CN103992995A - 一种高表达水溶性肝素酶i融合蛋白及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高表达水溶性肝素酶I融合蛋白及其编码基因，肝素酶I融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；肝素酶I融合蛋白的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过利用pColdTF载体对肝素酶I的表达基因进行改造，增加了一段表达pColdTF蛋白的核苷酸序列，获得了肝素酶I融合蛋白；该肝素酶I融合蛋白的酶活可达64000U/L发酵液，表达量可达320mg/L发酵液，比酶活可达200U/mg。并且该酶还可通过镍柱分离实现该融合蛋白的一步纯化。

Description

一种高表达水溶性肝素酶I融合蛋白及其编码基因

技术领域

本发明涉及一种高表达水溶性肝素酶I融合蛋白及其编码基因，属于基因工程技术领域。 

背景技术

肝素/硫酸乙酰肝素(Heparin/Heparan Sulfate，Hep/HS)两者具有相同的主链结构，是通过20-100个由D-葡糖醛酸/L-艾杜糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成二糖连接而成的直链多糖，糖链中不同部位的羟基(-OH)及N-乙酰葡糖胺2位氨基的乙酰化或硫酸化使Hep/HS的结构变得异常复杂(Castelli et al.2004；Casu2005)。Hep/HS广泛分布于哺乳动物的细胞表面和胞外基质中，在各种生命过程中起着重要作用，如：调节血管壁功能，凝血，炎症反应和细胞分化等。 

肝素酶(Heparinase)是研究Hep/HS构效关系的重要工具酶。肝素酶广泛存在于微生物和动物体内，通过选择性切割Hep/HS多糖链对Hep/HS的降解代谢和生物学功能进行调节。无论微生物还是哺乳动物来源的肝素酶对Hep/HS糖链的切割均具有结构选择性。哺乳动物来源的酶是通过对己糖醛酸和葡萄糖胺之间的糖苷键的水解作用来降解糖链的，而微生物来源的肝素酶则是通过β-消除机制对葡萄糖胺和己糖醛酸之间的糖苷键进行切割，在己糖醛酸残基的4、5位碳原子之间形成在232nm有特定紫外吸收的双键。哺乳动物来源的肝素降解酶参与了细胞信号转导，细胞迁移和癌变等各种生理病理过程。而微生物来源的肝素裂解酶则主要是参与微生物对肝素作为碳源的降解利用以及某些病原微生物对宿主的入侵过程。微生物来源的肝素酶由于种类多、酶活高、稳定性好、易于大量表达纯化、生产成本相对较低等优点，在科学研究、工业生产及临床上被广范应用。具有巨大的开发价值(Tripathi CK et al.2012)。 

三种来自于肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)的肝素裂解酶被广泛研究并做为主要的商品化肝素酶被广泛应用，被分别命名为为肝素酶I(Heparinase I)、肝素酶II(Heparinase II)、肝素酶III(Heparinase III)。这三种肝素裂解酶在降解肝素与硫酸乙酰肝素的能力上有差异，肝素酶I主要以降解肝素为主，肝素酶III主要降解硫酸乙酰肝素，肝素酶II既降解肝素也降解硫酸乙酰肝素(Linhardt et al.1987,1990)。这三个酶均为周质空间空间蛋白，早期主要是通过对菌体进行渗透压冲击或超生破碎并结合各种色谱对天然酶蛋白进行分离纯化，天然酶蛋白具有酶活高水溶性好等特点，但存在产量低、操作复杂、纯度难以保证和成本高等问题。 

自上世纪九十年代初开始，三种来自肝素黄杆菌的肝素酶被先后克隆表达(Godavarti et al.1996；Sasisekharan et al.1993；Shaya et al.2004)。但是，目前利用pET表达系统在大肠杆菌中表达肝素酶时，一直存在重组酶水溶性差，易形成包涵体，需要复杂的蛋白复性处理，且 复性蛋白不稳定，容易在保存过程中再度沉淀时候等问题。近年来，肝素酶I被广泛克隆到不同的表达载体与宿主中，但是依然面临着表达量低，活性低，水溶性差等问题，因此寻找和建立表达效率高、酶蛋白水溶性好、活力高的肝素酶重组表达技术具有重要的理论和现实意义。 

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种水溶性好、酶活力高的肝素酶I融合蛋白及其编码基因。 

一种肝素酶I融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 

一种肝素酶I融合蛋白的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

一种重组表达载体，在表达载体中插入了上述肝素酶I融合蛋白的编码基因。 

上述表达载体选自大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。 

一种重组菌或转基因细胞系，在宿主细胞或细胞系中插入了上述肝素酶I融合蛋白的编码基因。 

上述宿主细胞或细胞系选自大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。 

用于重组表达肝素酶I融合蛋白的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces Iactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lactic acid bacteria C0CC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichoderma viride,Trichoderma reesei,Aspergillus niger、Aspergillus nidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori,Antharaea eucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO,幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。 

上述编码基因、重组表达载体、重组菌或转基因细胞系在制备肝素酶I融合蛋白中的应用。 

益效果 

本发明通过利用pColdTF载体对肝素酶I的表达基因进行改造，增加了一段表达pColdTF蛋白的核苷酸序列，获得了肝素酶I融合蛋白；该肝素酶I融合蛋白的酶活可达64000U/L发酵液，表达量可达320mg/L发酵液，比酶活可达200U/mg。并且该酶还可通过镍柱分离实现该融合蛋白的一步纯化。 

附图说明

图1为表达载体pColdTF-Hep01的构建过程示意图。 

图2为从肝素黄杆菌中PCR扩增得到的肝素酶I基因电泳图谱。 

图3为转化子PCR验证电泳图谱。 

图4为转化子酶切验证电泳图谱。 

图5重组肝素酶pColdTF-Hep01表达及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)； 

其中：M、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD；泳道1、对照菌株破壁前菌体，上样量10μL，泳道2、重组菌破壁前菌体，上样量10μL，泳道3、重组菌破壁后上清，上样量10μL，泳道4、经镍柱纯化的HCDase，上样量10μL。 

图6重组肝素酶pColdTF-Hep01降解肝素所得产物的HPLC分析图。 

具体实施方式

以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中个参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指重均分子量，温度是摄氏度。 

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。所述引物合成及测序工作均由上海生工生物技术有限公司完成，所有的限制性内切酶及dNTP均购TaKaRa公司；所有感受态细胞(如：DH5α、BL21)购自北京全式金生物技术有限公司)；肝素酶I酶活测定底物肝素购自Sigma公司，其它的化学药品均为一般分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。 

实施例1、肝素酶I融合蛋白pColdTF-HepI的表达 

一、去除信号肽的肝素黄杆菌肝素酶I编码序列的克隆 

表达载体pColdTF-HepI的构建过程如图1所示，具体过程如下： 

1、引物的设计及合成 

经Genbank查询得到肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)肝素酶I的DNA序列(Su，H.，Blain，F.，Musil，R.A.，Zimmermann，J.J.，Gu，K.and Bennett，D.C.Isolation and expression in Escherichia coli of hepB and hepC，genes codingfor the glycosaminoglycan-degrading enzymes heparinase II and heparinase III,respectively，from Flavobacterium heparinum.Appl.Environ.Microbiol.1996，62，2723-2734)，再根据去除编码信号肽碱基的肝素黄杆菌肝素酶I的DNA序列设计引物，并在引物序列中引入限制性内切酶xba I和Nde I的识别位点，所用的上下游引物分别为： 

上游引物(引物P1)：5’-GCATATGCAGCAAAAAAAATCCGGTAACATC-3’(带下划线的碱基为NdeI的酶切位点)， 

下游引物(引物P2)：5’-GTCTAGATCTGGCAGTTTCGCTGTACCCGC-3’(带下划线的碱基为Xba I的酶切位点)，扩增后，即分别引入Nde I和Xba I酶切位点。 

2、PCR扩增去除信号肽的肝素黄杆菌肝素酶I的编码序列 

PCR扩增的反应体系为：50ng肝素黄杆菌基因组DNA模版，上游引物和下游引物各100pmol，1×扩增缓冲液(北京天为生物技术有限公司)，每种dNTP各200μmol/L，1单位高保真PrimerSTAR HS DNA Polymerase； 

扩增程序为：95摄氏度变性5分钟，68摄氏度引物退火并延伸2分钟，30个循环后，72摄氏度延伸10分钟结束反应。 

该PCR结果如图2所示，表明扩增得到了1.1kb的肝素酶I基因片段，测序表明，扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列1的第1414-2502位所示(命名为Hep01)。图2中，泳道1,2分别为退火温度为对照以及实验扩增结果，泳道M为分子量marker(条带大小依次为8kb、5kb、3kb、2kb、、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp)，箭头所指处为1.1kb左右目标片段。 

3、构建含有目的片段的克隆载体 

参照试剂盒说明书进行操作，将步骤一中2中的PCR扩增的目的片段直接连接到载体pEasy Blunt Simple(TaKaRa公司)中，得连接产物。 

4、转化大肠杆菌及阳性克隆转化子的筛选及测序 

将步骤3获得的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，具体方法为： 

将10μl的连接产物与50μl的大肠杆菌DH5α感受态细胞混匀，冰浴30分钟，42摄氏度热激60秒，冰浴3分钟，然后加入300μl含100μg/L氨苄青霉素的LB液体培养基(蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl3g，水285mL)中，180rpm、37摄氏度振摇60分钟，涂于含100μg/L氨苄青霉素的LB抗性培养平板(蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl3g，琼脂粉4.5g，水285mL，16μl X-gal和4μl IPTG/平板)进行蓝白斑筛选。37摄氏度培养12-20小时。挑选白斑并以此为模版，用引物P1和P2进行菌落PCR鉴定，PCR反应体系及反应条件与步骤2相同。 

反应结束后，对扩增产物进行0.8wt％琼脂糖凝胶电泳检测，可含转化子的阳性克隆。将筛选得到的阳性克隆转至5mL含0.05mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37摄氏度、220rpm振摇12小时，将菌液进行测序，将含有具有序列表中序列1的第1414-2502位核苷酸序列的肝素酶I蛋白编码基因的pEasy Blunt-Hep01重组载体命名为pEasy Blunt-Hep01。 

二、重组大肠杆菌表达载体的构建 

以pEasy Blunt-Hep01质粒为模版，用引物P1和P2进行PCR扩增肝素黄杆菌肝素酶I的基因，PCR反应体系及反应条件与步骤一中2相同。 

将pColdTF载体(购自美国TaKaRa公司和PCR产物(以pColdTF-Hep01质粒为模版的扩增产物)分别用Xba I和Nde I双酶切，用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)连接，转化DH5α，以P1和P2为引物，通过菌落PCR筛选转化子(如图3所示)，提取可得到1.1kbPCR产物的转化子中的pColdTF重组载体，分别通过Xba I和Nde I双酶切验证(如图4所示)。图3中M为分子量marker条带大小依次为8kb、5kb、3kb、2kb、、1kb、750bp、500bp、 250bp、100bp)，泳道1、2为PCR验证的转化子，箭头所指处为肝素酶I基因条带。图4中M为分子量marker条带大小依次为8kb、5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道1为质粒pColdTF被Xba I和Nde I双切后电泳图，泳道2为重组质粒pColdTF-Hep01被Xba I和Nde I双切后电泳图，箭头所指处为肝素酶I基因通过Xba I和Nde I双酶切得到的1.1kb片段的质粒进行测序，将含有具有序列表中序列1的第1414-2502位核苷酸序列的肝素酶I融合蛋白编码基因的pColdTF重组载体命名为pColdTF-HepI。 

三、肝素酶I融合蛋白pColdTF-HepI的表达 

提取步骤二中含有pColdTF-HepI的大肠杆菌DH5α中的质粒，按照常规方法转化大肠菌BL21(DE3)。E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司。经过氨苄青霉素筛选和利用步骤一中步骤1提供的引物进行菌落PCR鉴定，得到含有pColdTF-HepI的大肠杆菌BL21(DE3)，即BL21(DE3)/pColdTF-HepI作为表达pColdTF-HepI的工程菌。 

以质粒pColdTF转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到空载体对照BL21(DE3)/pColdTF。 

以下操作对上面的工程菌平行进行。 

将空载体对照和工程菌分别在含氨苄青霉素抗性的LB培养基(NaCl10g/L，酵母提取物为5g/L，蛋白胨10g/L，含100μg/L氨苄青霉素)37摄氏度培养2.5小时后，加入终浓度为005mM IPTG16摄氏度诱导24小时。10000rpm，8分钟离心收集菌体并用20mmol/LTris-HCl(pH7.5)洗涤两次，重悬至OD₆₀₀约为8.000附近。将上面OD₆₀₀约为8.000重悬液进行超声破碎(输出功率为300W，每次超声3秒和间歇3秒的处理198次)，12000rpm，30分钟离心，超声破碎后离心所得的上清液即为粗酶液。 

酶活力(单位为IU/L)的检测采用232nm的光吸收法，1IU的酶活定义为30摄氏度每分钟产生1μmol不饱和键的反应效力。取肝素底物溶液0.5ml(25g/L肝素，40mM NaCl，3.5mM CaCl2，17mM Tris-HCl，pH7.5)，加入上步中所得的粗酶液，其他体积以Tris缓冲液补充，最终的反应体积为1.5ml，测单位时间内在232nm的吸光度变化ΔA232。消光系数ε＝3800M-1。比酶活(单位为IU/mg蛋白)的定义为酶活力与粗酶液蛋白浓度(单位为mg/L)的比值。蛋白浓度监测采用常规的Bradford法。 

结果如表1所示，空载体对照菌株BL21(DE3)/pColdTF诱导培养后无酶活，工程菌BL21表达出了有活性的可溶性pColdTF-HepI融合蛋白。 

经过测序，BL21(DE3)/pColdTF-Hep01表达出的融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：2所示；并且该融合蛋白pColdTF-HepI中pColdTF的氨基酸序列如SEQ ID No：2的自氨基酸第1-471所示；该融合蛋白中的HepI的氨基酸序列如SEQ ID No：2的自氨基酸第471-834所示。 

对最佳宿主BL21表达的蛋白进行SDS-PAGE电泳：取上述超声破碎后离心所得的上清夜(粗酶液)5μl做可溶蛋白组分SDS-PAGE电泳，取上述超声破碎后离心所得的沉淀来做不可溶蛋白组分SDS-PAGE电泳。结果如图5所示。 

图5中M为marker(由上至下大小为116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD；泳道1、对照菌株破壁前菌体，上样量10μL，泳道2、重组菌破壁前菌体，上样量10μL，泳道3、重组菌破壁后上清，上样量10μL，泳道4、经镍柱纯化的HCDase，上样量10μL(目的蛋白91.7KDa)。 

实施例2、通过镍柱纯化肝素酶I融合蛋白pColdTF-HepI 

将pColdTF-HepI转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自美国Novagen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤进行重组酶诱导表达。并用Ni Sepharose6Fast Flow(GE)凝胶对HepI融合蛋白进行纯化，纯化条件按照GE公司的产品手册操作。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组pColdTF-HepI的纯化情况，结果如图5的5号泳道所示，纯化后的重组HepI融合蛋白在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。 

实施例3、HepI融合蛋白的酶活测定 

将质量浓度为1％肝素、pColdTF-HepI酶液、5倍缓冲液(250mM Tris-HCl、500mM NaCl、10mM CaCl₂，PH7.9)以及水按2：1：2：5(体积比)的比例混合后，在最适温度和最适pH下反应2-10min，按前述的紫外法测酶活力(Yamagata,Saito et al.1968)，同时用购于康为世纪公司的蛋白质定量试剂盒测定HepI融合蛋白酶液的蛋白含量，结果表明重组HepI融合蛋白对肝素的比活为200U/mg。 

实施例4、HepI融合蛋白降解肝素降解产物的高效液相(HPLC)分析 

将质量浓度为1％肝素、HepI融合蛋白酶液、5倍缓冲液(250mM Tris-HCl、500mM NaCl、10mM CaCl₂,PH7.9)缓冲液以及水按2：1：2：5(体积比)的比例混合后，在最适温度和最适pH下反应10min条件下反应，进行HPLC分析。HPLC分析条件为凝胶柱：superdex peptide10/300GL(GE)；流动相：0.2M碳酸氢铵；流速：0.4mL/min；检测条件：UV232nm。 

结果如图6所示，从图6可以看出经HepI融合蛋白降解后，肝素寡糖产物聚合度随降解时间的延长而快速降低，最终转变成二糖。该结果表明HepI融合蛋白属于内切肝素/硫酸乙酰肝素裂解酶，可被用于肝素/硫酸乙酰肝寡糖的制备及其构效关系研究。 

实施例5、切除HepI融合蛋白水溶性蛋白标签后酶活比较 

将质量浓度为1％肝素、HepI酶液、5倍缓冲液(250mM Tris-HCl、500mM NaCl、10mM CaCl₂,PH7.9)缓冲液以及水按2：1：2：5(体积比)的比例混合后，在最适温度和最适pH下反应10min条件下反应， 

以上HepI酶是重组HepI融合蛋白经抗凝血酶在37度处理pColdTF-Hep012h切除水溶性蛋白标签后，加入到以上反应体系中，按前述的紫外法测酶活力(Yamagata,Saito et al.1968)，同时用购于康为世纪公司的蛋白质定量试剂盒测定pColdTF-HepI酶液的蛋白含量，结果表明重组pColdTF-HepI已切除水溶性标签对肝素的比活为250U/mg，接近天然酶活力。 

说明书中涉及的参考文献 

1.Castelli R,Porro F,and Tarsia P.(2004)The heparins and cancer:review of clinical trials and biological properties.Vasc Med,9:205 

2.Casu B.(2005)Structure and active domains of heparin.In:Garg HG,Linhardt RJ,Hales CA(eds)Chemistry and biology of heparin and heparan sulfate.Elsevier,London,pp1–28 

3.Tripathi CK1,Banga J,and Mishra V.(2012)Microbial heparin/heparan sulphate lyases:potential and applications.Appl Microbiol Biotechnol.94:307-21 

4.Linhardt RJ,Galliher PM,Cooney CL(1987)Polysaccharide lyases.Appl.Biochem.Biotechnol.12:135–176 

5.Linhardt RJ,Turnbull JE,Wang HM,Loganathan D,Gallagher JT(1990)Examination of the substrate specificity of heparin and heparan sulfate lyases.Biochemistry29:2611–2617 

6.Godavarti R,Sasisekharan R(1996)A comparative analysis of the primary sequences and characteristics of heparinases I,II,and III from Flavobacterium heparinum.Biochem.Biophys.Res.Commun.229:770–777 

7.Godavarti R,Davis M,Venkataraman G,Cooney C,Langer R,Sasisekharan R(1996)Heparinase III from Flavobacterium heparinum:cloning and recombinant expression in Escherichia coli.Biochem.Biophys.Res.Commun.225:751–758 

8.Sasisekharan R,Bulmer M,Moremen KW,Cooney CL,Langer R(1993)Cloning and expression of heparinase I gene from Flavobacterium heparinum.Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:3660–3664 

9.Shaya D,Li Y,Cygler M(2004)Crystallization and preliminary X-ray analysis of heparinase II from Pedobacter heparinus.Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.60:1644–1646 

10.Yamagata,T.,et al.(1968)."Purification and properties of bacterial chondroitinases and chondrosulfatases."The Journal of biological chemistry243(7):1523-1535。 

Claims (7)

1.一种肝素酶I融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种肝素酶I融合蛋白的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种重组表达载体，在表达载体中插入了权利要求2所述肝素酶I融合蛋白的编码基因。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体选自大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物细胞表达载体。

5.一种重组菌或转基因细胞系，在宿主细胞或细胞系中插入了权利要求2所述肝素酶I融合蛋白的编码基因。

6.如权利要求5所述的重组菌或转基因细胞系，其特征在于，所述宿主细胞或细胞系选自大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

7.权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的重组表达载体或权利要求5所述的重组菌或转基因细胞系在制备肝素酶I融合蛋白中的应用。