CN101857856B - 一种枯草芽孢杆菌脂肪酶及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌脂肪酶及制备方法和应用，一种枯草芽孢杆菌脂肪酶，大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-/Lip A f10-H1(I12V/L140F/D144E)，CCTCC NO：M2010058。这种高活力脂肪酶突变体的编码基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其步骤是：第一是通过PCR扩增出枯草芽孢杆菌脂肪酶Lip A结构基因；第二是设计3对诱变引物，通过重叠PCR将突变引入脂肪酶Lip A基因；第三获得高活力脂肪酶产生菌BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)；第四是在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白；第五是纯化蛋白。一种枯草芽孢杆菌脂肪酶在洗涤剂工业中的应用。本发明方法易行，成本低廉，高酶活脂肪酶突变株蛋白在食品、能源、化工和医药等行业具有重要应用价值。

Description

一种枯草芽孢杆菌脂肪酶及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分子酶学与生物技术，具体涉及一种高活力脂肪酶的编码基因，同时涉及该突变基因编码的脂肪酶蛋白的制备方法。高酶活脂肪酶突变株蛋白可以广泛应用于食品、能源、化工和医药等行业。
背景技术
脂肪酶(Lipase，E.C.3.1.1.3)，全称为三酰基甘油酰基水解酶(triacylglycerolacylhydrolase)，它属于α/β折叠酶家族，是一种丝氨酸水解酶。脂肪酶的催化遵循丝氨酸水解酶的反应机制，能够在油水界面上将甘油三酯完全水解成脂肪酸和甘油，因而脂肪酶能够催化脂水解、脂合成和脂交换等多种反应，被应用于油脂处理、洗涤剂、食品加工、精细化工、制药、造纸等多种行业。
脂肪酶在动植物的各种组织及微生物中普遍存在，是生物体内脂代谢不可缺少的重要水解酶。人们于1834年首先在动物胰脏发现脂肪酶的活性，至今已有近二百年的历史。1871年报道了植物种子脂肪酶，而上世纪初人们从微生物中也发现了脂肪酶。由于微生物脂肪酶种类多，具有比动植物脂肪酶更广的反应pH值、反应温度以及对底物的反应专一性，又便于进行工业化生产和获得高纯度的酶制剂，再加上微生物脂肪酶在理论研究和实际应用中都非常重要，因此它们在研究和应用上的进展相当迅速。产生脂肪酶的微生物种类很多，如黑曲霉、白地霉、毛霉、荧光假单胞菌等，它们所产生的脂肪酶相继获得结晶。其它如无根根霉、圆柱形假丝酵母、耶尔氏球拟酵母、粘质色杆菌等来源的脂肪酶也相继得到高度提纯，并对它们的理化性质开展了进一步的研究。
尽管产脂肪酶微生物容易发现，但寻找适合于工业规模生产的脂肪酶产生菌及其发酵条件却非常困难。在通过传统诱变育种以及优化发酵条件提高脂肪酶产量方面已经开展了大量的工作，并使得许多脂肪酶实现了工业化生产。近年来随着基因操作技术的深入发展和应用，人们能够越来越多的通过直接对酶基因的改造，获得更适合于生产实践需求的脂肪酶制剂。在众多的脂肪酶中，枯草杆菌脂肪酶Lip A作为一种细菌来源的脂肪酶，具备许多优良的性质，如分子量小，催化活力高，底物范围广，是一种嗜碱性脂肪酶等，因此其具有较好的食品工业及化学工业等方面的应用潜力。但是，由于枯草杆菌脂肪酶高浓度时容易聚集，给其纯化和应用带来很大困难，所以通过改造Lip A，得到高酶活突变株，使其在低浓度范围就具有高催化活性，具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种高酶活脂肪酶突变株蛋白的编码基因LipA(I12V/L140F/D144E)，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列以及所述的序列编码的突变酶，该突变酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。通过重叠PCR引入突变，连接于表达载体，获得高活力脂肪酶产生菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-/Lip A f10-H1(I12V/L140F/D144E)，生产高活力突变体脂肪酶。该突变酶的酶活是野生型的三倍。
本发明的另一个目的是在于提供了一种枯草芽孢杆菌脂肪酶的制备方法，该方法是构建大肠杆菌表达系统，利用亲和层析方法纯化高酶活脂肪酶突变株蛋白。该方法简便，成本低廉。
本发明的再一个目的是在于提供了一种枯草芽孢杆菌脂肪酶在洗涤剂工业中的应用。该突变体蛋白对不同碳链长度的底物的催化活性是野生型的3倍以上，往洗涤剂中添加时在保证相同催化功效的前提下，与野生型酶制剂相比可以有效减少酶制剂的使用量，从而避免脂肪酶高浓度应用容易发生聚集而降低催化效率，提高洗涤剂的去污能力。
为了实现上述任务，本发明采用以下技术措施：
本发明的第一个目的是提供一种核苷酸序列，该序列编码一种高酶活脂肪酶突变株蛋白，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其特征是在于野生型脂肪酶结构基因上具有34位的A突变为G(I12V)，420位的A突变为T(L140F)，432位的T突变为G(D144E)的点突变。
一种高酶活脂肪酶突变株蛋白的制备方法，其步骤是：
1.突变脂肪酶LipA(I12V/L140F/D144E)突变点的引入：
(1)设计诱变引物，采用重叠PCR法依次在脂肪酶基因上把野生型Lip A基因上34位的A突变为G(I12V)，420位的A突变为T(L140F)，432位的T突变为G(D144E)；
(2)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和Hind III进行酶切，与经过相同酶切的质粒pET28a(+)(购自Novagen公司)片段连接后，转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Novagen公司)感受态细胞，获得的酶在大肠杆菌菌株(Escherichia coli)BL21/pET28a-/Lip Af10-H1(I12V/L140F/D144E)中的表达；
2.鉴定重组质粒pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)：用酶切、PCR方法对重组质粒进行鉴定，并测序检验，一种分离的蛋白质(一种高活性脂肪酶的编码基因)，其编码基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，
本发明所述的编码高酶活脂肪酶突变株蛋白的基因Lip A(I12V/L140F/D144E)，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，有以下特征：
1.本发明所用的脂肪酶野生型基因来自枯草芽孢杆菌，结构基因长度为546bp。
2.具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，与野生型相比在此结构基因上具有三处点突变，即34位的A突变为G(I12V)，420位的A突变为T(L140F)，432位的T突变为G(D144E)。
3.基因Lip A(I12V/L140F/D144E)编码的脂肪酶蛋白对不同碳链长度的底物(C4-C16)的催化活性是野生型的3倍以上，并与野生型酶具有相似的热稳定性。
本发明的高酶活脂肪酶突变株蛋白可用如下方法生产。该方法包括：以下具体的操作按照常规实验条件，如《分子克隆实验手册》(第三版)【J.萨姆布鲁克等编著，2003，北京：科学出版社】中所述的条件进行。
1.突变脂肪酶Lip A(I12V/L140F/D144E)突变点的引入
(1)设计诱变引物，采用重叠PCR法依次在脂肪酶基因上把野生型Lip A基因上34位的A突变为G(I12V)，420位的A突变为T(L140F)，
432位的T突变为G(D144E)；
(2)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和Hind III进行酶切，与经过相同酶切的质粒pET28a(+)片段连接后，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得大肠杆菌菌株(Escherichia coli)BL21/pET28a-/Lip A f10-H1(I12V/L140F/D144E)；
2.鉴定重组质粒pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)：用酶切、PCR方法对重组质粒进行鉴定，并测序检验，由此得到具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.将大肠杆菌BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)单克隆子转到5ml含有卡那霉素的液体LB培养基中培养过夜，次日取过夜培养物2.5ml以1％(v/v)的接种量转接到250ml的液体培养基中在37℃的条件下振荡培养至OD600为0.6，加入IPTG至终浓度为0.4mM，控制温度在18℃进行突变蛋白的诱导表达；
4.将诱导培养的菌体以8000rpm在4℃冷冻离心机中离心，弃掉上清，收集菌体。以Mili-Q级水、平衡缓冲液分别洗涤菌体一次，洗去菌体上残留的培养基。将250ml的菌体以25ml的平衡缓冲液重悬，以超声波处理菌液30min，至菌液澄清。在4℃冷冻离心机中，10000rpm下离心菌液30min，取上清，弃杂质。将上清经0.45μm的滤膜过滤，即得粗酶液；
5.LipA(I12V/L140F/D144E)突变体蛋白的纯化采用金属螯合的亲和层析法，粗酶液经过亲和纯化，即可得到具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的高酶活脂肪酶突变株蛋白；
6.采用SDS-PAGE方法检测突变蛋白的纯度；
7.将脂肪酶底物融入异丙醇中配成25mM的母液，稀释酶液至10μg/ml。反应在pH8.0的磷酸缓冲液(部分长链底物需加0.1％(v/v)阿拉伯胶作乳化剂)中进行，底物终浓度为0.5mM，反应温度为37℃，200ul体系中含5μl稀释酶液。用酶标仪监测OD405在1min内的变化，检验突变脂肪酶的活性。
注：以上提到的LB培养基配方如下：
LB液体培养基：1％(w/w)胰蛋白胨，0.5％(w/w)酵母抽提物，1％(w/w)NaCl，用蒸馏水配置，调节pH至7.0，在1.034×105Pa高压下蒸气灭菌20分钟。
LB固体培养基：在上述LB液体培养基的基础上再加1.5-2.0％(w/w)琼脂。
发酵产酶培养基：在LB培养基中加卡那霉素至终浓度为0.4mM即可。
本发明获得的一种枯草芽孢杆菌脂肪酶在食品、能源、化工和医药等行业有着广泛的应用前景。在食品工业中脂肪酶可以用于油脂改性、乳酪的熟化和后期风味的强化等；在化工工业中脂肪酶可以用于绢纺、皮毛、皮革、明胶等的脱脂、添加到洗涤剂中增加洗涤剂的去污能力等；在医药行业中脂肪酶可作为帮助消化、降低血脂、治疗局部炎症的药物、作为临床诊断脂血病、胰腺炎等疾病的依据及进行消旋体药物的生物法手性拆分等。脂肪酶在洗衣粉中的应用过程如下：
在洗衣粉中加入5-500U/g的脂肪酶，脂肪酶能催化分解衣物油污成甘油二脂、甘油单脂及脂肪酸等较易溶于水的物质，从而显著提高洗衣粉的洗涤效果，尤其是去除黄斑的效果。在洗衣粉添加脂肪酶的优势是能有效提高洗衣粉的去污能力，并降低直链烷基苯磺酸盐、脂肪醇硫酸盐、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸盐、烷基磺酸盐等表面活性剂和三聚磷酸钠的用量，减少去污剂对环境的污染。本发明所述的高酶活脂肪酶突变株蛋白的优势之一在于其酶活是野生型的3倍以上，可以有效减少酶制剂的使用量，从而降低含酶洗衣粉的成本。优势之二在于低剂量的酶制剂应用可以避免脂肪酶高浓度应用容易发生聚集而降低催化效率，保证洗涤剂的油脂去污能力。
所述的大肠杆菌表达载体pET28a(+)和大肠杆菌菌株BL21(DE3)均购自Novagen公司。所述重组质粒pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)为本发明所构建。所述的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)是具有质粒pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)的大肠杆菌菌株，保藏编号：CCTCC NO：M2010058，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2010年3月15日，分类命名：大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21/pET28a-/Lip A f10-H1(I12V/L140F/D144E)。所述的编码基因Lip A(I12V/L140F/D144E)是具有SEQUENCE NO.1的核苷酸序列的高酶活脂肪酶突变株蛋白编码基因。所述的蛋白Lip A(I12V/L140F/D144E)是具有SEQUENCE NO.2的氨基酸序列的高酶活脂肪酶突变株蛋白。一种分离的蛋白质，其序列为SEQUENCE NO.2所示的氨基酸序列。
本发明的优点和效果：
本发明中提供的脂肪酶突变株的核苷酸序列和蛋白质序列是一种脂肪酶高酶活突变株的基因和蛋白质序列，未见报道。本株脂肪酶突变株蛋白对不同碳链长度的底物的催化活性酶活是野生型酶活的3倍以上，同时45℃以下具有良好的热稳定性，符合实际应用的要求。而脂肪酶在食品、化工和医药等领域有着广泛的应用，因此，获得高酶活的脂肪酶，具有很高的实用价值。特别是脂肪酶高浓度应用时容易聚集，影响催化效率。而该高酶活突变株可以在低浓度范围提供高催化活性，即达到相同催化效力，酶的添加量仅为野生型的三分之一，有效避免高浓度应用酶发生聚集的问题。
附图说明
图1为一种重组质粒的构建示意图
(1)用PCR方法扩增出Lip A基因；
(2)设计诱变引物，采用PCR定点突变法依次在脂肪酶基因上把野生型Lip A基因上34位的A突变为G(I12V)，420位的A突变为T(L140F)，432位的T突变为G(D144E)；
(3)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和Hind III进行酶切，与经过相同酶切的质粒pET28a(+)片段连接后，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得获得重组质粒pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)；
图2为一种重组表达质粒pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)的PCR鉴定(a)和酶切鉴定(b)结果示意图(1％琼脂糖凝胶电泳)。
如图2(b)所示，以上下游引物扩增出的条带大小为546bp，与LipA结构基因大小一致。
表达载体pET28a(+)大小为5369bp，插入的Lip A结构基因大小为546bp，将重组表达质粒pET28a-LipA(I12V/L140F/D144E)用BamHI和Hind III双酶切，电泳结果如图2(b)中所示，得到大小分别约为5360和550bp的两个片段，与推测值一致。以上结果证明高酶活脂肪酶突变株蛋白编码基因Lip A(I12V/L140F/D144E)已克隆到表达载体pET28a(+)，重组表达质粒pET28a-LipA(I12V/L140F/D144E)构建成功。
图3为一种纯化后的重组大肠杆菌菌株(Escherichia coli)BL21/pET28a-/Lip A f10-H1(I12V/L140F/D144E)诱导表达产生的高酶活脂肪酶突变株蛋白示意图(10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测)
脂肪酶分子量约为21kDa，与结果相符。
图4为一种突变酶与野生型的热稳定性比较
将野生型和突变株酶液分别置于45℃和50℃下，每隔十分钟取样测定剩余酶活，评价了酶的热稳定性。如图4(a)所示，在45℃中水浴中水浴保存1小时内，野生型和突变株酶活都没有明显损失。50℃中水浴保存20分钟后，突变株Lip A(I12V/L140F/D144E)的酶活开始下降，1小时后其剩余酶活为原来的60％左右；野生型在50℃水浴30分钟后，酶活也开始下降，但下降幅度较小，1小时后野生型仍可保留80％以上的活性，见图4(b)。总体而言，高酶活脂肪酶突变株蛋白Lip A(I12V/L140F/D144E)具有良好的热稳定性，能够满足实际应用的需要。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。实施例中的实验方法，均按常规条件进行，具体参考《分子克隆实验指南》(作者：J.萨姆布鲁克等，第三版，2003年，科学出版社)中所述实验方法。
实施例1.高酶活脂肪酶突变株蛋白的获得：
图1显示了重组突变脂肪酶基因的构建原理和过程。天然的脂肪酶为单体蛋白，含181个氨基酸，基因长为546bp。
一种高酶活脂肪酶突变株蛋白的制备方法，其步骤是：
1.突变酶Lip A(I12V/L140F/D144E)编码基因中突变点的引入：
(1)设计诱变引物，采用重叠PCR法在Lip A基因上依次把野生型Lip A基因上34位的A突变为G(I12V)，420位的A突变为T(L140F)，432位的T突变为G(D144E)。
设计脂肪酶定点突变所需引物序列：
上游引物：5′-ATTAGGATCCGCTGAACACAATCCAGTCGTTATGG-3′
下游引物：5′-TATA AAGCTTTTAATTCGTATTCTGGCCCCCG-3′
定点突变引物：
12V-1：5′-ATGCCCCTCCAACACCGTGAAC-3′
12V-2：5′-GTTATGGTTCACGGTGTTGGAG-3′
140F-1：5′-CTAATCTTGAAAAGTAATTC-3′
140F-2：5′-GTCATGAATTACTTTTCAAG-3′
144E-1：5′-CGTTTCTAGCACCCTCTAATC-3′
144E-2：5′-TTCAAGATTAGAGGGTGCTAG-3′
以野生型脂肪酶基因片段为模板，用上游引物与引物12V-1为PCR引物，扩增出约56bp的基因片段。PCR循环条件：94℃5min；94℃30sec，52℃40sec，72℃40sec，30个循环；72℃5min。PCR扩增产物经1.8％(w/w)琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。另外，此56bp的基因片段也可通过核苷酸片段的合成来直接获得。
用下游引物与引物12V-2作为PCR反应的引物，以野生型脂肪酶基因片段为模板，扩增出520bp的基因片段。PCR循环条件：94℃5min；94℃30sec，52℃40sec，72℃60sec，30个循环；72℃5min。PCR扩增产物经1.2％(w/w)琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。
将以上得到的两种PCR产物混合，加入上、下游引物再次进行PCR，PCR反应条件为：94℃5min；94℃30sec，50℃60sec，72℃60sec，30个循环；72℃10min。PCR扩增产物经1.2％(w/w)琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。得到含有突变位点I12V的脂肪酶基因片段。
以突变体I12V脂肪酶基因片段为模板，分别以上游引物与引物140F-1作为一对PCR引物，下游引物与引物140F-2作为一对PCR引物，通过两次PCR操作，分别获得大小约为430bp和130bp的PCR产物。然后将两种PCR产物混合，加入上、下游引物再次进行PCR，获得含有突变位点I12V和L140F的脂肪酶基因片段Lip A(I12V/L140F)。
以突变体Lip A(I12V/L140F)为模板，分别以上游引物与引物144E-1作为一对PCR引物，下游引物与引物144E-2作为一对PCR引物，通过两次PCR操作，分别获得大小约为440bp和120bp的PCR产物。然后将两种PCR产物混合，加入上、下游引物再次进行PCR，获得含有突变位点I12V、L140F和D144E的脂肪酶基因片段Lip A(I12V/L140F/D144E)。
(2)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶BamHI和Hind III进行酶切，用T4连接酶与经过相同酶切的质粒pET28a(+)片段连接，16℃连接过夜后连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用卡那霉素-LB平板筛选得到阳性菌落，经过鉴定(见下一步骤)，命名为大肠杆菌菌株BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)；
2.质粒pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)的鉴定：
用质粒抽提试剂盒从阳性菌落BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)培养物中分别提取质粒pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)，分别采用酶切和PCR方法对重组质粒进行鉴定。以上下游引物进行PCR，扩增出的条带大小约为546bp，如图2(a)，与预期大小相符。与Lip A结构基因大小一致。
用BamHI和Hind III双酶切，电泳结果如图2(b)中所示，得到大小分别约为5360和550bp的两个片段，与实验结果基本一致。
质粒上Lip A(I12V/L140F/D144E)基因的序列测定由英俊(invitrogen)生物技术有限公司进行。测序引物是利用质粒pET28a(+)上的通用引物，测序结果表明获得的Lip A(I12V/L140F/D144E)基因序列与预期设计完全一致，由此得到具有SEQ ID NO.1所示序列的高酶活脂肪酶突变株蛋白编码基因Lip A(I12V/L140F/D144E)。一种分离的蛋白质，其编码基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。Lip A(I12V/L140F/D144E)基因全长546nt，编码181个氨基酸的蛋白。将产生的质粒命名为(Escherichia coli)BL21/pET28a-/Lip A f10-H1(I12V/L140F/D144E)。
4.重组质粒pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)的提取：
将BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)接种到LB培养基，37℃过夜培养，用质粒抽提试剂盒提取质pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)。
4.突变体蛋白Lip A(I12V/L140F/D144E)的诱导表达；
将大肠杆菌BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)单克隆子转到5ml含有卡那霉素的液体LB培养基中培养过夜，次日取过夜培养物2.5ml以1％(v/v)的接种量转接到250ml的液体培养基中在37℃的条件下振荡培养至OD600为0.6，加入IPTG至终浓度为0.4mM，控制温度在18℃进行突变蛋白的诱导表达
5.突变体蛋白LipA(I12V/L140F/D144E)酶液的提取；
将诱导培养的菌体以8000rpm在4℃冷冻离心机中离心，弃掉上清，收集菌体。以Mili-Q级水、平衡缓冲液分别洗涤菌体一次，洗去菌体上残留的培养基。将250ml的菌体以25ml的平衡缓冲液重悬，以超声波处理菌液30min，至菌液澄清。在4℃冷冻离心机中，10000rpm下离心菌液30min，取上清，弃杂质。将上清经0.45μm的滤膜过滤，即得粗酶液；
6.突变体蛋白Lip A(I12V/L140F/D144E)的纯化；
采用金属螯合的亲和层析法，具体采用GE公司的预装柱His Trap FF 1ml，在ATKA系统上进行。粗酶液经过亲和纯化，即可得到具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的高酶活脂肪酶突变株蛋白。一种分离的蛋白质，其序列为SEQUENCE NO.2所示的氨基酸序列。
实施例2：
突变体蛋白Lip A(I12V/L140F/D144E)的活性检测及其他酶学性质分析。
将不同碳链长度的各种底物融入异丙醇中配成25mM的母液。将酶液用反应缓冲液稀释成10μg/ml。反应在pH8.0的磷酸缓冲液(部分长链底物需加0.1％(v/v)阿拉伯胶作乳化剂)中进行，反应温度为37℃，200ul体系中含5μl稀释酶液，底物终浓度为0.5mM，利用酶标仪监测OD405在1min内的变化。酶活单位定义为：在37℃下，每分钟产生1μmol对硝基苯酚所需要的酶量。
用Bio-Rad公司生产的蛋白质浓度测定试剂盒测定，以BSA作标准曲线。
计算酶比活
热稳定性分析：
催化活性提高的突变体有时会伴随热稳定性的降低，将野生型和突变株酶液分别置于45℃和50℃下，每隔十分钟取样测定剩余酶活，评价了酶的热稳定性。如图4(a)所示，在45℃中水浴中水浴保存1小时内，野生型和突变株酶活都没有明显损失。50℃中水浴保存20分钟后，突变株Lip A(I12V/L140F/D144E)的酶活开始下降，1小时后其剩余酶活为原来的60％左右；野生型在50℃水浴30分钟后，酶活也开始下降，但下降幅度较小，1小时后野生型仍可保留80％以上的活性，见图4(b)。总体而言，高酶活脂肪酶突变株蛋白Lip A(I12V/L140F/D144E)具有良好的热稳定性，能够满足实际应用的需要。
实施例3：
一种枯草芽孢杆菌脂肪酶在洗涤剂中的应用。
将突变体蛋白Lip A(I12V/L140F/D144E)以5-500U/g的脂肪酶剂量添加到洗衣粉中，该蛋白能催化分解衣物油污成甘油二脂、甘油单脂及脂肪酸等较易溶于水的物质，从而显著提高洗衣粉的洗涤效果，尤其是去除黄斑的效果。在洗衣粉添加脂肪酶的优势是能有效提高洗衣粉的去污能力，并降低直链烷基苯磺酸盐、脂肪醇硫酸盐、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸盐、烷基磺酸盐等表面活性剂和三聚磷酸钠的用量，减少去污剂对环境的污染。本发明所述的高酶活脂肪酶突变株蛋白的优势之一在于其酶活是野生型的3倍以上，可以有效减少酶制剂的使用量，从而降低含酶洗衣粉的成本。优势之二在于低剂量的酶制剂应用可以避免脂肪酶高浓度应用容易发生聚集而降低催化效率，保证洗涤剂的油脂去污能力。
序列表(SEQUENCE LISTING)
<110>中国科学院武汉病毒研究所
<120>一种枯草芽孢杆菌脂肪酶及制备方法和应用
<130>一种枯草芽孢杆菌脂肪酶及制备方法和应用
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>546
<212>DNA
<213>脂肪酶
<400>1
gctgaacaca atccagtcgt tatggttcac ggtgttggag gggcatcatt caattttgcg    60
ggaattaaga gctatctcgt atctcagggc tggtcgcggg acaagctgta tgcagttgat    120
ttttgggaca agacaggcac aaattataac aatggaccgg tattatcacg atttgtgcaa    180
aaggttttag atgaaacggg tgcgaaaaaa gtggatattg tcgctcacag catggggggc    240
gcgaacacac tttactacat aaaaaatctg gacggcggaa ataaagttgc aaacgtcgtg    300
acgcttggcg gcgcgaaccg tttgacgaca ggcaaggcgc ttccgggaac agatccaaat    360
caaaagattt tatacacatc catttacagc agtgccgata tgattgtcat gaattacttt    420
tcaagattag agggtgctag aaacgttcaa atccatggcg ttggacacat cggccttctg    480
tacagcagcc aagtcaacag cctgattaaa gaagggctga acggcggggg ccagaatacg    540
aattaa                                                               546
<210>2
<211>181
<212>PRT
<213>脂肪酶
<400>2
Ala Glu His Asn Pro Val Val Met Val His Gly Val Gly Gly Ala Ser
1                 5                       10                     15
Phe Asn Phe Ala Gly Ile Lys Ser Tyr Leu Val Ser Gln Gly Trp Ser
             20                       25                      30
Arg Asp Lys Leu Tyr Ala Val Asp Phe Trp Asp Lys Thr Gly Thr Asn
         35                     40                     45
Tyr Asn Asn Gly Pro Val Leu Ser Arg Phe Val Gln Lys Val Leu Asp
     50                     55                      60
Glu Thr Gly Ala Lys Lys Val Asp Ile Val Ala His Ser Met Gly Gly
65                     70                       75                      80
Ala Asn Thr Leu Tyr Tyr Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asn Lys Val
                   85                      90                    95
Ala Asn Val Val Thr Leu Gly Gly Ala Asn Arg Leu Thr Thr Gly Lys
              100                     105                     110
Ala Leu Pro Gly Thr Asp Pro Asn Gln Lys Ile Leu Tyr Thr Ser Ile
         115                    120                      125
Tyr Ser Ser Ala Asp Met Ile Val Met Asn Tyr Phe Ser Arg Leu Glu
     130                     135                     140
Gly Ala Arg Asn Val Gln Ile His Gly Val Gly His Ile Gly Leu Leu
145                     150                      155                 160
Tyr Ser Ser Gln Val Asn Ser Leu Ile Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly
                    165                     170                 175
Gly Gln Asn Thr Asn
              180

Claims (4)

1.一种枯草芽孢杆菌脂肪酶，其特征在于：该酶在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-/Lip A f10-H1(I12V/L140F/D144E)中表达，CCTCC NO：M2010058，该酶的编码基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种分离的蛋白质，其编码基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.一种分离的蛋白质，其序列为SEQUENCE NO.2所示的氨基酸序列。
4.权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌脂肪酶在洗涤剂中的应用。
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