸中，优选为在至少40个连续的氨基酸中，优选为在至少50个连续的氨基酸中，优选为在至少60个连续的氨基酸中测定氨基酸序列的同一性程度。
适合地，在全序列中测定氨基酸序列的同一性程度。
所述序列也可以具有产生沉默改变和产生功能等价物的氨基酸残基的缺失、插入或取代。可以根据残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质上的相似性来进行谨慎的氨基酸取代，只要该物质的次要结合活性被保持即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
例如可以根据下表进行保守取代。在第二列中相同栏中的氨基酸，优选为在第三列中相同行中的氨基酸可以相互取代：
Figure BPA00001204796900641
本发明还涵盖可以发生的同源取代(本文所用的取代和替换均指现存氨基酸残基与可选残基的互换)，即相似取代，如碱性氨基酸取代碱性氨基酸、酸性氨基酸取代酸性氨基酸、极性氨基酸取代极性氨基酸等。也可以发生非同源取代，即从一类残基变成另一类残基，或涉及包含非天然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。
也可以使用非天然氨基酸进行替换。
氨基酸变体序列可以包含可以在序列的任何两个氨基酸残基间插入的适合的间隔子基团，除氨基酸间隔子如甘氨酸或β-丙氨酸残基外，还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。本领域的技术人员可充分理解其它形式的变异，其涉及以类肽(peptoid)形式存在的一个或多个氨基酸残基。为了避免争议，“类肽形式”用来指α-碳取代基基团在残基的氮原子上而非在α-碳上的氨基酸残基变体。制备类肽形式的肽的方法是本领域内已知的，如Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。
本发明所使用的或编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列可以在其内部包含合成的或修饰的核苷酸。本领域中已知对寡核苷酸的许多不同类型的修饰。这些修饰包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3’末端和/或5’末端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本发明的目的，应该理解，可以用本领域中可用的任何方法来修饰本文所述的核苷酸序列。可以进行所述修饰以增强核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涵盖与本文所讨论的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的应用。如果序列与其片段互补，此序列可以被用作探针以鉴定其它生物等中类似的编码序列。
可以以多种方式获得与本发明的序列并非100％同源但却落入本发明范围中的多核苷酸。可以通过例如探测由一系列个体(如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获得本文所述序列的其它变体。此外，可以获得其它病毒/细菌或细胞同源物，特别是在哺乳动物细胞(如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中发现的细胞同源物，且所述同源物或其片段将通常能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。可以通过探测从其它动物物种制备的cDNA文库或基因组DNA文库，并在中度至高度严谨条件下使用包含所附序列表中任何一个序列的全部或部分的探针探测所述文库来获得所述序列。类似的考虑用于获得本发明多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。
也可以使用简并PCR来获得变体和株/种同源物，所述简并PCR将使用设计为靶向变体和同源物中编码本发明序列中的保守氨基酸序列的序列。例如可以通过比对来自多个变体/同源物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件进行序列比对。例如广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。
简并PCR中所用的引物可包含一个或多个简并位点，且其使用条件的严谨性可低于使用针对已知序列的单一序列引物克隆序列所用的那些条件。
或者，也可以通过已表征序列的定点诱变来获得所述多核苷酸。例如当需要沉默密码序列的改变，从而为表达多核苷酸序列的特定宿主细胞优化密码子偏爱性时，这可能是有用的。可能需要其它序列改变，以引入限制性多肽识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的性质或功能。
可以使用本发明的多核苷酸(核苷酸序列)制备引物，如PCR引物，用于可选扩增反应的引物；探针，如使用放射性或非放射性标记物通过常规方法用显示标记物标记的探针；或可以将多核苷酸克隆到载体中。所述引物、探针和其它片段的长度可以是至少15个，优选为至少20个，如至少25个，30个或40个核苷酸，且其也涵盖在如本文所用的术语多核苷酸之内。
可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制备根据本发明的多核苷酸(如DNA多核苷酸)和探针。它们也可以通过标准技术进行克隆。
通常，可通过合成方法来制备引物，该方法包括以每次一个核苷酸的方式逐步制备所需要的核酸序列。使用自动化技术来实现这一方法的技术在本领域中是容易获得的。
通常使用重组方法，如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术来制备较长的多核苷酸。这包括制备位于所需要克隆的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物(如约15至30个核苷酸)，使引物接触从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA，在使所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，并回收扩增的DNA。可以设计引物使其包含适合的限制性酶识别位点，使得可以将扩增的DNA克隆到适合的克隆载体中。
杂交
本发明还涵盖与本发明的序列互补的序列，或能够与本发明的序列杂交的序列或与本发明的互补序列杂交的序列的应用。
本文所用的术语“杂交”包括“一条核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”，以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行扩增的过程。
本发明还涵盖所述核苷酸序列的应用，所述核苷酸序列能够和与本文所讨论的目标序列、或其任何衍生物、片段或衍生物互补的序列杂交。
本发明还涵盖能够与本文所讨论的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。
杂交条件基于核苷酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，Vol.152，Academic Press，San Diego CA)中所教导，且给出了如下文所解释的定义的“严谨性”。
最高严谨性通常出现在约(Tm-5)℃(比探针的Tm低5℃)；高严谨性在比Tm低约5℃至10℃；中等严谨性在比Tm低约10℃至20℃；而低严谨性出现在比Tm低约20℃至25℃。如本领域技术人员的理解，最高严谨性杂交可以用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等(或低)严谨性杂交可以用于鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件或中等严谨性条件下与编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列杂交的序列的互补序列的应用。
更优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件(如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH 7.0})下与编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列的应用。
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)杂交的核苷酸序列的应用。
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)杂交的序列的互补核苷酸序列的应用。
本发明的范围还包括能够在中等至最高严谨性条件下与本文所讨论的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列的应用。
在优选的方面，本发明涵盖能够在严谨性条件(如50℃和0.2×SSC)下与本文所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的应用。
在更优选的方面，本发明涵盖能够在高严谨性条件(如65℃和0.1×SSC)下与本文所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的应用。
多肽的表达
可以将用于本发明的核苷酸序列或用于编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列引入重组的复制型载体中。载体可以用于在相容的宿主细胞中和/或从相容的宿主细胞复制并以多肽形式表达所述核苷酸序列。可以使用控制序列来控制表达，所述控制序列包含启动子/增强子和其它表达调控信号。可以使用原核生物的启动子和在真核细胞中有功能的启动子。可以使用组织特异的或刺激物特异性启动子。也可以使用包含来自上述两个或更多不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
根据所用的序列和/或载体，通过由宿主重组细胞表达核苷酸序列而产生的多肽可以被分泌，或被包含在细胞内。编码序列经设计可以具有信号序列，该信号序列指导编码序列物质分泌通过特定的原核生物或真核细胞膜。
构建体
术语“构建体”，与术语如“结合物(或连接物)”、“盒(cassette)”和“杂合体(hybrid)”同义，其包含依照本发明使用的编码具有本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列，且其直接或间接地与启动子连接。间接连接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列之间提供适合的间隔子基团，如内含子序列，如Sh1内含子或ADH内含子。本发明中的相关术语“融合”也是如此，其包括直接或间接连接。在一些情况中，这些术语不涵盖编码所述蛋白的核苷酸序列与其通常连接的野生型基因启动子的天然组合(此时这两者均处于其天然环境中)。
所述构建体甚至可以包含或表达允许选择基因构建体的标记物。
对于一些应用，优选构建体至少包含本发明的核苷酸序列，或编码具有如本文定义的特定性质的多肽且可操作地与启动子连接的核苷酸序列。
生物
与本发明有关的术语“生物”包括可包含本发明的核苷酸序列或编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物的任何生物。
与本发明有关的术语“转基因生物”包括任何这样的生物，其包含编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物，和/或其中启动子能够允许编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列在所述生物内表达。优选核苷酸序列被引入到生物的基因组中。
术语“转基因生物”不涵盖在处于自身天然环境中并同时受到其同处于自身天然环境中的天然启动子控制的天然核苷酸编码序列。
因此，本发明的转基因生物包括包含以下任何一种或其组合的生物：编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列、本文定义的构建体、本文定义的载体、本文定义的质粒、本文定的细胞或其产物。例如，所述转基因生物还可以包含编码具有如本文定义的特定性质的多肽且受到启动子控制的核苷酸序列，其中所述启动子原本并不与脂质酰基转移酶编码基因相连。
宿主细胞/生物的转化
所述宿主微生物可以是原核或真核生物。
合适的原核宿主的实例包括细菌，例如大肠杆菌和地衣芽孢杆菌，优选地衣芽孢杆菌。
原核宿主的转化的教导在本领域中有详细的文献记载，例如参见Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。如果使用原核宿主，则在转化前需要适当地修饰核苷酸序列，例如去除内含子。
在另一个实施方式中，所示转基因生物可以为酵母。
可以利用本领域已知的多种方法转化丝状真菌，例如包括原生质体形成和原生质体转化，然后以已知的方式重建细胞壁的方法。在EP 0 238 023中公开了曲霉作为宿主微生物的应用。
另一种宿主生物可以为植物。用于转化植物的常用技术的概述可见于Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant MoI Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)。关于植物转化的其它教导可见于EP-A-0449375。
以下部分为关于真菌、酵母和植物转化的一般教导。
转化的真菌
宿主生物可以为真菌，例如丝状真菌。此类宿主的合适实例包括属于嗜热菌属(Thermomyces)、枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属、青霉属(penicillium)、毛霉菌属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)和木霉属(Trichoderma)等的任何成员。
关于转化丝状真菌教导的概述见于US-A-5741665，其中描述了用于丝状真菌转化以及真菌培养的标准技术是本领域所熟知的。应用于链孢霉(N.crassa)的技术的研究进展见于，例如Davis and de Serres，Methods Enzymol(1971)17A：79-143。
关于丝状真菌的进一步教导的概述见于US-A-5674707。
一方面，所述宿主生物可以为曲霉属，例如黑曲霉。
本发明的转基因曲霉属还可以通过以下制备，例如Turner G.1994(Vectors for genetic manipulation.In：Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(Editors)Aspergillus：50 years on.Progress in industrial microbiology vol 29.Elsevier Amsterdam 1994.pp.641-666)的教导。
丝状真菌的基因表达的综述见于Punt等.(2002)Trends Biotechnol 2002May；20(5)：200-6，Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4)：273-306。
转化的酵母
在另一个实施方式中，所示转基因生物可以为酵母。
酵母中异源基因表达的原则的综述见于，例如Methods MoI Biol(1995)，49：341-54，和Curr Opin Biotechnol(1997)Oct；8(5)：554-60。
在这一点上，酵母，例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(参见FEMS Microbiol Rev(200024(1)：45-66)可用作异源基因表达的载体。
在酿酒酵母中的异源基因表达和基因产物的分泌的原则的综述见于E Hinchcliffe E Kenny(1993，″Yeast as a vehicle for the expression ofheterologous genes″，Yeasts，VoI 5，Anthony H Rose and J Stuart Harrison，eds，2nd edition，Academic Press Ltd.)。
对于酵母的转染，已经开发出了多种转染方法。例如，本发明的转基因酵母可以根据以下教导制备：Hinnen等，(1978，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H et a/(1983，J Bacteriology 153，163-168)。
可以利用各种筛选标记物筛选转化的酵母细胞，例如营养缺陷型标记物、显性抗生素抗性标记物。
合适的酵母宿主生物可以选自在生物技术上相关的酵母种，例如但不限于选自毕赤酵母、汉逊酵母、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowinia)、酵母菌(包括酿酒酵母)或裂殖酵母菌(包括粟酒裂殖酵母)的酵母种。
甲醇营养型酵母种的菌株巴斯德毕赤酵母可以用作宿主生物。
在一个实施方式中，所述宿主生物可以为汉逊酵母种，例如汉森酵母(H.polymorpha)(如WO01/39544中的阐述)。
转化的植物/植物细胞
适合用于本发明的宿主生物可以为植物。常用技术的综述可见于以下文献：Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)，或者WO 01/16308。转基因植物可以产生，例如水平提高的植物甾醇酯和植物甾烷醇酯。
因此，本发明还涉及产生具有增强水平的植物甾醇酯和植物甾烷醇酯的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：利用本文定义的脂质酰基转移酶(尤其是利用包含本文定义的脂质酰基转移酶的表达载体或构建体)转化植物细胞，和由转化的植物细胞培养出植物。
分泌
通常，期望表达宿主将多肽分泌到培养基中，由此可以更容易地回收酶。根据本发明，可以基于所需的表达宿主来选择分泌前导序列。本发明中也可以使用杂合信号序列。
原本不与编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列连接的分泌前导序列的典型实例为那些源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-18个氨基酸和24个氨基酸两种形式，如来自曲霉菌属)、a-因子基因(酵母，如酵母属、克鲁维酵母和汉逊酵母)或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌)的序列。
检测
本领域已知多种用于检测和测定氨基酸序列表达的操作方法。实例包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和荧光活化的细胞分选(FACS)。
本领域技术人员已知多种标记物和结合技术，并可以将其用于各种核酸和氨基酸分析。
许多公司如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)为这些方法提供商业试剂盒和操作说明。
适合的报告分子或标记物包括那些放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或显色剂，以及底物、辅助因子、抑制剂和磁性粒子等。教导这些标记物应用的专利包括US-A-3,817,837、US-A-3,850,752、US-A-3,939,350、US-A-3,996,345、US-A-4,277,437、US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。
此外，可以如US-A-4,816,567中所示制备重组免疫球蛋白。
融合蛋白
用于本发明的脂质酰基转移酶可以作为融合蛋白制备，例如以便有助于其提取和纯化。融合蛋白配偶体(partner)的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。也可以方便地在融合蛋白配偶体和目的蛋白序列之间包含蛋白水解切割位点以去除融合蛋白序列。优选地，融合蛋白将不会妨碍蛋白序列的活性。
Curr.Opin.Biotechnol.(1995)6(5)：501-6已经对大肠杆菌中的基因融合表达系统进行了综述。
具有如本文定义的特定性质的多肽的氨基酸序列可以与非天然序列连接以编码融合蛋白。例如，对于为获得能够影响物质活性的试剂而进行的肽库筛选，其可用于编码表达可被商购抗体所识别的非天然表位的嵌合体。
下文将参照以下附图和实施例，仅以举例的方式描述本发明。
图1显示了突变的杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列，该突变体具有Asn80Asp突变(注意，第80位氨基酸位于成熟序列中)(SEQ ID 16)；
图2显示了来自嗜水气单胞菌(ATCC #7965)的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.1)；
图3显示了来自第6版数据库的pfam00657共有序列(SEQ ID No.2)；
图4显示了从生物嗜水气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.3)(P10480；GI：121051)；
图5显示了从生物杀鲑气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.4)(AAG098404；GI：9964017)；
图6显示了从生物天蓝色链霉菌A3(2)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.5)(Genbank登录号NP_631558)；
图7显示了从生物天蓝色链霉菌A3(2)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.6)(Genbank登录号CAC42140)；
图8显示了从生物酿酒酵母获得的氨基酸序列(SEQ ID No.7)(Genbank登录号P41734)；
图9显示了从生物雷尔氏菌属获得的氨基酸序列(SEQ ID No.8)(Genbank登录号AL646052)；
图10显示了SEQ ID No.9。Scoe1 NCBI蛋白登录号CAB39707.1GI：4539178的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图11显示了如SEQ ID No.10所示的氨基酸。Scoe2 NCBI蛋白登录号CAC01477.1 GI：9716139的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图12显示了氨基酸序列(SEQ ID No.11)。Scoe3 NCBI蛋白登录号CAB88833.1 GI：7635996的推定的分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图13显示了氨基酸序列(SEQ ID No.12)。Scoe4 NCBI蛋白登录号CAB89450.1 GI：7672261的推定的分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图14显示了氨基酸序列(SEQ ID No.13)。Scoe5 NCBI蛋白登录号CAB62724.1 GI：6562793的推定的脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图15显示了氨基酸序列(SEQ ID No.14)。Srim1 NCBI蛋白登录号AAK84028.1 GI：15082088的GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]；
图16显示了来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.Salmonicida)(ATCC#14174)的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.15)；
图17显示了SEQ ID No.19。Scoe1 NCBI蛋白登录号CAB39707.1 GI：4539178的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图18显示了用于诱变嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶基因的融合构建体的氨基酸序列(SEQ ID No.25)。下划线的氨基酸为木聚糖酶信号肽；
图19显示了来自链霉菌的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.26)；
图20显示了来自喜热裂孢菌的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.27)；
图21显示了来自喜热裂孢菌的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.28)；
图22显示了来自Corynebacterium efficiens GDSx 300个氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.29)；
图23显示了来自Novosphingobium aromaticivorans GDSx 284个氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.30)；
图24显示了来自天蓝色链霉菌GDSx 269个氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.31)；
图25显示了来自灰色链霉菌\GDSx 269个氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.32)；
图26显示了来自链霉菌的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.33)；
图27显示了从生物嗜水气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No.34)(P10480；GI：121051)(注意，这是成熟序列)；
图28显示了突变的杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列(SEQ ID No.35)(注意，这是成熟序列)；
图29显示了来自Streptomyces thermosacchari的核苷酸序列(SEQ ID No.36)；
图30显示了来自Streptomyces thermosacchari的氨基酸序列(SEQ ID No.37)；
图31显示了来自褐色喜热裂孢菌/GDSx 548个氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID No.38)；
图32显示了来自褐色喜热裂孢菌的核苷酸序列(SEQ ID No.39)；
图33显示了来自褐色喜热裂孢菌/GDSx的氨基酸序列(SEQ ID No.40)；
图34显示了来自Corynebacterium efficiens/GDSx 300个氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID No.41)；
图35显示了来自Corynebacterium efficiens的核苷酸序列(SEQ ID No.42)；
图36显示了来自天蓝色链霉菌/GDSx 268个氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID No.43)；
图37显示了来自天蓝色链霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No.44)；
图38显示了来自灰色链霉菌的氨基酸序列(SEQ ID No.45)；
图39显示了来自灰色链霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No.46)；
图40显示了来自褐色喜热裂孢菌/GDSx的氨基酸序列(SEQ ID No.47)；
图41显示了来自褐色喜热裂孢菌/GDSx的核苷酸序列(SEQ ID No.48)；
图42显示了L131与来自灰色链霉菌和褐色喜热裂孢菌的同源物的比对，说明了GDSx基序(在L131以及灰色链霉菌和褐色喜热裂孢菌中均为GDSY)、GANDY框(其为GGNDA或GGNDL)和HPT区(被认为是保守的催化组氨酸)的保守性。这三个保守部分均被突出标记；
图43显示了来自近平滑假丝酵母脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.17)；
图44显示了来自近平滑假丝酵母脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.18)；
图45显示了活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的带状显示图。此图使用Deep View Swiss-PDB观测器制作。
图46显示了活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的侧视图(使用Deep View Swiss-PDB观测器制作)，黑色部分为活性位点甘油
Figure BPA00001204796900751
以内的残基。
图47显示了活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的俯视图(使用Deep View Swiss-PDB观测器制作)，黑色部分为活性位点甘油以内的残基。
图48显示了比对1；
图49显示了比对2；
图50和51显示了1IVN与P10480的比对(P10480为嗜水气单胞菌酶数据库序列)，此比对从PFAM数据库获得并用在模型构建过程中；和
图52显示了其中P10480为嗜水气单胞菌数据库序列的比对。此序列用于模型构建和位点选择。注意绘制出了完整的蛋白(SEQ ID No.25)，成熟蛋白(等价于SEQ ID No.34)起始于第19位残基。A.sal为杀鲑气单胞菌的GDSX脂肪酶(SEQ ID No.4)，A.hyd为嗜水气单胞菌的GDSX脂肪酶(SEQ ID No.34)。所列序列间的差异位置在共有序列中用*表示。
图53显示了在实施例1中使用的基因构建体；
图54显示了在实施例1中使用的密码子优化的基因构建体(no.052907)；和
图55显示了包含LAT-KLM3’前体基因的XhoI插入物的序列，下划线处为-35框和-10框；
图56显示了在三丁酸甘油酯琼脂上于37℃生长48小时后的BML780-KLM3’CAP50(包含SEQ ID No.16-上面的菌落)和BML780(空宿主菌株-下面的菌落)。
图57显示了来自杀鲑气单胞菌的包含信号序列(preLAT-从第1位至第87位)的核苷酸序列(SEQ ID No.49)；
图58显示了从生物嗜水气单胞菌获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.50)；
图59显示了从生物杀鲑气单胞菌获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.51)；
图60显示了从生物天蓝色链霉菌A3(2)获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.52)(Genbank登录号NC_003888.1：8327480..8328367)；
图61显示了从生物天蓝色链霉菌A3(2)获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.53)(Genbank登录号AL939131.1：265480..266367)；
图62显示了从生物灰色链霉菌获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.54)(Genbank登录号Z75034)；
图63显示了从雷尔氏菌生物获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.55)；
图64显示了如SEQ ID No.56所示的核苷酸序列，其编码NCBI蛋白登录号CAB39707.1 GI：4539178的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图65显示了如SEQ ID No.57所示的核苷酸序列，其编码Scoe2，NCBI蛋白登录号CAC01477.1 GI：9716139的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图66显示了如SEQ ID No.58所示的核苷酸序列，其编码Scoe3，NCBI蛋白登录号CAB88833.1 GI：7635996的推定分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图67显示了如SEQ ID No.59所示的核苷酸序列，其编码Scoe4，NCBI蛋白登录号CAB89450.1 GI：7672261的推定分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图68显示了如SEQ ID No.60所示的核苷酸序列，其编码Scoe5，NCBI蛋白登录号CAB62724.1 GI：6562793的推定脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图69显示了如SEQ ID No.61所示的核苷酸序列，其编码Srim1，NCBI蛋白登录号AAK84028.1 GI：15082088GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]；
图70显示了来自嗜水气单胞菌(ATCC #7965)的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.62)；
图71显示了来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(ATCC#14174)的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.63)；
图72显示了来自嗜水气单胞菌的编码包含木聚糖酶信号肽的酶的核苷酸序列(SEQ ID No.24)；
图73显示了具有Asn80Asp突变(注意，第80位氨基酸位于成熟序列中)的突变的嗜水气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列(本文显示为SEQ ID No.16)，和经过翻译后修饰的氨基酸序列(SEQ ID No.68)——SEQ ID No.68的第235位和236位氨基酸残基在翻译后修饰后并没有共价连接，所形成的两个肽通过一个或多个S-S桥连接在一起。SEQ ID No.68中的第236位氨基酸对应于本文所示的SEQ ID No.16中的第274位氨基酸残基；
图74a显示了对未加工食用油进行水脱胶/精炼的常规方法。在水脱胶结束时，分离油相和胶相。此后可通过常规/已知方法进一步加工油相和胶相；
图74b显示可本发明使用酶对未加工食用油进行水脱胶/精炼的方法。与相当的方法(即图74a中所示的一种方法，即没有添加酶的水脱胶)的油相相比，在分离油相和胶相时获得的油相具有更高的产量。可任选地对油相和/或胶相进行进一步加工，例如进一步的常规加工；
图75显示了根据本发明进行实验室级水脱胶方法的流程图；
图76显示了在水脱胶(即图74a或74b的步骤1)后，胶相和油相的分析图；
图77显示了在根据本发明对未加工大豆油(crude soya bean oil)进行水脱胶3小时后的胶相；
图78显示了在使用和没有使用酶时，对未加工大豆油进行水脱胶30分钟后的胶相％；
图79显示了水量(1.5％、2％或2.5％)对未加工大豆油水脱胶后的胶量的影响；
图80显示了在使用和没有使用酶时，水量(1.5％、2％或2.5％)对使用和没有使用酶对未加工大豆油进行水脱胶后的胶量的影响；
图81显示了在使用不同剂量的酶对未加工大豆油进行水脱胶后油相中的磷(ppm)。柱1为没有使用酶的对照；
图82显示了在使用不同剂量的酶对未加工大豆油进行水脱胶后油相中的甘油三酯％。柱1为没有使用酶的对照；
图83显示了在使用不同剂量的酶对未加工大豆油进行水脱胶后油相中的相对PA％。柱1为没有使用酶的对照；
图84显示了在使用不同剂量的酶对未加工大豆油进行水脱胶后油相中的相对PE％。柱1为没有使用酶的对照；
图85显示了与对照相比，酶促脱胶获得的油产量增加(％)。将油在不同的相对离心力下离心3分钟；
图86显示了在所示不同时间(柱中显示的分钟数)和不同的相对离心力下将油离心获得的胶中的胶含量(％)和甘油三酯量。第3批：对照，55℃；第4批：使用酶(KLM3′)，55℃；
图87显示了粘度与剪切率的函数。基于来自第1批(对照，70℃)和第2批(使用酶，70℃)的胶进行测量；
图88显示了通过由(对照)胶量减去(酶样品)胶量获得的油产量(％)；
图89显示了胶相TLC分析的结果。使用递增量(0、0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml、1.5ml和1.9ml 4％-溶液)的NaOH进行脱胶获得的胶中的甘油三酯含量(％)；
图90：显示了GC的结果。使用递增ml数的NaOH脱胶后，油中的FFA、植物甾醇和植物甾醇酯的含量(％)-样品1：对照(没有酶和NaOH)；样品2-8：使用KLM3′(0.1TIPU-k/g)和递增量(0、0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml、1.5ml和1.9ml 4％-溶液)的NaOH的酶促样品；
图91显示了胶相TLC分析的结果。胶中磷脂(PA、PE、PC和PI)的相对降解。样品1：对照(没有酶和NaOH)；样品2-7：使用KLM3′(0.1TIPU-k/g)和递增ml数的NaOH；
图92显示了由常规水脱胶和本发明的酶促脱胶产生的胶的显微镜分析(图片为25℃，放大200倍和400倍)；
图93显示了由常规脱胶和酶促脱胶产生的胶的X射线分析；
图94显示了沉积漏斗(第3天)。左侧：对照；右侧：酶处理的油；
图95显示了由常规脱胶和酶促脱胶产生的胶的显微镜分析；
图96显示了与对照相比，酶促脱胶获得的油产量增加(％)；
图97显示了在对照和使用1％、1.5％和2％水进行酶促脱胶的样品(按照本发明)中的油损失；油损失的计算：(胶％/胶中的甘油三酯％)x 100％；
图98显示了与对照(没有酶)相比，酶促(KLM3′)胶样品中磷脂酸和磷脂酰乙醇胺的相对降解；
图99显示了使用不同量的水(1.25％、1.5％、1.75％和2％)脱胶获得的酶促胶相的粘性测量结果；
图100显示了使用KLM3′并添加实施例9中表1所示受体时，未加工大豆水脱胶获得的胶相；
图101显示了通过HPTLC分析的胶相中磷脂的相对量；
图102显示了由未加工大豆油水脱胶获得的油中的磷ICP分析(实施例9的表1)；
图103：实施例13中的样品1-9在温育30分钟后的TLC(运行缓冲液1)；
图104：实施例13中的样品1-9在温育240分钟后的TLC (运行缓冲液1)；
图105：实施例13中的样品1-9在温育30分钟后的TLC(运行缓冲液6)；PE＝磷脂酰乙醇胺；PA＝磷脂酸；PI＝磷脂酰肌醇和PC＝磷脂酰胆碱；
图106：实施例13中的样品1-9在温育240分钟后的TLC(运行缓冲液6)；PE＝磷脂酰乙醇胺；PA＝磷脂酸；PI＝磷脂酰肌醇和PC＝磷脂酰胆碱；
图107：实施例13中通过使用脂质酰基转移酶(KLM3′)和磷脂酶C(PLC)对未加工油进行酶促处理而产生的磷脂相对降解。反应时间240分钟；
图108：实施例13中磷脂甘油二酯酰基转移酶反应；
图109：实施例13中磷脂酶C和KLM3′对未加工大豆油脱胶中甘油二酯(DAG)水平的相互作用；
图110：实施例13中TLC分析；
图111显示了酶添加对甘油三酯的影响；
图112显示了反应时间对甘油三酯的影响；
图113显示了如实施例13中详述，与酰基转移酶一起温育30和90分钟的甘油二酯/PC底物的TLC分析；
图114显示了如实施例13中详述，与酰基转移酶一起温育30和90分钟的甘油二酯/PC底物的TLC分析；
图115显示了酰基转移酶对甘油二酯/PC 80/20底物中甘油三酯形成的影响；
图116显示了温育时间对甘油二酯/PC 80/20底物中甘油三酯形成的影响；
图117显示了酶促水脱胶的流程图；
图118显示了如实施例15中详述，在55℃水脱胶并温育0天、1天或7天后，胶相样品的TLC分析；和
图119显示了如实施例15中详述，在45℃水脱胶并温育0天、1天或7天后，胶相样品的TLC分析。
实施例1：
地衣芽孢杆菌中KLM3′的表达
在地衣芽孢杆菌中将编码脂质酰基转移酶(SEQ.ID No.16，下文称为KLM3′)的核苷酸序列(SEQ ID No.49)与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT)的信号肽一起作为融合蛋白表达(参见图53和54)。为了优化在芽孢杆菌中的表达，从Geneart(Geneart AG，雷根斯堡，德国)订购了经密码子优化的基因构建体(no.052907)。
构建体No.052907包含位于LAT-KLM3’前体基因之前的不完全LAT启动子(仅-10序列)和位于LAT-KLM3’前体基因下游的LAT转录(Tlat)(参见图53和55)。为了构建包含5’末端侧翼具有完全LAT启动子、3’末端侧翼具有LAT终止子的LAT-KLM3’前体基因的XhoI片段，以Plat5XhoI_FW和EBS2XhoI_RV为引物并以基因构建体052907为模板进行PCR(聚合酶链式反应)扩增。
Plat5XhoI_FW：
      ccccgctcgaggcttttcttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaaaattc
          ggaatatttatacaatatcatatgtttcacattgaaagggg    
EB S2XhoI_RV：tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc
根据生产商的说明书(退火温度55℃)使用Phusion高保真度DNA聚合酶(Finnzymes OY，埃斯波，芬兰)在热循环仪进行PCR。
根据生产商的说明书(Invitrogen，Carlsbad，Calif.USA)，使用限制性酶XhoI消化所得PCR片段，并使用T4DNA连接酶将其连接到经XhoI消化的pICatH中。
如美国专利申请US20020182734(国际公布WO 02/14490)所述，将连接混合物转化进入枯草芽孢杆菌株SC6.1。通过DNA测序确定包含LAT-KLM3’前体基因的XhoI插入物的序列(BaseClear，莱顿，荷兰)，并将正确质粒克隆之一命名为pICatH-KLM3’(ori1)(图53)。在许可的温度(37℃)下将pICatH-KLM3’(ori1)转化进入地衣芽孢杆菌株BML780(BRA7和BML612的衍生物，参见WO2005111203)。
选择一个新霉素抗性(neoR)和氯霉素抗性(CmR)的转化株并将其命名为BML780(pICatH-KLM3’(ori1))。通过在非允许温度(50℃)下、于含有5μg/ml氯霉素的培养基中培养菌株，使BML780(pICatH-KLM3’(ori1))中的质粒整合到地衣芽孢杆菌基因组的catH区中。选择一个CmR抗性克隆，并将其命名为BML780-pICatH-KLM3’(ori1)。再次在允许温度、没有抗生素的情况下培养BML780-pICatH-KLM3’(ori1)数代以使载体序列环出(loop-out)，随后选择一个对新霉素敏感(neoS)的CmR克隆。在此克隆中，染色体上的pICatH载体序列被切除(包括新霉素抗性基因)，并只留下catH-LATKLM3’盒。随后，通过在氯霉素浓度增加的培养基中/上培养菌株来扩增染色体上的catH-LATKLM3’盒。在扩增数轮后，选择一个克隆(抗50μg/ml氯霉素)，并将其命名为BML780-KLM3’CAP50。为了确定KLM3’表达，使BML780-KLM3’CAP50和BML780(空宿主菌株)在添加有1％三丁酸甘油酯的Heart Infusion(Bacto)琼脂培养板上于37℃下培养48小时。在BML780-KLM3’CAP50菌落周围清楚可见澄清的区域(指示脂质酰基转移酶活性)，而宿主菌株BML780周围则不可见(参见图56)。此结果显示在地衣芽孢杆菌株BML780-KLM3’CAP50中表达了大量的KLM3’，且这些KLM3’分子是有功能的。
比较例1
载体构建体
所述质粒构建体为pCS32new N80D，其为携带有第80位氨基酸由Asn取代成Asp的成熟形式天然杀鲑气单胞菌甘油磷酸酯-胆固醇酰基转移酶(KLM3′)的编码序列的pCCmini衍生物，所述编码序列在p32启动子的控制下并具有CGTase信号序列。
用于表达的宿主菌株为枯草芽孢杆菌OS21ΔAprE菌株。
以用酯化胆固醇％表示的转移酶活性来计算表达水平，在PC(TPC)为供体和胆固醇为受体分子的反应中，根据参比样品中游离胆固醇和酶样品中游离胆固醇的差值来计算酯化胆固醇％。
培养条件
将单个菌落接种在添加有50mg/l卡那霉素的5ml LB肉汤培养基(酪蛋白酶解物，10g/l；低钠酵母提取物，5g/l；氯化钠，5g/l；惰性压片填充剂(Inert tableting aid)，2g/l)中，并于205rpm、30℃温育6小时。将0.7ml此培养物接种到添加有50mg/l卡那霉素和高麦芽糖淀粉水解物溶液(60g/l)的50ml SAS培养基(K2HPO4，10g/l；MOPS(3-吗啡啉丙磺酸)，40g/l；氯化钠，5g/l；消泡剂(Sin 260)，5滴/l；脱脂豆粉，20g/l；Biospringer 106(100％dw YE)，20g/l)中。在30℃、180rmp下继续温育40小时，随后以19000rpm离心30分钟来分离培养物上清液。将上清液转移到清洁试管中并直接用于转移酶活性测定。
底物的制备和酶促反应
以9∶1的比例称量PC(Avanti Polar Lipids #441601)和胆固醇(Sigma C8503)，将其溶解在氯仿中，并蒸发至干。
通过将3％PC∶胆固醇(9∶1)分散到50mM HEPES缓冲液(pH 7)中来制备底物。
将0.250ml底物溶液转移到带有螺纹盖的3ml玻璃试管中。加入0.025ml培养物上清液并将混合物在40℃下温育2小时。另使用水代替酶来制备参比样品。将反应混合物在沸水浴中加热10分钟来终止酶反应。向反应混合物中加入2ml 99％的乙醇，然后进行胆固醇试验分析。
胆固醇试验
将100μl底物在37℃下温育5分钟，随后加入5μl酶反应样品并混合，其中所述底物为含有1.4U/ml胆固醇氧化酶(SERVA Electrophoresis GmbH cat.No 17109)、0.4mg/ml ABTS(Sigma A-1888)、6U/ml过氧化物酶(Sigma 6782)的0.1M Tris-HCl(pH 6.6)和0.5％ Triton X-100(Sigma X-100)溶液。将反应混合物继续温育5分钟并测量OD405。根据对含有0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.20mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml和0mg/ml胆固醇的99％EtOH溶液的胆固醇标准溶液的分析，计算胆固醇的含量。
结果
此表显示了8个单独表达培养物的平均值
Figure BPA00001204796900831
实施例2
脂质酰基转移酶在水脱胶中的应用
材料和方法
酶：
KLM3′：实施例1中所述的脂质酰基转移酶，具有SEQ ID No.68(本文也称为“K932”)-1128 TIPU/ml
油：
SBO 1：未加工大豆油，来自Solae，Aarhus，DK.27.09.2007 Delite(基于来自加拿大的豆类)
SBO 2：未加工大豆油，来自巴西
SBO 3：粗提取的油菜籽油，来自Aarhus Karlshamn
SBO 4：粗压榨的油菜籽油，来自Scanola，Aarhus，DK
大豆卵磷脂混合标准物(ST16)，来自Spectra Lipid，德国
方法：
HPTLC：
点样器：自动TLC点样器4，CAMAG
HPTLC板：20x10cm，Merck号1.05641.使用前在160℃下活化10分钟。
点样：
油相：使用自动TLC点样器将5μl于氯仿∶甲醇2∶1中的8％油溶液点样到PTLC板上。
胶相：将来自于10g油的胶相溶解在7.5ml氯仿和甲醇(2∶1)中。
将1μl样品点样到HPTLC板上。
TLC点样器
运行缓冲液6：氯仿∶1-丙醇∶乙酸甲酯∶甲醇∶0.25％KCl水溶液＝25∶25∶25∶10∶9
运行缓冲液5：P-醚∶MTBE＝30∶70
洗脱：使用来自Camag的自动展开仪ADC2(Automatic Developing Chamber ADC2)将板洗脱7cm。
显影：
将板在烘箱中在160℃下干燥10分钟，冷却，并浸入6％乙酸铜的16％H3PO4溶液中。在160℃下额外干燥10分钟，并直接评价。
在显影后，将板在Camag扫描仪上扫描，并计算TLC板上每个组分(点)的面积。
计算
油相：
通过分析在与油样品相同的TLC板上的标准卵磷脂来计算油相中磷脂的量，所述标准卵磷脂具有不同的已知浓度的磷脂(PE，PA，PI，PC，PS)浓度。基于标准混合物，得到每种磷脂的校准曲线，并使用校准曲线来计算油样品中每种磷脂的磷脂浓度。基于摩尔重量，将磷脂的浓度转换为ppm P(磷)。
胶相：
基于对与胶相相同的板上的标准精炼植物油的分析，计算胶相中甘油三酯的含量。基于对植物油的分析，得到校准曲线，并使用校准曲线来计算胶相中的甘油三酯。
胶相中磷脂的分析是基于将来自对照(未加入酶)的不同体积的胶相加到与其它胶相相同的板上。基于对对照胶相中磷脂(PE和PA)的分析，得到校准曲线，并使用校准曲线来计算相对于对照中磷脂的量(定义为100％)，酶处理样品中磷脂的量。
pH测定：
来自油脱胶的样品的pH通过http://www.3i-usa.com/downloads/hvdrop man.pdf中所述的荧光法来分析，即pH测定通过使用HydroPlate
Figure BPA00001204796900851
HP96C(来自Presens，Josef Engert Str.11，D-93053 Regensburg，Germany)来进行。
HydroPlate
Figure BPA00001204796900852
是无菌的聚苯乙烯微量滴定板，常规具有96个集成传感器的96孔形式。传感器被固定在每个孔的底部。传感器可从底部读出。这可通过几乎任何商购荧光读板仪来进行。分析是基于两种不同的荧光染料：pH敏感指示剂和惰性参比染料。这种组合确保精确的内部参比信号，以实现最精确的实验结果。
pH也可通过使用pH电极来测定，参见Bo Yang et al JAOCS，Vol.83，No.7(2006)pp653-658。
油中水的测定
油中的残留水通过AOCS法Ca 2c-25或等价形式来测定。
GLC分析
Perkin Elmer Autosystem 9000毛细管气相色谱，安装有WCOT熔融氧化硅柱12.5mx0.25mm IDx0.1μ膜厚度5％苯基-甲基-硅酮(CP Sil 8CB，来自Chrompack)。
载气：氦气
进样器：PSSI冷分流进样(cold split injection)(起始温度50℃，加热至385℃)，体积1.0μl
检测器FID：395℃
炉程序(自2003年10月30日开始使用)：1    2    3
炉温(℃)                          90   280  350
等温，时间(分钟)                  1    0    10
升温速率(℃/分钟)                 15   4
样品制备：将50mg样品溶解在含0.5mg/ml内标十七烷的12ml吡啶中。随后将500μl样品溶液转移至钳口瓶，加100μl MSTFATMCS-99∶1(N-甲基-N-三甲基甲硅烷基-三氟乙酰胺)，并在60℃下反应20分钟。
计算：由纯参比材料(称量12ml吡啶中的纯材料8-10mg，含内标十七烷，0.5mg/ml)测定甾醇、棕榈酸甾醇酯和硬脂酸甾醇酯的响应因子。
酶分析，TIPU
底物：
将0.6％L-α磷脂酰胆碱95％ Plant(Avanti #441601)，0.4％ Triton-X 100(Sigma X-100)和5mM CaCl2溶解在0.05M HEPES缓冲液(pH 7)中。
分析步骤：
使用KoneLab自动分析仪将34μl底物加入试管中。在T＝0分钟时，加入4μl酶溶液。另分析代替酶的水空白。将样品混合并在30℃下温育10分钟。
样品的游离脂肪酸含量使用来自WAKO GmbH的NEFA C试剂盒来分析。
计算分析条件下每分钟产生的脂肪酸微摩尔数作为酶活性TIPU(pH 7)。
脱胶步骤，实验室规模
称量100g未加工大豆油，加到有盖的250ml Blue Cap烧瓶中，并加热至50℃或55℃或60℃或65℃或70℃。
随后将水加入油中，再加入酶。将油用Ultra Turrax混合器均质化30秒，并随后通过450rpm磁力搅拌搅动30分钟。
在30、120或180分钟后，将10ml油转移至12ml离心管(带刻度)中。将油在沸水浴中加热至97℃，持续10分钟，并随后立即在5000g下离心5分钟。
将油从胶相中倒出，将试管沥干30分钟，并测量两个相的重量。(见图75)。
通过GLC分析油相的游离甾醇、甾醇酯和游离脂肪酸，且也通过TLC分析油相。(见图76)。
结果
实施例2a：
在此实验中，在未加工SBO 1的水脱胶方法中测试KLM3′。
测试0.1至0.5 TIPU/g油的不同剂量的KLM3′，且也测试Ultra Turrax混合的影响。
下表与图77一起显示出在KLM3′处理的样品中胶相的明显减少和(油相中)油产量的提高。
观察到约2％的油增加，且有通过增加酶剂量来获得更高产量的趋势。
混合也对胶相有影响。可见，在加入酶后立即进行对油进行30秒UltraTurrax处理得到更少的胶相，但在有或无Ultra Turrax混合下，酶加入的影响几乎相同。在工业中，通常在加入水后通过静态混合器或动态混合器来泵油，为了在实验室规模上对此进行模拟，决定使用Ultra Turrax混合。
Figure BPA00001204796900881
*没有添加酶的对照
实施例2b：
根据标准操作(加入或未加入KLM3′酶)，在水脱胶中测试两种不同的未加工SBO。酶剂量为0.25TIPU/g。
配方：
Figure BPA00001204796900882
下表所示结果表明在30分钟和120分钟的反应时间后，胶相明显减少，这对应于较高的油产量。油相中甾醇和甾醇酯的分析显示出酶处理样品中甾醇向甾醇酯的高转化率。还观察到游离脂肪酸(FFA)含量的增加，这是因为还产生了水解活性。
结果
Figure BPA00001204796900891
实施例2c：
在此实验中，在50℃下在SBO 2水脱胶中测试不同剂量的KLM3′。还在加入或未加入酶的方法中，测试了不同的水含量，即1.5％、2％和2.5％。
配方：
Figure BPA00001204796900892
下表中以及图78、图79、图80、图81、图82、图83和图84中所示的结果清楚地表明胶相的量减少，且因为胶相和油相之和是100％，所以得出酰基转移酶(KLM3′)导致油相中油产量的改进。
还观察到在酶处理样品中，胶相中磷脂含量降低。胶相中磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酸(PA)相对于无酶处理的胶相中这些磷脂的含量均降低。胶相中甘油三酯的量在酶处理的胶相中也减少，这也证实了酶处理样品中(油相中)油产量的增加。
加入到未加工大豆油中的水的量也如所预期的显示出对胶相量的影响，但结果也证实了相对于无酶加入的对照，在不同水加入下酰基转移酶对产量的影响(见图80)。
在水脱胶实验中，pH在5.5至6的范围内，这解释了在低剂量下的高酶活性，和甾醇向甾醇酯的高转化率。
结果
  2460-152   1   2   3   4   5   6   7   8
  胶相
  胶，30分钟   ％   6.48   5.14   5.68   5.19   5.73   4.85   7.06   6.03
  胶，120分钟   ％   5.79   5.88   4.86   4.94   5.65   5.07   6.12   5.96
  TLC分析
  磷   ppm   66   73   64   58   76   62   65   62
  PA   相对％   100   61   45   35   86   47   105   50
  PE   相对％   100   45   24   18   88   26   102   34
  甘油三酯   ％   65   26   37   29   62   41   62   38
  GLC分析
  FFA   ％   0.63   0.71   0.78   0.87   0.57   0.79   0.57   0.73
  游离甾醇   0.27   0.12   0.06   0.05   0.27   0.06   0.26   0.11
  甾醇酯   0.18   0.41   0.47   0.51   0.12   0.53   0.13   0.40
所述分析一式两份进行，且使用StatGraphic S Plus软件，将结果用于统计学评估。
实施例2d：
为了研究不同温度下KLM3′对油产量的影响，将酶在55℃、60℃、65℃和70℃下SBO2的水脱胶中进行测试。
配方：
下表所示结果清楚地说明了KLM3′对胶相含量的影响。在全部温度下，0.1TIPU/g油的剂量导致胶含量的显著降低。将酶含量增加至0.2和0.3使胶相进一步减少点。
结果
在不同温度、反应时间和酶剂量下，通过SBO 2水脱胶的％胶相。
实施例3
中试规模的酶促水脱胶
配方
中试规模的水脱胶试验中所用的组分
批次1：对照，70℃，
批次2：有酶(即脂质酰基转移酶K932-本文中有时称为KLM3′-其具有如本文SEQ ID No.68所示的氨基酸序列)，70℃，
批次3：对照，55℃，和
批次4：有酶(即脂质酰基转移酶K932-本文中有时称为KLM3′-其具有如本文SEQ ID No.68所示的氨基酸序列)，55℃。
Figure BPA00001204796900921
中试级水脱胶的步骤
首先，将油在50升罐中在N2覆盖和搅动下加热。随后，将水(和酶)加入油中。在初始实验(批次1和2)中，在加入水和酶后，使用均化器(Silverson，Chesham Sweden)将油再循环。在批次3和4中，仅使用再循环泵以降低罐中的搅动。
收集油样品(批次1-4)以用于实验室分析30分钟后酶活性，并将油样品置于沸水浴中(10分钟)以灭活酶。罐中剩余油的灭活通过将油加热至75℃(搅动下)来完成。随后，在预热(热水)离心机(Alfa Laval)中进行离心，并使油相流入桶中并称重。测试了不同离心机的容量调整(capacity adjustment)，不能监测分离的胶相，因为离心机的体积与油的量相比太大。因此，从胶相聚集的离心机盖处收集胶相。
实验室级水脱胶和离心
将100g未加工大豆油称量，加入有盖的250ml Blue Cap烧瓶中，并加热至55℃。将水加入油中，随后加入酶。将油用Ultra Turrax混合器均质化30秒，随后通过450rpm磁力搅拌搅动30分钟。在30分钟后，将10ml油转移至12ml离心管(带刻度)中。将油在沸水浴中加热至97℃，持续10分钟，并随后立即在不同的相对离心力(500、1000、2500和5000)下离心不同时间(3、6和10分钟)。
将油从胶相中倒出，将试管沥干15分钟，并测量两个相的重量。通过GLC分析油相的游离植物甾醇、甾醇酯和游离脂肪酸，并且还通过HPTLC分析油相。
结果和讨论
油产量
图85显示，与对照相比，根据本发明从未加工大豆油酶促脱胶获得的油产量增加。将油在更高的相对离心力(rcf)(500、1000、2500和5000)下离心3分钟，且根据对照中胶含量减去酶促样品中胶含量(％)计算油产量。
清楚地看出，与对照相比，在酶促脱胶中的油产量增加，且油产量随rcf降低而增加。
离心的作用
对于批次3和4，从在不同时间下(柱中的分钟数)离心的油样品中获得的胶中甘油三酯的量和胶的量显示在图86中。
结果说明rcf影响从常规脱胶(蓝柱)获得的胶的量(％)。最初，在低rcf(500-1000)下，胶的量比在2500至5000相对离心力下获得的量高(高甘油三酯含量)。离心时间(3、6和10分钟)似乎不影响胶量，至少在5000rcf下不影响。
检查从本发明酶促脱胶获得的胶，含量似乎不受rcf和时间的影响。尽管不希望受理论的束缚，这可解释为从常规脱胶和本发明酶促脱胶获得的胶之间粘度的差异。在图87中，显示基于胶相的粘度测定。粘度随两种类型胶剪切速率的增加而降低，然而，在根据本发明酶促脱胶获得的胶中，粘度降低程度更大。
除了油产量增加外，通过本发明实现的粘度降低还对工业水脱胶方法具有其它益处。生产能力可能会增加。
实施例4
未加工大豆油水脱胶中NaOH的评价
配方
表1：用于水脱胶试验的样品
Figure BPA00001204796900941
实验室级水脱胶步骤
将100g未加工大豆油称量，加入有盖的250ml Blue Cap烧瓶中，并加热至55℃。将水和NaOH加入油中，随后加入酶。将油用Ultra Turrax混合器均质化30秒，并通过450rpm磁力搅拌搅动30分钟。在30分钟后，将约10ml油转移至12ml离心管(带刻度)中。将油在沸水浴中加热至97℃，持续10分钟。
结果和讨论
油产量分析
图88显示从KLM3′(即脂质酰基转移酶K932-本文中有时称为KLM3′-其具有如本文SEQ ID No.68所示的氨基酸序列)(0.1TlPU-K/g)酶促脱胶和增加量的NaOH(0、0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml、1.5ml和1.9ml 4％溶液)获得的增加油产量。计算是基于对照中胶量减去酶促样品中胶量。
最高的油产量增加通过没有NaOH的酶促脱胶实现，且通常增加的油产量(％)随NaOH含量增加而降低。这最可能解释为甘油三酯的皂化随NaOH含量增加而增加。然而，通过检查对照和酶促胶样品(图89)中甘油三酯，与未使用NaOH所通常观察到的含量相比，在NaOH处理的胶中含量未显著增加。未使用NaOH的酶促样品中甘油三酯的水平也与之前观察到的相当。
油中脂肪酸、植物甾醇和植物甾醇酯的分析
对照和酶促脱胶油中植物甾醇、植物甾醇酯和游离脂肪酸的含量显示在图90中。植物甾醇酯的含量从0.19％(对照)增加至最大值0.42％(0.2ml NaOH)。在此点后，植物甾醇酯降低至0.15％。因此，观察到植物甾醇最初从0.3％降低至0.12％，随后从0.12％增加至0.28％。
类似地，FFA增加至pH 6.3(0.2ml NaOH)的点，这最可能是因为皂化增加。
结果清楚地说明，在较高pH下进行水脱胶增加脂质酰基转移酶KLM3′的转移酶活性。即使pH略微增加(如0.1ml NaOH)也使植物甾醇酯的形成增加约50％，几乎不影响油中FFA的形成(增加0.02％)。要考虑到FFA的增加很重要，因为FFA在除臭步骤期间蒸发，并因此视为油损失。
油中磷脂含量分析
表2显示了使用增加量的NaOH(0、0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml和1.9ml)脱胶的油(对照和酶促样品)中磷脂(磷脂酰乙醇胺和磷脂酸)的含量(ppm)。
表2：来自PA、PE、PC的磷含量(ppm)，和通过增加量的4％ NaOH溶液(0、0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml、1.5ml和1.9ml)脱胶的油中总磷含量(ppm)。
Figure BPA00001204796900951
在使用0.1ml NaOH(pH 6.3)脱胶的油中观察到最高的磷降低(40.2ppm)，然而在常规脱胶条件(0ml NaOH)也获得相当的含量。因此，看起来增加pH 1.0单位确实影响KLM3′的水解活性。在pH大于6.3(＞0.2ml NaOH)时，与“常规”酶促条件相比，观察到降低的磷脂降解。
胶中磷脂含量分析
图91显示与对照相比，酶促胶样品中磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇(PI)的相对降解。将对照中磷脂的降解设定为100％，相对于对照计算酶促样品中的含量。
使用0、0.1和0.2ml NaOH的酶促样品中磷脂降解类似。因此，与仅使用KLM3′的酶促脱胶相比，使用小于0.2ml量的NaOH不损害磷脂的降解。相反，在使用较高量NaOH(0.5ml、1ml和1.9ml)的油中观察到降解降低。
结论
在未加工大豆油的水脱胶中通过NaOH增加pH如所预期的证明了增加了KLM3′的活性。增加的植物甾醇酯的形成与增加NaOH含量同时发生。最大植物甾醇酯水平(0.42％)在pH 6.3(0.2ml NaOH)下获得，在此pH后连续下降。在油中FFA也观察到类似的模式，FFA从对照中的0.46％增加至使用0.2ml NaOH脱胶的油中的0.60％，在0.2ml NaOH后开始降低。
少量NaOH不影响KLM3′的水解活性，正如观察到使用0和0.1mlNaOH脱胶的油中磷脂水平相当。在pH在7.5以上(＞0.5ml NaOH)时，与常规酶促脱胶(仅KLM3′)相比，胶相中磷脂降解降低。
最高的油产量增加通过无NaOH的酶促脱胶实现，且通常增加的油产量(％)随NaOH量增加而降低。
本实验的结论是少量NaOH会有利于水脱胶中植物甾醇酯的形成，然而，NaOH对油产量和磷脂降解无积极作用。
实施例5
酶促水脱胶的胶相分析-显微镜和X-射线分析
配方
实验室级水脱胶步骤
将100g未加工大豆油称量，加入有盖的250ml Blue Cap烧瓶中，并加热至55℃。将水加入油中，随后加入酶。将油用Ultra Turrax混合器均质化30秒，并通过450rpm磁力搅拌搅动30分钟。在30分钟后，将油离心(2000rcf，持续3分钟)。将胶相取出用于显微镜和X-射线分析。
结果和讨论
显微镜/X-射线分析
收集来自对照和酶促水脱胶试验的胶(后者根据本发明制备)以用于显微镜和X-射线分析。胶相在不同温度(25℃、35℃、45℃、55℃和65℃)下在显微镜(平面偏振光)中研究。在全部温度下，胶是层状相(被水层分离的脂双层)，如图92中对照和酶促样品(25℃)中所见。
一些区别在对照和酶促样品之间可见。对照胶看起来比本发明的酶促胶化样品更粗糙。对照和酶促样品间的区别也能够从X-射线分析中观察到，如图93所示。
与酶处理样品相比，对照中约
Figure BPA00001204796900972
的较大间距对应于脂肪酸链的长度(C18)。间距表示水和磷脂层，因此，对照中较大间距可解释对照包含脂肪酸的特大单层，或更多水被吸收在胶相中。
实施例6
沉淀研究
配方
Figure BPA00001204796900981
步骤
将200g未加工大豆油称量，加入有盖的250ml Blue Cap烧瓶中，并加热至55℃。将水加入油中，随后加入酶。将油用Ultra Turrax混合器均质化30秒，并通过450rpm磁力搅拌搅动30分钟。在30分钟后，将样品置于分离漏斗中。在1、3和6天后给胶相拍照。在第6天后，取胶用于显微镜分析。
结果
胶相的图片/显微镜法
在图94中，可见对照和酶促样品的油相和胶相。重力沉淀已持续进行3天。在对照和酶促样品间存在明显差别，如从油相和胶相所见。
酶处理油的油相(即根据本发明处理的)比对照更清楚，且与对照相比，观察到胶量降低。结果可从显微镜分析解释(图95)。观察到酶促处理的胶为乳液，而对照胶是层状相。
实施例7
未加工大豆油酶促脱胶中不同水量的评价
配方
实验室级水脱胶步骤
将100g未加工大豆油称量，加入有盖的250ml Blue Cap烧瓶中，并加热至55℃。将水加入油中，随后加入酶。将油用Ultra Turrax混合器均质化30秒，并通过450rpm磁力搅拌搅动30分钟。在30分钟后，将约10ml油转移至12ml离心管(带刻度)中。将油在沸水浴中加热至97℃，持续10分钟。将试管在300rcf下离心3分钟。将油从胶相中倒出，将通过将试管颠倒沥干15分钟。基于胶相的重量，计算油产量。
结果和讨论
油产量
图96显示通过改变水量，从未加工大豆油酶促脱胶获得的油产量增加。通过从对照中胶量减去酶促样品中胶量计算增加的油产量。
与对照相比，酶促脱胶导致油产量增加，且看起来油产量随水量降低而增加。当水从2％降低至1％时，与对照相比，酶促脱胶中油产量约增加50％。
这些计算是基于胶量，因此也包括胶相中甘油三酯含量。检查实际油损失(基于胶量和胶中甘油三酯含量)(图97)，对照中油损失随水含量增加而降低。然而，在酶促脱胶中，油损失有些不受水量的影响。与对照中3.5％-6.5％的油损失相比，酶促脱胶中油损失约2％。
酶促水脱胶中水量减少可在经济上有利于工业(更少的工艺水)，且也最可能涉及胶相干燥期间的节能。
胶相中磷脂降解
图98显示相对于对照，酶促胶相中磷脂酸(PA)和磷脂酰乙醇胺(PE)的相对降解(％)。
使用KLM3′的磷脂降解似乎在较低水浓度下更明显。总之，与使用2％水的脱胶相比，使用KLM3′和1％水的酶促脱胶看起来在磷脂降解方面是有利的。
胶相的粘度测定
来自使用不同量水脱胶的酶促(KLM3′0.2 TIPU-K/g)胶相的粘度显示在图99中。粘度未显著受到不同水含量的影响。在较低剪切速率(至多约10)下，所有样品的粘度有些类似，然而，在此点后，使用最低水量(1.25％)的样品粘度增加，而使用最高水量(2％)的胶样品增加。
实施例8
未加工玉米油的水脱胶
摘要
在未加工玉米油中测试脂质酰基转移酶KLM3′(有时称为K932，且具有本文所示的氨基酸序列SEQ ID No.68)，旨在研究对此油水脱胶中油产量的影响。
材料和方法
酶：
KLM3′K932.1128 TIPU/g
油：
未加工玉米油，来自Cargill，2008年5月
脱胶步骤：
将100g未加工玉米油称量，加入有盖的250ml Blue Cap烧瓶中，并加热至55℃。
加入水和酶，并将油用Ultra Turrax混合器均质化30秒，并随后通过450rpm磁力搅拌搅动30分钟。
在30分钟后，将10ml油转移至12ml涂焦油的(tarred)离心管中，并记录油重量。将油在沸水浴中加热至97℃，持续10分钟，并随后立即在3000rcf下离心3分钟。
将油从胶相中倒出，并通过将试管颠倒沥干15分钟。基于胶相的重量，计算相对于未用酶处理油的油产量。
随后用HPTLC分析胶相，并计算胶相中磷脂的降解。
结果
用不同浓度的KLM3′进行油脱胶方法。
表1：用于未加工玉米油脱胶的配方
Figure BPA00001204796901011
样品如“脱胶步骤”中所述处理，且湿胶量一式两份测定，结果如下。
表2：来自未加工玉米油水脱胶的胶相％
从表2的结果可见KLM3′在未加工玉米油的水脱胶中导致胶相的量降低。胶相量的降低对应于油相从0.28％增加至0.44％。
从未加工玉米油水脱胶分离的胶相通过TLC分析，且相对于未经酶处理的胶量来计算磷脂酰乙醇胺和磷脂酸的降低。(表3)
表3：胶相的TLC分析。PE＝磷脂酰乙醇胺；PA＝磷脂酸
Figure BPA00001204796901022
表3的结果表明KLM3′对未加工玉米油中磷脂的活性。观察到直至0.1TIPU/g油的剂量酶活性增加。在较高酶剂量下，对磷脂的活性达到稳定。
实施例9
未加工大豆油的水脱胶，和受体的加入
在来自Solae的未加工大豆油中测试脂质酰基转移酶KLM3′，旨在研究加入受体底物对酶KLM3′的影响。
在此研究中，测试来自德国Henkel的植物甾醇产品Generol 122和脂肪醇(月桂醇)。
向油中加入植物甾醇产生更多的甾醇酯，同时游离脂肪酸的形成降低。结论为，当有更多受体底物时，可实现较高的磷脂转化率，而脂肪酸产生不增加。
材料和方法
酶：
KLM3′K932(具有SEQ ID No.68所示的氨基酸序列-1128 TIPU/g)来自大豆的植物甾醇：Generol 122N，来自
Figure BPA00001204796901031
lllertissen，Germany。
月桂醇：Sigma L-5375
油：未加工大豆油，来自Solae，2008年1月
大豆卵磷脂混合标准物(ST16)，来自Spectra Lipid，德国。
脱胶步骤：
将100g未加工大豆油、植物甾醇和月桂醇称量，加入有盖的250ml Blue Cap烧瓶中，并加热至55℃。在进一步处理前，将植物甾醇完全溶解在油中。
加入水和酶，并将油用Ultra Turrax混合器均质化30秒，并随后通过450rpm磁力搅拌搅动30分钟。
在30分钟后，将10ml油转移至12ml涂焦油的离心管中，并记录油重量。将油在沸水浴中加热至97℃，持续10分钟，并随后立即在3000rcf下离心3分钟。
将油从胶相中倒出，并通过将试管颠倒沥干15分钟。基于胶相的重量，计算油产量。
油相和胶相随后用HPTLC分析，并计算胶相中甘油三酯的量和油相中磷脂的降解。
结果
油脱胶方法通过不同浓度的KLM3′、植物甾醇和脂肪醇进行，如表1所示。
表1 未加工大豆油脱胶的配方
Figure BPA00001204796901041
样品如“脱胶步骤”中所述处理，且湿胶量一式两份测定，结果显示在图100中。
加入更多量的植物甾醇没有导致胶％的任何降低，pH调节(测验6)对胶量无任何显著影响，不过此测验中具有胶增多的趋势。加入0.2TIPU/gKLM3′对胶含量有显著影响，且显示增加至1TIPU/g进一步降低胶量。月桂醇对胶量无任何影响。
通过GLC分析从胶分离的油相的游离脂肪酸、甾醇和甾醇酯。
表2的结果表明0.2TIPU/g(样品2)酶促处理使游离脂肪酸增加0.09％，但观察到具有增加植物甾醇水平的样品3至5包含较少的游离脂肪酸。在用1TIPU/g处理的样品7和8中，当向油中加入更多甾醇时也观察到游离脂肪酸减少。这些结果表明水解反应随着油中甾醇量增加而降低。
随后应预料到甾醇酯量随油中甾醇增加而增加。这也见于样品3，但随着甾醇(样品4和5)量增加，甾醇酯量未改变。甚至在样品5中观察到甾醇酯量有降低的趋势，但这在实验误差范围内。然而，如前所见，通过加入NaOH调节pH对甾醇酯的形成有很强的作用。酶量增加(样品7和8)也导致甾醇酯形成的增加。
表2 来自样品水脱胶的油相的GLC分析(见表1)
通过样品水脱胶分离的胶相(表1)通过HPTLC分析，并相对于对照样品1来定量某些磷脂(磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酸(PA))的降解。(图101)
图101的结果说明在加入0.25％甾醇时，PA和PE的降解增加。
但是增加剂量(0.5和0.75％甾醇)不进一步导致磷脂降解。这与对甾醇酯形成的作用方面的观察一致(见表2)。通过NaOH的pH调节也对磷脂降解有强作用，但这与酶活性随pH增加而更高有关。
也观察到酶剂量增加至1TIPU/g进一步降解磷脂。
从水脱胶分离的油相通过ICP分析，旨在分析油中残留磷的量。
图102的结果说明油中磷的水平不十分取决于油中甾醇的量，但结果说明酶剂量增加(1TIPU/g)对磷水平有影响。月桂醇(C12醇)的加入对油相中磷的水平有负性影响。
结论
向未加工油中加入脂质酰基转移酶KLM3′催化甾醇酯形成期间脂肪酸部分从磷脂转移至甾醇。在分子水平上，未加工大豆油中甾醇量小于磷脂量的1/3。因为在未加工大豆油中酰基受体甾醇是KLM3′的限制因子，所以水解反应的发生有可能依赖酶剂量和反应时间。
在此研究中，发现当用脂质酰基转移酶KLM3′处理未加工油时，将更多甾醇加入油中将产生更多甾醇酯，且与无甾醇加入的油相比，形成的游离脂肪酸量降低。
在水脱胶后，加入过多甾醇对油相中磷水平无显著影响，但观察到KLM3′剂量增加降低油相中磷水平。加入0.5％月桂醇对游离脂肪酸的水平无显著影响，且通过GLC分析未观察到月桂醇酯。
实施例10
脂质酰基转移酶和磷脂酶C的组合
材料和方法
酶：
脂质酰基转移酶KLM3′K932.1128LATU/g(具有SEQ ID No.68所示的氨基酸序列)
磷脂酶C，Sigma P7633 15单位/mg
油：
未加工大豆油，来自Solae，Aarhus，DK
脱胶步骤：
将100g未加工大豆油称量，加入有盖的250ml Blue Cap烧瓶中，并加热至55℃。加入0.14ml 50％一水合柠檬酸。将油用Ultra Turrax混合器均质化30秒，并随后通过450rpm磁力搅拌搅动15分钟。加入0.367ml 1N NaOH，随后加入2.5％水和5单位/g油的磷脂酶C。将油再用Ultra Turrax混合器均质化30秒，并通过450rpm磁力搅拌搅动。在2小时反应时间后，加入0.2LATU/g油的酶(脂质酰基转移酶KLM3′)，并在搅拌下再继续反应1小时。
将油在沸水浴中加热至97℃，持续10分钟，并随后立即在3000rcf下离心3分钟。
将油相从胶相中倒出。测量胶相和油相的重量。
通过TLC分析油相的残留磷脂，且通过ICP分析磷(ppm)。游离甾醇、甾醇酯、游离脂肪酸和甘油二酯通过GLC分析。
分析胶相的甘油三酯、甘油二酯、残留磷脂和游离脂肪酸。
胶相中磷脂的降解通过TLC分析。
结果
与未使用酶处理的油相比，使用脂质酰基转移酶和磷脂酶C组合的脱胶方法预期增加油产量大于2％。初始研究提示在酶处理的样品中在油相中已产生甘油二酯。
在离心后的油相中，甾醇的主要部分将被酯化。
初步研究显示油相中磷水平小于5ppm和胶相中磷脂的强降解(即，磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)几乎完全消失，和磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酸(PA)的强降解)。
实施例11
脂质酰基转移酶与磷脂酶C组合
材料和方法
酶：
脂质酰基转移酶KLM3′K932.1128LATU/g
磷脂酶C，Sigma P7633 15单位/mg
油：
未加工大豆油，来自Solae，Aarhus，DK
脱胶步骤：
将100g未加工大豆油称量，加入有盖的250ml Blue Cap烧瓶中，并加热至55℃。
加入3％水，随后加入0.1单元/g油的酰基转移酶KLM3′和5单元的磷脂酶C。将油用Ultra Turrax混合器均质化30秒，并随后通过450rpm磁力搅拌搅动30分钟。
在30分钟后，将10ml油转移至12ml涂焦油的离心管中，并注意油重量。将油在沸水浴中加热至97℃，持续10分钟，并随后立即在3000rcf下离心3分钟。
将油相从胶相中倒出，并通过将试管颠倒沥干15分钟。基于胶相的重量，计算油产量。通过TLC和ICP分析油相的残留磷脂。游离甾醇、甾醇酯、游离脂肪酸和甘油二酯通过GLC分析。
分析胶相的甘油三酯、残留磷脂和游离脂肪酸。
结果
初步研究提示，与未使用酶处理的油相比，使用脂质酰基转移酶和磷脂酶C组合的水脱胶方法导致油产量显著增加大于2％。初始研究显示甘油二酯在油相中产生，且油相中甾醇的主要部分被酯化。
实施例12
使用脂质酰基转移酶KLM3′和磷脂酶C(PLC)的酶促脱胶
材料和方法
酶：
脂质酰基转移酶KLM3′K932.1128LATU/g
磷脂酶C，Sigma P7633 15单位/mg
油：
未加工大豆油，来自Solae，Aarhus，DK
脱胶步骤：
将100g未加工大豆油称量，加入有盖的250ml Blue Cap烧瓶中，并加热至55℃。
加入3％水，随后加入5单位/g油的磷脂酶C。用NaOH将pH调节至5.5。将油用Ultra Turrax混合器均质化30秒，并随后通过450rpm磁力搅拌搅动15分钟。在15分钟后，将样品取出，并加入0.1单位/g油的酰基转移酶。将油在55℃下进一步搅动15分钟。
经2x15分钟反应时间后，将10ml油转移至12ml涂焦油的离心管中，并注意油重量。将油在沸水浴中加热至97℃，持续10分钟，并随后立即在3000rcf下离心3分钟。
将油从胶相中倒出，将通过将试管颠倒沥干15分钟。基于胶相的重量，计算油产量。
通过TLC和ICP分析油相的残留磷脂。游离甾醇、甾醇酯、游离脂肪酸和甘油二酯通过GLC分析。
分析胶相的甘油三酯、残留磷脂和游离脂肪酸。
结果
初步研究提示，与未使用酶处理的油相比，使用脂质酰基转移酶和磷脂酶C组合的水脱胶方法使油产量增加大于2.5％。初始研究提示在15分钟后，在油相中已产生甘油二酯。
油相中甾醇的主要部分将被酯化。
初步研究显示在15分钟后，磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰胆碱(PC)的主要部分已消失，但在磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酸(PA)上仍可见较少的活性。在30分钟和离心后，在样品中，PI和PA的主要部分将消失。
实施例13
使用脂质酰基转移酶和磷脂酶C(PLC)的酶促脱胶
在未加工大豆油的水脱胶中，测试单独的脂质酰基转移酶KLM3′(来自Sigma)和磷脂酶C(PLC)以及它们的组合。在油脱胶中，磷脂酶C由油中的磷脂产生甘油二酯。令人惊奇地发现，KLM3′在产生甘油三酯期间能使用甘油二酯作为受体分子。使用包含甘油二酯和磷脂酰胆碱的底物的模型试验确认了脂质酰基转移酶(KLM3′)在甘油三酯的生成期间催化脂肪酸部分从磷脂到甘油二酯的转移反应。
所述结果的商业相关性
此研究的起始目的是现实KLM3′和磷脂酶C(PLC)的组合在未加工植物油脱胶中的显著优点。
现已将来自Verenium，U.S.的磷脂酶C(即Purifine
Figure BPA00001204796901091
)用于油脱胶(WO 2008/036863)。
此酶作用于未加工油中的磷脂(例如磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺)，形成甘油二酯(二酰基甘油)和磷-胆碱、-乙醇胺、-肌醇或-酸。在此过程中产生的甘油二酯将在油脱胶过程期间形成一部分油，并且由此提高油产量。
本发明的发明人已证明，脂质酰基转移酶(例如KLM3′)能够通过改进伴随甾醇酯形成的磷脂来获得提高的油产量。
脂质酰基转移酶(例如KLM3′)能够使用甾醇作为酰基受体以及其他受体，例如醇类，包括脂肪醇。
本研究的目的是研究脂质酰基转移酶(例如KLM3′)与磷脂酶C组合使用时的任何协同作用。
材料和方法：
●KLM3′：甘油磷脂胆固醇酰基转移酶(FoodPro LysoMax Oil)(K932)(SEQ ID No.68)
批号102629600。活性1128LATU/g
●磷脂酶C P7633 Sigma，来自Clostridium perfringens，135.3mg固体：3.8单位/mg固体，13.2单位/mg蛋白质
●磷脂酶C P6621 Sigma，来自蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，250单位
甘油二酯：蒸馏的甘油二酯，来自葵花油，Jour 2641/064
磷脂酰胆碱，Avanti #441601
甘油单酯-甘油二酯-甘油三酯：GRINDSTEDMONO-D1 R 50/D
未加工大豆油18，来自Argentina
HPTLC分析
来自酶处理样品的胶相中磷脂的降解通过HPTLC分析。
点样器：自动TLC点样器4，CAMAG
HPTLC板：20x10cm，Merck号1.05641。使用前在160℃下活化10分钟。
点样：
将来自于10g油的胶相溶解在7.5ml己烷和异丙醇(3∶2)中。
将1μl样品点样到HPTLC板上。
将磷脂标准品(0.5％磷脂(Spectra Lipid，Germany))点样(0.1、0.3、0.5、0.8和1.5μl)，并用于计算胶中单个磷脂。
在一些应用中，相对于未用酶处理的对照胶，计算磷脂含量。将此对照样品点样0.1-0.3-0.5-0.8-1μl，并用于制作校准曲线。
油相。称量约90mg，并溶解在1ml己烷和异丙醇(己烷∶异丙醇＝3∶2)中。
将5μl样品加到HPTLC板上。将5mg/ml已知浓度的甘油单酯-甘油二酯以0.1-0.3-0.5-0.8-1.5μl点样，并用于单个甘油酯成分的计算。
TLC点样器
运行缓冲液1：P-醚∶甲基叔丁基酮∶乙酸＝50∶50∶1
运行缓冲液6：氯仿∶1-丙醇∶乙酸甲酯∶甲醇∶0.25％ KCl水溶液＝25∶25∶25∶10∶9
洗脱：使用来自Camag的自动展开仪ADC2(Automatic Developing Chamber ADC2)将板洗脱7cm。
显影：
将板在Camag TLC Plate Heater III上在160℃下干燥6分钟，冷却，并浸入6％乙酸铜的16％ H3PO4溶液中。在160℃下额外干燥10分钟，并直接评价。
TLC板上成分的密度通过Camag TLC Scanner 3分析。
气相色谱
胶相中游离脂肪酸通过GLC分析。
油相的甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、甾醇和甾醇酯也通过GLC分析。
装置：
●Perkin Elmer Autosystem 9000毛细管气相色谱，安装有WCOT熔融氧化硅柱12.5mx0.25mm IDx0.1μ膜厚度5％苯基-甲基-硅酮(CP Sil 8 CB，来自Chrompack)。
●载气：氦气
●进样器：PSSI冷分流进样(起始温度50℃，加热至385℃)，体积1.0μl
●检测器FID：395℃
炉程序(自2003年10月30日开始使用)：1    2    3
炉温(℃)                          90   280  350
等温，时间(分钟)                  1    0    10
升温速率(℃/分钟)                 15   4
样品制备：
将样品溶解在含0.5mg/ml内标十七烷的12ml庚烷和吡啶(庚烷∶吡啶＝2∶1)中。将500μl样品溶液转移至钳口瓶，加入100μl MSTFA(N-甲基-N-三甲基甲硅烷基-三氟乙酰胺)，并在60℃下反应15分钟。
计算：
基于纯的参比材料，测定甾醇、甾醇酯、游离脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯的响应因子。
试验：
按照表1中所示的配方，使用未加工大豆油在水脱胶方法中测试酰基转移酶KLM3′和PLC。
表1
Figure BPA00001204796901121
来自产气荚膜梭菌的磷脂酶C P7633 Sigma，135.3mg固体：3.8单位/mg固体，32.9mg酶在0.5mL水中
来自蜡状芽孢杆菌的磷脂酶C P6621 Sigma，250单位溶于1ml水
稀释至10LATU/ml的酰基转移酶KLM3′(K932)
将未加工大豆油在20ml的Wheaton玻璃瓶中加热至45℃。添加水和酶。
通过高剪切混合30秒将样品均质化。
将样品放置在带有磁力搅拌的45℃加热器(heating block)上。
在30和240分钟后取出1mL样品放入Eppendorf管中，并在97℃将酶灭活10分钟。值得注意地，尽管在此试验中进行了酶灭活，但在工业实践中通常不进行。在本试验中进行灭活仅仅是为了对酶降解进行准确分析。
将样品在3000rcf下离心3分钟。将油相与胶相分离，并通过TLC和GLC分析所述胶相和油相。
结果
TLC分析
通过TLC分析在30分钟和240分钟后取出的样品，结果显示在图103至106中。
扫描TLC平板(图103和图104)，并将其用于1，2-甘油二酯(DAG sn1，2)的定量测定，结果显示在下表2和表3中。
磷脂的相对降解显示在图107中。
表2：反应时间30分钟后油相的TLC分析
Figure BPA00001204796901141
表3：反应时间240分钟后油相的TLC分析
Figure BPA00001204796901142
上述表2和表3的结果清楚地表明磷脂的PLC降解导致了甘油二酯的形成。观察到随着所使用PLC的剂量，sn 1，2-甘油二酯的形成在30分钟的反应时间后已经达到其最大值。还观察到在与PLC组合使用时，sn 1，2-甘油二酯的量随着KLM3′剂量的增加而减少。
在两种磷脂酶C中均观察到了这种效应，但在将KLM3′与来自产气荚膜梭菌的磷脂酶C P7633 Sigma组合使用时，此效应最为显著。关于这一点，最有可能的解释是来自产气荚膜梭菌的PLC仅降解小部分磷脂，所以KLM3′可用的底物更多。
图107中的结果也清楚地显示来自产气荚膜梭菌的磷脂酶C P7633 Sigma主要作用于磷脂酰胆碱(PC)，而来自蜡样芽孢杆菌的磷脂酶C P6621 Sigma主要作用于磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)，而对磷脂酸和磷脂酰肌醇(PI)具有较少的活性。此结果还验证了KLM3′可使用所有4种类型的磷脂。
因此，结论为酰基转移酶KLM3′能够使用sn1，2-甘油二酯作为受体分子，并催化图108中的反应。
GLC分析
还通过GLC分析了来自表1中试验的油相样品第1-6号。
总甘油二酯(DAG)、甾醇、甾醇酯和FFA的GLC分析列出于下表4中。
Figure BPA00001204796901151
对在反应时间30分钟和240分钟后取出的样品的GLC分析确认了TLC分析观察到的结果，即来自产气荚膜梭菌的磷脂酶C P7633 Sigma从油中的磷脂产生了甘油二酯。这些结果还确认了磷脂酶C与KLM3′组合时通过减少甘油二酯的量产生协同作用。使用统计绘图软件通过ANOVA进行的PLC和KLM3′对甘油二酯量的影响的统计评估清楚地表明了这两种酶之间的相互作用，参见图109。
PLC对油中的甾醇没有显著的影响，但KLM3′将游离甾醇转化成甾醇酯。对于KLM3′，甾醇是比DAG更好的受体分子，因此，在反应中仅有10-15％的DAG被转化成甘油三酯。
PLC对游离脂肪酸(FFA)水平没有太大的影响，但观察到高剂量KLM3′和延长的反应时间有助于提高FFA水平。
试验编号2460-224：
尽管不希望被理论束缚，通过组合酰基转移酶(KLM3′)和磷脂酶C(PLC)使甘油二酯减少可能是由两种酶在一起使用时的底物(磷脂)竞争引起的。
为了证明KLM3′能够使用甘油二酯作为受体，并催化图108中所示的反应，使用表5中所示的配方进行了模型试验。
表5：用于研究KLM3′对甘油二酯/磷酸胆碱底物的酰基转移酶作用的配方
  1   2   3   4   5   6
  甘油二酯/PC80/20   g   3   3   3   3   3   3
  酰基转移酶KLM3′：300LATU/g   ml   0   0.01   0.01   0.01
  缓冲液   ml   0.03   0.03   0.03   0.03   0.03   0.03
  水3％盐   0.01   0.01   0.01
  缓冲液1：100mM乙酸盐pH 5.5   X   X
  缓冲液2：100m MHEPES pH 7   X   X
  缓冲液3：100mM MES pH 6   X   X
将基于葵花油蒸馏的甘油二酯和磷脂酰胆碱混合并搅动加热至80℃，直至PC溶于甘油二酯。
在带有螺盖的7ml Dram玻璃管中称量底物并加热至55℃。加入酶、缓冲液和水，并使用磁力搅拌在450rpm搅动样品。
在30和180分钟后，取出样品，并通过TLC分析(图110)。
扫描TLC平板，并根据由菜籽油分析制成的标准曲线对样品中的甘油三酯含量进行定量，结果显示在下表6中。
Figure BPA00001204796901171
使用统计制图软件通过ANOVA分析表6中所示的结果，结果显示在图111和图112中。
对表6所得甘油三酯结果的统计分析确认了通过向包含甘油二酯和磷脂酰胆碱的底物中添加酰基转移酶KLM3′使甘油三酯的量显著增加。
试验编号2460-228
进一步详细研究了上述表5中所示的试验，以测试较高的含水水平在甘油三酯形成中对脂肪酸部分从磷脂到甘油二酯的转移反应的影响。下表7中列出了试验设定。
表7：用于研究KLM3′对甘油二酯/磷脂酰胆碱底物的酰基转移酶作用的配方
Figure BPA00001204796901181
将基于葵花油蒸馏的甘油二酯和磷脂酰胆碱(PC)混合并搅动加热至80℃，直至PC溶于甘油二酯。
在带有螺盖的7ml Dram玻璃管中称量底物并加热至55℃。加入酶、缓冲液和水，并使用磁力搅拌在450rpm搅动样品。
在30、90和240分钟后，取出样品，并通过TLC分析。
TLC色谱图显示在图113和图114中。
扫描TLC板，并基于由甘油三酯(菜籽油)制成的校准曲线计算样品中的甘油三酯含量。甘油三酯的测定结果显示于表8中。
表8：与酰基转移酶KLM3′一起温育的甘油二酯/PC底物中的甘油三酯分析
Figure BPA00001204796901182
使用统计制图软件通过ANOVA分析表8中的结果，结果显示在图115和图116中。
表8以及图115和图116中的结果清楚地证明了酰基转移酶KLM3′由甘油二酯和磷脂酰胆碱底物产生甘油三酯的能力。
结论
已知脂质酰基转移酶KLM3′和磷脂酶C(PLC)有助于提高植物油脱胶中的油产量。
脂质酰基转移酶KLM3′在油脱胶中的作用是基于溶血磷脂和甾醇酯的产生期间，脂肪酸部分从磷脂到甾醇的转移反应。
磷脂酶C(PLC)的作用依赖于磷脂到甘油二酯和水溶性磷衍生物的转化。此反应产生的甘油二酯将通过脱胶方法累积在油相中，但由于甘油二酯会影响油的发烟点，并且还影响较多饱和脂肪源的结晶性质，所以并不总是优选油具有高的甘油二酯。
在本研究中，在水脱胶方法中测试单独的脂质酰基转移酶KLM3′和磷脂酶C(PLC)以及它们的组合。试验显示PLC在大豆油的水脱胶中产生形成油相部分的甘油二酯。将PLC与KLM3′组合使用时，令人惊奇地发现PLC产生的甘油二酯量下降，并且甾醇被转化成甾醇酯，表明这两种酶之间的协同作用，这是因为KLM3′在甘油三酯形成期间催化脂肪酸部分从磷脂到甘油二酯的转移反应。
在由甘油二酯和磷脂组成的模型体系中确认了在甘油三酯形成期间，由KLM3′催化的脂肪酸部分从磷脂到甘油二酯的转移反应。
结果还显示所测试的两种磷脂并非对所有类型的磷脂都均有相同的活性，但KLM3′对未加工大豆油中存在的所有四种磷脂均有几乎相同的活性。这还提供了将磷脂酶C与KLM3′组合使用以获得进一步磷脂转化的可能性。
实施例14
KLM3′在未加工大豆油水脱胶中的应用
包括大豆油在内的植物油包含1-3％的磷脂，其通过油脱胶过程被去除。油脱胶过程通常被分成水脱胶过程和中和过程。未接受水脱胶的含1-3％磷脂的未加工大豆油不能运输出口，其中所述水脱胶的目的是将磷水平降低至200ppm磷或更低以满足水脱胶未加工油的规格。
如果磷水平大大低于200ppm，这可能是不利的。常规脱胶在离心后通常得到约50ppm的磷水平。这是因为不能控制离心机以得到小于200ppm但与此水平尽可能接近的磷水平。
与此相反，在使用脂质酰基转移酶的本发明中，经水脱胶的油可优选调整至约180ppm磷。
本发明对酶促水脱胶过程中磷的调整可优选通过调整离心机中胶和油之间的界面，以使稍多的磷脂进入油相而完成。然而，在常规水脱胶法中，胶相非常厚重粘稠，因此调整离心机中的该界面并不容易。
本发明的发明人令人惊奇地发现，在水脱胶过程中使用脂质酰基转移酶(例如，KLM3′)时，能调整该界面而没有离心机中的问题，并能产生更接近于200ppm磷的最大规格的脱胶油。
试验
将脂质酰基转移酶KLM3′(SEQ ID No.68)用于图117中所示的未加工大豆油的水脱胶方法中。
在图117中所示的水脱胶法中使用包含1100ppm磷的未加工大豆油。在第一个试验中进行所述脱胶法而没有添加酶。在第二个试验中添加酶KLM3′，并且在分析水脱胶油中的磷含量后，将离心机中的胶和油界面调整到离心机的中部。当操作过程再次平衡后，重新分析磷。
结果显示于下表1中。
表1
*不显著
结论
在使用KLM3′进行酶促水脱胶的试验中，显示能够容易地调整或控制离心机中油和胶之间的界面，以产生磷水平接近标准(即更接近但小于200ppm)水脱胶油。
在常规水脱胶条件下，并不总能容易地调整所述界面，这是因为胶相的粘稠度(高粘度)不允许此类调整。
实施例15
在对植物油进行酶促水脱胶后，“胶相”中的酶促反应
在未加工大豆油的水脱胶中测试脂质酰基转移酶LysoMax Oil(KLM3′)。值得注意地，如工业常规操作那样，在酶促水脱胶过程结束时不进行酶灭活。因此，根据下文所示试验步骤进行酶促水脱胶过程。注意，在脱胶后不进行酶灭活。
将通过该方法分离的胶相在40℃温育，并分析胶相中磷脂的进一步降解。所得结果令人惊奇地显示，酶进一步将磷脂水解成溶血磷脂和游离脂肪酸。这由通过离心从油相分离胶相时，酶与胶相结合的事实来解释。
此外，溶血磷脂在贮存期间被水解，并且在贮存7天后，几乎所有的磷脂都从胶相中消失。
所述结果的商业相关性
使用KLM3′对未加工大豆油的酶促油脱胶显示能将油产量从0.5％提高到1.5％。由此方法分离的胶相通常仍包含一些油和磷脂(EP 1 624 047)。已知通过胶相的水解，可从胶中分离油相，其可通过离心或其他分离方式分离。包含高水平游离脂肪酸的油相可作为酸性油销售，其价值高于添加到膳食中的通常胶相。
另一方面，在分离酸性油后剩余的固相具有高于通常胶的磷水平，由此可以用作有机磷源。
介绍
本发明的发明人令人惊奇地发现，脂质酰基转移酶LysoMax Oil(KLM3′)在从未加工大豆油的酶促水脱胶分离的胶相中具有活性。因此，推测酶是否能进一步将磷脂降解成游离脂肪酸，然后通过离心可将作为酸性油的游离脂肪酸与胶相中剩余的甘油三酯一起分离。
在此研究中，测试了不同酶剂量和水脱胶温度对胶相中磷脂降解的影响。
材料和方法
●KLM3′：甘油磷脂胆固醇酰基转移酶(FoodPro LysoMax Oil)(K932)
批号102629600.1；活性1128LATU/g
未加工大豆油18号：来自阿根廷
HPTLC分析
通过HPTLC分析来自酶处理样品的胶相中的磷脂的降解。
点样器：自动TLC点样器4，CAMAG
HPTLC板：20x10cm，Merck no.1.05641.使用前在160℃活化10分钟。
点样：
将来自10克油的胶相溶解于7.5ml己烷∶异丙醇(3∶2)中。
将1μl样品点样到HPTLC板上。
将磷脂标准品(0.5％磷脂(Spectra Lipid，Germany))点样(0.1、0.3、0.5、0.8和1.5μl)并用于计算胶中的单个磷脂。
在一些点样中，计算相对于未经酶处理的对照胶的磷脂含量。将此对照样品以0.1-0.3-0.5-0.8-1μl点样，并用于绘制校准曲线。
油相：称量约90mg并溶于1ml己烷∶异丙醇(3∶2)中。
将5μl样品点样到HPTLC板上。将浓度已知的5mg/ml甘油单酯-二酯以0.1-0.3-0.5-0.8-1.5μl点样并用于计算单个甘油脂成分。
TLC点样器
运行缓冲液1：P-醚∶甲基叔丁基酮∶乙酸＝50∶50∶1
运行缓冲液6：氯仿∶1-丙醇∶乙酸甲酯∶甲醇∶0.25％ KCl水溶液＝25∶25∶25∶10∶9
洗脱：使用来自Camag的自动展开仪ADC2(Automatic Developing Chamber ADC2)将板洗脱7cm。
显影：
将板在Camag TLC Plate Heater III上在160℃下干燥10分钟，冷却，并浸入6％乙酸铜的16％H3PO4溶液中。在160℃下额外干燥10分钟，并直接评价。
TLC板上成分的密度通过Camag TLC Scanner 3分析。
气相色谱
胶相中游离脂肪酸通过GLC分析。
油相的甾醇、甾醇酯以及甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯也通过GLC分析。
装置
●Perkin Elmer Autosystem 9000毛细管气相色谱，安装有WCOT熔融氧化硅柱12.5mx.25mm IDx0.1μ膜厚度5％苯基-甲基-硅酮(CP Sil 8 CB，来自Chrompack)。
●载气：氦气
●进样器：PSSI冷分流进样(起始温度50℃，加热至385℃)，体积1.0μl
●检测器FID：395℃
炉程序(自2003年10月30日开始使用)：1    2    3
炉温(℃)                          90   280  350
等温，时间(分钟)                  1    0    10
升温速率(℃/分钟)                 15   4
样品制备：
将样品溶解在含0.5mg/ml内标十七烷的12ml庚烷和吡啶(庚烷∶吡啶＝2∶1)中。将500μl样品溶液转移至钳口瓶，加入100μl MSTFA(N-甲基-N-三甲基甲硅烷基-三氟乙酰胺)，并在60℃下反应15分钟。
计算
基于纯的参比材料，测定游离脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯的响应因子。
试验：
按照下表1中所示的配方在未加工大豆油中测试脂质酰基转移酶KLM3′。
表1中的脱胶试验在45℃和55℃进行。
Figure BPA00001204796901241
在20ml Wheaton玻璃管中将未加工大豆油加热至55℃(或45℃)。添加水和酶。通过高剪切混合将样品均质化30秒。将样品放置在带有磁力搅拌(450rpm)的55℃(或45℃)加热器上。在温育30分钟后将样品在3000rcf离心3分钟。
通过将管倒置15分钟，将油相与胶相分开，将胶留在管中。
随后立即冷冻样品1-4每个的胶相。
将样品5-8的胶相均在40℃温育1天，然后冷冻。
将样品9-12每个的胶相均在40℃温育7天。
在相同的时间通过TLC和GLC分析所有样品。
结果：
对来自在55℃脱胶样品的胶相的TLC分析显示在图118中，在45℃脱胶样品显示在图119中。
基于TLC色谱图的扫描，计算了酶处理胶相中磷脂相对于没有酶处理的胶相的相对含量(参见下表2和表3)。
表2：在55℃水脱胶的胶相中的相对磷脂
Figure BPA00001204796901251
表2：在45℃水脱胶的胶相中的相对磷脂
在脱胶反应和离心后立即取出第0天的胶相样品。此时大部分磷脂已经降解，并可见溶血磷脂量增加(表2)。在胶相的温育期间，磷脂发生进一步的水解，但溶血磷脂也被水解。
通过GLC分析胶相的游离脂肪酸(FFA)和甘油三酯(见下表3)。
使用己烷∶异丙醇(2∶1)提取部分胶相两次，将不溶部分干燥并按重量定量。
表3：胶相和不溶物质中FFA和甘油三酯的GLC分析
Figure BPA00001204796901261
表3中所示的结果清楚地确认了胶相在40℃贮存直至7天期间持续的酶促水解。
有机溶剂(己烷∶异丙醇，2∶1)不能萃取的胶相含量是测量胶相中固体量的量度。当胶相中的磷脂水解成FFA和磷脂酰甘油时，己烷∶异丙醇中不溶物质的量增加。在温育7天后，胶相中90％以上由FFA、甘油三酯和磷脂酰甘油组成，并且胶相中没有剩余的磷脂。因为胶相中没有剩余的乳化剂(磷脂和溶血磷脂)，温育后胶相的组成使其更易于分离成油相和固体/水溶相。
结论
在使用脂质酰基转移酶(例如KLM3′)进行酶促脱胶期间，包含活性酶的胶相被分离。胶相在40℃温育使胶相中的磷脂进一步水解。依赖于酶的剂量，所有的磷脂和溶血磷脂均水解成脂肪酸和磷脂酰甘油。胶相中磷脂的消除使有可能分离胶相中包含游离脂肪酸和剩余的甘油三酯的油相。
在55℃进行的脱胶试验中，观察到的磷脂降解高于在45℃进行的脱胶试验。在这两个试验中，酶在分离后的胶相中均具有活性，因此在55℃进行水脱胶时，有在40℃贮存期间总水解程度较高的趋势。
以上说明书提到的全部出版物均通过引用并入本文。本发明所述方法和体系的各种改进和改变对本领域的技术人员来说都是清楚的，而不脱离本发明的范围和精神。尽管已参照具体优选实施方式描述了本发明，但是应该理解所主张的发明不仅限于所述具体实施方式。事实上，对于生物化学领域和生物工程学领域或相关领域的普通技术人员而言显而易见的那些对所述发明实施方式的各种修改意欲包含在权利要求的保护范围内。
                           保藏证明
        布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
Figure BPA00001204796901281
1 当适用细则6/4(d)时，此日期为国际保藏单位获得资格的日期。
表 BP/4(单页)
            布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
Figure BPA00001204796901291
1指原始保藏日，或者，当进行了新保藏或转保藏时，指最新近的相关日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于涉及细则10.2(a)(ii)和(iii)的情况，指最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
表 BP/9(第一页)
4 如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
表 BP/9(第二页且为最后一页)
     布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
Figure BPA00001204796901311
1当适用细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位获得资格的日期。
表BP/4(单页)
        布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
1指原始保藏日，或者，当进行了新保藏或转保藏时，指最新近相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于涉及细则10.2(a)(ii)和(iii)的情况，指最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
表BP/9(第一页)
Figure BPA00001204796901331
4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
表BP/9(第二页且为最后一页)
      布达佩斯条约有关用于专利程序的国际认可的微生物保藏
Figure BPA00001204796901341
1当适用细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位获得资格的日期。
表BP/4(单页)
      布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
Figure BPA00001204796901351
1指原始保藏日，或者，当进行了新保藏或转保藏时，指最新近相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于涉及细则10.2(a)(ii)和(iii)的情况，指最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
表 BP/9(第一页)
Figure BPA00001204796901361
4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
表 BP/9(第二页且为最后一页)
         布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
Figure BPA00001204796901371
1当适用细则6.4(d)时，所述的日期为国际保藏单位获得资格的日期。
表 BP/4(单页)
       布达佩斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏
Figure BPA00001204796901381
1指原始保藏日，或者，当进行了新保藏或转保藏换时，指最新近相关的日期(新保藏的日期或是转保藏的日期)。
2对于涉及细则10.2(a)(ii)和(iii)的情况，指最近的存活性检验。
3用打叉表示选定。
表 BP/9(第一页)
Figure BPA00001204796901391
4如果要求该信息并且如果检验为阴性，则填写此项。
表 BP/9(第二页且为最后一页)

Claims (34)

1.食用油(优选未加工食用油)的水脱胶方法，所述方法包括以下步骤：a)将约0.1-5％w/w水与食用油(优选未加工食用油)和脂质酰基转移酶混合，b)将混合物在约45℃至约90℃下搅动约10分钟至180分钟，和c)分离油相和胶相。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括：d)温育包含活性脂质酰基转移酶的胶相最少约2小时至最长7天的时间，和e)从所述胶相分离油。
3.用于处理胶相(优选可通过食用油脱胶获得或通过食用油脱胶获得，所述脱胶例如为水脱胶或酶促脱胶或其组合)的方法，其中将胶相与单独的一种或多种脂质酰基转移酶一起温育或者与一种或多种脂质酰基转移酶和一种或多种磷脂酶C的组合一起温育最少约2小时至最长7天的时间，并从所述胶相分离油。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法的pH在约pH 5.0至约pH 10.0之间。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶包含GDSx基序和/或GANDY基序。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为具有酰基转移酶活性并包含氨基酸序列基序GDSX的酶，在GDSX中X是以下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一个或多个。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于本发明任一方法和/或应用的脂质酰基转移酶可获自于，优选获自于一种或多种以下属的生物：气单胞菌属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrionaceae)、木杆菌属(Xylella)、硫叶菌属(Sulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、李斯特菌属(Listeria)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和假丝酵母属(Candida)。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶可获自于，优选获自于气单胞菌属的生物。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，所述多肽是通过表达以下所示的任一核苷酸序列或与其具有75％或更高同一性的核苷酸序列获得的：SEQ ID No.49、SEQ ID No.36、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ ID No.44、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62或SEQ ID No.63。
10.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，所述多肽是通过表达以下序列获得的：
a)SEQ ID No.49所示的核苷酸序列，或与其具有75％或更高同一性的核苷酸序列；
b)编码所述多肽的核酸，其中所述多肽与SEQ ID No.16所示的多肽序列或SEQ ID No.68所示的多肽序列具有至少70％同一性；或
c)在中度严谨条件下与包含SEQ ID No.49所示核苷酸序列的核酸探针杂交的核酸。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶是通过在地衣芽孢杆菌中表达所述核酸序列而获得的。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，所述多肽包含以下所示的任一氨基酸序列或与其具有75％或更高同一性的氨基酸序列：SEQ ID No.68、SEQ ID No.16、SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，所述多肽包含SEQ ID No.68所示的氨基酸序列或与其具有75％或更高同一性的氨基酸序列。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中另外将磷脂酶C与油和/或水和/或脂质酰基转移酶混合。
15.脂质酰基转移酶在食用油水脱胶中用于提高在水脱胶过程完成后油相中的油产量的应用。
16.脂质酰基转移酶在食用油水脱胶中用于降低在水脱胶过程完成后胶相的粘度的应用。
17.脂质酰基转移酶与磷脂酶C的组合在食用油水脱胶中用于提高油产量和/或用于提高在水脱胶过程完成后油相中的甘油三酯水平和/或用于降低在水脱胶过程完成后油相中的甘油二酯水平的应用。
18.脂质酰基转移酶(或脂质酰基转移酶与磷脂酶C的组合)在胶相(可通过食用油脱胶获得或通过食用油脱胶获得，所述脱胶例如为水脱胶、酶促脱胶或其组合)温育中用于提高油产量和/或与未处理胶相比产生具有改进的磷水平的固相(分离酸性油之后)的应用。
19.如权利要求15-18中任一项所述的应用，其中将0.1-4％w/w的水与食用油混合。
20.如权利要求15-19中任一项所述的应用，其中在约45℃至约90℃范围的温度下将所述酶添加到食用油中。
21.如权利要求15-20中任一项所述的应用，其中所述脱胶过程的pH在约pH 5.0至约pH 10.0之间。
22.如权利要求15-21中任一项所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶与所述食用油反应约10分钟至180分钟之间。
23.如权利要求15-22中任一项所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶包含GDSx基序和/或GANDY基序。
24.如权利要求15-23中任一项所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为具有酰基转移酶活性并包含氨基酸序列基序GDSX的酶，在GDSX中X是以下氨基酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S中的一个或多个。
25.如权利要求15-24中任一项所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶可获自于，优选获自于一种或多种以下属的生物：气单胞菌属、链霉菌属、酵母菌属、乳球菌属、分枝杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、脱亚硫酸菌属、芽孢杆菌属、弯曲杆菌属、弧菌属、木杆菌属、硫叶菌属、曲霉属、裂殖酵母属、李斯特菌属、奈瑟氏菌属、中慢生根瘤菌属、雷尔氏菌属、黄单胞菌属和假丝酵母属。
26.如权利要求25所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶可获自于，优选获自于气单胞菌属的生物。
27.如权利要求15-26中任一项所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶是通过表达以下所示的任一核苷酸序列或与其具有75％或更高同一性的核苷酸序列获得的：SEQ ID No.49、SEQ ID No.36、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ ID No.44、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48、SEQ IDNo.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62或SEQ ID No.63。
28.如权利要求15-27中任一项所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶是通过表达以下序列获得的多肽：
a)SEQ ID No.49所示的核苷酸序列，或与其具有75％或更高同一性的核苷酸序列；
b)编码所述多肽的核酸，其中所述多肽与SEQ ID No.16所示的多肽序列或SEQ ID No.68所示的多肽序列具有至少70％同一性；或
c)在中度严谨条件下与包含SEQ ID No.49所示核苷酸序列的核酸探针杂交的核酸。
29.如权利要求28所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶是通过在地衣芽孢杆菌中表达所述核酸序列而获得的。
30.如权利要求15-29中任一项所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶是包含以下所示的任一氨基酸序列或与其具有75％或更高同一性的氨基酸序列：SEQ ID No.68、SEQ ID No.16、SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35。
31.如权利要求15-30中任一项所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶是包含SEQ ID No.68所示的氨基酸序列或与其具有75％或更高同一性的氨基酸序列的多肽。
32.如权利要求15-31中任一项所述的应用，其中所述脂质酰基转移酶与磷脂酶C组合使用。
33.参照本文实施例和附图，基本如本文定义的方法。
34.参照本文实施例和附图，基本如本文定义的应用。
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