CN110699334B - 一种酰基转移酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种酰基转移酶及其应用,属于酶工程技术领域。本发明的酰基转移酶,可应用于磷脂纯化、油脂精炼等领域。具体来说,该酰基转移酶可将磷脂中羧基转化为羟基,消除磷脂制备过程中非水化磷脂产生的磷酸脂钙镁盐的影响,使制备的大豆浓缩磷脂达到透明、稳定的状态。另外,该酰基转移酶在食用油脂精炼过程中,产品中甘油二酯含量有一定提高,从而增加油脂工业的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域,具体涉及一种酰基转移酶及其应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
植物油脂是人类生存不可缺少的食品,植物油脂精炼技术也备受关注,随着植物油脂油脂工业的发展及人们对植物油脂加工原理的进一步认识,植物油脂精炼技术有了新进展。2001年徐振山在“粮食与油脂”杂志上发表“国产浓缩大豆磷脂质量制约因素分析”,国产磷脂与进口磷脂相比,质量相差甚远,特别是浓缩磷脂,在色泽、透明度、气味方面远不如进口产品,而造成这种原因的真凶则是原料大豆中的磷脂,更确切地讲,是原料大豆中非水化磷脂(NHPL)所致。所以,选择一种酰基转移酶,使非水化磷脂(NHPL)变成水化磷脂(NHPL),是目前提高植物油有效分离磷脂,并提高磷脂质量的关键。
近年来,甘油二酯由于其优越的性能备引起了科研工作者广泛的关注。甘油分子上的三个羟基提供了与脂肪酸结合生成酯类产品的三个位点。常见的油和脂肪是三个羟基均与脂肪酸结合产生酯基的甘油酯,称为甘油三脂。当甘油分子只有两个羟基形成酯基时,称为甘油二脂。甘油二酯可广泛应用于多种领域,如提高油脂塑性的添加剂,食品工业中的食用营养油,以及生产化妆品、药品生产的基材等。一般来说,甘油二酯的制备方法包括:甘油与脂肪酸的酯化反应,甘油与甘油三酯的醇交换反应。使用的催化剂为碱或生物酶。相关领域已有多篇文献专利报道。例如:专利CN200310112327、CN2004100153484、CN2005101350520、CN2006100357438、CN2006100492425、CN2006100681944、CN2007100302730、CN200810205018、CN2008801023446,以及华南理工大学宁正祥、王卫飞“酶法甘油解合成甘油二酯工艺的研究”,青岛农业大学王宝维、韩海娜“酶解法催化鹅油制备甘油二酯”,南昌大学李建科、董攀“脂肪酶水解法制备1,3-甘油二酯及脂肪酶的固定化研究”。这些科研成果主要是通过选择不同的生物酶催化,实现甘油三酯的不完全水解或者由甘油和脂肪酸直接合成甘油二酯。而专利和文献报道以上的水解酶能够使植物油中的其中的一个或两个羧基被羟基取代,但不能催化非水磷脂变成水化磷脂。因此,在油脂精炼工艺中,选择一种既能消除非水化磷脂又能提高甘油二酯的酰基转移酶,可大大增加油脂工业的经济效益。
目前,消除非水化磷脂一般采用植物油脂酶法脱胶工艺。专利CN 102634411A、CN102533440B、CN107267282A等都介绍了食用油酶法脱胶方法及工艺。与化学和物理脱胶方法相比,酶法具有成本低、产率高、安全环保等优点。但发明人发现,酶催化的脱胶反应耗时太长,且由于磷脂被磷脂酶水解成溶血磷脂和脂肪酸盐,易乳化而引起中性油损失。
发明内容
针对现有技术中的不足,本发明的目的在于提供一种酰基转移酶及其应用。经试验证明,本发明提供酰基转移酶,可应用于磷脂纯化、油脂精炼等领域。具体来说,该酰基转移酶可将磷脂中羧基转化为羟基,消除磷脂制备过程中非水化磷脂产生的磷酸脂钙镁盐的影响,使制备的大豆浓缩磷脂达到透明、稳定的状态。另外,该酰基转移酶在食用油脂精炼过程中,产品中甘油二酯含量有一定提高,从而增加油脂工业的经济效益,因此具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的,本发明的技术方案如下:
本发明的第一个方面,提供一种多肽,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第二个方面,提供一种多肽类似物,其具有与所述多肽相同的生物活性,所述多肽类似物是指在用所述多肽和另一种化合物融合或者用所述多肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。
本发明的第三个方面,提供一种多肽衍生物,其氨基酸序列具有与所述多肽氨基酸主序列≥70%的一致性,≥90%的相似性,该衍生物是指把所述多肽的氨基酸序列中的一个或者几个氨基酸的某个基团用另外的基团取代后且与所述多肽具有同样生物活性的多肽。
本发明的第四个方面,提供一种多肽变体,其氨基酸序列具有与多肽氨基酸主序列≥70%的一致性,≥90%的相似性,该变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列,所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中,在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸,或在序列两端添加氨基酸或核苷酸,所述多肽变体具有与上述多肽相同的生物活性。
本发明的第五个方面,提供编码所述多肽、多肽类似物、多肽衍生物或多肽变体的核苷酸,其包含下组中的任一种:
a)编码具有所述氨基酸序列的多肽或类似物、衍生物或其变体的核苷酸;
b)与a)所述核苷酸互补的核苷酸;
c)与a)或b)中所述核苷酸具有≥75%序列一致性的核苷酸。
所述核苷酸采用人工合成方法制备。
本发明的第六个方面,提供所述多肽、多肽类似物、多肽衍生物或多肽变体作为酰基转移酶在磷脂纯化或油脂精炼中的应用。
所述应用具体为:上述多肽、多肽类似物、多肽衍生物或多肽变体发挥酰基转移酶催化作用,使植物油中的磷脂中的一个或两个脂肪酸基由羟基取代,将非水化磷脂转化为水化磷脂。
本发明的第七个方面,提供一种植物磷脂纯化的方法,所述方法包括植物毛油预热—调节pH—酶混合—酶解—灭酶。
具体的,植物毛油预热至30-60℃,调节pH至5-8,按100-2000U/g混合油比例加入上述多肽、多肽类似物、多肽衍生物或多肽变体中的一种或多种进行酶解反应,酶解时间控制在0.5-3小时,将反应体系高温灭酶,将毛油进行水化脱胶处理,经过离心及蒸出水分后得到纯化磷脂。
其中,所述酰基转移酶为上述多肽、多肽类似物、多肽衍生物或多肽变体中的一种或多种。
需要说明的是,所述酰基转移酶在实际应用中,可固定在载体上,有利于酶解反应的持续进行,同时也有利于回收利用。所述载体包括但不限于活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃中的一种或多种。
具体的,其中所述植物毛油包括大豆油、椰子油、橄榄油、菜籽油、玉米油、棉籽油、棕榈油、棕榈仁油、花生油、红花油、豆油、葵花籽油、米糠油、玉米麸油、琉璃苣油、月见草油、亚麻籽油、葡萄籽油、亚麻籽油、苜蓿油、杏仁籽油、杏仁油、鳄梨油、巴巴苏油、猴面包树油、黑加仑籽油、巴西坚果油、可可籽油、山茶油、胡萝卜油、腰果油、榛子油、麻籽油、猕猴桃籽油、澳洲坚果油、芒果籽油、瓜籽油、尼日尔籽油、桃仁油、紫苏子油、阿月浑子油、罂粟油、南瓜子油、红毛丹果籽油、玫瑰果油、香油、谢伊籽油、高油、核桃油、小麦胚芽油中的一种或多种。
与现有技术相比,本发明取得了以下有益效果:
本发明提供的酰基转移酶,其可应用于磷脂纯化、油脂精炼等领域。该酰基转移酶可将磷脂中羧基转化为羟基,消除磷脂制备过程中非水化磷脂产生的磷酸脂钙镁盐的影响,使制备的大豆浓缩磷脂达到透明、稳定的状态。另外,经研究发现,本发明提供的酰基转移酶在食用油脂精炼过程中,产品中甘油二酯含量有一定提高,这也增加了油脂工业的经济效益,具有良好的实际应用之价值。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明,以下实例仅是为了解释本发明,并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件,通常按照常规条件,或按照试剂公司所推荐的条件;下述实施例中所用的试剂、耗材等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
本发明的一个具体实施方式中,提供一种多肽,所述多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
本发明的又一具体实施方式中,提供一种多肽类似物,其具有与所述多肽相同的生物活性,所述多肽类似物是指在用所述多肽和另一种化合物融合或者用所述多肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。
本发明的又一具体实施方式中,提供一种多肽衍生物,其氨基酸序列具有与所述多肽氨基酸主序列≥70%的一致性,≥90%的相似性,该衍生物是指把所述多肽的氨基酸序列中的一个或者几个氨基酸的某个基团用另外的基团取代后且与所述多肽具有同样生物活性的多肽。
本发明的又一具体实施方式中,提供一种多肽变体,其氨基酸序列具有与多肽氨基酸主序列≥70%的一致性,≥90%的相似性,该变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列,所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中,在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸,或在序列两端添加氨基酸或核苷酸,所述多肽变体具有与上述多肽相同的生物活性。
上述多肽、多肽类似物、多肽衍生物或多肽变体均具有酰基转移酶活性,在pH值范围为4-10之间活跃,在60℃以下温度稳定。经试验证明,其在pH为7.5,温度为35℃时,活性最好。
本发明的又一具体实施方式中,实际应用时,所述多肽、多肽类似物、多肽衍生物或多肽变体被固定到载体上。
本发明的又一具体实施方式中,其中载体为活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃的一种或几种混合物。
本发明的又一具体实施方式中,所述多肽、多肽类似物、多肽衍生物或多肽变体为冻干和/或非冻干技术制备。
本发明的又一具体实施方式中,提供编码所述多肽、多肽类似物、多肽衍生物或多肽变体的核苷酸,其包含下组中的任一种:
a)编码具有所述氨基酸序列的多肽或类似物、衍生物或其变体的核苷酸;
b)与a)所述核苷酸互补的核苷酸;
c)与a)或b)中所述核苷酸具有≥75%序列一致性的核苷酸。
本发明的又一具体实施方式中,所述编码具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述核苷酸采用人工合成方法制备。
本发明的又一具体实施方式中,提供所述多肽、多肽类似物、多肽衍生物或多肽变体在磷脂纯化或油脂精炼中的应用。
所述应用具体为:上述多肽、多肽类似物、多肽衍生物或多肽变体发挥酰基转移酶催化作用,使植物油中的磷脂中的一个或两个脂肪酸基由羟基取代,将非水化磷脂转化为水化磷脂。
本发明的又一具体实施方式中,提供一种植物磷脂纯化的方法,所述方法包括植物毛油预热—调节pH—酶混合—酶解—灭酶。
本发明的又一具体实施方式中,植物毛油预热至30-60℃,调节pH至5-8,按100-2000U/g混合油比例加入酰基转移酶,酶解时间控制在0.5-3小时,将反应体系高温灭酶,将毛油进行水化脱胶处理,经过离心及薄膜蒸发器蒸出水分后得到纯化磷脂。
本发明的又一具体实施方式中,所述酰基转移酶为上述多肽、多肽类似物、多肽衍生物或多肽变体中的一种或多种。
本发明的又一具体实施方式中,其中所述植物毛油包括大豆油、椰子油、橄榄油、菜籽油、玉米油、棉籽油、棕榈油、棕榈仁油、花生油、红花油、豆油、葵花籽油、米糠油、玉米麸油、琉璃苣油、月见草油、亚麻籽油、葡萄籽油、亚麻籽油、苜蓿油、杏仁籽油、杏仁油、鳄梨油、巴巴苏油、猴面包树油、黑加仑籽油、巴西坚果油、可可籽油、山茶油、胡萝卜油、腰果油、榛子油、麻籽油、猕猴桃籽油、澳洲坚果油、芒果籽油、瓜籽油、尼日尔籽油、桃仁油、紫苏子油、阿月浑子油、罂粟油、南瓜子油、红毛丹果籽油、玫瑰果油、香油、谢伊籽油、高油、核桃油、小麦胚芽油中的一种或多种。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明,但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件进行。
实施例1
将大豆毛油加热到35℃,加入一定质量的浓度为0.5%氢氧化钠溶液,调节大豆混合油pH至7.5,然后按100U/g混合油比例加入酰基转移酶(SEQ ID NO:1),混合均匀,将体系处于密闭恒温环境中,设定搅拌速度在300r/min进行酶反应,时间控制在1h;将反应升温至90℃以上灭酶15min。毛油进入200目刮刀过滤器后进入水化脱胶工艺。经离心、薄膜蒸发器后得到浓缩磷脂。经本实施方式制得的大豆浓缩磷脂,透明度有所提高,大豆油中甘油二酯含量提高1%左右。
实施例2
将大豆毛油加热到35℃,加入一定质量的浓度为0.5%氢氧化钠溶液,调节大豆混合油pH至7.5,然后按2000U/g混合油比例加入酰基转移酶(SEQ ID NO:1),混合均匀,将体系处于密闭恒温环境中,设定搅拌速度在300r/min进行酶反应,时间控制在1h;将反应升温至90℃以上灭酶15min。毛油进入200目刮刀过滤器后进入水化脱胶工艺。经离心、薄膜蒸发器后得到浓缩磷脂。经本实施方式制得的大豆浓缩磷脂,透明度提高明显,大豆油中甘油二酯含量提高1.5%左右。
应注意的是,以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明,但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东禹王生态食业有限公司
<120> 一种酰基转移酶及其应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 661
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Met Gly Thr Leu Phe Arg Arg Asn Val Gln Asn Gln Lys Ser Asp Ser
1 5 10 15
Asp Glu Asn Asn Lys Gly Gly Ser Val His Asn Lys Arg Glu Ser Arg
20 25 30
Asn His Ile His His Gln Gln Gly Leu Gly His Lys Arg Arg Arg Gly
35 40 45
Ile Ser Gly Ser Ala Lys Arg Asn Glu Arg Gly Lys Asp Phe Asp Arg
50 55 60
Lys Arg Asp Gly Asn Gly Lys Lys Arg Trp Arg Asp Ser Arg Arg Leu
65 70 75 80
Ile Phe Ile Leu Gly Ala Phe Leu Gly Val Leu Leu Pro Phe Ser Phe
85 90 95
Gly Ala Tyr His Val His Asn Ser Asp Ser Asp Leu Phe Asp Asn Phe
100 105 110
Val Asn Phe Asp Ser Leu Lys Val Tyr Leu Asp Asp Trp Lys Asp Val
115 120 125
Leu Pro Gln Gly Ile Ser Ser Phe Ile Asp Asp Ile Gln Ala Gly Asn
130 135 140
Tyr Ser Thr Ser Ser Leu Asp Asp Leu Ser Glu Asn Phe Ala Val Gly
145 150 155 160
Lys Gln Leu Leu Arg Asp Tyr His Ile Glu Ala Lys His Pro Val Val
165 170 175
Met Val Pro Gly Val Ile Ser Thr Gly Ile Glu Ser Trp Gly Val Ile
180 185 190
Gly Asp Asp Glu Cys Asp Ser Ser Ala His Phe Arg Lys Arg Leu Trp
195 200 205
Gly Ser Phe Tyr Met Leu Arg Thr Met Val Met Asp Lys Val Cys Trp
210 215 220
Leu Lys His Val Met Leu Asp Pro Glu Thr Gly Leu Asp Pro Pro Asn
225 230 235 240
Phe Thr Leu Arg Ala Ala Gln Gly Phe Glu Ser Thr Asp Tyr Phe Ile
245 250 255
Ala Gly Tyr Trp Ile Trp Asn Lys Val Phe Gln Asn Leu Gly Val Ile
260 265 270
Gly Tyr Glu Pro Asn Lys Met Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu
275 280 285
Ala Tyr Leu Asp Leu Glu Arg Arg Asp Arg Tyr Phe Thr Lys Leu Lys
290 295 300
Glu Gln Ile Glu Leu Phe His Gln Leu Ser Gly Glu Lys Val Cys Leu
305 310 315 320
Ile Gly His Ser Met Gly Ser Gln Ile Ile Phe Tyr Phe Met Lys Trp
325 330 335
Val Glu Ala Glu Gly Pro Leu Tyr Gly Asn Gly Gly Arg Gly Trp Val
340 345 350
Asp Glu His Ile Asp Ser Phe Ile Asn Ala Ala Gly Thr Leu Leu Gly
355 360 365
Ala Pro Lys Ala Val Pro Ala Leu Ile Ser Gly Glu Met Lys Asp Thr
370 375 380
Ile Gln Leu Asn Thr Leu Ala Met Tyr Gly Leu Glu Lys Phe Phe Ser
385 390 395 400
Arg Ile Glu Arg Val Lys Met Leu Gln Thr Trp Gly Gly Ile Pro Ser
405 410 415
Met Leu Pro Lys Gly Glu Glu Val Ile Trp Gly Asp Met Lys Ser Ser
420 425 430
Ser Glu Asp Ala Leu Asn Asn Asn Thr Asp Thr Tyr Gly Asn Phe Ile
435 440 445
Arg Phe Glu Arg Asn Thr Ser Asp Ala Phe Asn Lys Asn Leu Thr Met
450 455 460
Lys Asp Ala Ile Asn Met Thr Leu Ser Ile Ser Pro Glu Trp Leu Gln
465 470 475 480
Arg Arg Val His Glu Gln Tyr Ser Phe Gly Tyr Ser Lys Asn Glu Glu
485 490 495
Glu Leu Arg Lys Asn Glu Leu His His Lys His Trp Ser Asn Pro Met
500 505 510
Glu Val Pro Leu Pro Glu Ala Pro His Met Lys Ile Tyr Cys Ile Tyr
515 520 525
Gly Val Asn Asn Pro Thr Glu Arg Ala Tyr Val Tyr Lys Glu Glu Asp
530 535 540
Asp Ser Ser Ala Leu Asn Leu Thr Ile Asp Tyr Glu Ser Lys Gln Pro
545 550 555 560
Val Phe Leu Thr Glu Gly Asp Gly Thr Val Pro Leu Val Ala His Ser
565 570 575
Met Cys His Lys Trp Ala Gln Gly Ala Ser Pro Tyr Asn Pro Ala Gly
580 585 590
Ile Asn Val Thr Ile Val Glu Met Lys His Gln Pro Asp Arg Phe Asp
595 600 605
Ile Arg Gly Gly Ala Lys Ser Ala Glu His Val Asp Ile Leu Gly Ser
610 615 620
Ala Glu Leu Asn Asp Tyr Ile Leu Lys Ile Ala Ser Gly Asn Gly Asp
625 630 635 640
Leu Val Glu Pro Arg Gln Leu Ser Asn Leu Ser Gln Trp Val Ser Gln
645 650 655
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660
<210> 2
<211> 1986
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
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atgtaa 1986
Claims (5)
1.一种多肽在磷脂纯化或油脂精炼中的应用,其特征在于所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.如权利要求1所述应用,其特征在于,具体为:权利要求1所述多肽发挥酰基转移酶催化作用,使植物油中的磷脂中的一个或两个脂肪酸基由羟基取代,将非水化磷脂转化为水化磷脂。
3.一种植物磷脂纯化的方法,其特征在于,所述方法包括植物毛油预热—调节pH—酶混合—酶解—灭酶;
所述酶为酰基转移酶,所述酰基转移酶为权利要求1所述多肽。
4.如权利要求3所述方法,其特征在于,植物毛油预热至30-60℃,调节pH至5-8,按100-2000U/g 混合油比例加入所述酰基转移酶,酶解时间控制在0.5-3小时,将反应体系高温灭酶,将毛油进行水化脱胶处理,经过离心及蒸出水分后得到纯化磷脂。
5.如权利要求3或4所述方法,其特征在于,所述植物毛油包括椰子油、橄榄油、菜籽油、玉米油、棉籽油、棕榈油、棕榈仁油、花生油、红花油、豆油、葵花籽油、米糠油、琉璃苣油、月见草油、葡萄籽油、亚麻籽油、苜蓿油、杏仁籽油、鳄梨油、猴面包树油、黑加仑籽油、巴西坚果油、可可籽油、山茶油、胡萝卜油、腰果油、榛子油、猕猴桃籽油、澳洲坚果油、芒果籽油、尼日尔籽油、桃仁油、紫苏子油、阿月浑子油、罂粟油、南瓜子油、红毛丹果籽油、玫瑰果油、香油、核桃油、小麦胚芽油中的一种或多种。
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