CN111304229A

CN111304229A - 一种肝素酶基因工程表达产物及其制备方法

Info

Publication number: CN111304229A
Application number: CN201911269408.8A
Authority: CN
Inventors: 吴文林; 吴小婷
Original assignee: Quanzhou Normal University
Current assignee: Quanzhou Normal University
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2020-06-19

Abstract

本发明公开了一种肝素酶基因工程表达产物及其制备方法，属于基因工程技术领域。本发明以肝素黄杆菌肝素酶HepI基因为目的基因，成功构建肝素酶HepI基因大肠杆菌工程菌，实现在16℃低温下诱导重组肝素酶的可溶性表达。本发明的方法提高了肝素酶的表达量，简化了重组酶的分离纯化步骤，降低成本，所得重组肝素酶具有较强的降解肝素的活性，在酶法制备低分子肝素的生产中具备非常诱人的应用前景。

Description

一种肝素酶基因工程表达产物及其制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及肝素酶基因工程表达产物及其制备方法。

背景技术

肝素是一类由葡糖胺和葡糖醛酸为二糖单位组成的长链糖胺聚糖，由于其具有良好的抗凝血作用，临床上主要作为预防血栓或体外抗凝药使用。低分子肝素是从普通肝素中分离得到低分子量组分或裂解肝索产生的片段，其分子量在4000Da-6500Da，是新一代肝素类抗血栓药物。低分子肝素因分子量小，不易被第1v因子中和，抗凝效果和纤溶作用得以增强，而抗血小板、影响血小板功能、影响血液凝固性、诱发出血的作用大为减弱，并且其生物利用度高、血浆半衰期长、口服易吸收、不易透过胎盘屏障，同时具有快速和持续的抗血栓形成作用，因此颇受临床青睐，近年来在防治深部静脉血栓、肺栓塞治疗等方面发挥着越来越重要的作用，其作为抗凝血药物在临床上的应用比例亦越来越大。

目前国内外低分子肝素制剂已经有10多个品种问世，临床上使用较多的品牌如葛兰素史克的“速碧林”、赛诺菲的“克赛”等。但就肝素类药物价格来说，低分子肝素尤其是一些进口的低分子肝素产品的价格却远远高于普通肝素类药物。尽管低分子肝素类药物有着诸多的优点，但过高的价格无疑给使用者带来了沉重的经济负担，因此，如何提高肝素的降解效率、制备理想分子量的低成本低分子肝素有着重要的研究和实践意义。目前工业生产低分子肝素的方法主要是化学降解和酶降解法。虽然化学降解法工艺流程较简单，但裂解过程中加入的强氧化剂等会与肝素中的硫酸基团作用而引起肝素抗凝活性的降低，也破坏肝素的结构，而酶降解法由于其温和的反应条件、不引起肝素结构的破坏、无毒性、易实现生产连续化而越来越得到人们的关注。

酶降解法生产低分子肝素所使用的酶即肝素酶。肝素酶是一类能降解肝素类物质的裂解酶。在真核生物中，通常称作类肝素酶或乙酰肝素酶(heparanase)，其通过水解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)的肝素类侧链破坏细胞外基质和基底膜的基本结构，释放并激活连接在肝素类侧链上的活性物质，与血管生成、肿瘤转移、炎症等病理过程密切相关。原核生物肝素酶I(Heparinase I)目前主要来源于肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinum)，在制备低分子肝素、消除体外循环中的肝素抗凝剂、确定肝素精确结构等方面有着重要的用途。肝素酶具有重要的用途，尤其在低分子量肝素的生产和作为肝素体外循环中的肝素的去除。肝素酶的研究在我国起步相对较晚，到目前为止研究开展也并不系统和深入。由于肝素酶昂贵的价格，其结构的研究及在低分子量肝素的生产中的应用受到限制。利用基因工程方法制备肝素酶，对肝素酶的研究和应用发展将产生积极的推动作用。

已有的肝素酶基因工程制备方法和工艺，重组肝素酶在基因工程菌中是以包涵体方式表达，纯化时需要经过变性、复性等工艺，导致步骤多、活性低等缺点，最终由于产量低、价格高，限制了重组肝素酶在生产中的应用。本发明通过对工程菌培养条件，特别是工程菌诱导表达条件的优化，使得重组肝素酶以部分可溶的型式表达，其可溶性重组肝素酶的占比，达到了细胞总肝素酶含量的40%以上，比现有方法提高了40倍以上，这不仅大大提高了肝素酶的产量，而且简化了提取纯化的工艺步骤，降低了产品成本，为其商业应用提供了可能。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种肝素酶基因工程表达产物及其制备方法。该方法通过对重组肝素酶基因表达条件的优化，使重组肝素酶以可溶形式表达，提高了肝素酶的表达量，简化了重组酶的分离纯化步骤，降低成本。

一种肝素酶基因工程表达产物的制备方法，包括以下步骤：

（1）肝素黄杆菌肝素酶 HepI基因的克隆；

（2）构建肝素酶HepI基因的pGEX-4T-2-HepI重组表达载体；

（3）将步骤（2）的pGEX-4T-2-HepI重组表达载体转化进大肠菌宿主菌中，构建肝素酶HepI基因大肠杆菌工程菌；

（4）肝素酶HepI基因大肠杆菌工程菌中重组肝素酶的诱导表达；

（5）分离纯化步骤（4）所得的表达产物，获得重组肝素酶蛋白。

上述步骤（1）中所述肝素黄杆菌肝素酶 HepI基因ORF编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；设计扩增编码HepI基因ORF的特异性上游引物F1 : 5’-AA CCCGGG ATGAAAAAAC AAATTCTATA- 3’(Sma I) 和下游引物R1: 5’-AA GCGGCCGC CTATCTGGCAGTTTCGCTGT- 3’ (Not I)；在上、下游引物分别引入Sma I， Not I酶切位点；取肝素黄杆菌培养液到Ep管中，99°C裂解10 min，10,000 × g离心5min，取上清液作为PCR扩增的模板，然后以上述F1/R1为引物，PCR扩增获得肝素黄杆菌肝素酶HepI基因。

上述步骤（2）所述构建肝素酶HepI基因的pGEX-4T-2-HepI重组表达载体，具体为：

取将肝素酶HepI基因与pGEX-4T-2质粒分别用Sma I， Not I酶切，回收酶切产物，酶切产物用T4 DNA连接酶，转化大肠杆菌感受态细胞，经菌落PCR验证、质粒双酶切验证、质粒测序鉴定，获得码框正确无误的肝素酶HepI基因的pGEX-4T-2-HepI重组表达载。

上述步骤（3）中所述大肠菌宿主菌为大肠杆菌BL21。

上述步骤（4）肝素酶HepI基因大肠杆菌工程菌中重组肝素酶的诱导表达，具体为；肝素酶HepI基因大肠杆菌工程菌接种到 5mL 含100ug/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中，37°C下振荡培养过夜制得种子液，按种子液与培养基体积比为 1∶50 的比例将种子液接种到新鲜的1/2 LB液体培养基中，37°C摇培至OD₆₀₀达到1.0~1.2后，转移至16℃，后加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半苷，诱导剂的终浓度为0.25 mmol/L；继续摇培4~10 h进行目基因的诱导表达。

上述步骤（5）分离纯化为：离心收集步骤（4）诱导表达的菌体，加入预冷的15 mL 1×PBS缓冲液悬浮细菌，冰上超声裂解细菌；裂解液离心后的上清液与GlutathioneSepharose 4B结合，将结合液装到层析柱上，用1×PBS洗去杂蛋白，然后用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。

进一步的，所述洗脱缓冲液的组成为：50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L GSH，pH8.0。

一种上述方法制备所得的重组肝素酶蛋白。

上述重组肝素酶蛋白在生产低分子量肝素中的应用。

本发明的优点在于：

本发明成功构建肝素酶HepI基因大肠杆菌工程菌，成功实现在16℃低温下重组肝素酶的可溶性表达。可溶性重组肝素酶的含量比常规的LB液体培养基培养、37°C诱导表达提高了40倍以上。本发明的方法提高了肝素酶的表达量，简化了重组酶的分离纯化步骤，降低成本，可溶性重组肝素酶的制备方法简便快捷，生产成本低，所得重组肝素酶具有较强的降解肝素的活性，在酶法制备低分子肝素的生产中具备非常诱人的应用前景。

附图说明

图1 HepI基因克隆电泳图。1: DNA Mark, 2: 阴性对照, 3: HepI基因的PCR产物。

图2 重组质粒酶切电泳图。1: DNA Mark, 2: pGEX-4T-2 质粒,3: 重组表达载体质粒双酶切, 4: PCR产物。

图3 重组菌在不同温度、1/2LB培养基诱导的SDS-PAGE电泳图。1：蛋白质Maker；2:重组大肠杆菌37°C、OD值1.0时诱导超声破碎后沉淀；3：重组大肠杆菌37°C、OD值1.0时诱导超声破碎后上清；4：重组大肠杆菌20°C、OD值1.0时诱导超声破碎后沉淀；5：重组大肠杆菌20°C、OD值1.0时诱导超声破碎后上清；6：重组大肠杆菌16°C、OD值1.0诱导超声破碎后沉淀；7：重组大肠杆菌16°C、OD值1.0诱导超声破碎后上清。红色箭头指示重组肝素酶。

图4 重组菌在14°C、1/2LB培养基诱导的SDS-PAGE电泳图。1：蛋白质Maker；2：重组大肠杆菌14°C、OD值1.0时诱导超声破碎全菌；3：超声破碎后沉淀；4：超声破碎后上清。

图5 重组肝素酶Ｉ表达产物纯化检测电泳图谱。M：蛋白质Maker；1：pGEX-4T-2大肠杆菌未经IPTG诱导；2：重组大肠杆菌16°C诱导10h；3：重组大肠杆菌16°C诱导10h超声破碎后上清；4：纯化的肝素酶Ｉ。

图6 不同诱导温度条件下肝素酶可溶性表达对比。1：37°C诱导；2：16°C诱导。

具体实施方式

了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

实施例1 HepI基因重组表达载体的构建

根据pGEX-4T-2载体多克隆位点，设计扩增编码HepI基因ORF编码序列（其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所）的特异性上游引物F1： 5’-AA CCCGGG ATGAAAAAAC AAATTCTATA- 3’(SmaI)和下游引物R1：5’- AA GCGGCCGC CTATCTGGCAGTTTCGCTGT- 3’ (Not I)。在上、下游引物分别引入Sma I， Not I酶切位点。取20μl肝素黄杆菌培养液到Ep管中，99°C裂解10 min，10,000 × g离心5min，取上清液1μL作为PCR扩增的模板，同时在PCR管中加入PfuTaq酶0.2-0.3μL，Buffer 2μL，dNTPs 1μL，引物1和引物2各1μL，H₂O定容至反应总体积20μL，PCR扩增条件为：94°C预变性3min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸70s，共38个循环，再于72°C继续延伸10min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的基因(参见图1)。取目的基因DNA约1μg用 Sma I， Not I酶切，取pGEX-4T-2质粒DNA1μg用 Sma I， Not I酶切，然后回收酶切产物，取酶切后的目的基因DNA 200 ng，酶切后的质粒DNA 80 ng在 24°C下用 T4 DNA连接酶连接 30 min，连接产物转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，涂到含100ug/ml氨苄青霉素的LB固体培养基平板上培养16 h，挑取10个菌落，通过菌落PCR方法挑选阳性克隆，PCR条件同上。选取阳性克隆培养5 mL菌液，提取质粒，通过双酶切法进一步检测（参见图2），阳性菌落送生工测序。测序鉴定读码框正确无误。

实施例2 HepI基因的诱导表达

检测与测序正确的菌株接种到 5mL 含100ug/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中，37°C下振荡培养过夜制得种子液，第二天按种子液与培养基体积比为 1∶50 的比例接种到新鲜的1/2 LB液体培养基中摇培至OD₆₀₀达到1.0后，将菌液分别降温至不同温度（37℃、20℃、16℃、14℃）后加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半苷（IPTG），诱导剂的终浓度为0.25 mmol/L；然后在不同温度下继续摇培4~10 h进行目基因的诱导表达。离心法收集菌体，菌体用冰冷的PBS重悬，超声破碎裂解细菌，10,000 × g离心10 min，对离心后的上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析（参见图3）。结果显示，重组质粒转化的大肠杆菌经诱导后具有明显的重组蛋白诱导表达，蛋白条带在60kDa 左右（参见图3），与计算的理论分子量相似，后经质谱鉴定无误。由图3还能看出，在37°C、20°C诱导表达时，重组肝素酶的蛋白条带均位于沉淀中，而上清液中的相应位置没有条带，显示37°C、20°C时重组肝素酶为不溶性表达，在14°C（图4）重组肝素酶的表达仍然为部分可溶部分沉淀，但肝素酶的总量有所下降；在温度高于16°C时，重组肝素酶均为不溶性表达；而只有在16°C时，重组肝素酶才以可溶性的方式表达，根据考马斯亮蓝染色的蛋白条带的光密度分析，其可溶性的肝素酶约占总肝素酶的40%。

实施例3 HepI重组蛋白的纯化

将含重组质粒的BL21菌液按体积比为1:50的比例接种于500 mL1/2 LB液体培养基，摇培至OD₆₀₀达到1.0后取出冰浴10 min，然后加入0.25 mmol/L IPTG，在16°C继续摇培10 h，离心法收集细菌，加入预冷的15 mL 1×PBS缓冲液悬浮细菌，冰上超声裂解细菌。裂解液4°C下10,000 × g离心20 min，将离心后的上清液与Glutathione Sepharose 4B结合30min，将结合液装到层析柱上，用1×PBS洗去杂蛋白，然后用洗脱缓冲液(50 mmol/LTris-HCl, 10 mmol/L GSH，pH8.0)洗脱目的蛋白。通过SDS- PAGE法鉴定融合蛋白的纯度（参见图5），用Bradford法测定蛋白质浓度。

本发明旨在肝素酶I基因工程表达产品，以期获得肝素酶用于生产低分子量肝素。本发明获得了肝素酶I工程表达重组载体，并在大肠杆菌中成功重组表达、获得了肝素酶基因工程产品，为酶法生产低分子量肝素奠定了良好的前期基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 泉州师范学院

<120> 一种肝素酶基因工程表达产物及其制备方法

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1155

<212> DNA

<213> SEQ ID NO:1

<400> 1

atgaaaaaac aaattctata tctgattgta cttcagcaac tgttcctctg ttcggcttac 60

gcccagcaaa aaaaatccgg taacatccct taccgggtaa atgtgcaggc cgacagtgct 120

aagcagaagg cgattattga caacaaatgg gtggcagtag gcatcaataa accttatgca 180

ttacaatatg acgataaact gcgctttaat ggaaaaccat cctatcgctt tgagcttaaa 240

gccgaagaca attcgcttga aggttatgct gcaggagaaa caaagggccg tacagaattg 300

tcgtacagct atgcaaccac caatgatttt aagaaatttc ccccaagcgt ataccaaaat 360

gcgcaaaagc taaaaaccgt ttatcattac ggcaaaggga tttgtgaaca ggggagctcc 420

cgcagctata ccttttcagt gtacataccc tcctccttcc ccgacaatgc gactactatt 480

tttgcccaat ggcatggtgc acccagcaga acgcttgtag ctacaccaga gggagaaatt 540

aaaacactga gcatagaaga gtttttggcc ttatacgacc gcatgatctt caaaaaaaat 600

atcgcccatg ataaagttga aaaaaaagat aaggacggaa aaattactta tgtagccgga 660

aagccaaatg gctggaaggt agaacaaggt ggttatccca cgctggcctt tggtttttct 720

aaagggtatt tttacatcaa ggcaaactcc gaccggcagt ggcttaccga caaagccgac 780

cgtaacaatg ccaatcccga gaatagtgaa gtaatgaagc cctattcctc ggaatacaaa 840

acttcaacca ttgcctataa aatgcccttt gcccagttcc ctaaagattg ctggattact 900

tttgatgtcg ccatagactg gacgaaatat ggaaaagagg ccaatacaat tttgaaaccc 960

ggtaagctgg atgtgatgat gacttatacc aagaataaga aaccacaaaa agcgcatatc 1020

gtaaaccagc aggaaatcct gatcggacgt aacgatgacg atggctatta cttcaaattt 1080

ggaatttaca gggtcggtaa cagcacggtc ccggttactt ataacctgag cgggtacagc 1140

gaaactgcca gatag 1155

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> F1

<400> 2

aacccgggat gaaaaaacaa attctata 28

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> R1

<400> 3

aagcggccgc ctatctggca gtttcgctgt 30

Claims

1.一种肝素酶基因工程表达产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）肝素黄杆菌肝素酶 HepI基因的克隆；

（2）构建肝素酶HepI基因的pGEX-4T-2-HepI重组表达载体；

2.根据权利要求1所述的一种肝素酶基因工程表达产物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述肝素黄杆菌肝素酶 HepI基因ORF编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；设计扩增编码HepI基因ORF的特异性上游引物F1:5’-AA CCCGGG ATGAAAAAACAAATTCTATA-3’和下游引物R1: 5’ -AA GCGGCCGC CTATCTGGCAGTTTCGCTGT -3’ ；在上、下游引物分别引入Sma I，Not I酶切位点；取肝素黄杆菌培养液到Ep管中，99°C裂解10 min，10,000 × g离心5min，取上清液作为PCR扩增的模板，然后以F1/R1为引物，PCR扩增获得肝素黄杆菌肝素酶HepI基因。

3.根据权利要求1所述的一种肝素酶基因工程表达产物的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述构建肝素酶HepI基因的pGEX-4T-2-HepI重组表达载体，具体为：取将肝素酶HepI基因与pGEX-4T-2质粒分别用Sma I，Not I酶切，回收酶切产物，酶切产物用T4 DNA连接酶，转化大肠杆菌感受态细胞，经菌落PCR验证、质粒双酶切验证、质粒测序鉴定，获得码框正确无误的肝素酶HepI基因的pGEX-4T-2-HepI重组表达载。

4.根据权利要求1所述的一种肝素酶基因工程表达产物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述大肠杆菌宿主菌为大肠杆菌BL21。

5.根据权利要求1所述的一种肝素酶基因工程表达产物的制备方法，其特征在于：步骤（4）肝素酶HepI基因大肠杆菌工程菌中重组肝素酶的诱导表达，具体为；肝素酶HepI基因大肠杆菌工程菌接种到 5mL 含100ug/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中，37°C下振荡培养过夜制得种子液，按种子液与培养基体积比为 1∶50 的比例将种子液接种到新鲜的1/2 LB液体培养基中, 37℃摇培至OD₆₀₀达到1.0~1.2后，转移至16℃，后加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半苷，诱导剂的终浓度为0.25 mmol/L；继续摇培4~10 h进行目基因的诱导表达。

6.根据权利要求1所述的一种肝素酶基因工程表达产物的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述分离纯化为：离心收集步骤（4）诱导表达的菌体，加入预冷的15 mL 1×PBS缓冲液悬浮细菌，冰上超声裂解细菌；裂解液离心后的上清液与Glutathione Sepharose 4B结合，将结合液装到层析柱上，用1×PBS洗去杂蛋白，然后用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。

7.根据权利要求6所述的一种肝素酶基因工程表达产物的制备方法，其特征在于：所述洗脱缓冲液的组成为：50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L GSH，pH8.0。

8.一种如权利要求所述制备方法制备所得的重组肝素酶蛋白。

9.如权利要求8所述的重组肝素酶蛋白在生产低分子量肝素中的应用。