CN101173267A

CN101173267A - 长穗偃麦草在创制低乳糜泻抗原编码dna小麦中的应用

Info

Publication number: CN101173267A
Application number: CNA2007101139098A
Authority: CN
Inventors: 陈凡国; 夏光敏; 张尚立; 陈梦竹; 赵峰
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2007-10-17
Filing date: 2007-10-17
Publication date: 2008-05-07
Anticipated expiration: 2027-10-17
Also published as: CN101173267B

Abstract

本发明公开了一种利用长穗偃麦草创制低乳糜泻抗原(celiac disease epitope)编码DNA小麦的应用。该应用利用同源序列法筛选出低乳糜泻抗原编码DNA的小麦远缘禾草长穗偃麦草；之后利用体细胞杂交技术将远源禾草部分基因组或DNA转入小麦中，最后利用同源序列法筛选低乳糜泻抗原编码DNA小麦体细胞杂种。本发明获得低乳糜泻抗原编码DNA小麦体细胞杂种可以用于低乳糜泻抗原小麦的育种工作，为解决乳糜泻类病人治疗期间的食品问题奠定基础。

Description

长穗偃麦草在创制低乳糜泻抗原编码DNA小麦中的应用

技术领域

本发明涉及长穗偃麦草的应用，尤其涉及长穗偃麦草在创制低乳糜泻抗原编码DNA小麦中的应用。

背景技术

乳糜泻(celiac disease，简称CD)是遗传易感者摄入麸质后，由免疫系统介导的以乳糜样腹泻为主的全身性疾病。本病在欧美发病率较高，非洲最低。麸质食物是乳糜泻的致病因素，另外个体的遗传易感性、免疫反应和环境因素等影响该病与并发症的发生。麸质中麦醇溶蛋白(α-，β-，γ-，ω-)是主要的致病性植物蛋白抗原，尤以α-醇溶蛋白对小肠粘膜具有毒性。研究表明：在α-醇溶蛋白中含有四种乳糜泻抗原，分别为glia-α(QGSFQPSQQ)，glia-α2(PQPQLPYPQ)，glia-α9(PFPQPQLPY)，glia-α20(FRPQQPYPQ)(Herpen et al，2006)。正常人小肠粘膜细胞内有多肽分解酶，可将醇溶蛋白分解为小分子的无毒物质，而易感者肠粘膜缺少醇溶蛋白分解酶，影响机体免疫功能，对醇溶蛋白产生过敏反应。乳糜泻的发病与位于6号染色体的主要组织相容性复合体(HLA)II型D区基因异常所形成的HLA-DQ2和HLA-DQ8密切相关。研究表明，含有HLA-DQ2和HLA-DQ8编码基因者患CD的概率为2～3％，高于一般人群(1％)。乳糜泻是终身性疾病，治疗时以无麦醇溶蛋白食品为食是最基本的、必需的(Wang et al，2007)。

小麦是世界上除了水稻外最为重要的粮食作物，可以加工成许多种食品，如馒头、面条、面包饼干、糕点等(Shewry et al，2003)。小麦不仅供给人们热量，而且也是蛋白质的重要来源。而在蛋白质中，α-醇溶蛋白占总蛋白量的15-30％，由于现有小麦品种中多数含有乳糜泻抗原，因而进行低或无乳糜泻抗原小麦育种十分必要。在小麦的近缘材料中，如不同倍性的祖先种中，均有大量的抗原编码基因的存在(Herpen et al，2006)。

发明人的早期实验中，发现与小麦远缘的禾草二、十倍体长穗偃麦草中编码四种抗原的基因数和拷贝数均很低，有望作为有益的基因供体进行远缘育种工作，进而培育出低或无乳糜泻抗原小麦。长穗偃麦草(Agropyron elongatum)，由于具有蛋白质含量高和抗逆性强的优点，已经成为小麦育种中十分重要的野生资源之一(Xia et al，2003)。

远缘有性杂交可以实现供体遗传物质的转移，但是由于远缘杂交存在后代不育等缺点限制了该方法的使用。体细胞杂交技术可以有效地克服基因组杂交的限制，而紫外线照射可以提高外源基因组转移的效率和提高育性(Xia et al，2003)。这两个技术的结合就是现在常用的不对称体细胞杂交技术。

基因组原位杂交(GISH)分析表明，长穗偃麦草染色体小片段渐渗到小麦基因组并且在后代稳定遗传(Wang et al，2005)；通过蛋白电泳、基因克隆与序列分析表明体细胞杂交获得的普通小麦与长穗偃麦草后代株系中，出现了不同于双亲的优质HMW-GS基因及组合：如类似小麦的1Dx5+1Dy10，1Bx13+1By16(Liu et al，2006；liu et al，2007)。

总之，利用体细胞杂交技术接合紫外线照射供体基因组可以有效地转移外源遗传物质进入小麦基因组，进而获得大量遗传稳定的小麦与长穗偃麦草的体细胞杂种植株，为实现培育低或无乳糜泻抗原结合面粉品质优良的小麦奠定了技术基础。

发明内容

针对现有小麦含有大量乳糜泻抗原的问题，本发明的目的是提供一种长穗偃麦草的新应用，即长穗偃麦草在创制低乳糜泻抗原编码DNA小麦中的应用。

本发明所述长穗偃麦草在创制低乳糜泻抗原小麦的应用通过下列步骤实现：1)低乳糜泻抗原编码DNA的小麦远缘禾草长穗偃麦草的鉴定；2)不对称体细胞杂交转移长穗偃麦草遗传物质到受体小麦；3)低乳糜泻抗原编码DNA小麦体细胞杂种的筛选。

步骤1)低乳糜泻抗原编码DNA的小麦远缘禾草的鉴定：利用同源序列法筛选供体材料，获得低乳糜泻抗原编码DNA的小麦远缘禾草二、十倍体长穗偃麦草。

步骤2)包括双亲胚性细胞的获得：受体材料为小麦，供体材料为二、十倍体长穗偃麦草等含低乳糜泻抗原的远缘禾草，受体、供体的幼胚在MS培养基上诱导愈伤组织，经继代培养后，选取胚性愈伤组织作为受体；受、供体原生质体的收集：取继代2-5天的材料，切碎，利用酶解技术，即在25℃下，游离3-5小时，用300-500目不锈钢网过滤，500-800rpm离心5min，收集原生质体；供体原生质体的UV处理：将收集的供体原生质体，经洗液冲洗后，调密度为1×10^5-6/mL，之后铺于直径为3.5cm的培养皿低部成一均匀薄层，敞开盖后紫外线照射，强度和时间为380μw/cm²，1-2min；双亲原生质体的杂交：将供体与受体按照1∶2的体积比混合，用PEG法诱导，具体步骤如下：(1)向直径为.5cm的培养皿滴加0.2ml混合双亲原生质体成一均匀薄层，静置20-30min；(2)沿原生质体周围小心滴加0.2mlPEG溶液，静置15-20min；(3)在原生质周围滴加0.275M硝酸钙，调pH＝7.0，抽滤灭菌，0.4ml，静置15-20min；(4)小心吸掉皿中液体，间隔10min，洗液小心冲洗2次；(5)5-10min后用P₅培养基洗1次后，在P₅培养基中于25℃避光培养；杂种愈伤组织的培养与植株再生：待再生的愈伤组织至1.5-2mm时，移到增殖培养基上增殖和分化培养基上分化幼苗，待幼苗长到5cm时，在壮苗培养基上长出一片新叶后，经不同湿度、有菌等炼苗后栽到大盆中。

步骤3)低乳糜泻抗原编码DNA小麦体细胞杂种的筛选：利用同源序列法筛选再生材料，获得低乳糜泻抗原编码DNA的小麦体细胞杂种株系。

其中：

酶液成分：1.5％ cellulase(ONozuka RS，0.3％Pectolyase Y-23，5mM MES，0.6M甘露醇，5mM CaCl₂pH＝5.8；

洗液成分：0.6M甘露醇，5mM CaCl₂pH＝5.8；

PEG溶液配方：2g葡萄糖，1.5g硝酸钙，40g PE₆₀₀₀，溶于100ml无离子水中，调pH＝7.0，抽滤灭菌；

P5培养基：MS培养基大量和微量元素+B5维生素+500mg/L水解酪蛋白+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+90g/L葡萄糖+975mg/L MES，pH＝5.8；

MS培养基：MS培养基大量和微量元素+2mg/L甘氨酸+30g/L蔗糖+6.2g/L琼脂粉，pH＝5.8；

MS继代培养基：MS培养基+1mg/L 2，4-D+0.5mg/L玉米素；

MS诱导分化培养基：MS培养基+0-0.5mg/L 2，4-D+0.5mg/L玉米素；

MS壮苗培养基：MS培养基+0.5mg/L NAA+1-3mg/L多效唑。

本发明获得低乳糜泻抗原编码DNA小麦体细胞杂种可以用于低乳糜泻抗原小麦的育种工作，从而为解决该类病人治疗期间的食品问题奠定基础。

附图说明

图1二、十倍体长穗偃麦草中α-醇溶蛋白基因的PCR扩增。

其中：M：分子量标准(λDNA/EcoRI+HindIII)；1，二倍体长穗偃麦草；2，十倍体长穗偃麦草。

图2体细胞杂种II-12和双亲小麦济南177与长穗偃麦草中α-醇溶蛋白基因的PCR扩增。

其中：M：分子量标准(λDNA/EcoR I+Hind III)；1，体细胞杂种II-12；2，济南177；3，十倍体长穗偃麦草。

具体实施方式

实施例1利用同源序列法筛选低乳糜泻抗原编码DNA的小麦远缘禾草

取长穗偃麦草的幼叶，利用CTAB的方法提取DNA，引物为P1：5’-ATG AAG ACC TTTCTC ATC CT-3’，P2：5’-TCA GTT AGT ACC GAA GAT GCC-3’，PCR的反应的的酶为LA Taq(TaKaRa)；循环条件：初始变性94℃/3min，之后30个循环(变性94℃/40s，退火55℃/1min，延伸72℃/2min)，终延伸72℃/10min，PCR结果见图1。

PCR产物在2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳并回收(TIANGEN DNA回收试剂盒)。将PCR回收产物连到pMD18-T载体上，然后转化E.coli DH10B感受态细胞。克隆转化方法参照分子克隆实验指南(Sambrook et al，1989)，鉴定出的阳性克隆进行双向两次测序，十倍体长穗偃麦草α-醇溶蛋白基因的序列号为EU018300-EU018335；二倍体长穗偃麦草α-醇溶蛋白基因的序列号为EU018207-EU018267。筛选的四种在α-醇溶蛋白编码基因中的乳糜泻抗原总结情况见表1。

表1小麦济南177、二、十倍体长穗偃麦草和体细胞杂种II-12中四种乳糜泻抗原编码DNA在α-醇溶蛋白编码基因中的分布

可表达基因	glia-α	glia-α2	Glia-α9	glia-α20	基因数总计
可表达基因	glia-α	glia-α2	Glia-α9	glia-α20	基因数总计	济南177十倍体长穗偃麦草二倍体长穗偃麦草	550	500	900	500	955
杂种II-12	3	5	5	5	8	济南177十倍体长穗偃麦草二倍体长穗偃麦草	550	500	900	500	955
杂种II-12	3	5	5	5	8	假基因	glia-α	glia-α2	glia-α9	glia-α20	基因数总计
济南177十倍体长穗偃麦草二倍体长穗偃麦草杂种II-12	71413	8005	10006	11005	23315619	假基因	glia-α	glia-α2	glia-α9	glia-α20	基因数总计

实施例2利用不对称体细胞杂交获得小麦体细胞杂种

1)双亲胚性细胞的获得：受体材料为小麦，供体材料为二、十倍体长穗偃麦草等含低乳糜泻抗原的远缘禾草，受体、供体的幼胚在MS培养基上诱导愈伤组织，经继代培养后，选取胚性愈伤组织作为受体。

2)受、供体原生质体的收集：取继代2-5天的材料，切碎，利用酶解技术，即在25℃下，游离3-5小时，用300-500目不锈钢网过滤，500rpm离心5min，收集原生质体。

3)供体原生质体的UV处理：将收集的供体原生质体，经洗液冲洗后，调密度为1×10^5-6/mL，之后铺于直径为3.5cm的培养皿低部成一均匀薄层，敞开盖后紫外线照射，强度和时间为380μw/cm²，2min。

4)双亲原生质体的杂交：将供体与受体按照1∶2的体积比混合，用PEG法诱导，具体步骤如下：(1)向直径为.5cm的培养皿滴加0.2ml混合双亲原生质体成一均匀薄层，静置20-30min；(2)沿原生质体周围小心滴加0.2mlPEG溶液，静置15-20min；(3)在原生质周围滴加0.275M硝酸钙(调pH＝7.0，抽滤灭菌)0.4ml，静置15-20min；(4)小心吸掉皿中液体，间隔10min，洗液小心冲洗2次；(5)5-10min后用P₅培养基洗1次后，在P₅培养基中于25℃避光培养。

5)杂种愈伤组织的培养与植株再生：待再生的愈伤组织至1.5-2mm时，移到增殖培养基上增殖和分化培养基上分化幼苗，待幼苗长到5cm时，在壮苗培养基上长出一片新叶后，经不同湿度、有菌等炼苗后栽到大盆中。

6)杂种植株的鉴定：由于所使用的受体亲本小麦济南177经培养证明已经无法再生植株，而供体长穗偃麦草由于紫外线的照射基因组受到破坏也无法再生，根据体细胞杂交再生互补理论，能够再生植株的是体细胞杂种。

其中：

洗液成分：0.6M甘露醇，5mM CaCl₂pH＝5.8；

PEG溶液配方：2g葡萄糖，1.5g硝酸钙，40g PEG₆₀₀₀，溶于100ml无离子水中，调pH＝7.0，抽滤灭菌；

P₅培养基：MS培养基大量和微量元素+B5维生素+500mg/L水解酪蛋白+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+90g/L葡萄糖+975mg/L MES，pH＝5.8；

MS继代培养基：MS培养基+1mg/L 2，4-D+0.5mg/L玉米素；

MS诱导分化培养基：MS培养基+0.5mg/L玉米素；

MS壮苗培养基：MS培养基+0.5mg/L NAA+3mg/L多效唑。

实施例3低乳糜泻抗原编码DNA小麦体细胞杂种的筛选

实施的方法同实施例1中的步骤与方法。

杂种II-12(EU018336-EU018362)与亲本小麦(济南177)(EU018268-EU018299)、十倍体长穗偃麦草α-醇溶蛋白编码基因(EU018300-EU018335)中四种乳糜泻抗原编码DNA的比较见表1。

Claims

1.长穗偃麦草在创制低乳糜泻抗原编码DNA小麦中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述长穗偃麦草是低乳糜泻抗原编码DNA的小麦远缘禾草二倍或十倍体长穗偃麦草。