CN106497897A

CN106497897A - 一种提高肝素酶i活性的工程菌株构建方法

Info

Publication number: CN106497897A
Application number: CN201610943394.3A
Authority: CN
Inventors: 罗学刚; 杨宝成; 张同存
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2016-10-26
Filing date: 2016-10-26
Publication date: 2017-03-15

Abstract

本发明涉及一种高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表达生产方法。依照肝素酶I的空间结构分析对其氨基酸序列进行优化，获得比酶活提高48％的Hep¹⁶⁹。然后根据密码子偏爱性优化HepI¹⁶⁹基因，通过人工合成获得基因DNA，克隆到表达载体中与SUMO等标签进行融合表达，转化宿主细胞、筛选建立了Hep¹⁶⁹的可溶性基因工程表达生产体系，分析结果显示目的蛋白获得了高效的可溶性表达，且具有很好的生物学活性，能高效的裂解肝素生成低分子量肝素。本发明方法不仅提供了一种高活性的HepI，而且为肝素酶I的高效可溶性基因工程表达生产提供了一种新方法，可有效降低低分子肝素等药物的生产成本，具有广泛的应用前景。

Description

一种提高肝素酶I活性的工程菌株构建方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，是一种高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表达生产方法。

背景技术

肝素是动物体内一种天然抗凝血物质，一直被用做抗凝血的主要药物，并且研究表明除了抗凝血活性及其相关的抗血栓形成活性以外，肝素还具有抑制平滑肌细胞增殖、抗炎症、抗肿瘤和抗病毒等生物学功能。虽然肝素现仍用于临床治疗，但是其带来的副作用也越来越明显，例如肝素的长期使用容易引起大量出血，诱导血小板减少及血栓形成，影响血小板稳定及过敏反应等症状。而低分子量肝素以其注射吸收好、半衰期长、生物利用度高、出血副作用少等优点在临床上的应用不断扩大。截至目前为止，低分子量肝素已经逐步取代肝素成为了首选的治疗药物。

低分子量肝素的生产可以分为化学降解法和酶解法。酶解法相对于化学降解法而言具有其独特的优点，例如作用条件温和，酶的专一性高，环境相对友好等，是较理想的工业生产低分子肝素的方法。但是利用酶解法生产低分子量肝素的缺点在于肝素酶(HepI)的来源有限，其野生菌产量很低并且需要价格昂贵的肝素进行诱导表达，从而导致生产成本过高。另一方面也是由于HepI的重组表达极易形成无活性的包涵体，并且不容易复性。

我国是肝素原料的出口大国，但一直未能对低分子量肝素生产技术进行系统的研究。目前低分子量肝素主要来自合资企业生产或者由国外进口，因此，利用酶解法生产低分子量肝素的研究应用前景极为广泛。而HepI作为低分子量肝素酶法生产的原材料，其高效生产技术的研究则受到广泛关注。

本研究采用融合表达HepI的形式来克服其容易形成包涵体的难题，同时结合生物信息学分析，对采取定点突变策略提高其酶活性，以达到其高效生产和利用的目的。

发明内容

本发明的目的在于克服当前肝素酶活性低的而缺点，提供一种高活性HepI及其高效可溶性基因工程表达方法，本发明获得的工程菌可以可溶性表达高活性HepI，因此不但降低了包涵体在变复性过程中的酶活损失、缩短了生产工艺，降低了生产成本，便于更好的大规模工业化生产HepI，更能高效地用于低分子量肝素的工业化生产。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种一种高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表达生产方法，其特征在于：改造获得一种具有高活性的HepI突变体Hep¹⁶⁹，然后利用分子生物学技术建立了它的高效可溶性基因工程表达体系。

(1)依照HepI的空间结构分析，改造获得一种比酶活较野生型提高48％的高活性肝素酶Hep¹⁶⁹；

(2)针对宿主密码子偏爱性，对Hep¹⁶⁹的编码基因进行优化，以大肠杆菌为例，其优化后的序列如附录序列表所示；

(3)为实现高效可溶性基因工程表达，将Hep¹⁶⁹与可促进二硫键形成、空间折叠的融合标签进行融合表达，这些融合标签包括SUMO、泛素、GST、Trx、DsbC、MBP等

(4)为了确保融合标签不影响Hep¹⁶⁹的空间结构及活性，在肝素酶I基因的N端引入柔性linker，可用的柔性linker包括(G₄S)n(n＝1-4)、GSGGSG、GSGGSGG、GSGGSGGG等。

(5)为了在后续纯化中切去融合标签，在融合标签与Hep¹⁶⁹间引入了蛋白酶切割位点，可用的蛋白酶包括肠激酶、SUMO蛋白酶、凝血酶、TEV酶、Xa因子、3C蛋白酶等；

(6)将重组质粒转化至基因工程宿主菌，所述宿主菌包括大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌等。

(7)重组表达产物Hep¹⁶⁹可高效裂解肝素生成低分子量肝素。

本发明的有益效果和优点是：

1、本发明的方法改造获得了一种酶活显著提高的HepI突变体Hep¹⁶⁹，该突变体可明显提高低分子肝素的酶解制备效率、并降低成本。

2、成功实现了HepI¹⁶⁹的高效基因工程表达，避免了包涵体变复性过程中对酶活造成的损失、缩短了HepI的生产工艺流程，降低了生产成本。

3、本发明的重组Hep¹⁶⁹具有可溶性好，活性高等优点，可以极大地发挥其在工业上高效生产低分子量肝素的目的。

附图说明(以SUMO融合的大肠杆菌表达质粒为例)

图1为本发明重组质粒PCR验证图，泳道1是以pESUMO为模板做的PCR结果，作为阴性对照，泳道2是G₄S柔性linker-肠激酶切割位点(DDDDK)-HepI的PCR结果，作为阳性对照，泳道3是以构建的重组质粒pESUMO-HepI为模板做的PCR结果。

图2为HepI重组大肠杆菌的质粒提取验证图，泳道1是转入PESUMO空质粒的大肠杆菌；泳道2是转入pESUMO-HepI重组质粒的大肠杆菌，泳道3是转入突变质粒pESUMO-HepI¹⁶⁹的大肠杆菌。

图3为pESUMO-HepI¹⁶⁹的突变位点测序结果。

图4为利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测检测肝素酶的表达，泳道1是以导入空载质粒的大肠杆菌做阴性对照，泳道2是未经突变的HepI，泳道3是突变的Hep¹⁶⁹。

图5为HepI¹⁶⁹的酶活检测。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明提供一种高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表达生产方法。具体内容包括：

(2)Hep¹⁶⁹表达载体的构建：为实现高效可溶性基因工程表达，将Hep¹⁶⁹与可促进二硫键形成、空间折叠的融合标签进行融合表达，这些融合标签包括SUMO、泛素、GST、Trx、DsbC、MBP等；为了确保融合标签不影响Hep¹⁶⁹的空间结构及活性，在肝素酶I基因的N端引入柔性linker，可用的柔性linker包括(G₄S)n(n＝1-4)、GSGGSG、GSGGSGG、GSGGSGGG等；为了在后续纯化中切去融合标签，在融合标签与Hep¹⁶⁹间引入了蛋白酶切割位点，可用的蛋白酶包括肠激酶、SUMO蛋白酶、凝血酶、TEV酶、Xa因子、3C蛋白酶等；

(3)将重组质粒转化至基因工程宿主菌，所述宿主菌包括大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌等。

(4)重组表达产物Hep¹⁶⁹的活性分析。

结果显示：本发明所获得HepI突变体Hep¹⁶⁹具有显著高于野生型HepI的酶活，所建立的基因工程表达体系可实现Hep¹⁶⁹的高效可溶性表达。本发明方法不仅为HepI的生产提供了一种新发方法，而且所获得的高活性HepI-169可以更高效的用于低分子量肝素的工业化生产，这在医药工业方面具有广泛的应用前景。

一、高活性HepI的重组工程菌构建方法(以SUMO融合的大肠杆菌表达体系为例)，步骤如下：

1、构建N端引入G₄S柔性linker-肠激酶切割位点(DDDDK)序列的HepI基因

以下表中引物进行PCR扩增

，以肝素黄杆菌基因组DNA为模板，用P3、P4引物通过PCR扩增后获得HepI基因序列，再以引物P1、P2(引入BsaI和BamHI酶切位点，下划线部分)再次扩增获得G₄S柔性linker-肠激酶切割位点(DDDDK)-HepI，然后酶切、纯化、连接到pESUMO质粒中，得到pESUMO-HepI质粒。

具体体系及扩增条件如下：

扩增HepI的PCR反应体系

反应条件：

2、HepI¹⁶⁹重组质粒的构建

将pESUMO-HepI质粒转化大肠杆菌DH5α，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，培养12h后挑取单克隆，提取质粒进行PCR验证，琼脂糖凝胶电泳检测有1134bp HepI目的片段的重组质粒经测序鉴定正确后，命名为PESUMO-HepI，然后以pESUMO-HepI为模板进行169位氨基酸的定点突变，突变产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，培养12h后挑取单克隆，提取质粒经测序验证后，命名为pESUMO-Hep¹⁶⁹(见图2)。

构建质粒所需连接体系

3、将HepI¹⁶⁹重组质粒分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到基因工程菌株。

⑴将-80℃保存的大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞于冰上解冻(切勿开盖，解冻时间大概为2min)。

⑵设置4组实验，在无菌条件下，第一组加1μL重组融合质粒到感受态中，第二组加1μL重组融合突变质粒，第三组加1μL空载质粒，第四组做空白对照，不加任何质粒，加完之后冰浴30min。(重组质粒和空载质粒均含有卡那霉素抗性，大肠杆菌Rosetta(DE3)含氯霉素抗性)

⑶提前准备42℃的水，完成30min冰浴后热击90s。

⑷热击之后迅速进行冰浴，时间为2-5min，让细胞开口完全闭合，防止质粒漏出；

⑸在无菌条件下向含有感受态的EP管中加入900μL LB培养基，37℃培养至OD600＝0.4；

⑹在培养感受态细胞期间，制备4个无菌的LB固体培养基，均添加0.1‰卡那霉素和氯霉素；

⑺在无菌条件下，将转化产物取出，8000rpm，离心2min，吸除850μL上清，剩余的培养液用移液枪轻轻吹悬，混匀；

⑻在无菌条件下进行涂板，用移液枪将上一步混悬的液体转移到LB固体培养基中，涂匀，正置20min；

⑼在已涂好的LB培养基在37℃恒温培养箱正置培养12-18h，对所长出的阳性克隆进行质粒提取、酶切及测序验证筛选。

二、HepI¹⁶⁹在重组大肠杆菌中表达产物检测

1、将两种重组工程菌及转化pESUMO空质粒的大肠杆菌分别接种到5mL含有抗生素的LB培养基中，37℃，200r/min培养过夜。

2、将过夜培养菌液按2％接种量于50mL发酵培养基中(250mL摇瓶)，37℃，200r/min培养至OD600约为0.6-0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG，在37℃，200r/min条件下诱导培养10h，诱导完测定各菌体的OD600。

(3)4℃10000r/min离心10min收集菌体，用PBS洗涤菌体三遍。

(4)超声破碎菌体。

(5)破碎后样品处理：破碎后取两管40μL样品，其中一管直接加入10μL 5×SDS上样缓冲液，标记为全菌体；另一管12000r/min离心10min，上清转移至新EP管，加入10μL 5×SDS上样缓冲液，标记为上清液；沉淀用40μL PBS重悬，再加入10μL 5×SDS上样缓冲液，标记为沉淀。

(6)样品煮沸10min后经SDS-PAGE电泳检测，实验结果表明：HepI¹⁶⁹在重组大肠杆菌中进行了表达，利用Odyssey成像，图片经quantity one软件分析各样品上清中目的蛋白的百分含量。

三、HepI¹⁶⁹的酶活测定

酶活测定方法：232nm光吸收法，此法测定的1个国际单位(IU)是指在30℃，pH值为7.3的条件下能产生1μmol 4，5-不饱和糖醛酸的效力。

本实验采用Sigma公司测定此类酶活性的方法来进行测定，其过程如下：取两只试管，设为实验组A和对照组B，都加入375μL反应缓冲液和50μL肝素钠溶液，在实验组A中加75μL肝素酶溶液，对照组B不加，将A和B置于30℃水浴锅中反应10min，然后都加2.5mL盐酸溶液终止反应，最后往对照组B中加75μL肝素酶溶液，将A和B体系都混合均匀，分别在232nm处测量吸光值。

实验结果表明，重组表达所获得未经过突变的HepI和本发明构建的高活性肝素酶突变体HepI¹⁶⁹都具有活性，且HepI¹⁶⁹的酶活较HepI有显著提高。

序列表

(1)HepI¹⁶⁹氨基酸序列：

(2)HepI¹⁶⁹核苷酸序列(含G₄S linker及肠激酶切割位点)

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 一种提高肝素酶I活性的工程菌株构建方法

<130> 2016-10-25

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 363

<212> PRT

<213> HepI169氨基酸序列

<400> 1

Gln Gln Lys Lys Ser Gly Asn Ile Pro Tyr Arg Val Asn Val Gln Ala

1 5 10 15

Asp Ser Ala Lys Gln Lys Ala Ile Ile Asp Asn Lys Trp Val Ala Val

20 25 30

Gly Ile Asn Lys Pro Tyr Ala Leu Gln Tyr Asp Asp Lys Leu Arg Phe

35 40 45

Asn Gly Lys Pro Ser Tyr Arg Phe Glu Leu Lys Ala Glu Asp Asn Ser

50 55 60

Leu Glu Gly Tyr Ala Ala Gly Glu Thr Lys Gly Arg Thr Glu Leu Ser

65 70 75 80

Tyr Ser Tyr Ala Thr Thr Asn Asp Phe Lys Lys Phe Pro Pro Ser Val

85 90 95

Tyr Gln Asn Ala Gln Lys Leu Lys Thr Val Tyr His Tyr Gly Lys Gly

100 105 110

Ile Cys Glu Gln Gly Ser Ser Arg Ser Tyr Thr Phe Ser Val Tyr Ile

115 120 125

Pro Ser Ser Phe Pro Asp Asn Ala Thr Thr Ile Phe Ala Gln Trp His

130 135 140

Gly Ala Pro Asp Arg Thr Leu Val Ala Thr Pro Glu Gly Glu Ile Lys

145 150 155 160

Thr Leu Ser Ile Glu Glu Phe Leu Ala Leu Tyr Asp Arg Met Ile Phe

165 170 175

Lys Lys Asn Ile Ala His Asp Lys Val Glu Lys Lys Asp Lys Asp Gly

180 185 190

Lys Ile Thr Tyr Val Ala Gly Lys Pro Asn Gly Trp Lys Val Glu Gln

195 200 205

Gly Gly Tyr Pro Thr Leu Ala Phe Gly Phe Ser Lys Gly Tyr Phe Tyr

210 215 220

Ile Lys Ala Asn Ser Asp Arg Gln Trp Leu Thr Asp Lys Ala Asp Arg

225 230 235 240

Asn Asn Ala Asn Pro Glu Asn Ser Glu Val Met Lys Pro Tyr Ser Ser

245 250 255

Glu Tyr Lys Thr Ser Thr Ile Ala Tyr Lys Met Pro Phe Ala Gln Phe

260 265 270

Pro Lys Asp Cys Trp Ile Thr Phe Asp Val Ala Ile Asp Trp Thr Lys

275 280 285

Tyr Gly Lys Glu Ala Asn Thr Ile Leu Lys Pro Gly Lys Leu Asp Val

290 295 300

Met Met Thr Tyr Thr Lys Asn Lys Lys Pro Gln Lys Ala His Ile Val

305 310 315 320

Asn Gln Gln Glu Ile Leu Ile Gly Arg Asn Asp Asp Asp Gly Tyr Tyr

325 330 335

Phe Lys Phe Gly Ile Tyr Arg Val Gly Asn Ser Thr Val Pro Val Thr

340 345 350

Tyr Asn Leu Ser Gly Tyr Ser Glu Thr Ala Arg

355 360

<210> 2

<211> 1118

<212> DNA

<213> HepI169核苷酸序列:含G4S linker及肠激酶切割位点

<400> 2

ggtggcggtg gcagtgatga tgatgataaa cgcagaaaaa atccggtaac atcccgtacc 60

gtgttaacgt tcaggctgat tctgctaaac agaaagctat catcgataac aaatgggttg 120

ctgttggtat caacaaaccg tacgctttac agtatgatga taaactgcgc ttcaacggta 180

aaccgtccta ccgcttcgaa cttaaagctg aagataactc ccttgaaggt tacgctgctg 240

gtgaaactaa aggtcgtact gaattgtcct actcctacgc tactactaac gatttcaaaa 300

aattcccgcc gtccgtttac cagaacgctc agaaacttaa aactgtttac cattacggta 360

aaggtatctg tgaacagggt tcctcccgct cctacacttt ctccgtttac atcccgtcct 420

ccttcccgga taacgctact actatcttcg ctcagtggca cggtgctccg gatcgtactc 480

ttgttgctac tccggaaggt gaaatcaaaa ctctgtccat cgaagaattc ttggctttat 540

acgatcgcat gatcttcaaa aaaaacatcg ctcacgataa agttgaaaaa aaagataaag 600

atggtaaaat cacttacgtt gctggtaaac cgaacggttg gaaagttgaa cagggtggtt 660

acccgactct ggctttcggt ttctctaaag gttacttcta catcaaagct aactccgatc 720

gtcagtggct tactgataaa gctgatcgta acaacgctaa cccggaaaac tccgaagtta 780

tgaaaccgta ctcctccgaa tacaaaactt ccactatcgc ttacaaaatg ccgttcgctc 840

agttcccgaa agattgctgg atcactttcg atgttgctat cgattggact aaatacggta 900

aagaagctaa cactatcttg aaaccgggta aactggatgt tatgatgact tacactaaaa 960

acaaaaaacc gcagaaagct cacatcgtta accagcagga aatcctgatc ggtcgtaacg 1020

atgatgatgg ttactacttc aaattcggta tctaccgtgt tggtaactcc actgttccgg 1080

ttacttacaa cctgtctggc tattccgaaa ctgctcgt 1118

Claims

1.一种高活性的肝素酶I(HepI)及其高效可溶性基因工程表达生产方法，其特征在于：依照肝素酶I的空间结构分析，改造获得一种比酶活较野生型提高48％的高活性肝素酶Hep¹⁶⁹，然后利用分子生物学技术建立了Hep¹⁶⁹的高效可溶性基因工程表达体系。

2.根据权利要求1所述高活性肝素酶I，其氨基酸序列如附录序列表所示。

3.一种如权利要求1所述的Hep¹⁶⁹高效可溶性基因工程表达体系，其特征在于：

(1)针对宿主密码子偏爱性，对Hep¹⁶⁹的编码基因进行优化，以大肠杆菌为例，其优化后的序列如附录序列表所示；

(2)为实现高效可溶性基因工程表达，将Hep¹⁶⁹与可促进二硫键形成、空间折叠的融合标签进行融合表达，这些融合标签包括SUMO、泛素、GST、Trx、DsbC、MBP等

(3)为了确保融合标签不影响Hep¹⁶⁹的空间结构及活性，在肝素酶I基因的N端引入柔性linker，可用的柔性linker包括(G₄S)n(n＝1-4)、GSGGSG、GSGGSGG、GSGGSGGG等。

(4)为了在后续纯化中切去融合标签，在融合标签与HepI¹⁶⁹间引入了蛋白酶切割位点，可用的蛋白酶包括肠激酶、SUMO蛋白酶、凝血酶、TEV酶、Xa因子、3C蛋白酶等；

(5)将重组质粒转化至基因工程宿主菌，所述宿主菌包括大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌等。

4.一种如权利要求1所述的高活性肝素酶I在低分子量肝素制备等领域中的应用。