KR20120120461A

KR20120120461A - 안정한 리파제 변이체

Info

Publication number: KR20120120461A
Application number: KR1020127024522A
Authority: KR
Inventors: 날람 마두수다나 라오; 프리얌바다 아챠랴
Original assignee: 카운슬 오브 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치
Priority date: 2003-01-30
Filing date: 2004-01-29
Publication date: 2012-11-01
Also published as: JP4588695B2; US7303904B2; CA2514914A1; DK1590452T3; CN1768135A; WO2004067705A2; WO2004067705A3; EP1590452B1; EP1590452A2; US20050196834A1; DE602004021352D1; KR20050121667A; JP2007528200A

Abstract

본 발명은 내열성, 유기용매 내성 및 pH 내성을 갖는 신규한 리파제 유전자 변이체의 생성 및 제조에 관한 것이다. 본 발명은 또한 고온용 리파제 변이체의 선별 및 그 정제 방법에 관한 것이다.

Description

안정한 리파제 유전자 변이체 {STABLE GENE VARIANTS OF LIPASES}

효소는 생명체의 특징인 거의 모든 생물 과정에 영향을 주는 것으로 세포의 중요 역할을 담당한다. 이들은 놀랄만한 특이성과 개선된 속도로 화학 반응을 촉매한다. 이와 같은 효소의 놀라운 촉매력과 다재다능함은 오랜 동안 인정되어 왔고 또한 효소는 생명체 외부에서도 매우 유용한 것으로 입증되어 왔다. 오늘날 효소는 산업에 널리 활용되어 왔으며 효소 반응이 상대적으로 순한 조건을 요하고 비교적 적은 부산물과 폐기물을 발생시켜 상대적으로 깨끗한 경향이 있기 때문에 화학 시약에 대한 환경 친화적인 대안으로 여겨져 왔다. 효소는, 식품, 사료, 농업, 제지, 피혁 및 섬유 산업에서 수많은 새로운 응용 분야에서 사용되고 있으며 그 결과 현저한 원가 절감과 환경 친화적인 공정이 가능하게 되었다.

효소는 모체의 생리적 조건하에서 최상의 기능을 전개한다. 생체 밖(in vitro)에서의 응용은 효소가 비-생리적 조건하에서 작동하게끔 하거나 또는 전혀 전개하지 못하던 기능을 하게끔 한다. 예를 들어, 효소는 신규한 기질이 관련된 반응을 촉매하여야만 할 수도 있고; 염, 온도, pH 등의 가혹한 조건하에서나 잠재적 억제 또는 변성 화학물질의 존재하에서 작동하여야 할 수도 있다. 상기 응용은 효소의 심각한 문제점을 밝혀내어 효소가 산업 촉매제로서 작용할 수 있도록 하였다. 시험관 내에서와 산업적 반응기 내에서 효소로부터 최적의 성능을 끌어내기 위해서, 이러한 생물학적 촉매가 특정 응용에 적합하도록 맞춰질 필요가 있다.

이러한 효소의 상업적 성공은 그들의 사용의 용이성에 기인할 수 있다. 고온하에서 기능을 발휘하는 것에 부가하여, 내열성 효소는 일반적으로 매우 긴 저장 수명을 가져서 취급 조건을 현저하게 향상시킨다. 효소가 대규모 화학물질의 처리에서 뛰어난 역할을 발휘하려면, 이러한 처리에 관계된 가혹한 조건에서 견딜 수 있어야 한다. 내열성 효소는 취급이 상대적으로 용이하며, 비교적 긴 시간 동안 지속되고, 적절한 고정 지지체가 주어지는 경우에는 다양한 응용에서 재사용 가능해야 한다.

내열성 효소를 얻는데 있어서, 종래의 접근방법은 극한(extremephilic) 환경으로부터 수집된 미생물 수집물을 스크리닝하는 것이다(Karsheroff and Ladenstein, 2001). 장래성 있는 후보 효소들이 특정 공정에 대한 적합성을 위해 더욱 연구되고 있다. 예를 들어, 내열성 또는 내염성 효소가 요구되는 응용을 위해서, 호열성(thermophilic) 또는 호염성(halophilic) 생물체로부터 수집된 효소가 각각 사용되었다. 그러나, 그러한 접근 방법은, 모든 응용에 대한 효소들이 자연에서 발견될 수는 없었기 때문에, 효소의 사용을 지극히 제한하였다. 많은 종류의 형질전환체에 대한 천연 효소는 있을 수 없다. 더군다나, 효소 사용은 종종 생산물 저해, 낮은 안정성 등과 같은 바람직하지 못한 효소의 성질 때문에 제한되었다. 종종 효소는 천연 효소에서는 찾아볼 수 없는 몇몇 성질을 함께 갖도록 요구되어지기도 한다.

내열성 효소를 얻기 위한 또 다른 접근방법은, 중온균(mesophiles) 및 호열균(thermophiles)으로부터 유래한 동종(homologous) 효소의 단백질 구조(결정 구조)에 대한 현재의 지식에 근거한다 (Kumar et al ., 2000; Lehmann et al ., 1998). 그러한 비교들은 내열성을 강화하는 있을지 모르는 상호작용에 대한 정보를 가져왔다. 이러한 정보를 이용하여, 중온성 효소에서 이러한 변화를 통합하려는 노력을 기울여서 그 내열성을 개선할 수 있었다. 단백질 내에는 내열성을 개선하는 상호작용이 많고 각각의 단백질이 전개 시간 동안 그 서열에 가장 적합한 상호작용과 그것이 기능하는 환경(milieu)을 획득하기 때문에 이러한 접근 방법은 그리 성공적이질 못했다. 단백질 안정성의 구조적 결정소(structural determinant)가 모델 단백질에 대한 수많은 연구의 목적이었지만, 어떠한 보편적인 안정화 기구도 아직까지는 발견되질 않고 있다 (Jaenicke and Bohn, 1998). 선행 문헌으로부터 도출될 수 있는 가장 분명한 결론은 상이한 단백질은 다양한 전개 방법으로 상이한 열적 환경에 적응한다는 점이다. 호냉성(psychrophilic), 중온성 및 호열성 생물체로부터 유래한 동종 단백질들을 비교하는 실험적 연구가 단지 몇몇 단백질에만 제한적이었기 때문에, 단백질 내열성을 이끄는 구조적 특징에 대한 이해의 부족은 데이터의 부족에 일부 기인하기도 했다. 더군다나, 단백질 내열성을 개선하기 위한 명확한 기준을 형성할 수 없는 것은 수많은 그리고 복잡한 있을 수 있는 기여 인자들에 기인하다 (Jaenicke and Bohn, 1998; Vogt et al ., 1997a; Vogt et al ., 1997b; Ladenstein and Antranikain, 1998). 중온균과 호열균 간의 비교에 근거하여, 수소결합수와 염다리(salt bridge)수의 증가, 코어(core) 소수성의 증가, 패킹 효율(packing efficiency)의 개선, α-헬릭스 및 루프의 안정화 및 공유 파괴에 대한 저항성으로써, 내열성 증가의 주 매카니즘이 확인되었다. 염, pH 등 기타 선택압(selection pressure)으로부터 내열성의 원인이 되는 단백질 상호작용을 서술하는 것은 종종 어려움이 봉착하게 된다. 내열성 향상에 적합한 다른 전략은 고정화 효소(immobilized enzyme)가 어느 정도 내열성을 획득한다는 관찰결과에 기초하는 것이다 (Reetz et al ., 1995). 그러므로, 여러 고상 지지체(solid support)가 단백질을 고정하는데 시험되었다. 유기용매 내 효소로 행한 최근의 관찰결과에 따르면, 유기용매 내에서 효소가 내열성을 획득한다고 한다 (Plou and Ballesteros, 1999). 재조합 DNA 기술의 출현은 단백질 공학을 크게 유리하게 하여 단백질 제조 및 돌연변이(mutagenesis)를 아주 손쉽게 만들었다.

단백질 내열성이라는 용어는 가혹한 온도 조건하에서 폴리펩티드 사슬의 독특한(unique) 화학, 공간적 구조를 보존하는 것을 가르킨다 (Jaenicke and Bohn, 1998). 일반적으로, 효소가 노출되는 온도가 높을수록, 효소의 반감기(half-life)는 짧아진다(즉, 효소의 활성 유지 기간이 짧아진다). 유사하게, 상기 효소가 노출되는 유기용매의 수준(level)이 높을수록, 효소의 반감기는 짧아진다. "촉매 활성(catalytic activity)" 혹은 간단히 "활성(activity)"이라는 문구는 주어진 기질에서 k.sub.cat의 증가 혹은 K.sub.M의 감소를 의미하여, k.sub.catt/K.sub.M 비의 증가를 나타낸다. 단백질 내열성의 구조적 근거는 적어도 20년간 맹렬적으로 추구되어 온 연구 분야였다 (Argos et al ., 1979). 그러나, 생명체 자체로부터 추출된 효소가 항상 기능을 하는 것은 아니고 그들 자체의 자연 환경(milieu)에서만 기능한다. 예를 들면, 이들은 생물체의 생리적 온도에서 최적의 활성을 가지며 상대적으로 높은 온도에서는 변성되어 활성이 떨어지게 된다. 내열성 효소는 이들이 산업상 필요로 하는 고온 및 상대적으로 가혹한 조건에서도 사용될 수 있기 때문에 중요하다. 또한, 이들은 일반적으로 저장 안정성이 상대적으로 높으며, 저온 저장의 필요성을 덜어줌과 동시에 저장과 취급시의 변성으로 인한 손실을 줄여줌으로써 비용 절감을 가져온다. 더군다나 고온에서 이루어지는 반응이 일반적으로 빠른 속도로 진행되므로 작업 시간을 단축시킨다.

환경 안전 이유의 측면에서도, 산업상 환경 오염 공정의 사용을 줄이려는 끊임없는 압박이 있다. 효소는 피혁, 식품 및 제약 산업에서 화학적 공정들을 대체하는데 점점 더 많이 사용되고 있다. 극한 미생물(extremephiles)의 단백질 구조들을 비교하면, 단백질의 구조적 가소성(plasticity)이 엄청날 뿐더러 1차 구조(primary structure)에 내재한다는 것을 알 수 있다. 이는 단백질의 1차 구조를 유전적 수준에서 변형시키고 내열성 등의 특성을 갖는 변이체를 스크리닝하는 전략을 강력하게 뒷받침한다. 유전자 조작 및 유전자를 마음대로 변경할 수 있는 프로토콜 개발에 있어서의 굉장한 성공으로 인하여 특별한 기능을 가진 단백질을 전개할 수 있게 되었다. 이러한 전략은 분자 생물학적 방법으로 유전자 서열에 변이를 만들고, 이들을 발현시키고 돌연변이 개체들을 스크리닝함으로써 변이체들을 스크리닝하는 것에 의존한다 (Arnold, 1999; Stemmer, 1994; Ostermeier et al ., 1999). 스크리닝 프로토콜은, 고온에서의 활성 또는 유기용매의 존재하에서의 활성 등과 같이 관심 있는 성질에 기초한다. 본 발명은 유전자 서열에서 변이를 발생시키는 방법과, 높은 내열성을 갖는 효소를 스크리닝하는 프로토콜 뿐만 아니라 시퀀싱 및 발현 프로토콜을 모두 포함한다.

리파제(트리아실글리세롤 아실하이드로롤라제, E.C. 3.1.1.3)는 트리아실글리세롤에서 에스테르 결합의 가수분해를 촉매하는 수용성 효소이고 또한 종종 포스포리파제, 큐티나제(cutinase) 및 아미다제 활성을 나타낸다 (Woolley and Peterson, 1994). 이들은 세제, 제약, 향수, 향미 증진제 및 화장품 질감처리제(texturising agent)의 생산에 사용된다. 리파제는 광범위한 식품, 특히 우유, 지방 및 오일로 만들어지는 제품의 생산에 있어 중요한 효소이다. 리파제는 생리적으로 상당히 중요하며 산업적인 잠재력이 있는 어디서나 흔히 볼 수 있는 효소이다. 리파제는 촉매로 작용하여 트리아실글리세롤을 글리세롤과 유리지방산으로 가수분해시킨다. 에스테라제(esterases)와는 상반되게, 리파제는 오일-물 계면에 흡수될 때만 활성화되며 벌크액내에서 용해된 기질을 가수분해하지는 않는다. 전형적인 리파제는 트리올레인(triolein) 및 트리팔미틴(tripalmitin) 등의 장쇄(long-chain) 지방산과 글리세린의 유화(emulsified) 에스테르를 분리한다. 리파제는 세린 하이드롤라제(serine hydrolases)이다. 상업적으로 유용한 리파제는 대개 광범위한 세포외 리파제를 만드는 미생물로부터 얻어진다 (Jaeger et al ., 1999). 에스테르화 반응, 에스테르 교환 반응, 글리콜과 멘톨의 위치선택적(regioselective) 아실화, 및 펩티드 및 기타 화학물질의 합성을 포함한 다수의 유용한 반응을 촉매하는 많은 리파제는 유기용매 내에서 활성을 갖는다. 적당한 성질을 갖는 수많은 리파제가 얻어질 수 있으며 리파제를 기초하여 바이오트랜스포메이션 및 합성을 상용화하기 위한 노력이 진행 중이다 (Schmid and Verger, 1998). 산업용 효소의 경우, 세제 분말로 사용되는 효소가 단일 매출로는 여전히 가장 큰 시장이다. 가수분해 리파제의 주요 상업적 응용은 세탁 세제로서 이용하는데 있다. 세제용 효소가 전체 리파제 매출의 거의 32%를 차지하고 있다. 세제 용 리파제는 내열성을 필요로 하며 전형적인 기계 세탁의 알칼리 환경에서 활성이 유지될 필요가 있다. 대략 1000톤의 리파제가 매년 생산되는 약 130억톤의 세제에 첨가된다. 리파제는 지방을 가수분해하는 그 능력 때문에, 산업적 규모의 세탁이나 가정용 세제의 첨가제로 주로 사용된다. 세제용 리파제는 특히 다음의 요구조건을 만족하도록 선택된다: (1) 낮은 기질 특이성, 즉 다양한 조성의 지방을 가수분해할 수 있는 능력; (2) 상대적으로 가혹한 세탁 조건(pH 10-11, -60℃)을 견딜 수 있는 능력; (3) 많은 세제 제제에서 중요한 성분인 손상성 계면활성제 및 효소를 견딜 수 있는 능력 [즉 선형 알킬 벤젠 설포네이트(LAS) 및 프로테아제]. 바람직한 성질을 갖는 리파제가 연속적인 스크리닝(Jaeger and Reez, 1998; Wang et al .; Rubin and Dennis, 1997)과 단백질 공학 (Kazlauskas and Bornscheuer, 1998)의 조합을 통해서 얻어진다. 1994년에, 노보 노르디스크(Novo Nordisk)에 의하여 곰팡이 써모마이세스 라누지노수스(Thermomyces lanuginosus)에서 유래되고 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)에서 발현되는 최초의 상업용 재조합 리파제 '리포라제(Lipolase)'가 알려졌다. 1995년에, 2 종류의 박테리아성 리파제인 슈도모나스 멘도씨나(Pseudomonas mendocina) 유래의 '루마패스트(Lumafast)'와 피. 알칼리제네스(P. alcaligenes) 유래의 '리포맥스(Lipomax)'가 제넨코 인터내셔날(Genencor International)에 의해 알려졌다 (Jaeger et al ., 1999). 피. 알칼리제네스(P. alcaligenes) M-1이 생산하는 알칼리성 리파제는 현대의 기계 세탁의 조건하에서 지방 얼룩을 제거하는데 매우 적합하다는 보고가 있다. 세제에 사용되는데 적합하다고 언급되고 있는 많은 미생물 리파제가 특허 문헌들에 예시되어 있다 (Gerritse et al ., 1998).

리파제를 생산하는 미생물은 박테리아, 곰팡이, 효모, 방사선균(actinomyces)을 포함한다. 바실러스 서브틸리스(bacillus subtilis)는 그람-양성(Gram-positive), 호기성(aerobic), 포자-형성(spore-forming) 박테리아로서, 매우 효율적인 단백질 분비 시스템(protein secretion system) 때문에 실질적인 상업적 관심을 불러 일으키고 있다. 비.서브틸리스(B.subtilis)의 세포외 지방분해(lipolytic) 활성은 1979년 비교적 일찍 알려졌음에도 (Bycroft and Byng, 1992), 1992년에 이르러서야 비로소 분자적 연구가 시작되어 리파제 유전자인 lipA가 클로닝되었고 시퀀싱되었다 (Dartois et al ., 1992). 이어서, 리파제의 과발현, 정제되고 특징지워졌다 (Leuisse et al., 1993). 그 후, lipA와 핵산 수준에서 68%의 동일성을 갖는 제 2 유전자인 lipB가 밝혀졌다 (Eggert et al., 2000). 이 유전자도 클로닝되었고 그 단백질이 과발현, 정제되고 특징지워졌다.

19,348 Da의 분자량을 갖는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 리파제는 알려져 있는 리파제 중에서 가장 작은 리파제 중 하나이다. 이는 오일-물 계면의 존재하에서 계면 활성화를 보여주지 않는 드문 리파제 중의 하나이다. lipA는 염기성 pH에 대한 내성이 매우 크며 pH 10에서 최적의 활성을 갖는다. 이것은 sn-1 및 sn-3 글리세롤 에스테르를 단쇄 및 장쇄 지방산 둘다로 가수분해하며, C8 지방산 사슬로 가수분해시 최적의 활성을 보여준다.

박테리아성 리파제는 그들의 서열 유사성, 보존적 서열 모티프 및 생물학적 성질에 따라 8종의 패밀리로 분류된다(Arpigny and Jaeger, 1999). 전형적인 리파제는 6종의 서브패밀리를 포함하는 패밀리 I으로 분류될 수 있다. 바실러스 리파제는 서브패밀리 4 및 5에 속한다. 이들 2개의 서브패밀리에서는 활성 부위인 세린 잔기 부근의 보존된 G-X-S-X-G 펜타펩티드 내에 있는 첫번째 글라이신 잔기를 알라닌이 대체한다. 서브패밀리 4는 단지 3 종류, 즉 비.서브틸리스(B. subtilis) 유래의 LipA 및 LipB와 바실러스 푸밀리스(Bacillus pumilis) 유래의 리파제로만 구성되며 이들은 74-77%의 서열 동일성을 갖는다. 이것들은 알려진 리파제 중에서 가장 작은 리파제이며 서브패밀리 5를 구성하는 바실러스 리파제와 같은 아주 큰 다른 리파제와는 매우 적은 서열 유사성(~ 15%)을 보여준다.

비.서브틸리스(B.subtilis) 리파제 LipA의 결정 구조는 35x36x42의 크기를 갖는 구형(globular) 단백질을 나타낸다. 그 구조는 α-헬릭스(helices)로 둘러싸인 평행 β-시트(sheet) 내에 6개의 β-가닥(strand)으로 이루어진 치밀한(compact) 도메인을 보여준다. β-시트의 한면에는 2개의 α-헬릭스가 있고 나머지 면들에는 3개씩의 α-헬릭스가 있다. 비.서비틸리스(B.subtilis) 리파제의 폴드(fold)는 α/β 하이드롤라제 폴드 효소의 내부(core)의 폴드와 공통점이 있다. 비.서비틸리스(B.subtilis) 리파제는 정규(canonical) α/β 하이드롤라제 폴드 중 첫번째 두 가닥이 결여되고 작은 310 헬릭스가 헬릭스 αD를 대체한다. 헬릭스 αE는 예외적으로 단지 하나의 헬릭스 회전(helical turn)만을 가진 작은 구조로, 여러 개의 α-헬릭스가 310 헬릭스 회전으로 시작되거나 종결된다. 이러한 구조적 특징, 즉 작은 크기 및 리드 도메인(lid domain)의 부존재로 인하여, 비.서브틸리스(B.subtilis) 리파제는 최소(minimal) α/β 하이드롤라제 폴드 효소로 여겨진다.

본 발명의 주된 목적은 내열성, 유기용매 내성 및 pH 내성을 갖는 신규한 리파제 유전자 변이체에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 내열성, 유기용매 내성 및 pH 내성을 갖는 신규한 리파제 유전자 변이체를 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 내열성, 유기용매 내성 및 pH 내성을 갖는 리파제 유전자 변이체를 포함하는 발현 시스템의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 그 유전자가 10 내지 11의 높은 pH 범위에 견디는 고유능; 직쇄 알킬 벤젠 설포네이트류, 프로테아제류 및 이들의 혼합물로 구성된 군을 포함하는 손상성(damaging) 계면활성제 및 효소에 견디는 능력을 갖는 유전자 변이체에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 가정용 세제 및 세탁 산업에서 얼룩 제거제로서 유용한 유전자 변이체에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 지극히 높은 비활성(specific activity)을 갖는 유전자 변이체에 관한 것이다.

본 발명은 부위-특이적 돌연변이(site directed muatgenesis)를 통하여 개발된 리파제 효소의 신규한 유전자 변이체에 관한 것이다. 이 유전자 변이체는 매우 내열성이 뛰어나고, 강력한 유기용매에 대한 내성이 뛰어나며, 높은 pH에서도 견딜 수 있다. 개발된 본 유전자 변이체의 내열성은 50 내지 90℃의 온도 범위 내에서 200 배 높다. 개발된 본 유전자 변이체들은 높은 내열성, 비활성 및 높은 pH에서의 내성으로 인해 가정 세제 및 세탁 산업에 응용될 수 있다.

본 발명에서는 개발된 방법을 높은 내열성 특성을 지닌 원래 서열의 단백질 변이체를 분리하기 위해 리파제 유전자(유전자 서열번호 1)에 적용하였다. 이 방법은 원래 유전자 서열에서 무작위 변이체를 생성하여 박테리아인 대장균(E.coli) 내에서 그 상응 단백질을 발현하도록 하는 능력에 초기 의존한다. 이 원래 서열에서 만들어진 변이체들은 변형된 서열을 지니며, 그로 인해 변형된 특성을 지닌다. 단백질 수준에서 이 변이체들의 내열성을 테스트하고 향상된 내열성을 보이는 이들 서열들에 대해 다음 단계인 무작위 돌연변이와 스크리닝을 행한다. 따라서, 돌연변이체를 순차 누적시키고 다음으로 돌연변이체 풀(pool)을 만듦으로써, 리파제의 내열성을 고온에서 200배까지 향상시켰다. 고온의 범위는 50-90℃의 범위를 포함한다.

본 발명에 따른 방법은 변이체 리파제를 생성하는 4단계와 내열성 리파제를 얻기 위한 그 단계들의 특징을 포함한다. 첫번째 방법에서, 에러 프론(error prone) PCR 방법으로 리파제 유전자의 초기 서열의 변이체를 생성하였다. 이 채용된 프로토콜들은 몇몇 공개된 프로토콜들과 유사하다. 무작위 프라이밍(priming) 과 같은 많은 다른 프로토콜들에 추가하여, ITCHY 등을 유전자 서열의 변이의 생성에 적용할 수 있다(Lutz 및 Benkovic, 2000: Shao 등, 1998). 본 발명의 두번째 방법에서, 돌연변이 서열을 발현 벡터 내로 클로닝시키고 배양 여액(lysates)에 단백질을 발현시킨다. 중간 용량(medium-throughput) 방법을 사용하여 많은 개체에서 테스트된 더 높은 온도를 견디는 능력을 가진 발현 단백질을 스크닝한다. 본 발명의 세번째 방법에서, Stemmer 방법(1994)에 따른 패밀리 셔플링(family shuffling) 과정을 사용하여 장래의(promising) 변이체들의 풀(pool)을 만들었다. 이 셔플링 과정 외에도 초기 서열의 선별적 변경에 표준 분자 생물학 과정을 이용하였다. 본 발명의 네번째 방법에서, 양성(positive) 서열들을 다량의 배양액에서 과발현시키고 Dartois 등(1992)에 따른 공개된 과정에 따라 단백질을 정제하였다. 이 정제된 단백질의 내열성을 테스트하였다.

내열성이 증가된 리파제 변이체를 스크리닝하는 과정은 발색(chromogenic) 기질인 p-니트로페닐기를 포함한 에스테르를 가수분해하는 능력을 포함한다. 리파제의 고유 기질인 트리글리세라이드는 세포 여액 내 과별현된 리파제를 효소원으로 사용하기 때문에, 이는 단순한 중간 용량(medium through put) 어세이를 디자인하기에는 용이하지 않다 (Besson 등, 2000). 지방산의 P-니트로페닐 에스테르는 편리하고, 리파제의 활성이 트리글리세라이드의 리파제 활성을 나타낸다. p-니트로페닐계의 장쇄 에스테르, 특히 p-니트로페닐 올레이트가 이러한 목적에 매우 적합하다. 세제 가용성 PNPO는 무시해도 좋은 정도의 바탕(background) 가수분해를 나타내고 세포 여액 내에 존재하는 리파제에도 매우 적합하다. 가수분해 산물 p-니트로페닐의 진황색의 매우 높은 흡수(extinction) 계수는 96-웰 플레이트(well plate)에서 편리하게 측정될 수 있다. p-니트로페닐 에스테르와 함께, 지방산의 많은 다른 형광 또는 발색성 에스테르도 이 목적을 위해 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 내열성이란 용어는 효소의 성질을 나타내는 것으로, 상대적으로 더 높은 온도에 노출된 후에 그 활성을 유지하는 것이다. 효소는 더 높은 온도에 노출되는 경우 단백질의 기능 구조를 혼란시키는 구조적 요소의 운동 증가로 인하여 3차 구조(confirmation)를 상실한다. 일반적으로 단백질은 더 높은 온도에서 시간에 따라 그 활성을 상실한다. 활성 상실 속도는 반감기, 즉 초기 활성의 1/2을 상실하는데 요구되는 시간을 반영하고, 단백질의 내열성을 비교하는 편리한 파라미터이다(Jaenicke 및 Bohm, 1998). 여기서 정의된 활성은 k_cat/K_m이라는 용어로 나타나는 촉매 활성에 대응하는 것으로, 여기서 k_cat는 산물 형성의 속도이고, K_m은 효소에 대한 기질의 겉보기 친화 상수(affinity constant)이다. 높아진 온도에서 기능성 구조를 유지하는 것은 고온을 견디는 단백질 내 상호작용을 형성하는 능력에 달려있다. 본 발명과 관련된 온도의 범위는 35 내지 90℃이다.

바실러스 리파제(Bacillus lipase)로부터 자연 발생한 리파제는 서열번호 1에 제시된 바와 같이 1-181의 아미노산 서열을 지닌다. 68, 71, 114, 120, 132, 144, 147 및 166 위치의 아미노산 치환이 리파제의 내열성에 있어 중요하다는 것은 이미 알려졌다. 본 연구에 따라, 114, 132 및 166 위치의 치환이 단백질의 안정성을 향상시키는데 적합하다는 점도 추가로 밝혀졌다. 다른 19개의 아미노산으로 이들 각 위치를 치환시켜 나올 수 있는 무수한 조합의 임의의 치환체가 내열성에 바람직할 수 있다.

리파제의 내열성과 관련된 특정 치환물이 하기에 개시된다.

출발점 도착점 위치

N V 166

A D 132

A V 68

L P 114

R S 147

V A 144

N D 120

이에 따라, 본 발명은 분자량이 19443인 서열번호 2, 분자량이 19515인 서열번호 3, 분자량이 19456.9인 서열번호 4, 분자량이 19487인 서열번호 5 및 분자량이 19470.9인 서열번호 6을 가지며, 내열성, 유기용매 내성 및 높은 pH 내성을 갖는, 신규한 리파제 유전자 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 벡터 pJO290 내에 분자량이 19443인 서열번호 2, 분자량이 19515인 서열번호 3, 분자량이 19456.9인 서열번호 4, 분자량이 19487인 서열번호 5 및 분자량이 19470.9인 서열번호 6을 포함하는 것을 특징으로 하는, 내열성, 유기용매 내성 및 높은 pH 내성을 갖는 신규한 리파제 유전자 변이체의 발현 시스템에 관한 것이다.

또한, 본 발명은

(a) 바실러스 수브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 리파제 유전자를 분리 및 정제하고,

(b) 단계 (a)에서 분리한 리파제 유전자를 벡터 pJO290 내에 클로닝하고,

(c) 서열번호 13로 표시된 정방향 프라이머 JOF와 서열번호 14로 표시된 역방향 프라이머 JOR을 사용한 무작위 돌연변이 및 부위-특이적 돌연변이에 의하여 단계 (a)에서 분리된 리파제 유전자로부터 유전자 변이체를 생성시키고,

(d) 단계 (c)에서 얻은 유전자 변이체를 플라스미드 벡터 pJO290 내에 클로닝하고,

(e) 단계 (d)의 클로닝된 유전자 변이체를 대장균(E. coli) JM109 내로 라이게이션시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 분자량이 19443인 서열번호 2, 분자량이 19515인 서열번호 3, 분자량이 19456.9인 서열번호 4, 분자량이 19487인 서열번호 5 및 분자량이 19470.9인 서열번호 6을 가지며, 내열성, 유기용매 내성 및 높은 pH 내성을 갖는 신규한 리파제 유전자 변이체 발현 시스템의 제조 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 약 45 내지 95 ℃의 온도 범위에서 내열성이 있는 유전자 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 약 55 내지 90 ℃의 온도 범위에서 더욱 내열성이 있는 유전자 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 반감기(T₁ _/2) 값의 범위가 6 내지 685인 신규한 유전자 변이체의 T₁ _/2 값에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 반감기(T₁ _/2) 값의 범위가 7 내지 677인 신규한 유전자 변이체의 T₁ _/2 값에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 K_m 값의 범위가 0.5 내지 2.5 mM인 유전자 변이체의 K_m 값에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 K_m 값의 범위가 0.63 내지 1.96 mM인 신규한 유전자 변이체의 K_m 값에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 k_cat 값의 범위가 4.5×10^-2내지 8.5×10^-2/분인 신규한 유전자 변이체의 k_cat 값에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 k_cat 값의 범위가 5 10^-2내지 8.1×10^-2/분인 신규한 유전자 변이체의 k_cat 값에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 k_cat/K_m 값의 범위가 4×10^-2내지 10×10^-2/분인 신규한 유전자 변이체의 k_cat/K_m 값에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 k_cat/K_m 값의 범위가 4.1×10^-2내지 9.7×10^-2/분인 신규한 유전자 변이체의 k_cat/K_m 값에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 아세토니트릴, 이소프로판올, 디메틸 설폭사이드 및 디메틸 포름아미드로 구성된 군으로부터 선택된 유기용매에 대한 신규 유전자의 내성에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 사용된 유기용매가 아세토니트릴인 유기용매에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 아세토니트릴 존재 하에 상기 유전자 변이체의 잔류활성(residual activity)의 범위가 25 내지 100 %인 유전자 변이체의 잔류활성에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 아세토니트릴 존재 하에 상기 유전자 변이체의 잔류활성의 범위가 28.7 내지 85.5 %인 유전자 변이체의 잔류활성에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 9 내지 13의 높은 pH 범위에 견디는 고유능; 직쇄 알킬 벤젠 설포네이트류, 프로테아제류 및 이들의 혼합물로 구성된 군을 포함하는 손상성(damaging) 계면활성제 및 효소에 견디는 능력을 갖는 유전자 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 10 내지 11의 높은 pH 범위에 견디는 고유능; 직쇄 알킬 벤젠 설포네이트류, 프로테아제류 및 이들의 혼합물로 구성된 군을 포함하는 손상성(damaging) 계면활성제 및 효소에 견디는 능력을 갖는 유전자 변이체에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 내열성, 유기용매 내성 및 pH 내성을 갖는 신규한 리파제 유전자 변이체를 제공할 수 있다.

도 1: lipA 유전자 pBR 322. 신호 서열, 프로모터 및 리보좀 결합 서열과 함께 전체 리파제 유전자 서열을 포함하는 lipA 유전자가 나타나 있다.
도 2: 신호 서열을 갖는 lipA의 pET 21b로의 서브클로닝. For1 및 Rev1 프라이머를 이용하여 신호 서열과 함께 lipA 유전자를 증폭시킨 다음, 이를 pET 21b 내로 삽입시켜 pEt-lipwt를 얻었다. 상기 For1 및 Rev1 프라이머는 Nde 1 및 Bam H1 부위를 lipA 유전자로 도입하도록 설계되었다.
도 3: 신호 서열이 없는 lipA의 pJO290으로의 서브클로닝. EcoR1 및 Bam H1 부위를 증폭된 생성물로 도입할 수 있도록 특별히 설계된 PrEcoR1 및 PRBam H1 프라이머를 이용하여 pET-lipwt 내에 존재하는 lipA를 증폭시켰다. EcoR1 및 Bam H1을 이용하여 증폭된 생성물을 절단한 다음 이를 유사하게 절단되었던 pJO290 벡터 내로 삽입시켰다.
도 4: 정제 단백질의 SDS-PAGE 단면. 모든 리파제는 실시예들에서 주어진 과정에 의해 정제되었다: 저 분자량 마커, 레인 1; 야생형(wild-type) 리파제, 레인 2; 유전자 서열 2, 레인 3; 유전자 서열 3, 레인 4; 유전자 서열 4, 레인 5; 유전자 서열 5, 레인 6; 유전자 서열 6, 레인 7.
도 5: 리파제가 촉매하는 트리글리세라이드의 가수분해. 트리글리세라이드에 대한 리파제의 작용을 개략적으로 나타낸다. 리파제는 에스테르 결합에 작용하여 유리지방산과 글리세롤을 생산한다.
도 6: 55℃ 온도에서 노출된 여러 시간에서의 다양한 돌연변이체와 야생형의 잔류 활성. 사용된 기질은 PNPA이다. 야생형 및 돌연변이 효소를 55℃에서 여러 시간대에 걸쳐 배양시키고 수분 동안 얼음에 냉각시키면서 그 효소의 활성을 측정하였다. 실온에서 활성을 측정하였다. PNPA의 가수분해 속도로 활성을 나타내었다. 분광광도계를 사용하여 410 nm에서의 흡광도의 증가로서 PNPA의 가수분해를 모니터링하였다.
도 7: 55℃에 노출된 야생형 및 돌연변이체의 잔류 활성이 표에 나타나 있다. 단백질을 특정 시간 동안 배양하고 효소를 얼음 위에서 냉각시킨 후 실온에서 그 활성을 어세이함으로써 활성을 측정하였다.
도 8: 50℃ 온도에서 노출된 여러 시간에서의 다양한 돌연변이체 및 야생형의 잔류 활성. 사용된 기질은 올리브 오일이다. 기질 올리브 오일은 검 아라빅(gum Arabic)을 이용하여 유화되었다. 올리브 오일의 가수분해 속도는 0.1 m 수산화나트륨/분의 첨가 속도로 pH 스탯(stat)(Metrohom 718 pH Titrino)에서 모니터링하였다. 올리브 오일의 가수분해는 수산화나트륨에 의해 중화되었던 pH를 떨어뜨린다.
도 9: 55℃에서 야생형 및 돌연변이 리파제의 안정성의 속도론적 파라미터와 반감기. 야생형 및 돌연변이체의 내열성은 시간에 대한 잔류 활성을 플롯팅함으로써 얻어진 플롯의 기울기로 나타내었다. 낮은 기울기는 긴 반감기를 나타내므로 열안정성이 증가된다. 효소 상수는 돌연변이체 각각을 가지고 기질 농도에 대한 세세한 활성을 수행함으로써 측정되었다. 이러한 플롯팅을 이용하여 겉보기 평형 상수와 Vmax 즉 기질의 무한 농도에서의 속도를 산출하였다. K_m/V_max는 효소의 촉매 퍼텐셜(catalytic potential)을 나타내며, 이는 효소간의 촉매 퍼텐셜을 비교하는데 유용한 파라미터이다.
도 10: 물에 다양한 농도로 용해된 아세토니트릴의 존재하에 리파제 및 그 돌연변이체의 활성. 야생형 및 돌연변이 효소를 아세토니트릴의 함량을 달리하는 배지에서 배양하였다. 배양 시간을 30분으로 고정한 후 남아있는 활성을 PNPA를 기질로 이용하여 측정하였다.
도 11: 단백질을 20% 아세토니트릴에서 30분 동안 배양한 후 야생형 및 돌연변이체의 잔류 활성을 어세이하였다.
도 12: 야생형 리파제를 여러 농도의 3 종류의 세제의 존재하에서 30분 동안 배양하고, 30 분 경과후 그 활성을 어세이하였다. 3 종류의 세제들은 중성 세제인 트리톤 X-100, 음이온 세제인 소듐 도데실설페이트(sodium dodecylsulphate) 및 양이온 세제인 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드(cetyl trimethylammonium bromide)이었다.

하기의 실시예들은 본 발명의 설명을 위해 개시되며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예 1:

바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 리파제의 정제

적절한 벡터 내에 리파제를 발현시키는 대장균(E. coli) 세포로부터 리파제 정제를 행하였다. 이 정제는 근본적으로 페닐-세파로스(sepharose) 컬럼과 후속 모노-S 컬럼 내로 셀 용해물(lysate)을 통과시키는 단계를 포함한다. 리파제는 응집 유발성(aggregated prone) 단백질이며, 특히 5 mg/ml 이하로 단백질 농도를 유지하도록 보관되며, 단백질의 응집을 방지하는데 사용되었다. 리파제의 정제는 이전³²에 언급된 바와 같이, 경미한 변형(minor modifications)에 따라 수행되었다. 바실러스 균주의 배양 여액(filterates)이나 대장균(E. coli) 용해물(lysate)로부터의 리파제는 유사하게 처리된다. 대장균로부터 야생형 및 돌연변이 단백질을 정제하는 경우에는, lipA 유전자 또는 돌연변이 유전자들을 pET 21b 내로 클로닝한다. 이 경우, 전장의 성숙한 단백질에 대응하는 유전자를 프라이머 PrNde I(정방향 프라이머)(5'-CCATGATTACGCATATGGCTGAACACAA-3') 및 JOF로 증폭시켰다. 이 정방향 프라이머는 처리된(engineered) Nde I 부위를 갖는다. 또한 이 정방향 프라이머는 Nde I 인지 서열의 일부인 ATG 서열의 형태로 리파제 유전자의 시작부에 개시코돈을 도입한다. 이것은 비.서브틸리스(B.subtilis)의 배양 상등액으로부터 정제된 단백질에서 생긴 N-말단 알라닌보다는, 대장균 내에서 발현되는 성숙한 단백질의 N-말단에 메티오닌을 도입하는 것이다. 이러한 야생형 단백질과 돌연변이체들을 증폭시키고, Nde I 및 BamH I으로 절단한 다음, Nde I 및 BamH I로 절단된 pET-21b 내로 라이게이션시킨다. 상기 라이게이션 혼합물을 대장균 DH5α 내로 형질전환시키고 그 양성구(positive)을 플라스미드 미니프렙(minipreps)과 제한절단에 의해 선별하였다(도 1 및 도 2).

단백질을 대장균 BL21 (DE3) 세포로부터 정제하였다. 적절한 플라스미드를 함유한 세포를 중간 대수기(mid-log phase)까지 증식시킨 후 0.5 mM IPTG로 유도하였다. 유도 후 2.5 시간 경과 후 4 ℃, 15,000 rpm으로 20 분간 원심분리하여 세포를 수확하였다. 얻어진 펠렛을 STE로 세척하고 0.3 mg/ml 리소자임을 함유한 1X TE로 재현탁시켰다. 이 현탁액을 30 분간 얼음에서 배양시킨 후 초음파처리하여 세포를 용혈시켰다. 세포를 얼음에 둔 채 초음파처리를 수행하였다. 30 초간의 짧은 펄스를 가하고, 펄스 간에 1 분의 냉각 시간을 주었다. 초음파처리된 세포를 4 ℃에서 20,000 rpm으로 원심분리하였다. 이 상등액을 페닐 세파로제 컬럼 상에 로딩시켰다. 남은 단계들을 2장에서 개시된 바에 따라 행하였다. 다음에 사용할 때까지 이 정제 단백질을 -70 ℃에서 보관하였다.

비.서브틸리스(B. subtilis ) BCL1051을 2.4 %의 효모 추출물, 1.2 %의 트립톤, 0.4 %의 검 아라빅, 0.4 %의 글리세롤, 0.017 M의 KH₂PO₄, 0.072 M의 K₂HPO₄, 50 mg/ml의 칸나마이신 설페이트 조성의 배지 500 ml를 각각 함유한 2l 삼각(Erlenmeyer) 플라스크에서 37 ℃, 16-18 시간 동안 호기 증식시켰다. 배양 배지를 10 ml의 전배양액으로부터 1 % 배양하였다. 6000 rpm에서 30 분 원심분리하여 세포를 수확한 후, 배양 상등액을 100 mM의 칼륨 포스페이트, pH 8.0으로 평형화시킨 페닐 세파로스 패스트 플로우 하이 서브 컬럼(Fast Flow High sub column) (Pharmacia)(20 ml 컬럼 부피/ 11 배양액) 상으로 30 ml/시간의 유속으로 펌프시켰다. 50 ml/시간의 유속으로 10 mM 칼륨 포스페이트, pH 8.0을 이용하여 컬럼을 먼저 세척한 다음 10 mM 칼륨 포스페이트, pH 8.0 내의 30 % 에틸렌 글리콜로 다시 세척하였다. 10 mM 칼륨 포스페이트, pH 8.0 내의 80 % 에틸렌 글리콜을 이용하여 50 ml/시간의 유속으로 용출을 수행하였다. 2 ml 분획물을 포집하였고 (280 nm에서의 흡광도에서 검출된) 단백질을 함유하는 분획물의 효소 활성을 확인하였다. 활성 분획물을 풀(pool)시킨 후 2 mM 글라이신-NaOH, pH 10.0에 대하여 투석시켰다. 투석된 단백질을 50 mM 비신(Bicine)NaOH, pH 8.5 (완충액 A)로 1:1 희석시키고 모노S HR5/5(Pharmacia) 컬럼 상에 로딩한 후, 완충액 A로 전-평형화시켰으며, 이 때 FPLC(Pharmacia) 시스템 상의 Superloop(Pharmacia)를 사용하였다. 단백질이 결합된 컬럼을 완충액 A로 완전 세척하여 비결합 단백질을 제거하였다. 그 단백질을 완충액 B(50 mM 비신-NaOH, pH 8.5 1 M NaCl)에 대한 완충액 A의 선형 변화를 사용하여 용출시켰다. 효소는 약 300 mM NaCl에서 단일 피크로 용출되었다. 모노S 컬럼으로부터 용출된 활성 분획물을 2 mM 글라이신, pH 10.0에 대하여 하룻밤 동안 투석시키고 YM10 멤브레인(10 kD 컷오프)이 장착된 아미콘 농축기를 이용하여 농축시켰다. 단백질 순도는 5 M의 요소를 함유한 12 % SDS-PAGE 겔 상에서 확인하였다(Lessuisse 외, 1993). 단백질의 순도는 코마시 염색 겔 상에서 > 95 %로 나타났다(도 4).

실시예 2:

리파제의 어세이:

리파제는 계면 활성 효소로 알려진 효소 부류에 속한다. 이들 효소는 기질 모노머에 대한 활성은 아주 적지만 에멀젼화 트리글리세라이드류, 모노레이어류 등의 불용성 기질에서는 그 활성이 엄청나게 증가한다. 이런 성질로 인하여 리파제는 가용성 기질 모노머에 작용하는 다른 효소들과는 상이하다. 리파제의 천연 기질인 트리글리세라이드류는 간단한 발색성(chromogenic) 어세이를 설정하는데 있어 아주 번거롭다. 순수 리파제 활성은 pH-민감성 염색약을 사용하여 pH 변화를 관찰함으로써 종종 모니터링할 수 있다. 그러나, 이러한 어세이는 효소원이 용해물(lysate)인 경우와 pH를 바꿀 수 있는 다른 공정이 있는 경우에는 복잡해진다. P-니트로페닐 에스테르류가 상기 활성을 모니터링하는데 있어 가장 편리하다. 단쇄 에스테르, p-니트로페닐 아세테이트 및 장쇄 에스테르, p-니트로페닐 올레이트(PNPO)는 일반적인 합성법으로 합성된다(하기 참조). PNPO는 불용성 에스테르로, 가용화제로 트리온 X-100을 사용한 본 어세이에서 사용한 바 있다. 트리온 X-100: PNPO 코-미셀(co-micelles)은 낮은 백그라운드 가수분해를 나타냈고 또한 온도의 상승에도 안정하였다. 많은수의 샘플을 스크리닝하는 것이 유용하겠지만 일단 리파제 변이체를 스크리닝하기 위해 96-웰 플레이트를 어세이해서 대략 그 활성을 정량화하였다. 96-웰 스크린에서 얻은 모든 양성군을 샘플의 수가 적고 더욱 정확한 비활성 계산을 할 수 있는 튜브 어세이에서 확인하였다.

리파제 어세이를 위한 발색성 기질의 합성

하기 발색성 기질을 리파제 어세이를 위해 합성하였다:

1) p-니트로페닐 올레이트

2) p-니트로페닐 스테아레이트

3) p-니트로페닐 카프릴레이트

*지방산, N, N'-메틸테트라일 비스시클로헥사민(디시클로헥실카르보디이미드, DCC), N, N'-디메틸아미노 필딘(DMAP), 및 p-니트로페놀을 1:1:1:2의 몰비로 취하였다. 지방산은 20 ml의 건 DCM과 수 ml의 클로로포름을 함유한 둥근바닥 플라스크에 넣었다. 이 혼합물을 2 분간 교반시킨 후 DCC를 가하였다. 백색 침전물이 형성되었다. 다음으로 이에 DMAP를 가하였다. p-니트로페놀의 잇달은 첨가로 황색 침전물이 형성되었다. 질소로 반응 용기(vessel)를 플러싱한(flush) 다음 5 시간 동안 교반시켰다. 박막 크로마토그래피를 이용하여 반응의 진행을 모니터링하였다. 반응이 완료된 후, DCM을 증발시켜 건조 상태로 만들고 에스테르는 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔 컬럼, 페트로륨 에테르-아세톤으로 용출)로 정제하였다. 생성물의 순도 및 일치여부를 ¹H-NMR 분광기(spectroscopy)로 확인하였다.

실시예 3

96-웰 마이크로티터 플레이트에서의 리파제 어세이: 에러유발성(error-prone) PCR로 생성된 PCR 산물의 클로닝에서 얻은 콜로니를 또다른 비슷한 플레이트 상에 패치함과 동시에, 25 ㎍/ml 클로람페니콜 및 0.2 % 글루코스를 함유한 2XYT 200 ㎕를 함유한 수개의 웰을 가진 마이크로티터 플레이트에서 배양하였다. 200 rpm에서 연속 진탕하면서 마이크로티터 플레이트에서 24 시간 동안 세포들을 증식시켰다. 24 시간 후, 각 웰에서 5 ㎕의 배양액을 취하여 25 ㎍/ml 클로람페니콜을 보충한 2XYT 200 ㎕를 함유한 또다른 마이크로티터 플레이트 상의 상응하는 웰에 가하였다. 3 시간 동안 증식시킨 배양액을 1 mM IPTG로 유도하였다. 3 시간 더 지난 후에 25 ㎕의 배양액을 각 웰에서 취하여 25 ㎕ 포스페이트 완충액 pH 7.0을 함유한 두개의 신선한 마이크로티터 플레이트의 상응하는 웰에 가하였다. 플레이트 중 하나는 20 분간 고온에 노출시키고, 15 분간 얼음에서 냉각시킨 다음, 실온에 두었다. 나머지 플레이트는 실온에서 유지하였다. 상기 기재된 바에 따라 제조한 PNPO-트리온 X-100 기질 용액 5 ㎕를 각 웰에 가하였다. 플레이트를 37에서 배양시키고 405 nm에서의 흡광도를 정확한 시간 간격으로 ELISA 리더에서 기록하였다. 야생형 단백질(또는 클론이 생성된 모체) 활성의 20 %보다 적은 활성을 보이는 클론들은 다음 고려대상에서 제외하였다. 고온에 노출시킨 후의 각 클론의 잔류활성을 계산하였다. 가장 높은 잔류활성을 보여준 클론을 다음 수준의 스크리닝을 위해 선택하였다.

튜브 내에서의 리파제 어세이: 마이크로티터 플레이트 수준의 스크리닝에서 최고의 잔류활성을 보였던 콜로니들을 5 ml 2XYT 배지, 25 ㎍/ml 클로람페니콜과 0.2 % 글루코스 내에서 12 시간 증식시켰다. 25 ㎍/ml 클로람페니콜과 0.2 % 글루코스를 함유한 2XYT 10 ml과 하룻밤 증식배양액 100 ㎕을 함께 배양하였다. 2.5 시간 증식 후, 배양액을 1.5 mM IPTG로 유도하고 2.5 시간 지난 후에 수확하였다(harvest). 세포 펠렛을 STE로 세척하고 1 ml의 0.05 M 칼륨 포스페이트 완충액 pH 7.2에 재현탁시켰다. Branson 초음파처리기(sonicator)로 4 회의 30 초간 펄스와 펄스 간 1 분의 냉각 시간을 가하여 세포 현탁액을 초음파처리하였다. 초음파처리하는 동안 튜브를 얼음 속에 넣어 샘플을 냉각시켰다. 초음파처리된 샘플을 15,000 rpm에서 45 분 동안 원심분리하고 그 상등액을 어세이에 사용하였다. 상등액을 4 개의 250 ㎕ 분량(aliquot)으로 나누었다. 3 개의 분량은 보다 고온에 노출시키고 4 번째 분량은 얼음에 놓아두었다. 튜브를 20 분간 고온 노출시키고, 얼음 냉각시킨 후, 4 ℃, 15,000 rpm에서 원심분리한 다음 실온으로 가져온 후에 효소 활성을 어세이하였다. 세포 용해물 내의 리파제 활성은 실온에서 소듐 포스페이트 완충액 pH 7.2에서 p-니트로페닐 올레이트를 기질로 사용함으로써 측정하였다. 효소 활성은 시간에 따른 405 nm에서의 흡광도 변화에 따라 측정하였다. 리파제 유전자를 함유하지는 않았지만 상기 언급한 바와 같은 방법으로 진행되는 세포 용해물은 대장균 세포 용해물 내의 p-니트로페닐 올레이트의 백그라운드 가수분해를 측정하는데 사용된다. 백그라운드 가수분해 값은 효소 활성 값으로부터 뺀 값이다. 세포 용해물 내의 총 단백질은 Lowry 방법으로 측정하였고 활성을 정상화하는데 이용하였다.

실시예 4

열불활성화의 반감기

효소를 고온에 노출시킨 다음 실온에서 그 활성을 어세이하는 것은 효소의 내열성을 정상적으로 평가하는 방법이다. 높은 온도에서 단백질은 변성하고 비가역적으로 펼쳐진다. 내열성 효소는 열 변성에 영향을 덜 받도록 작용하는 안정화 상호작용을 부가적으로 가진다. 남아있는 활성은 잔류활성이며, 이는 주어진 온도에서는 온도의 증가에 따라 또는 시간의 증가에 따라 모두 감소한다. 정제 단백질의 열처리를 프로그램가능한 써멀 사이클러(thermal cycler)(GeneAmp PCR system 9700)에서 0.2 ml의 박판(thin-walled) PCR 튜브에서 수행하여 샘플의 미세한 온도 조절이 가능하도록 하였다. 단백질을 0.05 M의 소듐 포스페이트 완충액, pH 7.0 내에 0.05 mg/ml의 농도로 넣었다. 각 튜브에 0.25 ㎕의 단백질 샘플을 주입하였다. 단백질을 필요 시간 동안 가열한 다음, 4 ℃에서 20 분간 냉각한 후 원심분리시키고 실온에서 평형화시킨 후에 효소 활성을 어세이하였다. 열처리된 단백질 샘플 20 ㎕를 2 mM의 p-니트로페닐 아세테이트를 함유한 1 ml의 0.05 M 소듐 포스페이트, pH 7.2에 첨가하였다. 효소 활성은 25 ℃에서 405 nm에서의 흡광도 증가 속도를 모니터링하면서 측정하였다. 통상, 불활성화는 > 80 %의 활성을 상실할 때까지이다. 시간에 대한 log(잔류활성)의 플롯은 선형이었다. 기울기로부터 불활성화 속도 상수(k_inact)를 얻었고 반감기는 t₁ _/2=log2/k_inact로 계산하였다. PNPA를 기질로 써서 그 잔류활성을 측정했던 다양한 돌연변이체의 반감기가 도면(도 6 및 7)에 나타나 있다. 효소 돌연변이체를 55 ℃에서 노출시켰다. 도 8은 올리브유를 기질로 사용한 세 종류의 돌연변이체의 잔류활성 데이터를 보여준다. pH 스탯 장치를 이용하여 활성을 측정하였다. 상기 데이터는 돌연변이체에서 보여진 증가가 기질에 독립적이며 어세이의 본질이라고 설명하고 있다.

기질 스탁(stocks)의 제조:

적당량의 불용성 p-니트로페닐 에스테르와 트리톤 X-100을 유리 바이얼에 칭량하고 에스테르가 트리톤 X-100에 완전히 녹을 때까지 자석교반기(magnetic stirrer)로 혼합시켰다. 교반하는 동안 완충액을 천천히 첨가하여 0.4 mM p-니트로페닐 에스테르와 40 mM 트리톤 X-100을 함유하는 2X 스탁 용액을 제조하였다. 이러한 방법으로 제조된 기질 용액은 눈으로 볼 때 투명하였다. 수용성 p-니트로페닐 아세테이트의 100X 기질 스탁을 아세톤에서 만들었고 각 반응에는 2 mM p-니트로페닐 아세테이트를 이용하였다. 트리온 X-100의 부재 하에 반응들을 수행하였고 속도론적 파라미터를 결정하는데 필요한 모든 측정을 본 반응 시스템에서 행하였다.

실시예 5

올리브유를 이용한 어세이(리파제에 의한 지방/세제 분해의 개략도 도 5)

올리브유를 이용한 어세이를 pH 스탯(stat) 장치에서 수행하였다. 이 활성 이후의 모든 리파제는 양자(proton)를 방출함으로써 반응 배지의 pH를 떨어뜨렸다. pH의 감소는 공지량의 알칼리를 첨가하여 중화시킬 수 있었다. 알칼리의 첨가 속도는 리파제의 활성을 나타낼 수 있다. 검 아라빅(0.2 %), 올리브유와 CaCl₂를 혼합하여 리파제 기질을 제조하였다. 그 혼합물을 초음파 처리하여 균일 에멀젼을 얻었다. 각 어세이에 10 ml의 기질을 사용하였다. 알칼리 첨가에 의하여 초기 어세이에서 기질의 pH는 8.4에 달하였다. 1 mg/ml 효소 용액 10 마이크로리터의 첨가로 반응을 개시하였다. 반응 속도는 시간에 대한 알칼리양 곡선의 기울기로부터 계산하였다. 알칼리로는 1 N NaOH를 사용하였다.

실시예 6

리파제 유전자 변이체의 생성 방법:

그 산물이 본 발명에 따른 리파제 유전자인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래 LipA의 서열은 알려져 있다. 바실러스의 경우, 세포 밖으로 그 수송을 도와주는 분비 서열이 N-말단 서열에 존재하기 때문에 LipA 유전자 산물을 배양 배지 내로 분비한다. 바실러스 종은 분자생물학적으로 잘 연구되어 왔으며 바실러스는 그람-양성 균주이다. 그러나 형질전환, 클로닝, 발현 등의 일반적인 분자생물학 기술 면에서는 바실러스 종이 대장균에 비하여 다소 덜 적합하다 (Sambrook 외, 1989; Hoch 외, 1993). 바실러스 종을 플라스미드 내로 형질전환시키는 것이 어렵다는 것이 주된 문제점이다. 대장균과 대비해 볼 때 그 효능은 몇몇 크기(magnitude) 정도에 의하여 낮아진다. 또한, 관찰된 효능은 다소 거친 방법인 전기천공법(electroporation)으로만 검출할 수 있을 뿐이다. 대장균은 형질전환 효능이 매우 높으며 재생산할 수 있고 플라스미드의 선택 폭이 넓다. 따라서 다양한 유전자 조작을 수행하기 위하여 대장균을 이용하였다.

pBR322 플라스미드에 완전한 lipA 유전자를 함유한 클론 pLipA를 Frens Pierce 박사로부터 입수하였다(도 1). 분비 서열을 코딩하는 영역을 따라 리파제 유전자를 프라이머 For1 (정방향 프라이머) (5'-GGAGGATCATATGAAATTTGTAAAAA-3')와 Rev1 (역방향 프라이머) (5'-CCCGGGATCCATTGTCCGTTACC-3')을 이용하여 증폭시켰다. 이 프라이머들은 처리된(engineered) Nde1과 Bam H1 부위를 각각 포함한다. For1에서 Nde1의 ATG는 천연 리파제의 시작코돈과 부합하며 BamH1 부위는 천연 정지코돈의 범위를 넘었다. 증폭 산물을 Nde 1과 Bam H1으로 절단하고 플라스미드 pET-21b의 Nde 1-BamH1 부위 내로 클로닝시켜 플라스미드 pET-lipwt를 얻었다(도 2). 프라이머 PREcoR I (정방향 프라이머) (5'-CGTCAGCGAATTCCGCTGAACACAT-3')과 PRBamH I (역방향 프라이머) (5'-GCGGGAAGGATCCGAATTCGAGCT-3')을 이용하여 성숙한 단백질을 코딩하는 리파제 유전자를 pET-lipwt로부터 증폭시켰다. 이 프라이머들은 처리된(engineered) EcoR I과 BamH I 부위를 각각 포함한다. 증폭 산물을 EcoR I과 BamH I로 쪼갠 다음 플라스미드 pJO290의 EcoR1-BamH1 부위 내로 클로닝시켰다. 이 작제물(pJO290lip)을 내열성 돌연변이체를 스크리닝하는데 사용하였다(도 3). 모든 스크리닝 단계에 대장균(E. coli) 균주 JM109를 사용하였고 별다른 언급이 없는 한 모든 배지는 0.2 % 글루코스를 함유하도록 하였다. 대장균 내에서는 유전자 산물의 낮은 수준의 발현 및 조절, 유도가능한 발현이 가능하기 때문에 이 시스템을 선택하였으며, 이는 보고된 바 있는 대장균에 대한 단백질의 독성을 예방하고 소수성과 응집-유발성이 아주 큰 단백질의 생체 내(in vivo) 불용해성으로 인해 일어날 수 있는 복잡한 문제를 미연에 방지하는데 필요하다.

무작위적 돌연변이(random mutagenesis) 방법:

본 발명의 중요한 단계는 유전자 내에 변이를 만드는 능력에 있다. 생겨난 변이는 작용성 변이체를 얻는데 "충분"해야 할 것이다. 효소는 수백만년에 걸쳐 진화하여 왔고 그 과정에서 효소는 테스트를 통해 해로운 돌연변이체를 피하여 왔고 이로운 돌연변이체를 또한 테스트하여 통합하여 왔다. 또한 대부분의 유전자 돌연변이가 잠재성(silent), 즉, 아미노산 서열에는 변화를 가져오지 않았다고 생각된다. 무작위적 돌연변이 프로토콜에서는 그 유전자 산물이 비-작용성이거나 또는 형성되지 않는 과량의 변이와 비-잠재성 돌연변이를 일으키는 유전자 서열 내의 변이들을 얻을 필요가 있다. 에러-유발성 PCR 기재 돌연변이 프로토콜은 리파제의 활성에 있어 충분한 변이들을 얻도록 최적화될 필요가 있다. 방향적 진화(directed evolution) 프로토콜의 성공 여부는 이러한 변수의 조절에 달려있다. 본 실시예에서는 공지된 방법을 변형하셔 사용하였다.

리파제 유전자를 에러-유발성 PCR (Cadwell and Joyce, 1992)로 돌연변이시켰다. 프라이머 JOF (5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3') 및 JOR (5'-TGACACAGGAAACAGCTATGAC-3')는 플라스미드 상에 존재하는 Eco R1과 Bam H1를 넘어서 유전자를 플랭킹시킨다(flank). 플라스미드 pJO290-lip 20 펨토몰(femtomole), 프라이머 JOF 및 JOR 각각 50 pmole, 100 mM의 Tris.Cl(25℃, pH 8.3), 500 mM의 KCl, 0.1 % 젤라틴(w/v), 7 mM의 MgCl₂, 0.25 mM의 MnCl₂, 각각 1 mM의 dTTP와 dCTP, 각각 0.2 mM의 dATP와 dCTP 및 5 유닛(unit)의 Taq DNA 중합효소를 함유하는 100 ㎕의 반응 부피에서 에러-유발성 PCR을 수행하였다. 94 ℃에서 3 분간 초기 변성시킨 후, 써멀 사이클러(thermal cycler)에서 94 ℃에서 1 분, 45 ℃에서 1 분 및 72 ℃에서 1 분씩 30 사이클 동안 반복하였다. 증폭 산물을 에탄올로 침전시키고, 1 % 아가로스 겔로부터 용출시킨 후 EcoR I과 BamH I으로 절단하였다. 절단 산물을 1 % 아가로스 겔로 재용출시키고 EcoR I과 BamH I으로 절단된 pJO290에 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 대장균(E. coli) JM109 내로 형질전환시킨 후 25 ㎍/ml 클로람페니콜과 0.2 % 글루코스를 보충한 LB-아가에서 선별작업을 행하였다.

부위-특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)

변형 PCR 기술(Chen and Arnold, 1991)에 의하여 pET-21b에 클로닝된 리파제 유전자 상에서 부위 특이적 돌연변이를 수행하였다. 각 치환체는 목적 돌연변이체를 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머(부정합(mismatch) 프라이머)로 사용하여 5'과 3' PCR 프라이머 사이의 사슬 연장을 개시하였다. 첫번째 PCR에서, 부정합 프라이머와 3' 프라이머를 사용하여 새로운 염기 치환체를 함유하는 DNA 단편을 생성하였다. 아가로스 겔 전기영동을 행하여 그 단편을 주형과 프라이머로부터 분리, 정제한 다음, 5' 프라이머와 함께 두번째 PCR에서의 새로운 3' 프라이머로 사용하여 돌연변이 단백질의 발현을 위해 pET-21b 내로 클로닝될 전체 길이의 산물을 생성하였다.

실시예 7

두번째 PCR에서 얻은 클론의 재조합

돌연변이 유전자 서열 5는 리파제 유전자 910 위치의 특정 제한 부위 Hae II을 이용함으로써 클론 2-8G10와 wt에서 만들었다. 두 개의 단백질을 코딩하는 유전자를 T7 프로모터와 터미네이터 프라이머를 이용한 PCR로 증폭시켰다. PCR 산물을 겔 추출법으로 정제한 다음, Hae II 및 Nde I로 절단하였다. 윗쪽과 아래쪽 밴드는 각각 단백질의 C-말단 및 N-말단 영역에 대응한다. 클론 2-8G10의 윗쪽 밴드와 야생형 단백질의 아래쪽 밴드를 용출하였다. 좀더 큰 분자량의 단편을 BamH I으로 절단하고 정제하였다. (wt에서 나온) Nde I-Hae II 단편, (2-8G10에서 나온) Hae II-BamH I 단편 및 Nde I와 Hae II로 절단가능한 pET-21b를 함유하는 세번째 라이게이션을 설정하고, 그 라이게이션 혼합물을 DH5α로 형질전환시킨 다음 양성군(positive)을 선별하였다. DNA 시퀀싱에 의하여 유전자 서열을 확인하였다.

돌연변이 유전자 서열 6(삼중 돌연변이)은 돌연변이성 프라이머 PROLF: 5'-GGC AAG GCG CCT CCG GGA ACA GAT-3'을 이용한 유전자 서열 5 주형 상의 부위-특이적 돌연변이에 의하여 아미노산서열에서 L114P 변화를 일으켰던 코돈 변화 CTT -> CCT를 통합시켜서 만들었다. 모든 유전자 서열을 자동화 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.

실시예 8

효소 반응속도론(kinetics)

수용성 기질 p-니트로페닐 아세테이트를 이용한 자동온도조절장치가 있는 분광광도계(thermostatted spectrophotometer)로 모든 반응속도를 측정하였다. 여러 농도의 p-니트로페닐 아세테이트 가수분해의 초기 속도를 소듐 포스페이트 완충액 pH 7.2, 25 ℃에서 측정하였다. 대응하는 Lineweaver-Burke 플롯(plot)으로부터 K_M 및 k_cat 값을 유도하였다. 도 9는 야생형과 돌연변이체에서 얻은 속도론적 파라미터를 보여준다.

실시예 9

리파제 및 그 돌연변이체의 유기용매 존재 하에서의 활성

리파제 및 그 돌연변이체의 활성을 다양한 용매의 존재 하에서 확인하였다. 유기용매로는 아세토니트릴, 이소프로판올, 디메틸 설폭사이드 및 디메틸 포름아미드를 사용하여 테스트하였다. PNPA를 기질로 사용하여 활성 어세이를 수행하였다. 기질(2 mM)을 완충액(50 mM pH 8.0) 중의 여러 % 농도(v/v)의 유기용매에 용해시킨 다음, 0.246 mg/ml 농도의 리파제를 첨가하여 그 반응을 개시하였다. 그 활성은 410 nm에서의 흡광도의 n 증가치로서 모니터링하였고 그 곡선의 초기 기울기를 이용하여 비활성(specific activity)을 계산하였다. 도 10 및 11은 아세트니트릴을 사용하여 얻은 데이터를 보여준다.

앞선 실시예들은 천연 효소에 비하여 보다 고온의 유기 배지 중에서 안정성 및/또는 에스테르 가수분해 활성이 개선된 리파제를 생성, 동정 및 분리하는 데 있어서 본 발명의 유용성을 설명하고 있다.

실시예 10

야생형 리파제 또는 대조군 리파제의 여러 세제 존재 하에서의 활성(도 12)

따라서 본 발명에 따른 예시적인 구체예들이 기재되어 있지만, 본원에 개시된 내용은 단지 예시일 뿐이며 다양한 교체, 개조 및 변형이 본 발명의 범위 내에서 이루어질 수 있다는 것은 당해 기술 분야의 종사자들에게 자명할 것이다. 따라서, 본 발명을 본원에 예시된 특정 구체예들에 한정하고자 함이 아니다.

참고문헌

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Met Gly 65 70 75 80 Gly Ala Asn Thr Leu Tyr Tyr Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asn Lys 85 90 95 Val Ala Asn Val Val Thr Leu Gly Gly Ala Asn Arg Leu Thr Thr Gly 100 105 110 Lys Ala Leu Pro Gly Thr Asp Pro Asn Gln Lys Ile Leu Tyr Thr Ser 115 120 125 Ile Tyr Ser Ser Ala Asp Met Ile Val Met Asn Tyr Leu Ser Arg Leu 130 135 140 Val Gly Ala Arg Asn Val Gln Ile His Gly Gly His Ile Gly Leu Leu 145 150 155 160 Tyr Ser Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly 165 170 175 Gly Gln Asn Thr Asn 180 <210> 11 <211> 181 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enzyme <400> 11 Met Ala Glu His Asn Pro Val Val Met Val His Gly Ile Gly Gly Ala 1 5 10 15 Ser Phe Asn Phe Ala Gly Ile Lys Ser Tyr Leu Val Ser Gln Gly Trp 20 25 30 Ser Arg Asp Lys Leu Tyr Ala Val Asp Phe Trp Asp Lys Thr Gly Thr 35 40 45 Asn Tyr Asn Asn Gly Pro Val Leu Ser Arg Phe Val Gln Lys Val Leu 50 55 60 Asp Glu Thr Gly Val Lys Lys Val Asp Ile Val Ala His Ser Met Gly 65 70 75 80 Gly Ala Asn Thr Leu Tyr Tyr Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asn Lys 85 90 95 Val Ala Asn Val Val Thr Leu Gly Gly Ala Asn Arg Leu Thr Thr Gly 100 105 110 Lys Ala Leu Pro Gly Thr Asp Pro Asp Gln Lys Ile Leu Tyr Thr Ser 115 120 125 Ile Tyr Ser Ser Asp Asp Met Ile Val Met Asn Tyr Leu Ser Arg Leu 130 135 140 Asp Gly Ala Arg Asn Val Gln Ile His Gly Gly His Ile Gly Leu Leu 145 150 155 160 Tyr Ser Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly 165 170 175 Gly Gln Asn Thr Asn 180 <210> 12 <211> 181 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> enzyme <400> 12 Met Ala Glu His Asn Pro Val Val Met Val His Gly Ile Gly Gly Ala 1 5 10 15 Ser Phe Asn Phe Ala Gly Ile Lys Ser Tyr Leu Val Ser Gln Gly Trp 20 25 30 Ser Arg Asp Lys Leu Tyr Ala Val Asp Phe Trp Asp Lys Thr Gly Thr 35 40 45 Asn Tyr Asn Asn Gly Pro Val Leu Ser Arg Phe Val Gln Lys Val Leu 50 55 60 Asp Glu Thr Gly Ala Lys Lys Val Asp Ile Val Ala His Ser Met Gly 65 70 75 80 Gly Ala Asn Thr Leu Tyr Tyr Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asn Lys 85 90 95 Val Ala Asn Val Val Thr Leu Gly Gly Ala Asn Arg Leu Thr Thr Gly 100 105 110 Lys Ala Pro Pro Gly Thr Asp Pro Asp Gln Lys Ile Leu Tyr Thr Ser 115 120 125 Ile Tyr Ser Ser Asp Asp Met Ile Val Met Asn Tyr Leu Ser Arg Leu 130 135 140 Asp Gly Ala Arg Asn Val Gln Ile His Gly Gly His Ile Gly Leu Leu 145 150 155 160 Tyr Ser Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly 165 170 175 Gly Gln Asn Thr Asn 180 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer JOF <400> 13 cgccagggtt ttcccagtca cgac 24 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer JOR <400> 14 tgacacagga aacagctatg ac 22

Claims

분자량이 19443인 서열번호 2, 분자량이 19515인 서열번호 3, 분자량이 19456.9인 서열번호 4, 분자량이 19487인 서열번호 5 및 분자량이 19470.9인 서열번호 6을 가지며, 내열성, 유기용매 내성 및 높은 pH 내성을 갖는, 신규한 리파제 유전자 변이체.
제 1항에 있어서,
상기 유전자 변이체가 약 45 내지 95 ℃의 온도 범위에서 내열성이 있는, 신규한 유전자 변이체.
제 2항에 있어서,
상기 유전자 변이체가 약 55 내지 90 ℃의 온도 범위에서 더욱 내열성이 있는, 신규한 유전자 변이체.
제 1항에 있어서,
반감기(T₁ _/2) 값의 범위가 6 내지 685인, 신규한 유전자 변이체.
제 1항에 있어서,
반감기(T₁ _/2) 값의 범위가 7 내지 677인, 신규한 유전자 변이체.
제 1항에 있어서,
K_m 값의 범위가 0.5 내지 2.5 mM인, 신규한 유전자 변이체.
제 1항에 있어서,
K_m 값의 범위가 0.63 내지 1.96 mM인, 신규한 유전자 변이체.
제 1항에 있어서,
k_cat 값의 범위가 4.5×10^-2내지 8.5×10^-2/분인, 신규한 유전자 변이체.
제 1항에 있어서,
k_cat 값의 범위가 5×10^-2내지 8.1×10^-2/분인, 신규한 유전자 변이체.
제 1항에 있어서,
k_cat/K_m 값의 범위가 4×10^-2내지 10×10^-2/분인, 신규한 유전자 변이체.
제 1항에 있어서,
k_cat/K_m 값의 범위가 4.1×10^-2내지 9.7×10^-2/분인, 신규한 유전자 변이체.
제 1항에 있어서,
상기 유전자 변이체가 아세토니트릴, 이소프로판올, 디메틸 설폭사이드 및 디메틸 포름아미드로 구성된 군으로부터 선택된 유기용매에 대한 내성을 갖는, 신규한 유전자 변이체.
제 4항에 있어서,
사용된 유기용매가 아세토니트릴인, 신규한 유전자 변이체.
제 1항에 있어서,
아세토니트릴 존재 하에 상기 유전자 변이체의 잔류활성(residual activity)의 범위가 25 내지 100 %인, 신규한 유전자 변이체.
제 1항에 있어서,
아세토니트릴 존재 하에 상기 유전자 변이체의 잔류활성의 범위가 28.7 내지 85.5 %인, 신규한 유전자 변이체.
제 1항에 있어서,
상기 유전자 변이체가 9 내지 13의 높은 pH 범위에 견디는 고유능; 직쇄 알킬 벤젠 설포네이트류, 프로테아제류 및 이들의 혼합물로 구성된 군을 포함하는 손상성(damaging) 계면활성제 및 효소에 견디는 능력을 갖는, 신규한 유전자 변이체.
제 16항에 있어서,
상기 유전자 변이체가 9 내지 13의 높은 pH 범위에 견디는 고유능; 직쇄 알킬 벤젠 설포네이트류, 프로테아제류 및 이들의 혼합물로 구성된 군을 포함하는 손상성(damaging) 계면활성제 및 효소에 견디는 능력을 갖는, 신규한 유전자 변이체.
벡터 pJO290 내에 분자량이 19443인 서열번호 2, 분자량이 19515인 서열번호 3, 분자량이 19456.9인 서열번호 4, 분자량이 19487인 서열번호 5 및 분자량이 19470.9인 서열번호 6을 포함하는 것을 특징으로 하는, 내열성, 유기용매 내성 및 높은 pH 내성을 갖는 신규한 리파제 유전자 변이체의 발현 시스템.
제 18항에 있어서,
상기 유전자 변이체가 약 45 내지 95 ℃의 온도 범위에서 내열성이 있는, 발현 시스템.
제 19항에 있어서,
상기 유전자 변이체가 약 55 내지 90 ℃의 온도 범위에서 더욱 내열성이 있는, 발현 시스템.
제 18항에 있어서,
반감기(T₁ _/2) 값의 범위가 6 내지 685인, 발현 시스템.
제 21항에 있어서,
반감기(T₁ _/2) 값의 범위가 7 내지 677인, 발현 시스템.
제 18항에 있어서,
K_m 값의 범위가 0.5 내지 2.5 mM인, 발현 시스템.
제 23항에 있어서,
K_m 값의 범위가 0.63 내지 1.96 mM인, 발현 시스템.
제 18항에 있어서,
k_cat 값의 범위가 4.5×10^-2내지 8.5×10^-2/분인, 발현 시스템.
제 25항에 있어서,
k_cat 값의 범위가 5×10^-2내지 8.1×10^-2/분인, 발현 시스템.
제 18항에 있어서,
k_cat/K_m 값의 범위가 4×10^-2내지 10×10^-2/분인, 발현 시스템.
제 27항에 있어서,
k_cat/K_m 값의 범위가 4.1 10^-2내지 9.7×10^-2/분인, 발현 시스템.
제 18항에 있어서,
상기 유전자 변이체가 아세토니트릴, 이소프로판올, 디메틸 설폭사이드 및 디메틸 포름아미드로 구성된 군으로부터 선택된 유기용매에 대한 내성을 갖는, 발현 시스템.
제 29항에 있어서,
사용된 유기용매가 아세토니트릴인, 발현 시스템.
제 18항에 있어서,
아세토니트릴 존재 하에 상기 유전자 변이체의 잔류활성(residual activity)의 범위가 25 내지 100 %인, 발현 시스템.
제 31항에 있어서,
아세토니트릴 존재 하에 상기 유전자 변이체의 잔류활성의 범위가 28.7 내지 85.5 %인, 발현 시스템.
제 18항에 있어서,
상기 유전자 변이체가 9 내지 13의 높은 pH 범위에 견디는 고유능; 직쇄 알킬 벤젠 설포네이트류, 프로테아제류 및 이들의 혼합물로 구성된 군을 포함하는 손상성(damaging) 계면활성제 및 효소에 견디는 능력을 갖는, 발현 시스템.
제 33항에 있어서,
상기 유전자 변이체가 9 내지 13의 높은 pH 범위에 견디는 고유능; 직쇄 알킬 벤젠 설포네이트류, 프로테아제류 및 이들의 혼합물로 구성된 군을 포함하는 손상성(damaging) 계면활성제 및 효소에 견디는 능력을 갖는, 발현 시스템.
(a) 바실러스 수브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 리파제 유전자를 분리 및 정제하고,
(b) 단계 (a)에서 분리한 리파제 유전자를 벡터 pJO290 내에 클로닝하고,
(c) 서열번호 13로 표시된 정방향 프라이머 JOF와 서열번호 14로 표시된 역방향 프라이머 JOR을 사용한 무작위 돌연변이 및 부위-특이적 돌연변이에 의하여 단계 (a)에서 분리된 리파제 유전자로부터 유전자 변이체를 생성시키고,
(d) 단계 (c)에서 얻은 유전자 변이체를 플라스미드 벡터 pJO290 내에 클로닝하고,
(e) 단계 (d)의 클로닝된 유전자 변이체를 대장균(E. coli) JM109 내로 라이게이션시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 분자량이 19443인 서열번호 2, 분자량이 19515인 서열번호 3, 분자량이 19456.9인 서열번호 4, 분자량이 19487인 서열번호 5 및 분자량이 19470.9인 서열번호 6을 가지며, 내열성, 유기용매 내성 및 높은 pH 내성을 갖는 신규한 리파제 유전자 변이체 발현 시스템의 제조 방법.
제 35항에 있어서,
상기 유전자 변이체가 약 45 내지 95 ℃의 온도 범위에서 내열성이 있는, 방법.
제 36항에 있어서,
상기 유전자 변이체가 약 55 내지 90 ℃의 온도 범위에서 더욱 내열성이 있는, 방법.
제 35항에 있어서,
반감기(T₁ _/2) 값의 범위가 6 내지 685인, 방법.
제 38항에 있어서,
반감기(T₁ _/2) 값의 범위가 7 내지 677인, 방법.
제 35항에 있어서,
K_m 값의 범위가 0.5 내지 2.5 mM인, 방법.
제 40항에 있어서,
K_m 값의 범위가 0.63 내지 1.96 mM인, 방법.
제 35항에 있어서,
k_cat 값의 범위가 4.5×10^-2내지 8.5×10^-2/분인, 방법.
제 42항에 있어서,
k_cat 값의 범위가 5×10^-2내지 8.1×10^-2/분인, 방법.
제 35항에 있어서,
k_cat/K_m 값의 범위가 4×10^-2내지 10×10^-2/분인, 방법.
제 44항에 있어서,
k_cat/K_m 값의 범위가 4.1×10^-2내지 9.7×10^-2/분인, 방법.
제 35항에 있어서,
상기 유전자 변이체가 아세토니트릴, 이소프로판올, 디메틸 설폭사이드 및 디메틸 포름아미드로 구성된 군으로부터 선택된 유기용매에 대한 내성을 갖는, 방법.
제 46항에 있어서,
사용된 유기용매가 아세토니트릴인, 방법.
제 35항에 있어서,
아세토니트릴 존재 하에 상기 유전자 변이체의 잔류활성(residual activity)의 범위가 25 내지 100 %인, 방법.
제 48항에 있어서,
아세토니트릴 존재 하에 상기 유전자 변이체의 잔류활성의 범위가 28.7 내지 85.5 %인, 방법.
제 35항에 있어서,
상기 유전자 변이체가 9 내지 13의 높은 pH 범위에 견디는 고유능; 직쇄 알킬 벤젠 설포네이트류, 프로테아제류 및 이들의 혼합물로 구성된 군을 포함하는 손상성(damaging) 계면활성제 및 효소에 견디는 능력을 갖는, 방법.
제 50항에 있어서,
상기 유전자 변이체가 9 내지 13의 높은 pH 범위에 견디는 고유능; 직쇄 알킬 벤젠 설포네이트류, 프로테아제류 및 이들의 혼합물로 구성된 군을 포함하는 손상성(damaging) 계면활성제 및 효소에 견디는 능력을 갖는, 방법.