CN108220270B - 一种催化活性提高的酸性脂肪酶突变体 - Google Patents

一种催化活性提高的酸性脂肪酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种催化活性提高的酸性脂肪酶突变体，属于基因工程技术领域。本发明的突变酶ATLLid与将218的Val替换成Trp的突变酶ATLV218W的水解活性显著提高。ATLLid和ATLV218W对对硝基苯酚月桂酸酯p‑nitrophenyl laurate(p‑NPL)的水解活性分别为2.26和3.86倍，对p‑NPL的催化效率kcat/Km值较ATL分别提高了3.85倍和9.46倍。与ATL相比，ATLLid和ATLV218W的最适pH也为5.0，并在pH 2.0‑10.0具有较好的稳定性。

Description

一种催化活性提高的酸性脂肪酶突变体
技术领域
本发明涉及一种催化活性提高的酸性脂肪酶突变体，属于基因工程技术领域。
背景技术
脂肪酶(EC 3.1.1.3)又称甘油三酯水解酶，广泛分布于自然界中，是一类能在油水界面或水不溶系统进行酯类水解或酯类合成的界面酶。脂肪酶在工业上得到了广泛的应用，包括食品、化工、医药、饲料等领域，故而对脂肪酶的催化活性提出了更高的要求。多数脂肪酶的最适作用pH在中偏碱性条件下，然而，研究人员发现在酸性条件下具有较高催化活性的酸性脂肪酶具有重要的工业应用价值。例如，在医药行业中，酸性脂肪酶可用于治疗胃肠紊乱、消化不良等疾病；在食品行业中，酸性脂肪酶可在适当条件下产生低级脂肪酸等风味物质，增强食品香味；在饲料行业中，在幼畜幼禽的饲料中添加脂肪酶可以有效解决幼畜因消化机能尚未发育健全，内源性脂肪酶分泌量不足而导致的早期断奶产生的明显应激，避免对消化系统发育和消化酶分泌产生不良影响，并能提高饲料内脂肪类物质的利用率。
曲霉属脂肪酶在酸性环境中表现出良好的催化活性和耐受性，是获取高性能酸性脂肪酶重要来源之一。其中对于黑曲霉来源的酸性脂肪酶研究更为广泛，如，产自黑曲霉Aspergillus niger AN0512的脂肪酶在pH 5.0时催化活性最高，且在pH 3.0-7.0范围内保持良好的稳定性；产自A.niger NICM 1207的脂肪酶在pH 2.5和45-50℃条件下水解活力最高，且在pH 2.5-9.0范围内可保持较高活性。然而，黑曲霉来源的酸性脂肪酶多已申请了专利保护，如生产工艺和工业应用领域。因此，亟待开发其他来源的酸性脂肪酶，为工业应用提供更多的酶源选择。Shi等人发现了一种来自土曲霉Aspergillus terreus的酸性脂肪酶ATL，但仅对其进行了酶学特性研究。ATL具有良好的耐酸性能，其最适pH为4.0，且在pH3.0-12.0范围内活力稳定。A.terreus发酵脂肪酶活力仅为13.7U/mL，纯酶比活力为24U/mg，催化活性较低。
发明内容
为解决上述问题，本文将土曲霉A.terreus来源的酸性脂肪酶基因进行密码子优化，并在真核外源蛋白表达系统毕赤酵母中进行表达，通过ATL三维结构模拟及多序列同源比对，利用理性设计的方法在脂肪酶的盖子结构域和底物结合口袋域选择关键位点进行定点突变，以期提高ATL的催化活性。
本发明的第一个目的是提供脂肪酶突变体，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的脂肪酶上，将第92～95位的精氨酸、丝氨酸、脯氨酸和丙氨酸分别替换为丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和赖氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。
在本发明的一种实施方式中，将第92～95位的精氨酸、丝氨酸、脯氨酸和丙氨酸分别替换为丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和赖氨酸得到突变体ATLLid。
在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶突变体的催化活性提高。
本发明的第二个目的是提供编码所述脂肪酶突变体的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第三个目的是提供含有所述基因的表达载体。
本发明的第四个目的是提供表达所述脂肪酶突变体的重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以pPIC9K为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以毕赤酵母GS115为宿主菌。
本发明的第五个目的是提供所述脂肪酶突变体在食品、化工、医药、饲料领域的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括用于制备肠胃药物、生产低级脂肪酸。。
本发明的有益效果：
本发明的突变酶ATLLid与将218的Val替换成Trp的突变酶ATLV218W的水解活性显著提高。ATLLid和ATLV218W对橄榄油的水解活性分别是ATL的1.6和1.4倍；对对硝基苯酚月桂酸酯p-nitrophenyl laurate(p-NPL)的水解活性分别为2.26和3.86倍，对p-NPL的催化效率kcat/Km值较ATL分别提高了3.85倍和9.46倍。与ATL相比，ATLLid和ATLV218W的最适pH也为5.0，并在pH 2.0-10.0具有较好的稳定性。
附图说明：
图1为野生型脂肪酶与突变型脂肪酶的水解活性对比，以ATL对p-NPL的水解活力作为100％的相对酶活；
图2为突变型脂肪酶ATLLid，ATLV218W和野生型脂肪酶ATL的底物特异性，ATL对p-NPA的相对酶活设为数值“1”；
图3pH对脂肪酶活力和稳定性的影响，A为ATLLid、ATLV218W与ATL的最适pH，B为ATL的pH稳定性，C为ATLLid的pH稳定性，D为ATLV218W的pH稳定性。
具体实施方式
土曲霉A.terreus脂肪酶基因ATL序列(Genbank登陆号No.XP_001218444.1)根据毕赤酵母的密码子偏好性优化后，由南京金斯瑞公司合成。
培养基：大肠杆菌培养基LB：0.5％w/v酵母浸出粉，1％w/v胰蛋白胨，1％w/vNaCl，根据需要添加100μg/mL氨苄青霉素(Amp)。酵母培养基YPD、YPD-G418、MD、BMGY和BMMY根据“Invitrogen公司操作手册”方法配制。
比色法：根据Kordel等的方法，以对硝基苯酚酯为底物进行酶活测定。酶活的定义：一定反应条件下每分钟产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个脂肪酶水解酶活国际单位。对硝基苯酚酯p-nitrophenyl系列底物包括：对硝基苯酚乙酸酯p-nitrophenyl acetate(p-NPA)，对硝基苯酚丁酸酯p-nitrophenyl butyrate(p-NPB)，对硝基苯酚戊酸酯p-nitrophenyl valerate(p-NPV)，对硝基苯酚辛酸酯p-nitrophenyl caprylate(p-NPC)，对硝基苯酚月桂酸酯p-nitrophenyl laurate(p-NPL)，对硝基苯酚豆蔻酸酯p-nitrophenylmyristate(p-NPM)和对硝基苯酚棕榈酸酯p-nitrophenyl palmitate(p-NPP)。
碱滴定法：参考GB/T23535-2009方法，橄榄油与4％(w/v)聚乙烯醇(PVA)以1：3(v/v)的比例混合，用高压匀浆机处理后得到乳白色的乳化液。以乳化后的橄榄油作为脂肪酶水解底物。每个反应体系包括4mL橄榄油乳化液、5mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液和1mL酶液。该反应被95％乙醇溶液终止，反应释放的脂肪酸由0.1MNaOH中和。酶活的定义：一定反应条件下每分钟产生1μmol脂肪酸的酶量。
实施例1：脂肪酶定点突变、重组表达质粒及工程菌的构建
从基因数据库NCBI中检索到ATL基因(GenBank登录号No.XP_001218444.1)，以毕赤酵母密码子偏好性进行优化，将优化基因送上海生物工程有限公司进行合成，并在P.pastoris GS115中表达。利用限制性内切酶Not I和Avr II分别对公司合成的ATL基因DNA片段和pPIC9K空载体进行双酶切，利用T4DNA连接酶16℃连接过夜,转化至E.coliJM109感受态细胞，涂布于LB平板(含100μg/mL的Amp)，筛选出阳性转化子，并提取得到重组质粒pPIC9K-ATL。pPIC9K-ATL经限制性内切酶Sal I线性化后，利用电转化法(1500V,5ms)把重组质粒转化到宿主菌P.pastoris GS115中，并将转化物涂布于MD平板(含250μg/mL的G418)，30℃培养2-3d后，可挑取较大的阳性转化子菌落，提取酵母基因组利用引物3’-AOX1和5’AOX1进行PCR验证，得到正确的重组菌株GS115/pPIC9K-ATL。
以pPIC9K-ATL为模板，分别以Lid-F和Lid-R上下游引物(引物序列见表1)，进行全质粒PCR，得到突变后的质粒pPIC9K-ATLLid。反应体系为：模板1μl；PrimerSTAR HS 25μl；20mmol/L的上下游引物各1μl；加无菌水至总体积为50μl。反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火45s，72℃延伸11min，共30个循环；第30个循环，72℃延伸10min。将PCR扩增产物经PCRPurification Kit试剂盒纯化后，限制性内切酶Dpn I对PCR产物消化以降解模板质粒，再经过PCR Purification Kit试剂盒纯化后，转化至E.coli JM109感受态细胞。涂布于LB平板(含100μg/mL的Amp)，筛选出阳性转化子，可获得突变质粒pPIC9K-ATLLid。其余7种突变质粒均按照该方法进行构建(引物序列见表1)，分别得到不同的突变质粒：pPIC9K-ATLV218F、pPIC9K-ATLV218W、pPIC9K-ATLV218L、pPIC9K-ATLV218D、pPIC9K-ATLV218M、pPIC9K-ATLV218A、pPIC9K-ATLBP2。将突变后的质粒参考上述构建重组菌株GS115/pPIC9K-ATL的方法，得到8株突变株，分别为：GS115/pPIC9K-ATLLid、GS115/pPIC9K-ATLV218F、GS115/pPIC9K-ATLV218W、GS115/pPIC9K-ATLV218L、GS115/pPIC9K-ATLV218D、GS115/pPIC9K-ATLV218M、GS115/pPIC9K-ATLV218A和GS115/pPIC9K-ATLBP2。
表1引物序列表
Figure BDA0001565098760000041
实施例2：突变酶的表达及蛋白纯化
将实施例1的8株重组菌株与表达野生型脂肪酶的菌株GS115/pPIC9K-ATL，在含有250μg/mL G418的YPD平板上划线，30℃培养2-3d。挑取一环平板上的单菌落，接种至25mLBMGY培养基中，30℃，200rpm振荡培养16-20h至OD600为2-6。6000r/min离心10min，收集菌体并用100mL的BMMY培养基重悬，28℃，200rpm振荡培养120h，每隔24h添加1％的甲醇诱导表达并且取样检测OD600、发酵液上清的蛋白浓度和酶活性。蛋白浓度的检测使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒进行定量。当甲醇诱导发酵至96h时，所有菌株的胞外总蛋白浓度均达到最高，因此，在发酵96h时收集发酵上清液。
利用Ni-NTA镍柱亲和层析和AKTApurifire蛋白纯化系统进行重组蛋白的分离纯化。发酵液4℃ 6000r/min离心10min后取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤处理后方可上样。上样缓冲液为BufferA(0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0)，粗酶液上样到已用BufferA平衡的镍柱上，再用含不同浓度咪唑(0-0.25M)的上样缓冲液梯度洗脱吸附的蛋白，收集各洗脱峰流出液，通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴别。结果表明突变酶与野生型酶在蛋白分子量大小上没有显著区别，各样品均呈现约44kDa大小的条带。
实施例3：突变酶和野生酶酶活测定
分别以p-NPL为底物来检测纯化的突变酶和野生型酶的酶活力，如图1所示，部分突变酶表现出比野生型酶更高的水解活性，其中，ATLLid和ATLV218W对p-NPL的水解活性分别为2.26和3.86倍。
实施例4：突变酶和野生酶酶学性质
对酶活较高的突变酶ATLLid和ATLV218W与野生型酶ATL进行了对底物碳链长度特异性的测定。使用到的对硝基苯酚酯底物根据碳链长度由短至长依次为p-NPA(C2)、p-NPB(C4)、p-NPV(C5)、p-NPC(C8)、p-NPL(C12)、p-NPM(C14)和p-NPP(C16)。结果如图2所示，突变酶与野生型酶的脂肪酸碳链长度特异性一致，均对12个碳的对硝基苯酚月桂酸酯p-NPL特异性最高。然而，ATLLid对C14-C16的相对酶活显著高于ATLV218W和野生型酶ATL，说明ATLLid提高了对长链脂肪酸的底物特异性。
以对硝基苯酚酯p-NPP和p-NPL为底物，测定突变酶ATLLid和ATLV218W与野生型酶ATL的反应动力学，结果见表2。脂肪酶ATLLid对两种底物p-NPL和p-NPP的Km值从原来的0.15mM和0.73mM分别提高到了1.53mM和1.69mM，说明突变的盖子结构阻碍底物进入酶的活性中心，导致突变酶对底物的亲和力变差，酶反应所需的底物浓度增大。但是，脂肪酶的kcat值却比野生型酶分别提高了约38.93倍和10.55倍，说明盖子突变影响了酶的活性中心与底物的相互作用，导致催化活性显著增强。由此，kcat/Km值分别提高了3.85倍和4.57倍，该结果表明酶的催化效率提高的主要原因是盖子构型的变化导致的酶的活性中心的催化能力的提高，但随着对底物亲和力的降低，会影响催化效率的提高水平。
脂肪酶ATLV218W对两种底物p-NPL和p-NPP的Km值比野生型酶ATL分别提高了5.46倍和1.96倍，说明将底物结合口袋域中的缬氨酸Val突变为色氨酸Trp后，对底物的亲和力也显著降低，酶反应需要的底物浓度变大。然而，脂肪酶的kcat值却比野生型酶分别提高了约49.90倍和15.67倍，说明突变影响了酶的活性中心与底物的相互作用，导致催化活性显著增强。由此，kcat/Km值分别提高了9.46倍和8.00倍，该结果表明酶的催化效率提高的主要原因是底物结合口袋域构型的变化导致的酶的活性中心的催化能力的提高。
表2野生型ATL与突变型酶ATLLid和ATLV218W动力学参数
Figure BDA0001565098760000061
实施例5：突变酶的最适pH及pH稳定性
配制不同pH梯度的柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 2.0-10.0)，采用橄榄油滴定的方法测定脂肪酶的最适pH。测定pH稳定性时，将酶液加入上述不同梯度的柠檬酸-磷酸盐缓冲液，并放于4℃，每隔1h利用碱滴定法检测脂肪酶的残存活力，以初始酶活为100％相对酶活。如图3所示，突变酶ATLLid和ATLV218W与野生型酶ATL的最适pH均为5.0，当pH为2.0时，酶迅速失活，酶活力几乎为0。在碱性环境中，当pH高于7.0，酶活力明显下降，活力低于30％。可见，脂肪酶起水解活性作用的pH的范围较窄，一般在pH 4.5-6.0之间。如图3(B～D)所示酶的pH稳定性，在pH 4.0～8.0范围内ATL、ATLLid与ATLV218W均具有较好的稳定性，残余活力保持在90％以上。当在pH 3.0缓冲液中放置24h后，ATLLid、ATLV218W和ATL分别残留约78.26％、76.19％和72.19％的相对酶活，而在pH 2.0时，分别残留45.07％、42.40％和33.86％的相对酶活；可见，ATL在毕赤酵母中重组表达后并没有改变其耐酸的酶学特性，且突变酶ATLLid和ATLV218W也同样具有良好的耐酸特性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种催化活性提高的脂肪酶突变体
<160> 21
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ala Pro Met Arg His Val Ala Arg Asp Val Ser Thr Ala Ala Leu Thr
1 5 10 15
Gln Leu Asp Leu Phe Ala Glu Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Thr Gly
20 25 30
Asn Leu Asn Thr Thr Gly Thr Lys Val Val Cys Pro Ala Gly Asn Cys
35 40 45
Pro Gln Val Glu Ala Ala Asp Thr Thr Ser Leu Lys Glu Phe Leu Ala
50 55 60
Asp Gly Gln Tyr Gly Glu Leu Ala Gly Tyr Leu Ala Ala Asp Ser Thr
65 70 75 80
Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Pro Ala Asn
85 90 95
Trp Ile Ala Asn Leu Asp Phe Ile Phe Asp Asp Ala Asp Glu Leu Cys
100 105 110
Ala Asp Cys Lys Val His Gly Gly Phe Trp Lys Ala Trp His Thr Val
115 120 125
Ser Asp Ala Leu Lys Ala Glu Ile Gln Lys Ala Arg Thr Ala His Pro
130 135 140
Asp Tyr Lys Leu Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ala Ile Ala
145 150 155 160
Thr Leu Gly Ala Ala Glu Leu Arg Thr Thr Glu Lys Trp Ala Ile Asp
165 170 175
Val Tyr Ser Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn Leu Glu Leu Ala Glu
180 185 190
Tyr Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Tyr Arg Ala Thr His Thr Asn Asp
195 200 205
Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro Glu Ala Val Gly Tyr Arg His Pro Ser
210 215 220
Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Ala Asn Gly Val Glu Pro Thr Thr Ala
225 230 235 240
Asp Val Lys Val Ile Glu Gly Val Gly Ser Arg Lys Gly Asn Ala Gly
245 250 255
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<210> 2
<211> 276
<212> PRT
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35 40 45
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ggttctccaa gagttggtaa cttggaattg gctgagtaca ttacttcttt gggtgctatc 600
tacagagcta ctcatactaa cgatatcgtt cctagattgc cacctgaggc tgttggttac 660
agacacccat ctcctgaata ttggattact tctgctaacg gtgttgagcc aactactgct 720
gatgttaagg ttattgaagg tgttggttct agaaagggta atgctggaga ggcttctcct 780
gatgcttctg ctcactcttg gtatttcgga gatatttctg aatgtcaagg ttcttct 837
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttttgtcttt cagaggttct tctactatta aaaactggat cgctaatttg gatttcat 58
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgaaatcca aattagcgat ccagttttta atagtagaag aacctctgaa agacaaaa 58
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctagattgcc acctgaggct tttggttaca gacacccatc tcct 44
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aggagatggg tgtctgtaac caaaagcctc aggtggcaat ctag 44
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgttcctaga ttgccacctg aagcttgggg atacagacac ccatctcctg aata 54
<210> 9
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tattcaggag atgggtgtct gtatccccaa gcttcaggtg gcaatctagg aacg 54
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ctagattgcc acctgaggct ttaggttaca gacacccatc tcct 44
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
aggagatggg tgtctgtaac ctaaagcctc aggtggcaat ctag 44
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctagattgcc acctgaggct gacggttaca gacacccaag t 41
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
acttgggtgt ctgtaaccgt cagcctcagg tggcaatcta g 41
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctagattgcc acctgaggct atgggataca gacatccatc tc 42
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gagatggatg tctgtatccc atagcctcag gtggcaatct ag 42
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ctagattgcc acctgaggct gctggttaca gacacccaag tcct 44
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aggacttggg tgtctgtaac cagcagcctc aggtggcaat ctag 44
<210> 18
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cttctcctga tgcttctgct cacttgtggt actttttcgc tatttctgag tgtttgttgg 60
gttcttctca tcaccatcac catcac 86
<210> 19
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gtgatggtga tggtgatgag aagaacccaa caaacactca gaaatagcga aaaagtacca 60
caagtgagca gaagcatcag gagaag 86
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gcaaatggca ttcattctga catcc 25
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gactggttcc aattgacaag c 21

Claims (9)

1.一种脂肪酶突变体，其特征在于，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶上，将第92～95位的精氨酸、丝氨酸、脯氨酸和丙氨酸分别替换为丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和赖氨酸。
2.编码权利要求1所述脂肪酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.表达权利要求1所述脂肪酶突变体的重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以pPIC9K为表达载体。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以毕赤酵母GS115为宿主菌。
7.权利要求1所述脂肪酶突变体在食品、化工或饲料领域的应用。
8.权利要求1所述脂肪酶突变体在医药领域制备药物方面的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括用于制备肠胃药物、生产低级脂肪酸。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1768135A (zh) * 2003-01-30 2006-05-03 印度科学工业研究所 稳定的脂酶变异体
CN102220299A (zh) * 2011-04-22 2011-10-19 中国科学院成都生物研究所 一种阿魏酸酯酶a突变体及其用途
CN102839164A (zh) * 2012-09-06 2012-12-26 江南大学 基于二硫键强化折叠的热稳定性脂肪酶突变体及其构建方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Aspergillus niger Lipase: Heterologous Expression in Pichia pastoris, Molecular Modeling Prediction and the Importance of the Hinge Domains at Both Sides of the Lid Domain to Interfacial Activation;Zhengyu Shu等;《Biotechnology Progress》;20090226;第25卷(第2期);第409-416页 *
Creation of Rhizopus oryzae lipase having a unique oxyanion hole by combinatorial mutagenesis in the lid domain;Seizaburo Shiraga等;《Appl Microbiol Biotechnol》;20050224;第68卷(第6期);第779-785页 *
黑曲霉脂肪酶盖子结构域突变对其活性的影响;薛龙吟等;《生物技术通报》;20100226(第2期);第173-177页 *

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