CN109517074A - 一种融合标签促进Kuma030蛋白酶可溶性表达及非亲和层析快速纯化的应用 - Google Patents

一种融合标签促进Kuma030蛋白酶可溶性表达及非亲和层析快速纯化的应用 Download PDF

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刘厚权
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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，提供了一种融合标签促进Kuma030蛋白酶可溶性表达及非亲和层析快速纯化的应用，其是将融合表达策略与Kuma030蛋白酶自身性质相结合，获得了一种融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法，该方法不仅能够促进蛋白酶高表达，而且还可以得到移除融合表达标签的纯蛋白，纯度高的同时具有更加简便、低耗的优点，更适用于大规模的工业应用。

Description

一种融合标签促进Kuma030蛋白酶可溶性表达及非亲和层析 快速纯化的应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及融合标签促进蛋白质表达以及一种快速蛋白纯化方法在Kuma030表达纯化中的应用。
背景技术
乳糜泻(celiac disease,CD)是一种携带有遗传易感基因的个体因摄入含麦胶蛋白(即麸质gluten)的谷物(如小麦、大麦和黑麦，等)及其制品而引发的T细胞介导的系统性自身免疫病。Kumamolysin是一种可以降解麸质中PQ序列的一种蛋白酶。该蛋白酶具有独特的催化三联体(Glu78-Asp82-Ser278)，属于丝氨酸-羧基蛋白酶(S53)家族，且具有胶原蛋白酶活性。Kumamolysin蛋白酶由两部分组成：氨基端-前导肽(188个氨基酸)和成熟结构域(384个氨基酸)。当Kumamolysin蛋白处于酸性环境下(pH<4.0)，会发生自我切割现象(Okubo et al.2006)，由非成熟的完整形式变成具有催化活性的成熟形式(以下简称为Af-Kuma030，37kDa)。野生型KumaWT(Kumamolysin)经过两次蛋白质分子改造后得到高活性Kuma030突变体，其活性相对于野生型的KumaWT提高了800多倍。
2002年，Kumamolysin蛋白酶首次在大肠杆菌中克隆表达，但目标蛋白产量非常低，需要进一步浓缩之后才能在SDS-PAGE胶上检测到明显的条带(Oyama et al.2002)。2003年，Naoki Tsuruoka等将ScpA蛋白(后来被证实为Kumamolysin蛋白)在大肠杆菌中表达，最终得到的纯蛋白只有0.336mg/L(Tsuruoka et al.2003)。一方面，Kumamolysin蛋白在大肠杆菌中异源表达处于较低水平；另一方面，多步骤的非亲和层析纯化，例如阴阳离子交换、疏水作用等，使得最终纯蛋白的得率很低。因此，迫切需要解决该蛋白在大肠杆菌中低水平表达以及纯化产量低的问题。本发明人采用融合表达策略，利用能够促进蛋白质溶解、折叠的融合标签蛋白与Kumamolysin蛋白串联表达，使得蛋白产量提高到9.9mg/L。与此同时，发明人还采用一种快速高效的非亲和层析两步纯化方法，极大的简化了纯化步骤，提高了产品得率，相比于现行的纯化方法，更具大规模工业应用的潜力。
发明内容
鉴于Kuma030蛋白直接在大肠杆菌中异源表达水平较低以及多步骤的纯化方式，本发明提供了一种融合标签促进Kuma030蛋白酶表达以及一种两步纯化法的应用，能够在显著提高Kuma030蛋白酶表达量的同时，还能进一步快速纯化得到纯蛋白。
随着研究的深入，越来越多的融合表达标签被发现具有促进蛋白质折叠、可溶性表达的作用。然而，本发明人通过大量试验研究发现，现有的众多融合标签中，只有Sumo对Kuma030蛋白酶的表达具有明显的促进作用。另外，本发明人深入研究了Kuma030蛋白酶自身的性质，意外发现其在65℃高温、pH 4.0的环境中依然具有较高的活性。在进一步的研究中发现，酸性条件下，尤其是在pH不高于4.2时，Kuma030蛋白酶会进行自我切割，移除前导肽部分，形成具有催化活性的成熟肽，在此过程中，能够很好的移除位于目标蛋白N端的融合表达标签。因此，发明人构建了将具有促表达作用的融合标签Sumo序列连在Kuma030基因的N端的融合表达载体，在纯化过程中进行酸热两步处理时，一方面大量大肠杆菌内源蛋白在低pH环境变性沉淀；另一方面，Kuma030在酸的作用下进行自我切割，从而移除了在N端的融合标签，快速高效的得到了有活性的纯蛋白。
基于上述研究结果，本发明人利用融合表达策略以及结合Kuma030蛋白酶自身特性，最终提供了一种融合标签促进Kuma030蛋白酶表达以及二步非亲和层析纯化方式的应用。具体的技术方案概况如下：
一种融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法，该方法包括如下步骤：
(1)通过三轮PCR扩增得到Sumo-Kuma030片段，其中第一轮PCR扩增得到Kuma030片段，第二轮PCR扩增得到融合标签Sumo片段，第三轮通过连接PCR的方式将Sumo片段连接于Kuma030片段的N端，形成大片段Sumo-Kuma030；
(2)将步骤(1)获得的PCR产物Sumo-Kuma030回收后，用限制性内切酶酶切，再将载体经过上述限制性核酸内切酶酶切后回收，与片段Sumo-Kuma030酶连，得到表达载体pKuma030-3(如图1所示)；
(3)将表达载体pKuma030-3转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑取转化子进行培养和诱导表达；
(4)表达后收集菌体，去掉上清，水洗后用pH 6.8-7.2、0.03-0.08M Tris-HCl缓冲液重悬菌体，加入溶菌酶，室温静置30-50min，超声波破菌处理，离心破菌液，使破菌碎片与上清液完全分离，将上清液用HCl调pH至3.8-4.0，于52-60℃水浴中处理20-30min，离心收集上清。
进一步优选地，如上所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中表达并纯化的方法，其中步骤(2)中所述的载体为pET28a。
进一步优选地，如上所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中表达并纯化的方法，其中步骤(2)中所述的限制性核酸内切酶为NcoⅠ和XhoⅠ。
进一步优选地，如上所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中表达并纯化的方法，其中步骤(3)中所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
进一步优选地，如上所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中表达并纯化的方法，其中步骤(4)中所述的Tris-HCl缓冲液的pH为6.8-7.2，浓度0.03-0.08M。
进一步优选地，如上所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中表达并纯化的方法，其中步骤(4)中所述破菌处理的方式为超声波破菌，超声3s停6s，采用200-400W功率破菌8-12min。
进一步优选地，如上所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中表达并纯化的方法，其中步骤(4)中所述的水浴的温度为52-60℃。
另外，本发明还提供了一种利用上述方法表达并纯化得到的Kuma030蛋白酶的活性检测方法，该检测方法包括如下步骤：
(1)设计蛋白多肽底物MBP-Substrate-6xHis-GST，其中Substrate的序列如序列表中的序列1所示；
(2)取纯化得到的Kuma030蛋白酶与所述蛋白多肽底物，加入pH为3.8-4.0的醋酸钠缓冲液中混合，在36-38℃水浴中反应10-60min；
(3)反应结束后，取样用于SDS-PAGE检测，电泳结果显示为43kDa和26kDa两条带。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和显著的进步：
(1)本发明将融合表达策略与Kuma030蛋白酶自身性质相结合，获得了一种融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中表达并纯化的方法，该方法不仅能够促进蛋白酶高表达，而且还可以快速简单的得到移除融合表达标签的纯蛋白。
(2)与现有的多步骤纯化蛋白方式相比，本发明提供的纯化方法创造性地在蛋白纯化过程中引入酸处理和热处理两个过程，不需要任何纯化的树脂填料，最终得到的蛋白纯度可达99.7％，纯度高的同时具有简便、低成本的优点，更适用于大规模的工业应用。
(3)本发明人设计了一段蛋白多肽底物MBP-Substrate-6xHis-GST(70kDa)，其中Substrate序列为PFPQPQLPY，6xHis用于Ni-NTA纯化。Kuma030蛋白酶能够特异识别切割底物序列中的PQ序列，因此所设计蛋白多肽底物在经过Kuma030处理之后，经SDS-PAGE检测，会被特异切割成MBP(43kDa)和GST(26kDa)两部分。
附图说明
图1：本发明融合表达质粒结构示意图，包括不含融合标签的Kuma030表达载体pKuma030-1；含Ub融合标签的Kuma030表达载体pKuma030-2；含Sumo融合标签的Kuma030表达载体pKuma030-3；含MBP融合标签的Kuma030表达载体pKuma030-4。
图2：不同融合标签对Kuma030表达影响的SDS-PAGE检测图；其中，1-Kuma030，2-Ub-Kuma030，3-Sumo-Kuma030，4-MBP-Kuma030。箭头指示正确的融合蛋白条带。
图3：两步纯化方法纯化结果图；其中，1-含有Sumo-Kuma030的大肠杆菌细胞裂解液，2-经过酸处理之后的样品，3-经过酸处理和热处理之后的样品(Af-Kuma030)。
图4：蛋白多肽底物结构示意图以及Kuma030活性检测图；其中，A-底物结构图，B-活性检测图(1-两步法纯化的kuma030；2,3-底物对照0min,30min；4,5,6,7-反应0,10,30,60min)。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：构建三种融合表达标签(Ub、Sumo、MBP)与Kuma030基因串联在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达载体(以Sumo为例)
(1)通过三轮聚合酶链式反应(PCR)扩增得到Sumo-Kuma030片段。其中第一轮PCR扩增得到Kuma030基因片段，第二轮PCR扩增得到Sumo融合标签基因片段，第三轮通过连接PCR的方式将Kuma030基因片段与Sumo标签基因片段连接成大片段(Sumo-Kuma030)。
PCR反应体系：10×Pfu buffer，5μL；dNTP(2.5mM)，5μL；引物F(10μM)，2μl；引物R(10μM)，2μL；Pfu聚合酶，0.5μL；模板(prk792；Kuma030基因由公司合成)，1μL；加ddH2O至反应体系为50μL。
PCR扩增体系：94℃，3min；94℃，30s，58℃，20s，72℃，30s(延伸时间随片段长短变化)，25个循环；72℃，5min；4℃，∞。
(2)将步骤(1)获得的PCR产物回收后，用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，再把经过限制性核酸内切酶NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后回收的载体pET28a和片段(Sumo-Kuma030)以T4DNA Ligase酶连；含酶连产物的质粒pKuma030-3结构示意图如图1所示，转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑选转化子进行测序验证。
其他标签表达载体pKuma030-1，pKuma030-2，pKuma030-4的构建方式与上述表达载体pKuma030-3一样。
实施例2：含有融合标签的Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中的诱导表达
将实施例1构建的融合表达载体pKuma030-1,2,3,4分别转化于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。转化体系：重组质粒1μL；感受态细胞10μL；混合好体系后，冰上放置10min，然后42℃水浴35s，加入150μL LB培养基，37℃摇床孵育1h，然后涂布于加了卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-16h。
接种单菌落于20mL液体LB培养基中，加入50μg/mL的卡那霉素，37℃培养12-16h，按1％的接种量转接至1L液体LB培养基，加入50μg/mL的卡那霉素，37℃培养，待OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，然后转移至18℃低温诱导20-24h。
诱导完成后，4℃、5000rpm离心10min收集菌体，去掉上清，用无菌水重悬，再离心来洗涤细胞；用Lysis Buffer重悬细胞，加入Lysozyme混匀后4℃搅拌1hr；超声波破菌，超3s停6s，300W功率破菌10min；4℃、17000rpm离心30min离心破菌液，使破菌碎片与上清液完全分离。
取上清液，经SDS-PAGE检测后，各种标签融合表达结果如图3所示，泳道1是不引入任何融合标签的Kuma030蛋白酶表达情况；泳道2-4分别是引入了融合标签Ub、Sumo、MBP的Kuma030表达情况，箭头所示为融合蛋白理论的条带大小。结果表明，在这三种融合标签中，只有Sumo-Kuma030(73kDa)表达出了完整的融合条带，其他两种融合蛋白Ub-Kuma030(65kDa)，MBP-Kuma030(100kDa)没有看到明显的目的条带(如箭头所示)。因此，在这三种标签中只有Sumo标签展现出促进目标蛋白可溶的效果。为了进一步验证该条带是否为理论的融合蛋白条带，发明人进一步对含有融合蛋白的细胞裂解液进行纯化，最后通过活性检测来验证该条带。
实施例3：蛋白多肽底物在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达和Ni-NTA亲和纯化
为了对后续蛋白酶活性进行验证，构建蛋白多肽底物表达载体并在大肠杆菌进行了表达和纯化。
(1)通过三轮聚合酶链式反应(PCR)扩增得到MBP-substrate-GST的片段。其中第一轮PCR扩增得到MBP-substrate基因片段，第二轮PCR扩增得到substrate-GST基因片段，第三轮通过连接PCR的方式将MBP-substrate基因片段与substrate-GST基因片段连接成大片段(MBP-substrate-GST)。
PCR反应体系：10×Pfu buffer，5μL；dNTP(2.5mM)，5μL；引物F(10μM)，2μl；引物R(10μM)，2μL；Pfu聚合酶，0.5μL；模板(prk792)，1μL；加ddH2O至反应体系为50μL。
PCR扩增体系：94℃，3min；94℃，30s，58℃，20s，72℃，30s(延伸时间随片段长短变化)，25个循环；72℃，5min；4℃，∞。
(2)将步骤(1)获得的PCR产物回收后，用限制性内切酶NcoⅠ和BamHⅠ双酶切，再把经过限制性核酸内切酶NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后回收的载体prk792和片段(MBP-substrate-GST)以T4DNA Ligase酶连；酶连产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑选转化子进行测序验证。
(3)将构建好的底物载体转化于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。转化体系：重组质粒1μL；感受态细胞10μL；混合好体系后，冰上放置10min，然后42℃水浴35s，加入150μLLB培养基，37℃摇床孵育1h，然后涂布于加了氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12-16h。
(4)接种单菌落于20mL液体LB培养基中，加入100μg/mL的氨苄青霉素，37℃培养12-16h，按1％的接种量转接至1L液体LB培养基，加入加入100μg/mL的氨苄青霉素，37℃培养，待OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，然后转移至18℃低温诱导20-24h。
(5)取上述(4)中诱导后的菌体，4℃、5000rpm离心10min收集菌体，去掉上清，用无菌水重悬，再离心来洗涤细胞；用Lysis Buffer重悬细胞，加入Lysozyme混匀后4℃搅拌1hr；超声波破菌，超3s停6s，300W功率破菌10min；4℃、17000rpm离心30min离心破菌液，使破菌碎片与上清液完全分离；取1mL Ni-NTA 6xHis树脂填充到蛋白纯化柱中，用WashBuffer洗涤树脂2次；将破菌上清加入到蛋白纯化柱中，静置后待树脂沉降下来，将杂蛋白释放出来；用Wash Buffer洗涤树脂，去掉未结合的杂蛋白；用Elution Buffer洗脱目标蛋白，用过的树脂回收。
实施例4：应用两步纯化法纯化蛋白
应用二步纯化方法，纯化融合表达蛋白：
(1)取上述实例2中诱导后的菌体，4℃、5000rpm离心10min收集菌体，去掉上清，用无菌水重悬，再离心来洗涤细胞；
(2)用Tris-HCl缓冲液(pH 6.8-7.2)重悬细胞，室温静置30min。
(3)超声波破菌，超3s停6s，300W功率破菌10min；
(4)室温下12000rpm离心30min离心破菌液，使破菌碎片与上清液完全分离。
(5)将上清液加入适量1M HCl，调pH至4.0，静置30min后，12000rpm，15min离心，分离上清液。
(6)将上清液55℃水浴处理30min，离心(12000rpm，15min)收集上清。
两步纯化方法结果如图3所示，将含Sumo-Kuma030融合蛋白的破菌上清经过酸热处理纯化后，在自我切割前导肽的过程中同时移除了Sumo标签，形成了Kuma030成熟形式的条带Af-Kuma030，且无任何杂蛋白。
实施例5：Kuma030蛋白酶特异切割蛋白多肽底物的活性检测
为了进一步分析确定融合标签对Kuma030蛋白酶表达的影响，发明人对经由上述两步纯化法得到的Af-kuma030蛋白进行活性检测，结果显示Sumo标签能够有效的促进Kuma030蛋白酶高效表达，且仍保持较高活性，具体如下。
将用上述两步纯化方法快速纯化得到的Kuma030蛋白酶与实施例4纯化得到的蛋白多肽底物按摩尔比1:10进行反应。反应总体积200μL；醋酸钠缓冲液(pH 4.0)100μL；ddH2O补齐体系。混合好反应液后，在37℃水浴反应，于0min；10min；30min；60min取10μL样，用于SDS-PAGE分析。
结果如图4显示，利用该种非亲和层析快速纯化方法得到的Kuma030蛋白酶能在60min内将多肽底物完全水解。
综上所述，发明人通过优选几种常用的融合表达标签，最终发现Sumo标签促进了Kuma030在大肠杆菌中的可溶性表达，并通过高温酸性处理迅速移除标签蛋白，最终形成不含融合标签的成熟形式Kuma030蛋白酶纯品。
需要说明的是，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种融合标签促进Kuma030蛋白酶可溶性表达及非亲和层析快速纯化的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr
1 5

Claims (8)

1.一种融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)通过三轮PCR扩增得到Sumo-Kuma030片段，其中第一轮PCR扩增得到Kuma030片段，第二轮PCR扩增得到融合标签Sumo片段，第三轮通过连接PCR的方式将Sumo片段连接于Kuma030片段的N端，形成大片段Sumo-Kuma030；
(2)将步骤(1)获得的PCR产物Sumo-Kuma030回收后，用限制性内切酶酶切，再将载体经过上述限制性核酸内切酶酶切后回收，与Sumo-Kuma030酶连，得到表达载体pKuma030-3(如图1所示)；
(3)将表达载体pKuma030-3转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑取转化子进行培养和诱导表达；
(4)表达后收集菌体，去掉上清，水洗后用pH 6.8-7.2、0.03-0.08M Tris-HCl缓冲液重悬菌体，加入溶菌酶，室温静置30-50min，超声波破菌处理，离心破菌液，使破菌碎片与上清液完全分离，将上清液用HCl调pH至3.8-4.0，去除沉淀，离心收集上清液并于52-60℃水浴中处理20-30min，离心收集上清。
2.根据权利要求1所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的载体为pET28a。
3.根据权利要求1所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的限制性核酸内切酶为NcoⅠ和XhoⅠ。
4.根据权利要求1所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
5.根据权利要求1所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的Tris-HCl缓冲液的pH为6.8-7.2，浓度0.03-0.08M。
6.根据权利要求1所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法，其特征在于，步骤(4)中所述破菌处理的方式为超声波破菌，超声3s停6s，采用200-400W功率破菌8-12min。
7.根据权利要求1所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的水浴的温度为52-60℃。
8.一种利用权利要求1所述方法表达并纯化得到的Kuma030蛋白酶的活性检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)设计蛋白多肽底物MBP-Substrate-6xHis-GST，其中Substrate的序列如序列表中的序列1所示；
(2)取纯化得到的Kuma030蛋白酶与所述蛋白多肽底物，加入pH为3.8-4.0的醋酸钠缓冲液中混合，在36-38℃水浴中反应10-60min；
(3)反应结束后，取样用于SDS-PAGE检测，电泳结果显示为43kDa和26kDa两条带。
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