CN110106156B - 一种阿魏酸酯酶EpFAE1及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种阿魏酸酯酶EpFAE1及其编码基因和应用。所述的阿魏酸酯酶EpFAE1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。本发明从微细正青霉4‑14中克隆得到阿魏酸酯酶EpFAE1的编码基因，并通过毕赤酵母对其重组载体进行表达，获得纯酶。通过试验证实，本发明的阿魏酸酯酶EpFAE1具有高比活性、高的酶解效率、高稳定性和一定的耐金属离子和耐盐性等优势，在医药保健、食品、饲料以及生物能源等领域具有重要应用前景。

Description

一种阿魏酸酯酶EpFAE1及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种阿魏酸酯酶EpFAE1及其编码基因和应用。

背景技术

阿魏酸(Ferulic acid，FA)又称4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，广泛存在于植物细胞壁中一种酚酸类物质。在植物细胞壁中，阿魏酸能以酯键的形式与半纤维素多糖，或以醚键的形式与木质素交联，形成复杂的网状结构。阿魏酸的存在增强了细胞壁的机械强度，对于防止酶类降解、保护细胞壁结构的完整性具有十分重要的作用。由于特定的分子结构，阿魏酸具有优良的抗氧化性能，在医药领域作为抗氧化剂使用，并可以新药合成的前体。同时，阿魏酸具抗菌、抗肿瘤、抗炎、美白和抗紫外等特性，在医药健康、功能食品和化妆品等行业应用价值巨大。

阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73，feruloyl esterase，FAE)是一种羧酸酯水解酶的亚类，能够催化植物细胞壁中羟基肉桂酸和糖分子之间酯键的水解。研究显示，阿魏酸酯酶是释放植物细胞壁中阿魏酸的关键作用酶，在内切型木聚糖酶等的协同作用下，能够有效释放小麦麸皮等基质中的阿魏酸。工业上，可以将阿魏酸酯酶用于从农业加工副产物(如小麦麸和玉米麸)制备酚酸类物质，达到高附加值转化的目的；作为膳食纤维的添加剂，促进细胞壁中阿魏酸的释放；应用于饲料和造纸工业，促进饲料的降解或纸浆中半纤维素和木质素去除等。

当前，许多不同类型的阿魏酸酯酶已相继研究报道，但市场上的阿魏酸酶制剂等产品仍然不足。因此，挖掘新颖的阿魏酸酯酶基因资源，实现高水平表达和制备，明确其酶学特性及工业应用条件，是开发出序列新颖、易制备和各项性能稳定的阿魏酸酯酶的有效手段。

发明内容

发明目的：针对现有市场阿魏酸酶制剂产品的不足，本发明的目的是提供一种来源于微细正青霉4-14中的阿魏酸酯酶EpFAE1，使其具有较好的催化能力、温度稳定性和pH稳定性。本发明的另一目的是提供上述阿魏酸酯酶EpFAE1的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种阿魏酸酯酶EpFAE1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

经蛋白同源性比对发现阿魏酸酯酶EpFAE1属于碳水化合物酯酶家族1成员，并属于A型阿魏酸酯酶。其最适温度为50℃，能够耐受50℃的高温，最适pH为5.5，pH稳定性良好，对金属离子和盐具有一定的耐受性，比活性高。

所述的阿魏酸酯酶EpFAE1的编码基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的阿魏酸酯酶EpFAE1的编码基因的表达载体。

所述的阿魏酸酯酶EpFAE1在酶解小麦麸皮制备阿魏酸中的应用。利用1.75％磷酸处理，并在阿魏酸酯酶EpFAE1和木聚糖酶的共同作用下，阿魏酸的释放率最高可达83.07％。最高可从100g去淀粉小麦麸皮中释放0.36g阿魏酸，酶解率高。

所述的阿魏酸酯酶EpFAE1在酶解玉米麸皮制备阿魏酸中的应用。利用1％磷酸处理，并在阿魏酸酯酶EpFAE1和木聚糖酶的共同作用下，阿魏酸的释放率最高可达56.52％。最高可从100g去淀粉玉米麸中释放1.16g的阿魏酸，酶解率高。

用于扩增所述的阿魏酸酯酶EpFAE1基因的特异性引物，包括以下两条序列：

上游引物：5′-CCGgaattcGCCGTTACGCAGGGCGTCTCTG-3′；

下游引物：

5′-CTAGtctagaTCAgtgatggtgatggtgatgCCAACTGCAAGCTCCGCTCG-3′。

有益效果：与现有技术相比，本发明从微细正青霉4-14中克隆得到阿魏酸酯酶EpFAE1的编码基因，并通过毕赤酵母对其重组载体进行表达，获得纯酶。通过试验证实，本发明的阿魏酸酯酶EpFAE1具有高比活性、高的酶解效率、高稳定性和一定的耐金属离子和耐盐性等优势，在医药保健、食品、饲料以及生物能源等领域具有重要应用前景。

附图说明

图1是重组阿魏酸酯酶EpFAE1的SDS-PAGE电泳图；图中，M：Marker；EpFAE1：纯化的阿魏酸酯酶；

图2是重组阿魏酸酯酶EpFAE1的最适温度结果图；

图3是重组阿魏酸酯酶EpFAE1的温度稳定性结果图；

图4是重组阿魏酸酯酶EpFAE1的最适pH结果图；

图5是重组阿魏酸酯酶EpFAE1的pH稳定性结果图；

图6是重组阿魏酸酯酶EpFAE1对NaC1的耐受性结果图；

图7是重组阿魏酸酯酶EpFAE1的酶学动力学测定结果图；底物为阿魏酸甲酯。

图8是重组阿魏酸酯酶EpFAE1协同木聚糖酶降解去淀粉小麦麸皮释放阿魏酸的结果图；上清酶解，以1U/mL的EpFAE1进行酶解；基质酶解，以1U/g基质的EpXYN1和200U/g来源于微细正青霉的内切型木聚糖酶EpXYN1协同降解。

图9是重组阿魏酸酯酶EpFAE1协同木聚糖酶降解去淀粉玉米麸皮释放阿魏酸的结果图；上清酶解，以1U/mL的EpFAE1进行酶解；基质酶解，以1U/g基质的EpFAE1和200U/g来源于微细正青霉的内切型木聚糖酶EpXYN1协同降解。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例所使用的材料和试剂如下：

菌株及载体：微细正青霉4-14(Eupenicillium parvum 4-14)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M2015404。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)及表达载体pPICZαA购自Invitrogen公司，大肠杆菌Top10及基因操作质粒pEASY-Blunt购自北京全式金生物技术有限公司(TransGen Biotech)。

酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa公司；阿魏酸甲酯购自Aladdin公司；其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加1.5％(w/v)琼脂。

PDA培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，高温高压灭菌，

YPD培养基：Yeast Extract 10g，peptone 20g，葡萄糖20g，溶于900mL水，加蒸馏水定容至1000mL，pH 6.5，115℃、30min灭菌。

BMGY培养基：Yeast Extract 10g，peptone 20g溶于700mL水，高温高压灭菌，冷却到室温后加入100mLpH＝6的1M的磷酸钾缓冲液(高温高压灭菌)，100mL 10×YNB(过滤除菌)，100mL 10×GY(100mL甘油溶于900mL水高温高压灭菌)，混合均匀后4℃保存。

BMMY培养基：Yeast Extract 10g，peptone 20g溶于700mL水，高温高压灭菌，冷却到室温后加入，100mL pH 6的1M的磷酸钾缓冲液(高温高压灭菌)，100mL 10×YNB(过滤除菌)，100mL 10×M(5％的甲醇)，混合均匀后4℃保存。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1阿魏酸酯酶EpFAE1编码基因的克隆

真菌培养与总RNA提取：取约10mg微细正青霉4-14菌株的菌丝孢子混合物接入50mL PDA液体培养基中，37℃、180rpm培养4天。取1mL培养物接入一瓶固态发酵培养基(L.Long，D.Ding，Z.Han，H.Zhao，Q.Lin，S.Ding，Thermotolerant hemicellulolytic andcellulolytic enzymes from Eupenicillium parvum 4-14display high efficiencyupon release of femlic acid from wheat bran，J.App1.Microbiol.121(2016)422-434.)中，摇匀后置于37℃、70％湿度条件下静置培养3天。取白色菌丝体以无菌水漂洗干净后，滤纸吸干水分，液氮速冻后置于-70℃保存。以TransZolTM Plant试剂盒(TransGen，北京)提取菌体总RNA。

基因克隆：取适量总RNA以EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix试剂盒(TransGen，北京)和oligo(dT)为引物进行反转录反应获得cDNA。以获得cDNA为模板，以引物fae1_f1(5′-CGTTGAACCATTGTCCATCCA-3′)和fae1_r1(5′-TGAATCGCCTCTGACTACCAA-3′)进行常规PCR反应，获得目标基因片段。进一步，将目标基因片段克隆到载体pEASY-Blunt(TransGen，北京)，并由苏州金唯智生物技术有限公司完成序列分析。

得到含有阿魏酸酯酶EpFAE1的基因全长的片段。测序结果显示，该阿魏酸酯酶EpFAE1基因全长843bp，DNA序列见SEQ ID NO.2，表达的蛋白(阿魏酸酯酶EpFAE1)序列见SEQ ID NO.1，其阅读框包含280个氨基酸，其中前20个氨基酸为信号肽。经蛋白同源性比对发现其属于碳水化合物酯酶家族1成员，并属于A型阿魏酸酯酶，成熟蛋白的理论分子量为28.22kDa，理论等电点(pI)为4.97。

实施例2阿魏酸酯酶EpFAE1的毕赤酵母表达及纯化

分别设计合成表达阿魏酸酯酶EpFAE1的特异性引物fae1_f2和fae1_r2，如下：

fae1_f2：5′-CCGgaattcGCCGTTACGCAGGGCGTCTCTG-3′：

fae1_r2：

5′-CTAGtctagaTCAgtgatggtgatggtgatgCCAACTGCAAGCTCCGCTCG-3′。

利用这对引物从含有阿魏酸酯酶EpFAE1基因的质粒上扩增获得其不含信号肽的阿魏酸酯酶EpFAE1基因片段。将扩增的目标基因片段进行EcoRI-XbaI双酶切消化，并与经EcoRI-XbaI酶切的质粒pPICZαA进行连接，获得基因表达质粒pPIC-EpFae1。重组质粒pPIC-EpFae1经限制性内切酶SacI线性化后电击转入Pichia pastoris GS115后，利用含有1M山梨醇和100μg/mL Zeocin(Invitrogen)抗生素的YPD平板进行阳性克隆的筛选。将筛选到的阳性克隆接入装有5mL YPD和100μg/mL抗生素Zeocin的试管中28℃，200rpm摇床培养，20h后将菌液分别转接到50mL BMGY培养液中28℃，200rpm摇床培养至其OD₆₀₀达到3.0后，离心收集菌体，再转接到25mL BMMY培养液中28℃，200rpm摇床培养，每隔24h补加甲醇，甲醇浓度为0.8-1.0％(v/v)，连续培养5-7d后离心收集粗酶液。将粗酶液先装入透析袋中，4℃在pH 8.0的磷酸缓冲液中轻微搅拌透析24h。酶液的纯化参照Ni-NTA Agarose(Qiagen)的方法。蛋白定量分析采用BCA检测试剂盒(Thermo Tech，USA)完成。将纯化得到的蛋白利用SDS-PAGE进行检测。结果如图1所示，可见重组阿魏酸酯酶EpFAE1在毕赤酵母中得到了表达，经纯化后为单一条带，分子量接近40kDa。实际分子量大小比理论分子量大，推测是由糖基化引起的。

1、阿魏酸酯酶EpFAE1的活性测定方法

以阿魏酸甲酯为底物测定阿魏酸酯酶EpFAE1的活性。先用一级色谱纯甲醇溶解阿魏酸甲酯，配置成50mM浓度。取800μL柠檬酸-柠檬酸钠(0.1M，pH6.0)缓冲液，加入100μL的阿魏酸甲酯甲醇溶液，置于40℃预热5min，加入100μL稀释至适当浓度的酶液。将混合物于40℃下反应30min，并在99℃下处理10min终止反应。反应混合物于室温冷却，并以灭活酶液作对照。

根据Andersen等改进的HPLC分析方法(Andersen A，Svendsen A，et al.Studieson ferulic acid esterase activity in fungal lipases and cutinases.Colloidsand Surfaces B：Biointerfaces，2002，26：47-55)测定反应液中阿魏酸的产生量。使用的色谱柱型号为ZORBAX Eclipse Plus C18，填料直径3.5μm，尺寸4.6mm×100mm。流动相为甲醇∶0.1％乙酸＝35∶65，流速为0.8mL/min，柱温30℃，进样量5μL，检测波长为320nm。阿魏酸酯酶酶活定义：在40℃、pH6.0条件下，每分钟水解底物阿魏酸甲酯产生1μmol阿魏酸所需的酶量为1个活力单位(U)。阿魏酸标准曲线的制作：配制一系列浓度的阿魏酸甲醇溶液，0.04mM、0.2mM、1mM、2.5mM和5mM，分别用0.22μm滤膜过滤后，通过HPLC检测测定320nm波长下各浓度的峰面积，以测得的峰面积为纵坐标，物质浓度为横坐标绘制标准曲线，并通过软件进行线性拟合得到线性回归方程。根据标准曲线就可以计算出粗酶液中阿魏酸酯酶活力(U/mL)。

酶活性计算公式为(U/mL)＝(v×x)/(c×T)×n，其中，

v-酶促反应体系的最终体积(mL)；

x-根据阿魏酸标准曲线计算出的阿魏酸含量(μmol/mL)；

c-所加酶液的量(mL)；

T-酶促反应时间(min)；

n-酶液的稀释倍数。

2、阿魏酸酯酶EpFAE1酶学特性的测定

1)阿魏酸酯酶EpFAE1的最适催化温度和温度稳定性

最适催化温度：将阿魏酸甲酯用一级色谱纯甲醇溶解并配置成50mM浓度。取800μL0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)，加入100μL的底物溶液，分别置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃和70℃水浴锅中预热5min，加入100μL稀释后的酶液。反应30min后，沸水灭活10min终止反应。反应混合物于室温冷却，通过HPLC的方法检测酶活，并以灭活的酶液作对照。结果如图2所示，阿魏酸酯酶EpFAE1的最适反应温度为50℃。

温度稳定性：将纯化的阿魏酸酯酶EpFAE1分别置于45℃、50℃和55℃中分别孵育0.5-6h后按照标准方法检测剩余酶活，以未经处理的酶的活性为100％计算相对酶活。结果如图3所示，在50℃中放置6h仍能保持约70％的活性，但该酶在55℃下不稳定，放置6h完全失去活性。

2)阿魏酸酯酶EpFAE1的最适催化pH和pH稳定性

最适催化pH：将阿魏酸甲酯用一级色谱纯甲醇溶解并配置成50mM浓度。配制pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5且浓度为0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，各取800μL缓冲液加入100μL的底物，40℃预热5min，加入适当稀释的100μL酶液。将混合物于40℃下反应30min后，沸水灭活10min终止反应。设置灭活的酶作为对照。反应物于室温下冷却后，通过HPLC方法测定各pH下的酶活性，并以未作处理的酶活性为100％，计算相对酶活。结果如图4所示，阿魏酸酯酶EpFAE1的最适pH为5.5，降低或升高pH都会显著降低酶活。

pH稳定性：将纯酶与pH分别为3-8的0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液等体积混合，并于4℃下放置16小时后，通过HPLC检测剩余酶活。以未经处理的酶活为100％，计算相对酶活。结果如图5所示，EpFAE1在pH 3-8的缓冲液中放置16h均能保持80％以上的活性，其中pH为5.0的条件下，剩余活性达到90％以上。

3)金属离子或化学试剂对阿魏酸酯酶EpFAE1活性的影响

在50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.5)中，分别添加1或5mM的MnCl₂或NH₄Cl或CaCl₂或CuCl₂或ZnCl₂或FeCl₃或NiSO₄或MgCl₂或EDTA，以阿魏酸甲酯为底物，在最适反应条件下测定阿魏酸酯酶EpFAE1的活性。以未处理组作为对照，计算各处理的相对酶活。结果如表1所示，Mn²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺或Mg²⁺在1mM和5mM下对酶活性存在小幅的影响。Cu²⁺和Fe³⁺在低浓度(1mM)下能够明显抑制酶活性，高浓度(5mM)则完全抑制酶活性。低浓度(1mM)EDTA的添加使得酶活性降低约8.83％，高浓度(5mM)EDTA则对酶活性影响不显著。

表1金属离子或化学试剂对阿魏酸酯酶EpFAE1活性的影响

4)盐对阿魏酸酯酶EpFAE1活性的影响

配制分别含0M、0.25M、0.5M、1M、2M和3M NaCl的0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.5)。取800μL各种缓冲液加入100μL浓度50mM阿魏酸甲酯溶液，置于50℃水浴锅中预热5min，加入100μl稀释的酶溶液。按照实施例3中所述的方法测定酶活性(温度为50℃)。结果如图6所示，0.25-0.5M的NaC1对EpFAE1酶活性具有一定的促进作用；1M的NaC1对酶活的影响不明显；随着盐浓度继续升高，酶活呈逐渐下降的趋势；当盐浓度达到3M时，目标酶活降至未处理组的55％。阿魏酸酯酶EpFAE1具有一定的耐盐性。

5)阿魏酸酯酶EpFAE1的比活力及动力学常数测定

用一级色谱纯甲醇溶解阿魏酸甲酯分别配置成25mM、50mM、75mM、100mM、125mM、150mM、175mM、200mM、225mM和250mM的底物溶液。取800μL 0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠(pH5.5)缓冲液，分别加入100μL不同浓度的底物溶液，在50℃水浴锅中预热5min后加入100μL酶液(0.1U/mg)，反应30min，沸水灭活10min终止反应。反应混合物于室温冷却，通过上述酶活测定方法检测酶活。

酶动力学常数的数据利用Graphpad Prism 5.0软件进行非线性回归分析计算该酶的动力学常数。根据图7中的数据得出：EpFAE1的V_max为28.46U/mg；K_m为7.096mM；K_cat为13.42s^-1。

实施例3阿魏酸酯酶EpFAE1协同释放谷物麸皮中阿魏酸的应用

1)谷物麸皮的去淀粉处理和酶的制备

将从市场购买的小麦麸皮和玉米麸皮粉碎过筛并按照文献方法(Long et al.，Thermotolerant hemicellulolytic and cellulolytic enzymes from Eupenicilliumparvum 4-14display high efficiency upon release of ferulic acid from wheatbran.Journal of Applied Microbiology，2016，121：422-434)进行去淀粉处理，获得去淀粉小麦麸皮和去淀粉玉米麸皮，并进行80目筛网过筛后使用。按实施实例2中的方法制备阿魏酸酯酶EpFAE1，和按文献方法制备木聚糖酶EpXYN1(Long et al.，Characterization oftwo new endo-β-1，4-xylanases from Eupenicillium parvum 4-14and theirapplications for production of feruloyl oligosaccharides.Applied Biochemistryand Biotechnology，2018，186：816-833。

2)碱法测定去淀粉谷物麸皮中阿魏酸的总含量

称取干重5.0g的去淀粉小麦麸皮或去淀粉玉米麸皮置于250mL锥形瓶中，加入100mL含8％NaOH和1％Na₂SO₃的溶液，充分混匀；置于水浴摇床，在70℃与180rpm的条件下振荡碱解10h；碱解完成后离心取上清，用盐酸调节pH至2-3，再次离心取上清；加入与上清同体积的乙酸乙酯反复萃取三次；旋转蒸发仪浓缩样品，甲醇溶解析出物，并定容样品至终体积为10mL。按实施例2中的方法测定各样品中阿魏酸的总含量。经测定，去淀粉小麦麸皮中阿魏酸总含量为0.43％，去淀粉玉米麸皮中阿魏酸含量为2.06％。

3)稀酸处理结合酶解法制备去淀粉谷物麸皮中的阿魏酸

取去淀粉小麦麸皮或去淀粉玉米麸皮各1g，分别与20mL不同浓度的磷酸(0.5％、1.0％、1.25％、1.5％、1.75％、2％和2.25％)混合，并加入终浓度为1％的亚硫酸钠(作为保护剂)，以水为空白对照，置于99℃水浴锅中处理5h后，过滤法进行固液分离。滤液以1M的NaOH调pH至5后加入1U/mL的EpFAE1于50℃酶解4h。残余固态基质经自来水冲洗干净，于60℃下烘干后称重，并按1U/g基质的量添加EpFAE1和200U/g基质的量添加EpXYN1进行协同酶解。上清和基质的酶解液经0.22μm水系微孔滤膜过滤，获得阿魏酸溶液。按实施例2中的方法测定样品中阿魏酸含量，分别计算阿魏酸的得率。

由图8可知，未经酸预处理小麦麸皮阿魏酸释放率总数为61.60％，加入1-2.25％浓度的磷酸进行预处理后，酶解获得的阿魏酸总量显著增加。以1.75％的磷酸进行预处理后，阿魏酸的得率最高，可达到83.07％，其中上清液中获得总量79.31％的阿魏酸。按去淀粉小麦麸皮中阿魏酸总含量为0.43％计算，利用酸处理-酶解法可以从100g去淀粉麸皮中获得0.36g阿魏酸。

由图9可知，未经酸预处理的玉米麸皮阿魏酸释放率仅为3.76％；经0.5％-2％的磷酸处理后，酶解释放的阿魏酸总量显著提高；以1％的磷酸进行预处理后，获得的阿魏酸总量最高，得率可达56.52％。按去淀粉玉米麸皮中阿魏酸含量为2.06％计算，利用酸处理-酶解法可以从100g去淀粉玉米麸皮中获得1.16g阿魏酸。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种阿魏酸酯酶EpFAE1及其编码基因和应用

<130> 0

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 280

<212> PRT

<213> Eupenicillium parvum 4-14

<400> 1

Met Lys Ala Phe Ala Thr Arg Ala Leu Ala Phe Ser Val Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gln Ala Leu Ala Ala Val Thr Gln Gly Val Ser Asp Asn Thr Tyr Asn

20 25 30

Arg Leu Val Glu Met Ala Thr Ile Ser Gln Ala Ala Tyr Ala Asn Leu

35 40 45

Cys Asn Ile Pro Ala Thr Ile Gln Thr Val Glu Lys Ile Tyr Asn Ala

50 55 60

Gln Thr Asp Ile Asn Gly Trp Val Leu Arg Asp Asp Ser Arg Gln Glu

65 70 75 80

Ile Ile Thr Val Phe Arg Gly Thr Gly Ser Asp Thr Asn Leu Gln Leu

85 90 95

Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Ala Pro Phe Asp Thr Leu Pro Gln Cys Val

100 105 110

Gly Cys Ala Val His Gly Gly Tyr Tyr Leu Gly Trp Leu Ser Val Gln

115 120 125

Asp Gln Val Gln Ser Leu Val Gln Gln Gln Ala Ser Gln Tyr Arg Gly

130 135 140

Tyr Ala Val Thr Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ser Met Ala Ala

145 150 155 160

Ile Thr Ala Ala Gln Leu Ser Ala Thr Tyr Asp Asn Val Asn Leu Tyr

165 170 175

Thr Phe Gly Glu Pro Arg Thr Gly Asn Gln Ala Tyr Ala Ser Tyr Met

180 185 190

Asn Glu Ala Phe Asp Ser Ala Ser Pro Glu Thr Thr Arg Tyr Phe Arg

195 200 205

Val Thr His Ala Asp Asp Gly Ile Pro Asn Val Pro Pro Ala Glu Gln

210 215 220

Gly Tyr Val His Ser Gly Val Glu Tyr Trp Ser Val Glu Pro His Ser

225 230 235 240

Pro Gln Asn Thr Tyr Ile Cys Thr Gly Asp Glu Ile Gln Cys Cys Glu

245 250 255

Ala Gln Gly Gly Gln Gly Val Asn Ala Ala His Val Thr Tyr Phe Gly

260 265 270

Met Thr Ser Gly Ala Cys Ser Trp

275 280

<210> 2

<211> 843

<212> DNA

<213> Eupenicillium parvum 4-14

<400> 2

atgaaagcct ttgcaacacg cgctctcgct ttttccgttg ctgcaggaca agctctagct 60

gccgttacgc agggcgtctc tgacaacacc tacaaccgtc tggttgagat ggccaccatc 120

tcccaagctg cctatgcaaa cttgtgcaac attccggcga ccatacaaac ggtggagaaa 180

atatacaacg cccaaaccga tatcaacgga tgggtcctcc gcgacgatag tcgtcaagaa 240

atcatcaccg tctttcgcgg cactggcagt gatacgaact tgcagctcga taccaactac 300

actctcgctc cttttgacac ccttcctcaa tgcgtcggtt gtgccgtgca tggcggatac 360

tatcttggat ggctctctgt ccaagatcaa gtccagtcac ttgttcaaca gcaggccagc 420

cagtatcggg ggtatgcagt aacggtcaca ggtcacagtc tgggtgcctc gatggcagca 480

ataactgccg ctcagctgtc cgctacatac gacaatgtaa acttgtacac atttggcgaa 540

ccgcgaaccg gtaaccaggc ctacgcgtcg tatatgaatg aggctttcga ctcggctagc 600

cccgagacta cccgatattt ccgcgtcact catgccgacg atggcatccc aaatgtgccc 660

ccggctgaac agggatatgt ccattccggc gttgaatact ggagtgttga gccccatagc 720

cctcagaaca cgtatatctg tactggggat gagatccagt gctgtgaggc tcagggagga 780

cagggggtga atgctgctca tgtcacttat tttgggatga cgagcggagc ttgcagttgg 840

tag 843

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> fae1_f1(Artificial)

<400> 3

cgttgaacca ttgtccatcc a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> fae1_r1(Artificial)

<400> 4

tgaatcgcct ctgactacca a 21

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> fae1_f2(Artificial)

<400> 5

ccggaattcg ccgttacgca gggcgtctct g 31

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> fae1_r2(Artificial)

<400> 6

ctagtctaga tcagtgatgg tgatggtgat gccaactgca agctccgctc g 51

Claims (9)

1.一种阿魏酸酯酶EpFAE1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 权利要求1所述的阿魏酸酯酶EpFAE1的编码基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求2所述的阿魏酸酯酶EpFAE1的编码基因的表达载体。

4.权利要求1所述的阿魏酸酯酶EpFAE1在制备阿魏酸中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的制备为采用阿魏酸酯酶EpFAE1酶解谷物麸皮释放阿魏酸。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的谷物麸皮为小麦麸皮或玉米麸皮。

7.权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1) 对小麦麸皮进行预处理；

2）阿魏酸酯酶EpFAE1的制备；

3) 取预处理后的小麦麸皮1 g，加入终浓度1.75%的磷酸和终浓度1%的亚硫酸钠，置于99 ℃水浴锅中处理5 h后，进行固液分离；滤液以1 M的NaOH调pH至5后加入1 U/mL的EpFAE1于50 ℃酶解4 h；残余固态基质经自来水冲洗干净，于60℃下烘干后称重，并按1 U/g基质的量添加EpFAE1和200 U/g基质的量添加木聚糖酶EpXYN1进行协同酶解；酶解液经0.22μm水系微孔滤膜过滤后，获得阿魏酸水溶液。

8.权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1) 对玉米麸皮进行预处理；

2）阿魏酸酯酶EpFAE1的制备；

3) 取预处理后的玉米麸皮1 g，加入终浓度1%的磷酸和终浓度1%的亚硫酸钠，置于99℃水浴锅中处理5 h后，进行固液分离；滤液以1 M的NaOH调pH至5后加入1 U/mL的EpFAE1于50 ℃酶解4 h；残余固态基质经自来水冲洗干净，于60℃下烘干后称重，并按1 U/g基质的量添加EpFAE1和200 U/g基质的量添加木聚糖酶EpXYN1进行协同酶解；酶解液经0.22μm水系微孔滤膜过滤后，获得阿魏酸水溶液。

9.用于扩增权利要求1所述的阿魏酸酯酶EpFAE1基因的特异性引物，其特征在于，包括以下两条序列：

上游引物：5′- CCGgaattcGCCGTTACGCAGGGCGTCTCTG -3′；

下游引物：

5′-CTAGtctagaTCAgtgatggtgatggtgatgCCAACTGCAAGCTCCGCTCG-3′。

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