JPH04505553A - 雄性発生を受けるトウモロコシの能力を高めるための方法及びそれから生成される生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は単離された雄性配偶体培養物及び培養された雄性配偶体の続く遺伝的形 質転換に関する。

特定の性質の改良を示す新規植物を供給ｊ′ることは農業士且つ経済的な興味の 対象である。適切な品種改良技法を辿１７て、これらの特徴が新規又は存在する 植物種の遺伝子型中に導入され得、続いてこれらは直接市販され、又は中線した ハイブリッド植物を生成するために使用され得る。

トウモロコシハイブリッドの開発は、従来３段階を包含する：　（１）種々の発 芽形質プールから卓越した植物の選択；（２）お互い異なるが、真に育成し、そ １．てひじょうに均一性である一連の通交系を生成するためにいくつかの世代に わたっての卓越した植物の０殖：及び（３）ハイブリッド子孫（Ｆ、）を生成す るために無関係な通交系と選択された通交系との交配。通交系のホモ接合性及び ホモジェネート性の重要な結果は、いづれか２種の近文系の間のハイブリッドが 常に同じであることである。最良なハイブリッドを付与する通交系が同定されれ ば、そのハイブリッド種子は、その通交系親のホモジェネ−１・性が維持される 限り無限に生殖され得る。

選択的育種による改良は比較的遅い。なぜならば、限定された数の世代の植物の みがそれぞれの年に繁殖され得るからである。従って、植物の改良は、厳密な作 業の年の後でのみ得られて来た。

植物育種における半数体の可能性ある利用についての多くの論議が存在する。定 義すれば、半数体は、配偶子染色体補体を含む個体である。トウモロコシ育種は 、生殖ハイブリッドを直接又は親とｊ−で使用するために遺伝子型の開発に関係 されるので、半数体の染色体補体の２倍を伴うホモ接合性の急速な進歩が魅力的 な特徴である。しかし５ながら、トウモロコシ育種への半数体の利用試みは、広 範囲の商業的に重要な発芽形質から十分な数の二倍にされた半数体系を生成する 信頼できる手段の欠乏により妨げられて来た。

半数体植物を生成するために配偶体細胞のインビボ培養に基づく多くの研究が過 去２０年間報告されて来た。多数の書評、本及びシンポジウム議事録が同様に出 版されで来たく一般的に、Ｃｈｕ、　”Ｈａｐｌｏｉｄｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　 Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎビ、　Ｉｎ　ｌＫ１９８２、　１２９〜１５８ベージ；　 Ｈｅｂｅｒｌｅ−Ｂｏｒｓ、　”Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｈａｐｌｏｉｄｏｆ　Ｈｉ ｇｈｅｒ　Ｐｌａｎｔｓ　ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ″Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ 、　Ｂｅｒｌｉｎ。

（１９８６）を参照のこと）。

インビトロ培養の間の初期の出来事は、細胞学的、超構造学的及び生化学的レベ ルで特徴づけられて来た（Ｃｈｅｎなど０、“Ｓｅｇｍｅｎｔａｔ、ｉｏｎ　Ｐ ａｔｔｅｒｎｓ　ａｎｄ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｍｕｌ ｔｉ−ｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｄ　Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅｓ 　ｏｆ　Ｂａｒｌｅｙ’、Ｃａｎ、Ｊ。

Ｇｅｎｅｔ、Ｃｙｔｏｌ、、２６：　４７５−４８３　（１９８４）　；Ｒａｇ ｈａｖａｎ、’ＰｒｏｔｅｉｎＳｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ａｃｔｖｉｔｙ　ｄｕｒｉ ｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｐｏ１ｌｅｎ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄＤｕｒｉ ｎｇ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｏ１ｌｅｎ　Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｈ ｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ｒｔｉｇｏｒ”。

Ｊ、Ｃａｎ　Ｂｏｔ、、　１９８４．６２　：　２４９３〜２５１３　：及びＨ ｕａｎｇ、　”旧ｔｒａｓｔ−ｒｕｃｔｕａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｐｏ１ ｌｅｎ　Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｈｏｒｄｅｕｍ。

Ｔｒｊｔｉｃｕｍ　ａｎｄ　Ｐａｅｏｎｉａ”　Ｉｎ　Ｈｕ　Ｈ，Ｙａｎｇ　Ｈ （版）：“Ｈａｐｌｏｉｄｓｏｆ　Ｉｌｉｇｈｅｒ　Ｐｌａｎｔｓ　ｉｎ　Ｖｉ ｔｒｏ″、　Ｂｅｒｌｉｎ、　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ　：　Ｓｐｒｉｎ−ｇｅｒ −Ｖｅｒｌａｇ、　１９８６を参照のこと）。

インビトロ培養は、植物からの未成黙約を単離し、そしてその朽又はそれらから 単離された雄性配偶体を、雄性配偶体を誘発する培地上に置くことを包含し、こ こで前記配偶体は通常、分割し始め、そして植物が再生され得る細胞培養物を形 成するために花粉粒になるように予定されているであろう。

この現象は、雄性発生として知られている。得られた培養物は半数体であり、そ して元の植物からのたった一組の染色体を含む。これらの培養物に由来する植物 は、染色体の二倍体化が自発的に又は誘発により、十分に繁殖力があり、そして 完全に同系交配される二倍体化された半倍体を創造するために生じなければ、実 を結ばない。

約培養は、豹において直接的に雄性配偶体を培養するための方法を提供する。陽 性のインビトロ応答は、植物が再生され得る胚及び／又はカルスの発育を導ひく であろう。約培養の一般的な論議のためには、Ｊ、　Ｍ、　Ｄｕｎｗｅｌｌ、　 ”Ａｎｔｈｅｒ　ａｎｄ　０ｖａｒｙ（：ｕｌｔｕｒｅ”、Ｉｎ　ＳＷＪ　Ｂｒ ｉｇｈｔ　ａｎｄ　ＭＧＫ　Ｊｏｎｅｓ、（版）　、ＣａｒｅａｌＴｉｓｓｕｅ 　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎ１ｊｈｏｆｆ　Ｐ ｕｂｌｉｓｈｅｒ。

１９８５、　Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、１〜４４ベージ；及びＫｅｌｌｅｒなど、’ Ｈａｐｌｏｉｄｓｆｒｏｍ　Ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｉｃ　Ｃｅ１ｌｓ−ｒｅｃｅ ｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｆｕｔｕｒｅｐｒｏｓｐｅｃｔｓ” 、Ｉｎ　ＣＥ　Ｇｒｅｅｎ、ＤＡ　Ｓｏｍｅｒｓ、ＷＰ　Ｈａｃｋｅｔｔ、ＤＯ Ｂｉｅ−ｓｏｅｒ　（版）　、Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ｌａ１ｎ　ＲＬｉ５ｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、２２：３〜２４１ページを参照のこと。

約培養は、２００種以上の雄性配偶体由来のカルス、胚及び植物をウェル中に得 るために使用されて来た（ＭａｈｅｓｈＩｌｉａｒ　ｉなど１、　”Ｈａｐｌｏ ｉｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｐｏ１ｌｅｎ　Ｇｒａｉｎｓ−Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔ　ａｎ ｄＰｒｏｓｐｅｃｔ’、Ａｎｔｅｒ、Ｊ、Ｂｏｔ、、　１９８２．６９：　８６ ５〜８７９ページを参照のこと）。しかしながら、約培養応答は、種間及び同じ 種の遺伝子型の間で相当に変化する。約培養との全体の応答の比較は、出版され た研究に報告される結果が異なった単位で与えられる場合、困難にされる。たと えば、約培養能力は、分割し始める雄性配偶体の誘発、罰当たり生成される胚及 び／又はカルスの数、少なくとも１つの胚及び／又はカルスを生成する豹の百分 率、再生される半数体植物の数及び回収される二倍の半数体植物の数により定義 されて来た。

比較的急速な進歩がいくつかの種に創造されて来たが、不運なことに、トウモロ コシは、検出でき又は有意な約培養能力を示していない。

約培養性トウモロコシを開発することに多くの興味が存在するが、トウモロコシ における有意な約培養能力を定める記載は存在していない。一般的に、約培養の 使用における主要問題は、比較的低い応答頻度及び植物再生及びほとんど少ない 遺伝子型における染色体二倍体化に関係する困難性である。

トウモロコシ配偶体からの半数体植物の生成の報告は１９７５年にさかのぼるが （Ｋｕなど０、ｌ９７８）、応答頻度は非常に低かった（典型的には、培養され た１００個の罰当たり１〜２個以下の胚）　ｏ　Ｎ１ｔｓｃｈなど−、”Ｐｒｏ ｄｕｃｔｉｏｎｏｆ　Ｈａｐｌｏｉｄ　Ｐｌａｎｔｓ　Ｚｅａ　ｍａｙｓ　ａｎ ｄ　Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ　ｔｈｒｏｕｇｈ　Ａｎｄ−ｒｏｇｅｎｅｓｉｓ’、 Ｉｎ　ＥＤ　Ｅａｒｌｅ、　Ｙ、Ｄｅｍａｒｌｅｙ（版）　Ｖａｒｉａｂｉｌｉ ｔｙ　１ｎＰｌａｎｔｓ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｔｉ５ｓｕｅ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ｐｒａｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉ−ｓｈｅｒｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ、１９８２．　６９〜９１ページ；　Ｇｅｎｏｖｅｓｉ　ａｎｄ　Ｃｏ１−１ ｉｎｓ　（１９８２）　Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉ、　２２：　１１３７〜１１４４；及 びＰｅｔｏｌｉｎｏ　ａｎｄＪｏｎｅｓ、　”Ａｎｔｈｅｒ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　 ｏｆ　Ｂ１１ｔｅ　Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　Ｍａｉｚｅ’。

（１９８６）　Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉ、　２６　：　１０７２〜１０７４を参照のこ と。

相当量の遺伝子型スクリーニングの後でさえ、応答頻度は、はとんどの遺伝子型 において検出できず、そしていづれかの応答を示すものにおいてもひじょうに低 かった。Ｋｕなど０、”Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｍｏｒ ｐｈｏｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆ　Ｐｏ１ ｌｅｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｐｌａｎｔｓ　ｉｎ　Ｍａｉｚｅ”、（Ｚｅａ　ｍａ ｙｓ　Ｌ、）　ＰｒｏｃＳｙｍｐ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　（：ａｌｔ、、 （１９７ｇ）　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｐｅｋｉｎｇ。

３５′４２ページ；　Ｇｅｎｕｖｅｓｉなど０、”Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｐｒｏｄ ｕｃｔｉｏｎ　ｏｆＨａｐｌｏｉｄ　ｐｌａｎｔｓ　ｏｆ　Ｃｏｒｎ　ｖｉａ　 Ａｎｔｈｅｒ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ’、　Ｃｒｏｐ　５ｃｉｅｎｃｅ。

２２、　１９８２．　１１３７〜１１４４ページ、Ｄｉｅｕ　ａｎｄ　Ｂｅｃｋ ｅｒｔ、１９８６；及びＰｅｔｏｌｉｎｏ　ａｎｄ　Ｊｏｎｅｓ、（１９８６） 、前記を参照のこと。

従って、検出でき又は有意な約培養能力を示すトウモロコシを生成するための方 法の記載はどの文献にも存在しない。

トウモロコシの遺伝子型は、遺伝的要因が同一程度の半数体生成を決定すること において重要であることを示唆する約培養（Ｐｅｔｏｌｉｎｏ　ａｎｄ　Ｊｏｎ ｅｓ　（１９８６）　、前記）へのそれらの従順に関して異なる。商業的な育種 に約培養を用いる試みは、二倍体化された半数体種子回収の全体の効率において 相当の改良を要するであろう。不運には、この特性についての育種は、約培養が アッセイすべきには困難な特性であるので、容易に示されていない。

約培養システムのための誘発頻度（正常な発育からの出発）は、肉眼で見える構 造；たとえば胚又はカルスの出現の頻度（すなわち生存能力）よりもひじょうに 高いことが十分に記録されている。高い誘発及び低い生存能力のこの現象はトウ モロコシの約培養に示されて来た（Ｐｅｓｃｉｔｅｌｌｉ　ａｎｄ　Ｐｅｔｏｌ ｉｎｏ。

さらに、誘発された雄性配偶子の発育停止は、高い約培養応答の達成に重大な制 限を示すことが一般的に認識される（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ　ａｎｄ　Ｄｕｎｗ ｅｌｌ、（１９７７）、Ｉｎ　５ｔｒｅｅｔ　ＨＥ（版）　ＰｌａｎｔＴｉｓｓ ｕｅ　ａｎｄ　Ｃｅ１１　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ １ｉｆｏｒｎｉａ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、２２：３〜２６５ページ；　Ｗｅｎｚｅｌなど、（１９７５ ）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ。

約における空間及び栄養のための雄性配偶子間の競争及びインビトロ選択及び遺 伝的形質転換のための可能性は、単離された雄性配偶体の培養を所望のものにす る。単離された雄性配偶子培養は、豹からの小胞子を除き、そしてそれらをそれ ぞれ培養する。τ−とを包含する３、単離された雄性配偶−Ｆ〜培養は、遊離半 数体細胞の容易（，７利用できる源を提供−づる（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ　ａｎ ｄ　Ｄｕｎｗｅｌｌ、（１９７７＞　、前記を参照のこと）。

しかしながら、単離された雄性配偶１″−培養は、比較的高い約培養応答頻度を 示を遺伝子型を要する３、結果的に、多くの種が単離された雄性配偶子培養に従 かう；−、’：ができることは証明されでいない。

トウモロコシのインビトロ培養からの好結果をもたらす植物再生のほとんどの報 告は、比較的組織化され！、−組ｍｓｉを包含した（Ｈｏｄｇｅｓ、　ＴＫなど 、−１（１９８６）　Ｔｈｅ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆＴｉｓｓｕｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　ｆｏｒ　Ｍａｉｚｅ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ、　Ｉｌｌ　５１１ａ ｎｎｏｎ　ＪＣ。

Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　１１７〜１３３ページを参照のこ々）１．多細胞外植体 、たとえば未成熟胚及び花序は、多くの遺伝子型の胚発牛紹織培養を確立するた めに使用されて来た（　Ｄ　ｕ　ｎ　ｃ　ａ　ｎなと１、（１９８５）　Ｐｌａ ｎｔａ　１６５：　３２２〜３３２を参照のこと）１．原形置体単離に続く、ト ウモロコシ舎の単一体細胞からの植物再生が報告されているが（ＲＩｔ　ａ　ｄ 　ｅ”、、、など、　、（１９８８）　Ｆ３ｉｎｔｅｃｈｔ＋ｏｌｏ５３＋６＝ ５６〜６０を参照のこす）、シかしながら種子は得られ゛こいない。単一の単離 されたプロトプラストから生殖力ある１−ウを参照のこと〕。

１９７７年、Ｎ１ｔｓｃｈは、単離されたｌ−ウ午ｒＪ　ＸＪ　シ小胞子を培養 する試みを報告ｊ、またが、しか１．その結果は予備的であり、そ１．７て出版 さ、ｔ″＋２でいない（Ｎｉｔｓｃｈ（１９７７）　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　ｌ ５ｏｌａｔｅｄおいて、Ｎｉｔ、ｓｃｈはいくつかの細胞株分割の進歩を示すが 、ｊ７か１．胚種構造体（Ｅｌ、Ｓ）又は植物が形成される、−とを決１２で報 告していない４６、商業的なトつ玉−ロコシ育種に利用されるべき高い雄性発生 を示す系統のためには、植物再生及び続く二倍の半数体種子回収が不可欠である 。

従って、特にトウモロコシにおける商業的な育種に惟離された雄性配偶体を使用 する試みは、一般的に雄性発生の全体の効率においで相′憤り改良を必要とする であろう、。

高い約培養能力のための従来の育種遺伝子型及び高く応答する遺伝子型のための 必要条件の組合された回能性がトウモロコシにおけるｔｎ離ざイア、た遺伝子型 培養をひｌ二ように困鮒なものに１−る。

１゛記輪講から見出され得るように、羅′ｉ′／Ｊ：配偶子培養（セ５−法はま だかなり実験的であり、そし、でそれ自体、従来技術からの−・膜化を引き出す ことば回能であ７＞。

驚くべき事には、本発明は、雄性発生を受ける高めら７７、ソこ能力を有する新 規な発芽ブラダ７を生成するコ二キができる方法を提供する。。

本発明が、培養された豹、及び２ｊ培養、単離された雄性配偶体培養及び同様の もののためへのそのような発芽プラズマの使用並びにその遺伝的形質転換から高 められたレベルの半数体及び／又は二倍の半数体形成できるトウモロコシ植物を いかに開発するかは、この時点で従来技術から予測することができない。

１つの観点において、本発明は雄性発生を受ける改良された能力を存する植物の 生成方法を提供し、前記方法は、（１）少なくとも１種のへテロ接合体供与体植 物からの豹を供給し；（２）その供Ｉｊ体植物から得られた豹から、お互い接合 できる少なくとも２種の雄性配偶体由来の植物を＃離し；　（３）Ｆ、集団を生 成するために前記再発生された植物をお互い接で成る。

第２観点において、本発明はＦ２植物又はその子孫を供給し、前記植物は高い約 増殖（ＨＡＣ）遺伝子要因を含み、それによってその植物は、元の供与体植物の 約応答頻度よりも少なくとも２倍高い約培養応答頻度を含む。

第３観点においては、本発明は、（ａ）約培養され得るＨＡＣ遺伝子要因を含む 少なくとも１種の供与体トウモロコシ植物からの少なくとも１種の約から単離さ れた少なくとも１種の雄性配偶体を供給し；そして（ｂ）少なくとも１種のＥＬ Ｓの発生を助成するためにＥＬＳ誘発性培地に前記雄性配偶体をインキュベート する段階を含んで成る方法である。

第４観点において、本発明は、ＥＬＳをインキュベートすることから生成される 少なくとも１種のカルス；ぞのカルスから生成される少なくとも１種の植物；及 び少なくとも１種の植物から生成される少なくとも１種の種子に関する９３第５ 観点においては、本発明は７、ＨＡ　Ｃ遺伝子要因を含む少なくとも１種の単離 された雄性配偶体を供給する。

第６観点においては、本発明はトウモロコシの形質転換方法に関し、前記方法は 、単離された雄性配偶体培養により発生されたトウモロコシの半数体細胞を供給 し７、そして粒子衝撃（ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｂｏｍｂａｆｄｎ＋ｅｎｔ）　、マ イクロインジｆグション及び感染物質から成る群から選択された技法には前記半 数体細胞中に遺伝子物質を挿入することを含んで成る５゜第７観点においては、 本発明はホモ接合条件下でトウモロコシ突然変異体の選択方法に関１２、該方法 は、単離された雄性配偶体培養により発生されたトウモロコシの半数体細胞を用 いてのインビトロスクリーニング及び選択の段階を含んで成る。

第８観点においては、本発明はトウモロコシにおける遺伝子トランスロケーショ ン、置換及び付加系の生成方法に関し７、前記方法は、トウモロコシの種間及び 居間ハイブリッドの単離された雄性配偶体の培養を含んで成る。

定義 本明細書で使用される場合、用語“植物″とは、植物に発芽できる種子；植物細 胞：植物プロトプラスト：植物が再発生され得る植物細胞又は組織培養物：植物 カルス；植物群生：及び植物又は植物の一部、たとえば花、仁、実、穂軸、葉、 外皮、茎及び同様のものにおいて損なわれていない植物細胞を包含する。

“雄性配偶体”とは、トウモロコシの小胞子を含む、生活環の半数体相を意味す る。一般的に、雄性配偶体は次の態様で発生する。有糸分裂及び四分子から放さ れた後、それぞれ個々の小胞子は、細胞体積の１／３〜１／２を占める大きな核 により特徴づけられる。発芽孔が小胞子の拡大の前、出現し、ここで細胞質は細 胞を通して分散される。小胞子が大きくなるにつれて、核は孔近くにとどまり、 そしてより小さくなる。大きな中央の液胞の形成により、核は発芽孔の反対側に 押しつけられ、そして小胞子壁に結合される別々の細胞を組織化する。この細胞 内で、核は拡大し、そして最初の花粉粒の有糸分裂を受ける。初期において、大 きさ的に類似する娘細胞は、元の細胞質内に存在しながら、分化し始める。この 点で、栄養核は、より小さな雄原核に比べてその大きなサイズにより区別され得 る。

栄養核は、花粉粒の反対側に移動する。雄原核は、少量の細胞質と共に、内膜に 結合されるアーチ型状の細胞壁の形成により栄養核から分離される。栄養核のま わりの明確な細胞壁の形成は、移動の間、遅らされるように見える。孔に隣接す る位置に達した後、雄原核に類似する（但しそれよりも大きい）細胞が形成され る。スターチの蓄積が、全孔粉粒が満たされるまでターペタム又は孔側からの進 行を従がえる。次に、雄原細胞が内膜から分離し、丸くなり、そして第２花粉粒 の有糸分裂が生じる栄養細胞の方に移動する。

本発明の目的のために、約培養応答が、胚珠構造体／　１００個の培養された約 （ＥＬＳ／１００個の豹）として測定される。“胚珠構造体”　（ＥＬＳ）とは 、連続成長及び発生及び究極的には植物再発生できる雄性配偶体のくり返しての 分裂から得られる細胞の球状塊状物を意味する。

高い別培養性遺伝子型の創造 ひじょうに驚くべきには、本発明は、いづれかの親の約培養応答頻度よりも２倍 、好ましくは５倍及び最っとも好ましくは１０倍高い、再発生されたＦ２子孫の 約培養応答頻度における増強を提供するであろう。

この結果は予測できない。なぜならば、従来技術は、遺伝的に決定された特徴を 選択基準に合うようにする場合でさえ、従来の育種技法がたった約１０％までの 改良された約培養能力を付与するであろうことを示唆するからである。従来の育 種技法は、約培養に対するそれらの個々の植物の応答に基づく遺伝子型の選択を 示唆した。従来の育種技法は、約培養応答において、かなり有意な非遺伝子型の 植物から植物への変動により遺伝子型内でのサンプルを取る必要性のために、続 く発生において雄性発生を高める実質的な手段でない［Ｐｅｔｏ−１ｉｎｏなど 、　、’５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　Ａｎｔｈｅｒ　（ １’ｕｌｔｕｒｅＲｅｓｐｏｎｓｅ　ｉｎ　Ｍａｉｚｅ”、　Ｔｈｅｏｒ、Ａｐ ｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、、第７６巻、１５７〜１５９ページ（１９８８）　］。従来 の育種技法が本発明を示唆するものでない事実は、トウモロコシ育種及び組織培 養に熟練した職人が、これまで報告された失望する結果を伴って、高い約培養性 トウモロコシの開発のために長年、試みて来た事実である。Ｊｉａｌｉｎ、　” Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　１ｌａｐｌｏｉｄ　Ｃｏｒｎ　ｂｙ　Ａｎｔｈｅｒ　Ｃｕ１ −ｔｕｒｅ″、　Ｈ，Ｈａｎ、Ｗ、Ｈｏｎｇｙｕａｎ（版）　、Ｈａｐｌｏｉｄ ｓ　ｏｆ　Ｈｌｇｈｅｒ　１ｎＶｉｔｒｏ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ 、　Ｂｅｒｌｉｎ、（１９８６）を参照のこと。

ヘテロ接合性植物の遺伝子型は、当業者に既知であるいづれか便利な源から得ら れる。たとえば、植物は、天然において、放任受粉から生じるヘテロ接合体；通 交系の野生関連体：通交系の突然変異体；形質転換された通交系：及び通交系の 交雑の子孫であり、ここでそれぞれは他によって欠失され又は他を補足する１又 は複数の所望する特徴を有する。典型的な交雑は、単一交雑（すなわち２種の通 交系が交配され、Ｆ。

子孫が生成される）、三系交雑（すなわち３種の通交系が交雑される：　Ｃ（Ａ ｘＢ）ｘＣ’Ｊ　）及び複交雑〔すなわち４種の通交系が交雑される：　（Ａｘ Ｂ）ｘ　（ＣｘＤ）　〕。

そのような第１世代ハイブリッドの生成のために適切なトウモロコシ育種技法は 、当業者に良く知られている。そのような技法は、”Ｃｏｒｎ　ａｎｄ　Ｃｏｒ ｎ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ”、　Ｓｐｒａｇｕｅ版９、Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ａｇｒｏｎｏｍｙ、　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ第１８号、 Ｍａｄ　１−ｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　（１９７７）　；　Ｐｏｅｌｈｍ ａｎ、Ｊ」−、”Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｆｉｅ］ｄＣｒｏｐｓ”、　Ｈｅｎｒｙ　 Ｈｏ１ｔ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　（１９５９）；及 びＷｅｌｓｈ、Ｊ、Ｒ，、”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｒｅｅ−ｄｉｎｇ”、　Ｗｉｌｅｙ　（１９８１） に記載されている。これらの開示は引用により本明細書に組込まれる。

好ましくは、親のうち少なくとも１つの親は、農学的に重要な特徴を含む。高い 雄性発生の表現型は下記のように、農学的に重要な植物に移行され得るが、本発 明の方法に直接的に農学的に重要な植物を利用することがより便利である。他の 特徴の存在は、高い雄性発生の表現型を発現する遺伝的要因の移行に影響を及ぼ さないように選択されるべきである。

トウモロコシにおいて、植物の特に好ましい選択は、次の通交系の三系交雑に由 来する：　（Ｈ９９ｘＰＲ１６）ｘＰａ９１゜同系交配された植物を生成するた めの種子は、Ｈｏ１ｄｅｎ’５Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　５ｅｅｄｓ、　Ｗｉｌｌ ｉａｍｓｂｕｒｇ、　ＩＡ、（Ｈ９９及びＰａ９１）及び１１１ｉｎｏｉｓ　Ｆ ｏｕｎｄａｔｉｏｎ　５ｅｅｄ、　Ｔｏｌｏｎｏ、　ＩＬ　（ＦＲ１６）から得 られた。

供与体植物の約培養 この方法の第１段階は、選択された供与体植物から鰐を除くことである。ｉは、 成熟の適切な段階で植物から除かれ得る。一般的に、罰は、それらが成長の初期 の単一核〜後期の複数核段階で小胞子を含む場合に除去されるであろう。好まし くは、トウモロコシ約は、成長の後期の単一核〜初期の複数核段階で植物から除 去される。

朽の成熟度は、植物の定期的なサンプリングにより顕微鏡により決定される。顕 微鏡技法は当業界において良く知られている。一般的に、約成長の段階は、核染 色による処理の後、顕微鏡により容易に決定される。アセトカルミン及びミトラ マイシンが典型的な染料である。

供与体植物からの鰐が取り出された後、第２段階は、約培養能力を発現する遺伝 子型を単離するために細胞培養技法を用いることを包含する。

花序又は取り出された鰐のいづれかは、インビトロ培養の前、予備処理され得る 。異常な成長く誘発）のためｉ、を雄性配置偶体を条件づげするのＩｒ適）グ１ ないづれかの特定の物理的ヌは化学的′Ｔ−備処理技法が使用され得る。好まｊ ２、い予Ｋｉ処理プ）法は、Ｐｅｔｏｌｉｎｏ　ａｎｄ　、Ｊｏｎｅｓ、（１， ９８６）、前記に示されるように、花序又は取り出された！ｊを４・・＝１２℃ の間の温度に暴露することである、。

次に、豹は、異常な成長のため（、Ｘ！、′１づれか適切な技法により培養され 得る。たとえば、Ｉ’ｅｔｏｌｉｎｏ　ａｎｄ　Ｊｏｎｅｓ、（１９８６）、前 記：及びＤｉｅｕ　ａｎｄ　Ｂｅｃｋｅｒｔ、（１９８６）、前記を参照のこと 、。

一般的に、！ｊ培養技法は、基本的塩混合物中で約を培養することを含んで成る 。適切な基本的塩瀬合物は、ＹＰ、Ｎ６゜ＭＪ及びＢ５を含み、これはＰｌａｎ ｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　ａｎｄ　Ｃｅｌ！　Ｃｕ１ｔｕｉ−ｅ（１９７７）　１Ｊｎ ｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｐｒｅｓｓ、口ｅｒｋｅｌｅ ｙ　；及びＣｈｕなど１、（１９７８）　Ｐｒｎｃ、Ｓｙｎ＋ｐ、口ａｎｔ　Ｔ ｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔ−、、５ｃｉｅｎｃｅＰｒｅｓｓ、　Ｐｅｋｉｎｇ、４３ 〜５６ページに教授されており、この教授は引用により本明細書に組込まれる３ 、好ましい基本的塩混合べ・−ジにより教授されているようにし２で使用さｔｈ 、るべきであり、この教授は引用により本明細書に組込まれる。

典型的な炭素源は、スクロ一ス、グルコース及びフルクトースを包含し、そして スクロースが好ましい３．一般的１．″、炭素源は細胞増殖を支持するのに十分 な濃度で存在Ｊ−べきである。好まｌ、　＜は、炭素源は１０−２００ｇ／Ｌの 量で存在するであろう。最っ志も好ましくは、炭素源がスフ【１−スである場合 、炭素源は６０　＝　９０　ｇ　／　Ｌの・頃で存在ずイ）であろう、３一般的 （１、苅は、細胞磯、能（〕球−８め（２，不用欠？３あろ従求のｆｊ〜機成分 る−・含む、１Δ地ｒｐ−Ｑ培養さ４７、るであ−）う１．適切な有１幾成分は 、ビタミン、アミノ酸及びホルー７コ゛／を含むっそのような有機１成分は、５ ｔｒｅｅｔ　（１９７？）　、、　ｉ’ｉ？ｉ記に教浸さイア、る１、典型的な アミ、ノ酸混Ｃ物は、カゼイン加水分解物を含む１．好ましくは、アミ７ノ酸は 、１００へ−１０００ｍｇ／　Ｔ、、、のにで存在４−るであろ・う１．典型的 なホルモンは２，４．５−トリヨード安息谷酸を含む。好ま１〜くは５．ホルモ ンは０．１−０．２■／１−７の量で存在するであろう。

■己１．Ｓ誘発培地の成分は、好まし２くは活性炭Ｉｒ共ＩＪ″混合される。一 般的に、活セＪ炭は、オートクレー・ブ処理の前、ＥＬＳ誘発培地成分と共に添 加される。しかし２なから、活性炭が殺菌される場合、そ、ｔ′７．は、他の成 分がオー　トクレープ処理された後に添加さノ゛１．得る。一般的に１、活性炭 は有害な副生成物を吸＋ｌｙ″Ｊるのに一七分な朱で添加される。好まし２くは 、活性炭は、１〜・１０ｇ／Ｔ、、及び最っとも好ましくは３−７　ｇ　／　Ｌ の量で他の族４分と共に添加される３、活性炭は好゛まし７くは、配偶体とＥ　 Ｌ　Ｓ誘発培地とを接触ずろ前、濾過さイ゛７、る。Ｍｌ性炭は、当業者に知ら れた方法により濾過され得る１、典型的な濾過技法ｉ、！、篩、たＬえばＮａ　 １Ｂｅｎｅ”濾過単位、又はチーブ布を通１７′Ｃ培地を通すことを包含する、 。

好まし、くは、篩は、活性炭を濾過するのに寸・分に小さな孔を有すべきである 。

駆ｊは、Ｅ　Ｉ−Ｓの形成を促進するためにある期間及び温度及び光の強度の適 切な範囲内で培養される。２ｊは好ましくは暗室で＠養され；そして好ましくは ２０〜３０℃、最っとも好ましくは２６−２９℃の温度範囲で培養される。これ らのＥ　Ｌ　Ｓは、通常の二極性又は球状の胚〜複数の突出部のある又は他ｂ、 異常に構成された胚の範囲の種々の形状を有する黄色みがかった白色のものであ る。好ましくは、ＥＬＳは、明確な胚盤及び分裂組織・領域を有するであろう。

追加培養のための適切なＥ　Ｌ　Ｓはそれそ゛れ（Ｌ　５Ｘ１．５ａｕｎの長さ である。

カルス誘発 適切なＥ　Ｌ　Ｓは、Ｅ　Ｔ−、Ｓ誘発培地から除かれ、そし２でカルス誘発培 地に移される。“カルス”とは、組織化された構造体（たとえば根、２葉等）へ の分化を伴わないで、多かれ少なかれ組織化されていない態様で増殖する細胞を 意味する。

ＥＩ、Ｓは、カルスの形成を促進するために、温度及び光度の適切な範囲内でカ ルス誘発培地上で培養される。Ｅ　Ｌ　Ｓは、好ましくは暗室で及び好ましくは ２０〜３２℃、最っとも好ましくは２６〜２９℃の範囲の温度でカルス誘発培地 中において培養される。

本明細書において有用なＥｌ、Ｓ誘発培地成分は、基本的な塩混合物、少なくと もｊ種の炭素源及び少なくとも１種の植物成長ホルモンを含む水性組成物（水成 分は脱イオン化され、そして蒸留される）である。

基本的な塩混合物は、カルス誘発培地の主要成分である。

典型的な基本的塩瀬合物はＹＰ、Ｎ６．ＭＳ及び８５基本的塩を含み、これは５ ｔｒｅｅｔ　（１９７７）　’％前記；及びＣｈｕなど。、（１９７８）、、前 記に教授されでいる。

典型的な炭素源は、スクロース、グルコース及びフルクトースを含め、そし２で スクロースが好ましい。一般的に、炭素源は、細胞増殖を支持するのに十分な濃 度で存在すべきである。好ましくは、炭素源はｌｏ−２００ｇ／Ｌ、の量で存在 するであろう９．最っとも好まし、くけ、炭素源がスクロースである場合、炭素 源は１０〜４０ｇ／Ｌの量で存在するであろう。

一般的に、植物成長ホルモンは、５ｔｒｅｅｔ　（１９７７）　、前記に教授さ れるようにカルス分化を誘発するのにト分な濃度で存在するであろう。好ま（， ７くは、ホルモンは０．１・〜１０ｍｇ／ｌ、の量で存在ずろであろう。典型的 なホルモンは７、ジカムバ、２．４．、Ｄ及びビクロラムを包含する。

−・一般的に、カルス誘発培地は、５ｔｒｅｅｔ、　１．９７７に教授されるよ うに、他の従来の有機成分、たとえばビタミン及びアミノ酸を含むことができる 。典型的なビタミン源はビタミンのＮ６配合物である（Ｋ　ｕ、１．９７８、前 記を参照のこと）。

好ましくは、アミノ酸成分は、カゼイン加水分解物及びＴ、−プロリンを含む。

カルス誘発培地は、好都合には、ゲル化剤を含むであろう。

適切なゲル化剤は、たとえば０．６〜０．８％のレベルでの寒天；０．ｉ〜ｏ、 ２％のレベルでのＧｅ１ｒｉｔｅ；及び０．２〜０．４％のレベルでのアガロー ス（純粋な主成分）を包含する。

フィルター殺菌成分を除いて、カルス誘発培地中の培地は、通常、たとえば１６ ｐｓｉ　（Ｉ　Ｌ　Ｑｘ　１０’　ＫＰａ　）の蒸気を用いてオートクレーブ処 理することによって殺菌される。オートクレーブ処理する前の培地のｐＨは通常 、５．６〜６．０の範囲である。

一般的に、ＥＬＳは、密集した結節状外観を示すまで、カルス誘発培地中で培養 されるであろう。好ましくは、ＥＬＳは、少なくとも約７日及び最っとも好まし くは、１０〜１４日間、カルス誘発培地中で培養される。

確立した後、その密集した結節状カルスは好ましくは、染色体の二倍体化を誘発 するのに十分な量：染色体二倍体化物質に接触せしめられる。“染色体二倍体化 物質”とは、有糸分裂毒物、すなわち有糸分裂を妨害することができる化学物質 を意味する。染色体二倍体化物質の詳細な論議のためには、Ｊｅｎｓｅｎ　（１ ９７４）　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ＤｏｕｂＩｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　 ｉｎ　Ｈａｐｌｏ−ｉｄｓ、Ｉｎ　Ｋ、Ｊ、Ｋａｓｈａ（版）　、Ｈａｐｌｏｌ ｄｓ　ｉｎ　Ｈｉｇｈｅｒ　Ｐｌａｎｔ、　Ｕｎｉ−ｖｅｒｓｉｎｇ　ｏｆ　Ｇ ｕｅｌｐｈ、　１５３〜１９０ページを参照のこと。この教授は、引用により本 明細書に組込まれる。典型的な染色体二倍体化物質は、酸化亜硝酸及びコルヒチ ンを包含する。

植物の再発生 選択されたカルスを、カルス誘発培地から半固体状又は液体再発生培地にそれぞ れ移す。カルスのインキュベーションが、苗の形成を促進するために適切な範囲 の温度及び光力内で行なわれる。

再発生された植物の相互交配 再発生された二倍体の半数体植物の集団を生成した後、その再発生された植物は 、一連のＦ、ハイブリッドを生成するためにランダムに交雑され、そして次に、 そのＦ１ハイブリッドが自家受粉され、遺伝的変動性を有するＦ２集団、すなわ ち隔離集団が生成される。驚くべき事には、Ｆ、集団を生成するために約培養か らの再発生された植物を相互交配し、そしてＦ２集団を生成するために前記Ｆ１ 集団の個々を自家受粉することによって、これらの植物のＦ２子孫は、供与体植 物のめ培養応答よりも少なくとも２倍高い約応答頻度を有する。

再発生された植物を相互交配するための典型的な技法は、単一、三系及び複交配 を包含し：その交配を行なうための技法は、前記に記載されており、そしてそれ を引用により本明細書に組込む。好ましくは、再発生された集団の個々は、いく つかのＦ２集団を創造するためにできるだけ多くの手段で交配されるべきである 。

再発生された植物の相互交配の後、Ｆ２（Ｓｏ）集団にふいて最大の遺伝的変動 性を生成するために隔離集団を創造する。

Ｆ２集団は、Ｆ、集団の個々の自家受粉又は他家受粉により生成される。最大の 遺伝的変動性を生成するために隔離集団を創造するいづれかの方法を用いて、Ｆ ２集団を創造することができる。従って、本発明は、自家受粉により；又は他の 植物、たとえばＦ、集団以外のメンバー又は非応答性植物との交配によりＦ、集 団の個々を受粉することを含んで成り：そしてこれらの植物のＦ２子孫は、供与 体植物の約培養応答よりも２倍高い約応答頻度を有することを提供する。Ｆ４個 体の自家受粉が、Ｆｌの遺伝的変動性を最大にするために好ましい。

隔離集団の遺伝的固定 その後、隔離集団が遺伝的に固定される。一般的に、遺伝的固定は、標準の技法 により達成され得る。

適切な技法は、（１）相互交配された植物の子孫からの豹を供給し、そしてそれ らを約培養にゆだね、又は（２）相互交配された植物の子孫を同系交配すること を包含する。

二倍化された半数体植物を供給するいづれか適切なめ培養技法が使用され得る。

そのような技法は、上記に説明される（Ｄｕｎｗｅｌｌ　（１９８５）　、前記 及びＫｅｌｌｅｒなど、（１９８７）、前記を参照のこと）。

同系交配は、真の育種系又はホモ接合近文系を開発するためにいくつかの世代の 間、調節された自家受粉を包含する。

通交系は、５又はそれ以上の世代（Ｓ、〜Ｓ５）にわたって、自家受粉及び選択 の方法により誘導され、その結果、相同染色体上の遺伝子の対立遺伝子対がホモ 接合性又は同一になる。

多くの世代にわたって自家受粉され、そしてタイプについて選択された植物は、 はとんどすべての遺伝子座でホモ接合性になり、そして真の育種系子孫の均一の 集団を生成する。

系統における同系交配の程度は、世代光たり約５０％の割合に近づき、その結果 、第２世代までに、植物は約７５％ホモ接合性であり、そして第６世代までに、 植物は約９８％ホモ接合性になる。

その後、自家受粉、姉妹受粉又は通交系における他とのランダム交雑に由来する すべての植物は、理論的に、実質的に遺伝的に同一であり、そして従って、実質 的にホモ接合性であり、そして外観上均一であるはずである。

本発明の典型的な態様は、姉妹受粉又は（Ｈ９９ｘＦＲ１６）Ｐａ９１交雑のハ イブリッド植物の約培養により生成される再発生された植物の通交系における他 とのランダム交雑であり、これは下記の実験セクションにより詳細に記載されて いる。その交雑の結果として、トウモロコシの約培養能力を増強する遺伝子要因 がまず同定される。ここで論ぜられる、ＨＡＣ遺伝子要因を含む種子は、Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）、 　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託された。本発明の例に示される ように、ＡＴＣＣに寄託された種子は次の通りである：１３９／３９−０１〜１ ３９／３９−１４（この後、”１３９／　３９−ｂｕ　１　ｋ”と言及する）の ほぼ等しい分布を含む８１種子（ＡＴＣＣ第４０５１９号）の集団は、１９８８ 年１２月１日にＡＴＣＣに寄託された。１３９７３９−０５の個々は、約培養に ゆだねられ、そしてその得られた再発生された植物からの種子、１３９／３９− ＤＨ（ＡＴＣＣ番号４０５２０　）は、１９８８年１２月１日にＡＴＣＣに寄託 された。

ＨＡＣ遺伝子要因は、たとえばＪ、　Ｓ、　Ｂｅｃｋｍａｎ及びＭ、５ｏｌｌｅ ｒ。

Ｒｅ５ｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐ ｈｉｓｍ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅ−ｔｉｃ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔにお いて教授されるように、制限フラグメントの長さの多形性（ＲＦＬＰ）地図を用 いて定義され得る。

Ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、 第３巻、Ｏｘｆｏｒｄ１Ｊｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８６．　１ ９６〜’２５０ベージ；及びＷＯ３４１０４７５８を参照のこと。これらの教授 は引用により本明細書に組込まれる。

１１１０８４１０４７５８は、試験された変種のゲノムフィンガープリントが確 立されるまで、ラベルされたプローブによる制限フラグメントのハイブリダイゼ ーション方法を教授する。同じ手段で確立された、他の個々の植物又は変種のゲ ノムフィンガープリントと確立されたゲノムフィンガープリントとの比較は、個 体又は変種の関連性又は同一性の程度を定義する。

遺伝的類似性の程度を定義するこれらのゲノムフィンガープリントの差異は、制 限フラグメント多形性である。変種における特定の特性の存在とコンピューター 分析による個々の単離物のフィンガープリントとの間の比較は、プローブとして 使用されるランダムクローンが対象の遺伝子に結合されることを示唆するであろ う。

ＲＦＬＰ地図を用いる場合、トウモロコシにおけるＨＡＣ遺伝子要因の染色体位 置は、過度な実験を伴わないで当業者により決定できる。従って、ＨＡＣ遺伝子 要因の染色体位置が与えられる場合、トウモロコシの発芽プラズマは、ＨＡＣ遺 伝子要因の存在又は不在を決定するために、通常、ＲＦＬＰ地図を付与され得る 。

しかしながら、本発明の１つの観点が再発生された植物の相互交配する集団に向 けられる場合、本発明は、ＡＴＣＣに寄託される典型的な集団、すなわちＨＡＣ 遺伝子要因を有するこれらの個体に限定されない。方法及び植物が、雄性配偶体 培養、カルス培養、植物組織培養、植物組織、植物及び培養能力を発現し、そし てこの特徴を子孫に遺伝的に伝達する種子を生成するために提供される。

しかしながら、ＨＡＣ遺伝子要因の使用は、それが安定しており、そして多くの 世代にわたって子孫に伝達され得ることが示されているので、好ましい。ＨＡＣ 遺伝子要因は、一連の通交系が相互交配される場合、その系統の平均値が与えら れた交雑の応答を予測するために使用され得るようなものである。これは通常、 付加遺伝子効果及びそれらの相互作用の機能である。これは、トウモロコシにお ける量的に遺伝された特徴の典型である（すなわち１つ以上の遺伝子の相互作用 を包含する）。しかしながら、個々のハイブリッドは、それらの親の平均的性能 からそれることができる。従って、エビスタシスの優勢又は優勢タイプがまた、 約培養応答において役割を演じることができる。

ＨＡＣ遺伝子要因及び効果的に相同のその誘導体は、他の所望する特徴を有する 通交及びヘテロ性トウモロコシ植物の両者の雄性発生を受ける能力を高めること ができる。“効果的に相同の誘導体″とは、変異体、変性体及びＨＡＣ遺伝子要 因のヌクレオチド又はアミノ酸配列に機能的に同等である突然変異体を包含する ことを意味する。従って、この開示においては、少々の配列の変化が相同配列内 に存在することができ、そして少なくとも８０％の相同性を示すいづれかの配列 は、相同セグメント又は相同遺伝子が植物、すなわちＦ２植物又はそれらの子孫 、すなわち元の供与体植物の雄性配偶体培養応答よりも２倍高い雄性配偶体培養 応答頻度を有する植物に独得の表現型を生成する場合、機能的に同等であると思 われることが理解されるであろう。相同は、２種の配列（等しくない長さ）が整 合された後、適合する塩基（又はアミノ酸）の分率又は百分率で現わされる。用 語、整合は、Ｔｈｅ　Ｔｉｍｅ　Ｗａｒｐｓ、　Ｓｔｒｉｎｇ　Ｅｄｉｔｓ、　 ａｎｄ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　：　ＴｈｅＴｈｅｏｒｙ　ａｎｄ　Ｐ ｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ、　Ａｄｄｉ ｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ、　Ｒｅａｄｉｎｇ、　ＭＡ、　（１９８３）の本のチャ プター１において５ａｎｋｏｆｆ及びＫｒｕｓｋａｌにより定義される意味で使 用される。

概略的には、２種の配列は、最大のオーバーラツプを引き起こすようにいづれか の配列中への最少数の“ブランク”又は“ヌル”塩基の挿入により２種の配列間 の適合塩基（又はアミノ酸）の数を最大にすることによって整合される。

当業者は、現在開示される発明、すなわちＨＡＣ遺伝子要因の結果として、ＨＡ Ｃ遺伝子要因の源は無関係であることを認めるであろう。ＨＡＣ遺伝子要因又は の要因に由来する効果的に相同のＤＮＡ配列を供給するＤＮＡのいづれかの源は 、当業者の手段内である。

すべての又は一部のＨＡＣ遺伝子要因の遺伝子から製造された一連のプローブは 、未知の植物、特にトウモロコシ植物の相同遺伝子又は遺伝子セグメントを効果 的に見出すために使用され得る。特定のＤＮＡ配列の相同性は、当業界において 十分に理解されるような滋重な条件下で核酸の交差ハイブリダイゼーションの試 験を用いて、当業者により同定され得ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、口 Ｋ　（１９８５）に記載される〕。２種の配列が与えられる場合、それらの相同 性を計算するためには、アルゴリズムが利用できる　（Ｎｅｅｄｌｅｈａｍ　ａ ｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ、　Ｊ」ｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、４８．　４４３〜４５３　（１９７０）；及び５ａｎｋｏｆｆ　ａ ｎｄ　Ｋｒｕｓｋａｌ（上記で引用された）２３〜２９ページを参照のこと）。

ＨＡＣ遺伝子要因を含む種子はＡＴＣＣに寄託されているので、当業者は、ＨＡ Ｃ遺伝子要因が、適切な読み取り枠が維持される場合、付加、欠失又は限定され た数の種々のヌクレオチドの非保存的置換又は多くのヌクレオチドの保存的置換 により変性され得ることを理解するであろう。置換、欠失又は挿入が、最終構成 体に達するために組合され得る。付加、欠失及び置換のだめの典型的な技法は、 オリゴヌクレオチド介在の、特定部位突然変異誘発及びポリマラーゼ鎖反応を包 含する。

オリゴヌクレオチド介在の特定部位突然変異誘発は、本質的に、突然変異される べき領域を含む一本鎖ＤＮＡにより所望する突然変異をコードするオリゴヌクレ オチドをハイブリダイズし、そして突然変異を含む鎖を生成するためにオリゴヌ クレオチドの拡張のための鋳型として前記一本鎖を用いることを包含する。この 技法は、種々の形で、Ｚｏｌｌｅｒ、Ｍ、Ｊ、　ａｎｄＳｍｉｔｈ、Ｍ、、　Ｎ ｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１０　：　６４ｇ７〜６５００　（１９８２）　 ；　Ｎｏｒｒｉｓ。

ＫｌＮｏｒｒｉｓ、Ｆ−、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ、Ｌ、　ａｎｄ　Ｐｉｉｉ 、Ｎ、、　Ｎｕｃ、Ａｃｉｄｓ記載される。

ポリマラーゼ鎖反応は、本質的に、配列特異的オリゴヌクレオチドを用いてイン ビトロでＤＮＡを指数的に増幅することを包含する。オリゴヌクレオチドは、所 望により、配列変更を受けることができる。ポリマラーゼ鎖反応技法は、Ｍｕｌ ｌｉｓａｎｄ　Ｆａｌｏｏｎａ、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、　１５５．３３５〜３５０ 　（１９８７）に記載される。ＰＣＲを用いての突然変異誘発の例は、ｔｌｉｇ ｈｃｈｉなど０、ｔｉｏｎ　Ｇｅｎｅｓ　Ｗｈｉｔｈｏｕｔ　ｔｈｅ　Ｌｌｓｅ 　ｏｆ　Ｒｅ５ｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　：Ｇｅｎｅ　Ｓｐｌｉｃｉ ｎｇ　ｂｙ　０ｖｅｒｌａｐ　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ”、　Ｈｏｒｔｏｎなど１、 上記のようにして生成された植物が、上記に教授される技法により、続く約培養 に使用され得る。しかしながら、本発明はまた、インビトロ培養され、そして植 物に再発生されるために十分に適切である単離された雄性配偶体を供給する。

単離された雄性配偶体は、ＨＡＣを含むいづれかの約培養性遺伝子型から得られ る。

単離された雄性配偶体のインビトロ培養の原理は、ＥＬＳ及び／又はカルス形成 をもたらす異常な経路；すなわち胞子体経路に正常な発育を向けるために豹から 雄性配偶体を除くことである。ＥＬＳ及び／又はカルスは、胞子体相において配 偶子数の染色体を担持する半数体であることが予測される。

従って、半数体植物の染色体が二倍にされる場合、その得られた植物はホモ接合 性であろう。

植物が選択された後、その花序を収穫し、そして前処理する。花序の前処理の好 ましい技法は、Ｐｅｔｏｌｉｎｏ　ａｎｄ　Ｊｏｎｅｓ（１９８６）前記に示さ れる １つの態様にふいて、雄性配偶体は、発生の初期単核段階〜後期複数校段階から の鰐から除かれ得る。好ましくは、雄性配偶体は、発生の後期単核段階〜初期複 数校段階の間で除かれるであろう。雄性配偶体の熟成度は、植物を定期的にサン プリングすることによって、上記のようにして顕微鏡により決定される。

雄性配偶体は、適切な技法により豹から除かれ得る。適切な技法は、ＥＬＳ誘発 培地への雄性配偶体の機械的な除去又は裂開を包含する。

一般的に、雄性配偶体の機械的除去は、Ｒ，Ｌｉｃｈｔｅｒ　（１９８２）Ｚ、 　Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ、１０５　：　４２７〜４３４に示されるよ うにメツシュスクリーンを通して朽を通すことによって；又はＳｗａｎｓｏｎな ど、　、（１９８７）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ、６　：　９４ 〜９７に示されるようにマイクロブレンドすることによって達成され得る。

雄性配偶体の機械的除去のための特に好ましい技法は、市販の実験室用ブレンダ ー及び特殊化されたブレンド付属物を用いて取り出された朽をブレンドすること を含んで成る。類似する方法は、Ｃｏｕｍａｎｓなど８、′門ａｎｔ　Ｄｅｖｅ ｌｏｐｍｅｎｔ　ｆｒｏｎ＋ｌ５ｏｌａｔｅｄ　Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅｓ　ｏｆ 　Ｚｅａ　Ｍａｙｓ　Ｌ、　”、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ。

７、１９８９．６１８〜６２１ページに記載されている。この例においては、全 花序セグメントがブレンドされた。

この態様において、単離方法は、取り出された豹をブレンドすることから成る。

単一の単離は、ＥＬＳ誘発誘発培地４０〜６０出Ｌに適切なブレンド付属物（好 ましくは１１０ｍＬのＷａｒｉｎｇ　ＭＣ−２）中に１５０〜３００個の豹を配 置することから成った。その容器は、市販の実験室用ブレングー上に置かれ、そ して５〜１５秒間ブレンドされる。これは、配偶体及び適切な大きさ、好ましく は１００〜１２０μｍの篩を通される豹の壁材料のスラリーを形成する。単離さ れた配偶体はその篩を通過し、そして次に１１０００ＲＰで５分間の遠心分離を 通して集められ、そして適切な密度、好ましくは６０００〜１５０００個の配偶 体／ｒｎ１．でＥＬＳ誘発培地中に置かれる。

本発明はまた、生存する雄性配偶体が、培養の前又は培養の初めの７日間、分離 され得る方法を提供する。雄性配偶体の集団は、豹内で又は単離された培養物に おいて、生存性及び非生存性細胞から成る。生存細胞の濃縮は、遺伝子操作のた めに使用される単離された培養物において特に有益である。

次に、形質転換の努力が生存する雄性配偶体上に集中され、それによって好結果 をもたらす遺伝子のトランスファー及び植物回収の機会を高める。死んだ小胞子 の除去はまた、発生するＥＬＳのための成長条件を改良する。

生存する雄性配偶体を集める技法の１つの例は、不連続密度グラジェントの使用 である。ここで使用されるグラジェント媒体は、ＥＬＳ誘発培地の密度よりも高 い密度を有するいづれかの適切な材料、たとえばスクロース、Ｆｉｃｏｌｌ又は Ｐｅｔｃｏｌｌ　（好ましくはＰｅｔｃｏｌｌ）から成る。

グラジェント材料の濃度は、８０％のＥＬＳ誘発培地と共に、１０〜３０％、好 ましくは２０％であるべきである。この溶液３〜５ｒｎｌが、遠心分離管（好ま しくは１０−の大きさ）に置かれ、そして５００，０００〜１，０００，０００ 個の単離された雄性配偶体の濃溶液１−と共に混合される。純粋なＥＬＳ誘発培 地が雄性配偶体／Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液の上部に積層され、そしてＰｅ　ｒ　ｃ　 ｏ　１１／ＥＬＳ誘発培地の界面で雄性配偶体のバンドを形成するのに有効なｒ ｐｍで及び時間、遠心分離され、ここで他の雄性配偶体は管の底でペレットとし て得られる。一般的に、その溶液は、５００〜１５００ｒｐｍで２〜１０分間、 好ましくは１１０００ｒｐで５分間遠心分離される。上方のバンドは、雄性配偶 体くこの５０〜８０％は生存する）の約３０〜７０％を保持する。低部のペレッ トは典型的には、０〜２％の生存する雄性配偶体を含む。

一般的に、裂開は、液体培養培地中への雄性配偶体の脱落を含んで成る。液体培 地上に浮遊する朽はたぶん、条件づけ因子を生成し、そしてそれらを培地中に開 放する（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄなど、　（１９７７）　Ｎａｔｕｒｅ　２７０　 ：　２３６〜２３８を参照のこと）。

さらに、単離された雄性配偶体はプロトプラストに転換され得る。“プロトプラ スト”とは、細胞壁を有さない植物細胞を意味する。トウモロコシのプロトプラ ストを生成するための適切な技法は、ＥＰ　０２９２４３５に示されている。一 般的に、その文献は、細胞壁を除去する酵素調製物と共に細胞をインキュベート することを教授する。適切な酵素調製物は、当業界において既知である。本発明 の目的のためには、用語“雄性配偶体”とは、そのプロトプラストを包含するこ とを意図単離された雄性配偶体は、ＥＬＳ誘発培地上で及び上記のように、酌を 培養するために使用される条件と実質的に同じ条件下で培養され得る。

本発明はまた、発生するＥＬＳが、培養開始後、３〜２８日の範囲の発生の段階 で分離され得る方法を提供する。発生のより早い段階が遺伝子形質転換への使用 のために好ましい。

ＥＬＳの分離は、発生を最っとも続けがちであるそれらのＥＬＳを単離すること によって、遺伝子トランスファー及び植物回収の効率を高める。死んだ雄性配偶 体の除去は、また、発生するＥＬＳのための成長条件を改良する。

誘発された雄性配偶体は、７４〜１５０μｍの範囲のメツシュサイズを有する篩 に液体培養物を通すことによって、誘発されていない又は死んだ個体から分離さ れ得る。誘発された雄性配偶体は、誘発されていない個体よりもわずかに大きく 、そして篩により保持される。次に、それらはＥＬＳ誘発培地中に移される。こ の分離は、８８μｍのメツシュサイズを用いて、３〜１０日、好ましくは７日で 行なわれ得る。

１０日以上のＥＬＳはまた、８８〜１５０μｍの範囲のメツシュサイズを用いて 分離され得る。

カルス誘発 選択されたＥＬＳはＥＬＳ誘発培地から除かれ、そして上記のようにカルス誘発 培地に移される。

植物の再生 選択されたカルスは、上記のように、カルス誘発培地から、半固体又は液体再生 培地にそれぞれ移される。

植物再生培地から、苗が、たとえば温室又は野外において土壌又はハチ植用培地 に植えられ、そして周囲の通常の成長条件下で、その苗は、完全な生殖可能な植 物に戊長し、そして花が咲き、そして種子を生む。

最後に、種子は回収され、追加の植物の再生を提供し、これから種子がまた回収 され得る。種子は、上記のように成長された植物から又はその子孫から、種子の さやを収穫し、そしてそれから種子を手により又は脱穀機又はコンバインを用い ることによって分離することによって植物から回収する。

後植物再生段階は、従来の植物耕作技法により容易に行な選択的育種による改良 は、制限された数の植物の世代がそれぞれの年に成長されるので、比較的遅い。

従って、植物の改良は、数年の重労働の後でのみ得られて来た。

伝統的な植物育種の重要な目的は、収穫植物として価値ある改良された植物を作 り出すことである。

高いペテロ接合性の他家受粉性作物、たとえばトウモロコシにおいて、約培養を 通して生成される半数体が、ハイブリッド栽培変種植物発生において親として働 くことができる純粋な育種系を生成する急速な方法を創造する。Ｆ、供与体植物 からの半数体の生成は、ブリーターが所望する遺伝子組換え体を効果的に選択す ることを可能にする。ホモ接合系は急速に利用できるようになされ得るので、５ ０％までの時間の節約が、新規の栽培変種植物を開発するのに達成され得る。

半数体の使用は、細胞生物学研究において多くの可能性ある用途を有する。１つ の用途は、半数体細胞を用いてのインビトロスクリーニング及び選択であり、そ してホモ接合条件下で突然変異体を得ることである。半数体の他の適用は、種間 雑種及び風聞雑種の単離された雄性配偶体の培養を通して、所望する遺伝子のト ランスローケーション、置換及び付加系の生成である。半数体及びこの後、ホモ 接合系の生成は、まれな遺伝子型、たとえば劣性特性を有するものを選択するた めに、及び交雑の新規組合せにそれらを包含するために有意な方法論である。

約培養能力のトランスファ一 本発明の方法は、鰐において又はそれから単離された雄性配偶体（インビトロで 胚形成を受けることができる）を有するトウモロコシ植物を生成するための手段 を提供する。

本発明は、選択的に子孫に導入され得る遺伝的に伝達される高い約培養能力（Ｈ ＡＣ）特性を供給する。従って、伝統的な有性技法（たとえば育種）又は無性技 法（たとえばインビトロ方法）又は両者の組合せは、他の植物、たとえば商業的 に重要な系統にＨＡＣ遺伝子要因をトランスファーするために使用され得る。

有性技法 植物育種において、高められた約培養能力を有する遺伝的に固定された種類を得 た後、卓越したハイブリッド及び通交系の生成を可能にするであろう育種プログ ラムに親として高められた約培養能力を有する種類を用いることが所望される。

ＨＡＣ遺伝子要因を含むいづれかの植物が、他の通交系及びハイブリッドを発生 せしめるために育種株として使用され得る。特に、トウモロコシにおいては、Ｈ ＡＣ遺伝子要因は、他の所望する特徴を有するトウモロコシ近文系及びハイブリ ッド及びトウモロコシのすべての亜種、特にプントコーン（ｄｅｎｔ　ｃｏｒｎ ）、フリントコーン（ｆｌｉｎｔ　ｃｏｒｎ）　、ソフト又はフラワーコーン（ ｓｏｆｔ　ｏｒ　ｆｌｏｗｅｒ　ｃｏｒｎ）、スウィートコーン（ｓｗｅｅｔ　 ｃｏｒｎ）　、ボッドコーン（ｐａｄ　ｃｏｒｎ）及びポツプコーン（ｐｏｐ　 ｃｏｒｎ）中に容易に導入され得る。ＨＡＣ遺伝子要因を含む親と他の親との間 の交雑から形成されるハイブリッドは、親の約培養応答頻度の平均に近い約頻度 応答を有するであろう。

結果的に、他の遺伝子要因又は要因の組合せを有する異なった株は、高められた 約培養能力を有するハイブリッドを生成するために改良された約培養能力を有す る同じ種の株と交雑され得る。そのような交雑技法は、当業界において良く知ら れており、そして上記で詳細に説明された。便利には、約培養能力のトランスフ ァーは、血統育種又は戻し交雑育種（再発性選択育種）により達成される。

血統育種は、２種の遺伝子型の交雑により開始し、それぞれは、他に欠失してい るか又は他の補足する１又は複数の所望する特徴を有する。血統方法において、 卓越するＦ２植物が連続する世代において自給され、そして選択される。続く世 代においては、ヘテロ接合条件が、自家受粉及び選択の結果として相同系に負け る（典型的には５又はそれ以上の世代において）。その方法は、Ｆ、、Ｆ２．Ｆ 、等の集団の罰培養により変性され得る。

戻し交雑育種は、たとえば卓越した通交系（再発性態）と約培養能力の遺伝的に 伝達された特性を担持する供与体通交系（非再発性親）とをまず交雑することに よって達成され得る。次に、この交雑のＦ１子孫が卓越した再発性態に戻し交配 され、続いてその非再発性親からトランスファーされる所望する特徴のために得 られた子孫が選択される。所望する特徴のための選択を伴っての５回又はそれ以 上の戻し交雑の後、その子孫は、トランスファーされる特徴を調節する遺伝子座 のためにヘテロ接合性であるが、しかしほとんどすべての他の遺伝子のために卓 越した親のようであろう。この方法は、たとえばＦ、、Ｆ２．Ｆ、集団の豹培養 により変性され得る。

広範囲の所望する特徴を示す多くのホモ接合系が生成された後、多くの又はすべ ての同定される特性において卓越する実験的なハイブリッドが、生成され得る。

そのような最適な組合せが決定された後、親の系統が増加せしめられ、そして多 量の保存用種子が良く知られた手段により生成される。

無性技法 伝統的な植物育種のもう１つの又は補足的な手段として、科学者は、遺伝子工学 技法を通して植物の形質転換への研究を行なって来た。約培養のさらに追加の利 益は、遺伝子工学技法を通して半数体トウモロコシを形質転換する能力に存在す る。トウモロコシの形質転換における進歩は、現在利用できる遺伝子トランスフ ァーシステムの制限により限定されて来た。高められた雄性発生を提供するｒＤ ＮＡ（組換えＤＮＡ）の送出しのための典型的な技法は、マイクロインジェクシ ョン（Ｃｒｏｓｓｗａｙなど、　Ｍｏｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、　２０２：　 １７９〜１８５を参照のこと）又は遺伝子ガン技法（Ｋｌｅｉｎなど０、Ｂｉｏ ｔｅｃ！ｔ　６：５５９〜５６３を参照のこと）を包含する。

生存細胞中に生物学的物質を導入するための従来の技法は、粒子衝撃技法、マイ クロインジェクション機構、感染物質及びプロトプラストの形質転換のための技 法（たとえばエレクトロポレーション、摂取機構及び融合）を包含する。これら の技法は、染色体の二倍体化に基づいて、ｒＤＮＡのために植物ホモ接合性を供 給する。

最近、粒子衝撃を通して損なわれていない組織の細胞中に物質を送出すための技 法が開発されて来た。

１つの粒子衝撃装置は、例セクションに示されいる。

他の粒子衝撃技法は、旧ｇｈ−ｖｅｌｏｃｉｔｙ　Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉ ｌｅｓｆｏｒ　Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　１ｎｔｏ 　Ｌｉｖｉｎｇ　Ｃｅ１ｌｓ　（１９ｇ？）。

Ｔ６Ｍ、Ｋｌｅｉｎ、　Ｅ、Ｄ、Ｗａｌｆ、　Ｒ，Ｎｕ　ａｎｄ　Ｊ、Ｃ，５ａ ｎｆｏｒｄ、Ｎａｔｕｒｅ、　３３７；及びＤｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆ　５ｕｂｓ ｔａｎｃｅｓ　１ｎｔｏ　Ｃｅ１ｌ　ａｎｄ　Ｔｉ５ｓｕｅｓ　ｕｓｉｎｇａ　 Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　Ｐｒｏｃｅｓｓ、　Ｊ、Ｃ，５ａ ｎｆｏｒｄ、　Ｔ、Ｍ、Ｋｌｅｉｎ。

Ｅ、Ｄｌｗａｉｆ　ａｎｄ　Ｎ、ＡＩ］ｅｎ、　Ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ　Ｓｃｉ 、ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌ、、　５：２７〜３７に示される。これらの文献は、 小さな高密度のタングステン粒子（マイクロインジェクト物質）の促進が次の態 様を通して高速にされることを教授する：　（１）マイクロインジェクト物質（ プラスチック弾）及び停止プレート、（２）トランスファーされた機械的パルス 、（３）気体（たとえば空気）放出、及び請求心性加速システム。

さらに第３の装置はＨＰ　０２７０３５６に示される。一般的に、この文献は、 次のものを含んで成ることを特徴とする、生存細胞中にＤＮＡ担持キャリヤー粒 子を注入するだめの装置を教授する：火花放電チャンバー：その火花放電チャン バー中に延びる２つの電極、前記電極は高電圧放電の外部源に結合するために適 合されており：前記火花放電チャンバー上に一定間隔で維持されるキャリヤーシ ート、前記キャリヤーシートはその上にキャリヤー粒子を受け；前記キャリヤー シート上の場所に固定される保持スクリーン；及びキャリヤー粒子が標的表面上 で細胞中に促進されるように、火花放電チャンバーにおいて衝撃波を生成する火 花放電がキャリヤーシートを保持スクリーンに促進するように保持スクリーン上 に一定間隔で維持され、そして細胞を担持する標的表面。

他の技法は、マイクロインジェクションによる染色体のトランスファーのための 直接的な方法である。マイクロインジェクション技法の一般的な論議のためには 、次のものを参照のこと：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔ ｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ 、　（１９７３）、　Ｅ、Ｇ、Ｄｉａｃｕ＋ｎａｋｏｓ、　Ｉｎ　ＩＪｅｔｈｏ ｄｓ　１ｎ２８７〜３１１ベージ；　Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔ ｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｅ１ｌｓ（１９７３）、Ｍ、Ｇｒａｅｓｓ＋ｎ ａｎ　ａｎｄ　Ａ、Ｇｒａｅｓｓｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎｚｙ−ｍ ＯＩＯｇｙ、１０１：　４８２−４９２；　Ｃｒｏｓｓｗａｙ　Ａ、’、０ａｋ ｅｓ　Ｊ、Ｖ、、ＩｒｖｉｎｅＪ、Ｍ、、Ｗａｒｄ　Ｂ、、Ｋｎａｕｆ　Ｖ、Ｃ ，、Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ　Ｃ９に、　（１９８６）、Ｉｎｔｃ４−ｒａｔｉｏｎ 　ｏｆ　Ｆｏｒｅｉｇｎ　ＤＮＡ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃ ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｏｂａ−ｃｃｏ　Ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓ ｔｓ、Ｍｏｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、２０２：　１７９−１８５；　Ｃｒｏｓ ｓｗａｙ　Ａ、、Ｈａｕｐｔｌｉ　Ｈ，、Ｈｏｕｏｋ　Ｃ，Ｍ、、Ｉｒｖｉｎｅ 　ＪｏＭ、。

０ａｋｅｓ　ＪＪ、、　Ｐｅｒａｎｉ　Ｌ、Ａ−（１９８６）、　Ｍｉｃｒｏｍ ａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈ−ｎｉｑｕｅｓ　ｊｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏ ｔｅｃｂｎｏｌｏｇｙ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４：　３２０−３３４； 　Ｒｅ１ｃｈ　Ｔ、、Ｊ、、　Ｉｙｅｒ　Ｖ、Ｎ、、　５ｃｏｂｌｅ　Ｂ、、　 Ｍｉｋｉ　Ｂ、Ｌ、　（１９８６）。

Ａ　Ｄｅｔａｉｌｅｄ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｒａｎｕ ｃｌｅａｒ　Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃ−ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｏ ｐｌａｓｔｓ、Ｃａｎ０．ＬＢｏｔ、　；及びＲｅ１ｃｈ　Ｔ−Ｊ、。

ＩｙｅｒＶ−Ｎ、、Ｍｉｋｉ　Ｂ、［、−（１９８６）、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　 Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆＡｌｆａｌｆａ　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ 　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｒａｎｕｃｌｅａｒ　Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏ ｆ　Ｔｉ　Ｐｌａｓｍｉｄｓ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４　：　１００ １−１００４゜上記システムの他に、核酸を細胞中に送出すことができるいくつ かの感染物質が存在する。双子葉類植物細胞のためのアグロバクテリウム（Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）ベクター［：ＧｅｎｅｔｉｃＴｒａｎｓｆｏｒｍａ ｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｈｉｇｈｅｒ　Ｐｌａｎｔｓ　（１９８６）、　Ｒ，Ｔ、Ｆｒ ａｌｅｙ、　Ｓ−Ｇ、　Ｒｏｇｅｒｓ、及びＲ，Ｂ、Ｈｏｒｓｃｈ、　ＣＲＣＣ ｒ１ｔ、Ｒｅｖ、Ｐｌａｎｔ　５ａｃ−、４：１〜４６〕：及び動物細胞のため のレトロウィルスベクター［Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ ａｐｙ　（１９８４）、　Ｆ、ＷＪｎｄｅｒｓｏｎ。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２２６：　４０１〜４０９　］が、主に重要なものである。

レトロウィルス（ＲＮＡウィルス）は、動物細胞中に遺伝子を送り出すために使 用され得る。ウィルスが細胞中に入る場合、そのＲＮＡが宿主細胞のゲノム中に 組込むであろう相補的ＤＮＡの逆転写のための鋳型として作用する。このＤＮＡ は単離され、そしてプラスミド中に挿入され得る。付加される追加の遺伝子を有 するこのプラスミドを用いて、ヘルパーレトロウィルスの助けにより細胞を形質 転換することができる。

エレクトロポレーションは、細胞及びそれから単離されたプロトプラスト中に種 々の分子を、短い高電圧の電気的パルスにそれらをゆだねることによって導入す るための方法である。エレクトロポレーションの一般的な論議のためには次のも のを参照のこと：　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｕｋａｒｙｏｔ ｅｓ　ａｎｄＰｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ：　Ａ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ａｐｐｒｏａｃ ｈ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌ ｅｓ　１ｎｔｏ　Ｃｅ１ｌｓ、　（１９８８）、Ｋ、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ　ａｎ ｄ　Ｗｊ−Ｄｏｗｅｒ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６　：　７４２；　Ｈ ｉｇｈ−ｖｏｌｔａｇｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏ−ｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｔ ｅｒｉａ　：　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｍ ｐｙｌｏ−ｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ　ｗｉｔｈ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ、 （１９８８）、　Ｊ、Ｃ０Ｍ１ｌｌｅｒ、　Ｗ。

Ｊ、Ｄｏｗｅｒ、　Ｌ、Ｓ、Ｔｏｍｋｉｎｓ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８５：８５６−８６０　；及びＡ　Ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ 　Ｒａｐｉｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｔｉｃｓ　Ｔｒａｎ−ｓｆｏｒｍ ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌａｃｔｉｃ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ　ｂｙ　Ｅｌｅｃ ｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ。

（１９８８）、　１．Ｇ、Ｐｏｗｅｌｌ、　Ｍ、Ｇ、Ａｃｈｅｎ、　Ａ、Ｊ、Ｈ ｉｌｌｉｅｒ、　Ｂ、Ｅ、Ｄａｖｉｄ−ｓｏｎ、　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　５４：　６５５−６６０゜摂取のための１つの技法は 、カルシウム（Ｃａ　）　（ＣａｌｃｉｕｍＤｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｐｈａｇｅ　ＤＮＡ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　（１９７２）、Ｍ９Ｍａｎｄｅ ｌａｎｄ　Ａ、Ｈｉｇａ、　Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、、　５３：　１５９〜１６ ２）　；及び温度ショック（Ｆｒｏｚｅｎ−ｔｈａｗｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａ　 ａｓ　Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ　ｏｆ　ＩｓｏｌａｔｅｄＣｏｌｉｐｈａｇｅ　Ｄ ＮＡ　（１９７２）、Ｓ、Ｙ、Ｄｉｔｙａｔｋｉｎ、ＫＪ、Ｌｉ５ｏｖｓＫａｙ ａ、Ｎ。

ＮＪａｎｚｈａｖａ、Ｂ、Ｎ、Ｌｉａｓｈｅｎｋ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ 　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ。

２８Ｎ　３１９〜３２３）の使用による膜透過性の増強である。

摂取のための第２の技法は、表面結合剤、たとえばポリエチレングリコール（Ｐ ＥＧ）の使用である。表面結合剤の一般的な論議のためには、次のものを参照の こと：　Ｈｉｇｈ　Ｆｒｅｑｕ−ｅｎｃｙ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｂｙＰｒ ｏｔｏｐｌａｓｔｓ　Ｗｉｔｈ　Ｔｉ−ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ　（１９８２） 、　Ｆ、Ａ、Ｋｒｅｎｓ、　Ｌ。

Ｍｏ１ｅｎｄｉｊｋ、　Ｇｊ、Ｗｕｌｌｅｍｓ、　ａｎｄ　Ｒ，Ａ、５ｃｈｉｌ ｐｅｒｏｏｒｔ、　Ｎａｔｕｒｅ。

２９６　：　７２）　；又はたとえば、リン酸カルシウム（Ａ　Ｎｅｗ　Ｔｅｃ ｈ−ｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ａｓ５ａｙ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ 　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ５　ＤＮＡ　（１９７３）、　Ｐ、 Ｌ、Ｇｒａｈａｍ、　ａｎｄ　Ａ、Ｊ、Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｂｂ、　Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ。

５２　：　４５６；　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｍｍａｌｉａ ｎ　Ｃｅ１ｌｓ　ｗｉｔｈ　Ｇｅｎｅｓｆｒｏｍ　Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｅｓ　ａ ｎｄ　Ｅｕｃａｒｙｏｔｅｓ　（１９７９）、　Ｍ、Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｒ。

５ｉｖｅｅｔ、　Ｇ、に、Ｓｉｍ、　Ｂ、Ｗｏｌｄ、　Ａ、Ｐｅ１ｌｉｃｅｒ、 　Ｅ、Ｌａｃｙ、　Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ。

Ｓ−３ｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ、　ａｎｄ　Ｒ，Ａｘｅｌ、Ｃｅ１ｌ、　１６：７ ７？。

摂取のための第３技法は、プロトプラスト中への粒子の食作用である。適切な粒 子は、リポソーム（Ｌ　ｉｐｓｏｍｅ−ｍｅｄ　１ａｔｅｄＴｒａｎｓｆｅｒ　 ｏｆ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ロＮＡ　１ｎｔｏ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｓ　（１９８２）＋１１、口ｃｈｉｍｉｙａ、Ｔ、Ｏｈｇａｗａｒａ、ａｎｄ　 ）ｌ、Ｈａｒａｄａ、　Ｉｎ　：　Ａ、Ｆｕｊｉｗａｒａ（ｅｄ、）、Ｐｒｏｃ 、５ｔｈ　Ｉｎｔｌ、Ｃｏｎｇ、Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅ。

Ｊａｐ、Ａｓ５ｏｃ−ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　 Ｔｏｋｙｏ、　ｐｐ、５０７−５０８）；オルガネラ　（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ　１ｎｔｏ　Ｐｒｏｔｏ−ｐｌａ ｓｔｓ　ｏｆ　Ｐｅｔｕｎｉａ　（１９７３）、ｒ、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、　Ｚ、 Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙ−融合は、電流、ＰＥＧ、及び５ｅｎｄａ　ｉウィルス 粒子により誘発され得る。細胞融合の一般的な論議のためには、次のものを参照 のこと：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　［Ｊｓｉｎｇ　ＨＶＪ　（Ｓｅｎｄａｉ　Ｖｉｒｕ ｓ）ｆｏｒ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ　５ｕｂｓｔａｎｃｅｓ　１ｎｔｏ　Ｍａ ｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ　（１９８０）。

Ｔ、Ｕｃｈｄａｚ、　Ｍ、Ｙａｍａｉｚｕｍｉ、Ｅ、Ｍｅｋａｄａ、　Ｙ−Ｏｋ ａｄａ、Ｉｎ：　Ｉｎｔｒｏｄｕｃ−ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｃｒｏｍｏｌａｃｕ ｌｅｓ　Ｉｎｔｏ　Ｖｉａｂｌｅ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ、　Ｃ。

Ｂａｓｅｒｇａ、　Ｇ、Ｃｒｏｓｅ、　ａｎｄ　Ｇ、Ｒｏｖｅｒａ　（ｅｄｓ、 ）　Ｗｉｓｔａｒ　ＳｙｍｐｏｓｉｕｍＳｅｒｉｅｓ、　Ｖｏｌ、１．　Ａ、Ｒ １１ｓｓ　Ｉｎｃ、、　ＮＹ、　ｐｐ、１６９−１８５　；及びＨ９Ｈａｒｒｉ ｓ、　Ｃｅ１ｌ　Ｆｕｓｉｏｎ：　Ｔｈｅ　Ｄｕｎｈａｍ　Ｌｅｃｔｕｒｅｓ（ １９７０）、　０ｘｆｏｒｄ次の例は、例示的であって、本発明の範囲を限定す るものではない。すべての部及び％は、特にことわらない限り重量によってであ る。

三系交雑を行ない、供与体植物を創造した。この三系交雑に使用される通交植物 はＲ９９，ＰＨ１６、及びＰａ９１であった。通交系を生成するための種子は、 Ｈｏ１ｄｅｎ’ｓ　Ｆｏｕｎｄａ−ｔｉｏｎ　５ｅｅｄｓ、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｂｕｒｇ、　ＩＡ（ｔ１９９及びＰａ９１）及び［１１ｉｎｏｉｓＦｏｕｎｄａ ｔｉｏｎ　５ｅｅｄｓ、　Ｔｏｉｏｎｏ、　ＩＬ　（ＰＨ１０）から得られた。

すべての系統は、交雑のために使用される前、２年間、調節された自家受粉によ り維持された。三系交雑、（８９９ｘＦＲｌ　６）ｘｐａ９１を、上記のように してＨａｌｌａｕｅｒ　（Ｌ９８７）に示される方法に従って、調節された受粉 によって行なった。

供与体植物は、Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、　ＩＬにおいて、１９８５年４月〜８月の 間、野外で成長せしめられた。アセトカルミンによる処理後、顕微鏡により決定 される場合、発生の後期単核状態〜初期複数校状態で小胞子を含む豹を有する花 序を、葉序からの発生の前、供与体植物から除いた。次に、花序を湿気のある紙 タオルに包み、アルミ箔により被覆し、そして８℃で１４日間保持した。豹の取 り出しの前、花序を、０．５％の次亜塩素酸ナトリウムで１５分間、表面殺菌し 、続いて滅菌水によりすすいだ。主要花序ブランチの中央部分からの罰のみを用 いた。

６０個の豹を、２０ｍ１ｌ！の培地を包む２０Ｘ６０ｍｍのベトリ皿に置いた。

培地は、ＹＰ基本塩（Ｋｕなど０．１９７８、前記）、並びに５．０ｇ／Ｅの活 性炭、５００■／ｌのカゼイン加水分解物、２．　３．　４．　５−トリヨード 安息香酸０．１■、１２０ｇ／Ａのスクロース及び８．０ｇ／ｆｌの寒天（Ｇｉ ｂｃｏ）（ｐＨ５，８に調整されている）から構成された。典型的には、３〜６ 個の皿を個々の収穫された花序から得た。新しくプレートされた鰐を含む皿を、 パラフィンにより密封し、そしてアルミ箔によりおおわれたプラスチック箱に置 いた。

２８℃で暗室内で１週間後、皿を透明な箱に移し、そして冷白色螢光（６０μモ ル／ｍ／秒）下で１６時間の光周期で成長せしめた。４〜６週後、認識できるＥ ＬＳを有する豹が現われた。

ＥＬＳは外観上、黄色みがかった白色の球状物であり、種々の程度の異常組織分 化を示す接合胚に似ていた。

ＥＬＳを豹から持ち上げ、そして再生培地（ＹＰ並びに１０ｍｇ／ｊ！のインド ール−３−酢酸、１．０ｍｇ／ｌのＫｉｎｅｔｉｎ。

１４６■／ｌのグクタミン及び３０ｇ／ｌのスクロースを含む）上に置いた。２ 〜３週後、苗を、ホルモンを含まない培地（ＹＰ塩のみを含む）上に置き、そし て根の形成後、土壌に移し、そして温室で成熟せしめた。

２種の約培養由来のＥＬＳを２種の別々の花序から得、植物を再生した。その再 生された植物を、１９８５年１０月〜１２月の間に成熟せしめた。１つの植物（ ＃１３９）は、穂苗条（ｅａｒ　５ｈｏｏｔ）及び朽押出しを有さない花序を生 成した。

第２植物（１３９）は、生存する花粉を生成したが、しかし穂苗条は発生の後期 で生成された。植物＃３９からの花粉を植物＃１３９に適用し、単一のＦ１ハイ ブリッド（１３９／３９）種子の形成をもたらした。

Ｆ、ハイブリッド種子を発芽せしめ、そして得られた植物を自家受粉し、すなわ ち１つの植物からの花粉を用いてそれ自体を受精せしめ、Ｆ２　（Ｓ、）集団を 生成した。

Ｆ２集団を１９８６年の夏の間、Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、　ｆＬで野外成長せしめ 、そして１４種の植物を自家受粉し、そして−穂一列に成長せしめた。

得られた１４種の８１家系を、それらの豹増殖能力について評価した。評価は、 Ｐａｃｅなど−、”Ａｎｔｈｅｒ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆｍａｉｚｅ　ａｎｄ　 ｔｈｅ　ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｍ１ｃ ｒｏｓｐｏｒｅｓｂｙ　ｂｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ　ｍ１ｃｒｏｓｃｏｐｙ”、　 Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、、７３：　８６３〜８６９．１９８７（こ の方法は引用により本明細書に組込まれる）に示されるようにミトラマイシン／ 螢光染色により決定されるように、後期単核−初期複数核小胞子を含む酌を有す る花序を選択することによって行なわれた。選択された花序を、葉序からの出現 の前、供与体植物から除いた。その結果は第１表に示される。

第１表 トウモロコシの１４種の８１家系の培養された豹からの平均約培養応答 １３９／３９−０２　２６Ｌ　２ １３９／３９−０３　１３４．２ １３９／３９−０４　１２６．０ １３９／３９−０５　２３８．４ １３９／３９−０６　６４．２ １３９／３９−０７　７９．８ １３９／３９−０８　３０．４ １．３９／３９−０９　２４８．０ １３９／３９−１０　５７．６ １３９／３９−１１　１３０．０ １３９／３９−１２　８７゜５ 第１表（続き） トウモロコシの１４種のＳ、家系の培養された豹からの平均約培養応答 Ｌ３９／３９−１３　７０−　９ １３９／３９−１４　１１９．８ 十二胚様構造体 １３９／３９−０１〜１３９／３９−１４　（この後“１３９／　３９−　ｂ　 ｕ　Ｉ　ｋ”と言及する）のほぼ等しい分布を含む８１種子（ＡＴＣＣ第４０５ １９号）の集団を、１９８８年１２月１日にＡＴＣＣに寄託した。

花序が収穫される２種の元の植物（結局、植物＃３９及び＃１３９の再生を導び く）は、中でも、それらの個々の朽応答に基づいて生産性でなかった。従って、 むしろ驚くべき事には、１４種の８１系は応答し、そしてそれらは生産性であっ た。明らかに、雄性配偶体由来の植物の相互交配は、高められた応答性に対立遺 伝子頻度を転じる効果的な手段である。

１３９／３９−０５の個々を、上記約培養技法にゆだねた。

得られる再生された植物からの種子、１３９／３９−ＤＨ（ＡＴＣＣ第４０５２ ０号）を１９８８年１２月１日にＡＴＣＣに寄託した。

自家受粉を最っとも応答性の家系（１３９／３９−０１゜−０２，−０５、及び −０９）の４種により行ない、そして得られた穂からの８２種子を１９８８年４ 月〜１０月の間成長せしめた。自家受粉をその家系のそれぞれ内で行ない、本発 明の新規の８３発芽プラズマを生成した。

この材料は、４世代（Ｆ、、Ｆ、（Ｓ、）、Ｓ、、Ｓ、）の間、強制された育種 を受けたので、元のＦ、ハイブリッドにおいてへテロ接合性であるそれらの遺伝 子座のうち約９５％が現在ホモ接合性である。

他の遺伝子型への高い約培養能力のトランスファー交雑を、４種の選択されたＳ ２家系及び４種の他の農学的に重要な通交遺伝子型（ＵＡＳＩ、ＵＡＳ２．ＵＡ Ｓ３及びＵＡＳ４）（これらのそれぞれは約培養に非応答性である）”の間で行 なった。

得られたＦ、ハイブリッドを、ＥＬＳ形成により測定されるように、それらの約 培養能力について評価した。結果は第２表に示される。

第２表 トウモロコシの１６種のＦ、ハイブリッドの平均約培養応答 １３９／３９−０１ｘＵＡＳ１　５．７１３９／３９−０２ｘＵＡＳ１　２９． ２１３９／３９−０５ｘＵＡＳ１　１７．７１３９／３９−０９ｘＵＡＳ１　５ ．３１３９／３９−０１ｘＵＡＳ２　３０．７１３９／３９−０２ＸＵＡＳ２　 ６．７．４第２表（続き） トウモロコシの１６種のＦ１ハイブリ、７ドの平均豹培養応答 生成されたＥＬＳ 交　雑　（培養された１００個の罰当たり）１３９／３９−０５ｘＵＡＳ２　１ ８−　６１３９／３９−０９ｘＵＡＳ２　４７．３１３９／３９−０１ｘＵＡＳ ３　２０．６１３９／３９−０２ｘＵＡＳ３　２９．１１３９／３９−０５ｘＵ ＡＳ３　６．２１３９／３９−０９ｘＵＡＳ３　３２．５１３９／３９−０１Ｘ ＵＡＳ４　４ｇ、８１３９／３９−０２ｘＵＡＳ４　１７１．１１３９／３９− ０５ｘＵＡＳ４　１０７．６１３９／３９−０９ｘＵＡＳ４　１０４−　２遺伝 子要因が、非応答性発芽プラズマにおける約培養応答をは１３９／３９−０２が 誘導された３種の親のいづれかとのるようにそれらの約培養能力について評価し た。結果は、第３表に示される。

第３表 トウモロコシのＦ、ハイブリッドの平均約培養応答本本発明の例ではない。

データは、非応答性系統がいかにＨＡＣと応答するが、しかしＨＡＣの親とは応 答しないかを示す。これまでに言及されたように、ＨＡＣは、約由来の個体の相 互交配の後、１３９／３９−Ｂｕｌｋにおいて単離された遺伝子要因のユニーク な組合せであるように思える。第３表は、約非応答性遺伝子型にＨＡＣをトラン スファーする試みの応答データの比較を示す。

例２ 供与体植物（１３９／３９−０２）のために使用されるトウモロコシ遺伝子型を 、例１に示されているようにして発生せしめる。供与体植物は、１９８８年４月 〜８月の間、Ｃｈａｍ−ｐａｉｇｎ　ｌ１ｌｉｎｏｉｓで野外成長せしめられた 。供与体植物からの花序を収穫し、そして前記方法（Ｐｅｔｏｌｉｎｏ　ａｎｄ 　Ｊｏｎｅｓ（１９８ｇ＞、前記を参照のこと）に従って、前処理した。

主要花序ブランチからの酌を、約１０ｍ１のＥＬＳ誘発培地中に接種した（６０ Ｘ２０ｍｍのプラスチックペトリ皿当たり３０個の約）。典型的には、３〜６個 の皿を、収穫された個々の花序から得た。

ＥＬＳ誘発培地は、ＹＰ基本塩（Ｋｕ　（１９７８）　、前記を参照のこと）、 並びに追加の約６０ｇ／Ｉｔのスクロース、約５ｇ／Ａの活性炭、約５００■／ ｌのカゼイン加水分解物及び約０．１■／ｌの２．４．５−）リョード安息香酸 （ｐＨ５，８に調整されている）から成った。使用の前、培地は濾過され、活性 炭が除かれた。特に、活性炭は、約５ミクロンの孔サイズを有する市販のフィル ター殺菌単位による濾過により除去された。

新しくプレートされた杓を含む皿を、Ｐａｒａｆ　ｉｌｍ”ブランドのフィルム （Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃａｎ　Ｃｏｍｐａｎｙから市販されている）により密封 し、そしてアルミ箔によりおおわれたプラスチック箱に置いた（２８℃）。２日 以内に、液体培地に培養される豹は裂開し、雄性配偶体の定常懸濁液をもたらし た。最大の裂開は７日後に生じ、これは約４０％の雄性配偶体が発生した。７日 以内に、細胞分裂を示す単離された雄性配偶体が明らかになった。１２〜１５日 までに、多細胞塊状物が、外膜から脱離し、ＥＬＳの形成をもたらすことが観察 された。

２１日後、肉眼で見えるＥＬＳが出現した。形成されるＥ　Ｌ　Ｓのほとんどは 、プレートの底に沈められ、そして培地の表面上に浮遊する豹とは直接的に関連 されなかった。これらの構造体は、正常な二極性の球状胚〜複数裂片又は異常に 形成された胚の範囲の多様な形状を有する黄色みがかった白色であった。２１日 で、及びその後、３週間、毎週、０．５閣以上のＥＬＳを計数し、そしてカルス 誘発培地に移した。

６週後に生成されるＥＬＳの合計数を、第４表に示されるように、培養された１ ００個の罰当たりで示した。

次に、ＥＬＳをカルス誘発培地に移した。カルス誘発培地は、Ｎ６主要塩及びビ タミン（Ｃｈｕ　（１９７８）　、前記を参照のこと）、Ｂ５の重要でいない塩 （Ｇａｍｂｏｒｇなど、（１９６８）、前記を参照のこと”）、３０ｇ／ｌのス クロース、２．９ｇ／ｌのＬ−プロリン、１００■／ｌのミオイノシトール、１ ００■／１のカゼイン加水分解物、２．５ｍｇ／Ｉ！のｄｉｃａｍｂａ　。

０．１■／ｌの２．４−Ｄ、及び８ｇ／ｌのＴＣ−寒天（Ｈａｚｌｅｔｏｎ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｃ、、　Ｌｅｎｅｘａ、　Ｋａｎｓａ ｓから得られる）から成った。

２〜３週後、密集した結節状の外観を示すカルスを、植物再生培地に移し、そし て冷−白色螢光ランプから１６７８時の光周期（６０μモル／ｍ′／秒）で維持 した。再生培地は、ＳＨ基本塩（Ｓｃｈｅｎｋ　ａｎｄ　Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ ｔ　（１９７２）　、前記を参照のこと）及び１０ｇ／ｌのスクロースら成った 。

４週後、個々の苗を、土壌に移す前、追加の発生のために植物再生培地から新し い再生培地を含む１０１０Ｘ２５の培養管に移した。根の形成後、苗を土壌に移 し、そして周囲温度で温室内において成熟せしめた。苗は、花をつけ、そして種 子をつける完全な生殖植物に成長し、そして種子は生存する種子に成熟した。植 物が回収され得る培養物（再生できる培養物として言及される）の合計数を決定 し、そして第４表に示されるように、移された１００個のＥＬＳ当たりで示した 。

第４表 トウモロコシの培養された雄性配偶体からのＥＬＳの形成及び植物再生 第４図に見られるように、豹から裂開された単離された雄性配偶体は、ＥＬＳを 生成し、これから植物が再生され得る。

例３ 例２の方法をくり返した。但し、誘発培地に培養される朽は、培養開始後、０． ３及び７日で機械的に単離された雄性配偶体を有した。単離された雄性配偶体は 、ガラス棒を用いて、１１３ミクロンのステンレス鋼篩に対して損なわれていな い豹を軽く押しつけることによって単離される［ｌｉ（、ｈｔｅｒ。

（１９８２）、前記を参照のこと〕。１０ｒｒＬ１の体積の誘発培地中における ３０個の約の含有物は、血球計数器により決定される場合、６，０００＋／−５ ００の雄性配偶体／ｒｒＬ１の密度をもたらした（Ｓｔｒｅｅｔ、（１９７７） 、前記を参照のこと）。使用される血球計数器は、Ｃ，Ａ、Ｈａｕｓｓｅｒ　＆ 　Ｓｏｎ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ＰＡから入手できる５ｐｅｉｒｓ− Ｌｅｖｙ　Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌであった。

生成されるＥＬＳ／１００個の朽及び合計の再生可能培養物／１００個のＥＬＳ についての結果は、第５表に示される。

第５表 培養開始後、種々の時間でトウモロコシの豹から機械的に単離された雄性配偶体 からのＥＬＳ形成及び植物再生 第５表に見出されるように、罰から機械的に単離された雄性配偶体は、ＥＬＳを 生成し、これから植物が再生される。

例４ 例２の方法をくり返した。但し、豹は、培養の開始の前、機械的に単離された雄 性配偶体を有し、そして前に記載された分離技法が用いられ、そしてプレート効 率が決定された。

すべての単離は、小花からの取出し後、釣上で行なわれた。

単離方法は、６０個の豹を、４０ｒＩＬ１．のＥＬＳ誘発培地と共に１１０ｍ１ ’のステンレス鋼ブレンド付属装置（Ｗａｒ　ｉｎｇ　Ｍ　Ｃ−２＞中に置くこ とから成る。この実験においては、Ｐｅｒｃｏｌｌグラジェント分離（０日目で ）を、単独で及び篩分離（７日目で）と組合して用い、そしてプレート効率の評 価を個々の処理について行なった。Ｐｅｒｃｏｌｌグラジェントは、２０％Ｐｅ ｒｃａｌｌ／　８Ｑ％ＥＬＳ誘発培地の３０ｄ低層及び１．５ｄの純粋なＥＬＳ 誘発培地の上部層くすべては１５ｒｄの遠心分離管に含まれる）から成った。単 離された雄性配偶体を、５００．０００〜１，０００，０００個の雄性配偶体を 含むスラリー１ｄ中、低部層に添加し、そしてその管を１１０００ＲＰで５分間 遠心分離した。小胞子の上部バンドを保存した。

この研究における処理は、対照、ここで分離は行なわれなかった：〇−日でのＰ ｅｒｃｏｌｌグラジェント分離のみ：〇−日でのＰｅｒｃｏｌｌグラジェント分 離及び７日目での７４μｍの孔サイズを用いてのメツシュ分離：及び〇−日での Ｐｅｒｃｏｌ１分離及び７日目で行なわれる８８μｍの孔サイズを用いてのメツ シュ分離から成った。分離の後、すべての配偶体を、７５００〜１５，０００／ −の密度でＥＬＳ誘発培地に戻した。保持及び開放（篩を通過するもの）画分を 評価した。

小胞子密度を、個々のプレートのために４個の計数を有する血球計数器を用いて 評価した。密度、合計のＥＬＳ、１００個の罰同等物（約当たり２５００個の配 偶体を仮定する）当たりのＥＬＳ、プレート効率及びＲＣデータが下記第６表に 与えられる。

第６表 トウモロコシの鰐から機械的に単離され、そして分離された雄性配偶体からのＥ ＬＳ形成及び植物再生”　ＡＥ＝酌同等物＝２５００個の配偶体ＩＩＲＣ＝植物 が得られる再生可能培養物対照培養物にあける単離された雄性配偶体は、いづれ かの分離方法の適用なしに、損なわれていない鰐培養（例１及び２を参照のこと ）に典型的に観察される範囲に近いＥＬＳ応答レベルを生成した。Ｐｅｔｃａｌ ｌグラジェントのみの使用は、プレート効率の有意な上昇をもたらした。応答レ ベルにおける追加の改良が、Ｐｅｔｃａｌｌ及び篩分離の組合せにより観察され た。８８μｍのメツシュサイズは、特に効果的であり、対照よりも１６倍の効率 の改良を付与した。ＥＬＳ生戊に関しては、この処理において観察されるレベル は１２００　ＥＬＳ／１００　約に等しく、この遺伝子形のための損なわれてい ない約培養応答を越えた。さらに、この分離方法はまた、ＲＣの回収により示さ れるように、ＥＬＳの質も高めることか明らかであった。

篩技法はまた、大きなより成長したＥＬＳを得るために培養の後期段階（２１〜 ２８日）で使用され得ることを研究が示した。この方法を用いて、効果的なプレ ート効率は、下記第７表に示されるように、ＲＣ回収率（８〜２４％）に等しい レベルに近づくはずである。

第７表 トウモロコシの豹から機械的に単離され、そして分離された雄性配偶体からのＥ ＬＳ形成及び植物再生第４表に示されるこれらの技法は、例５に記載される粒子 衝撃技法のための標的を生成するために使用されて来た。

例５ 本発明の選択された発芽プラズマはまた、粒子衝撃技法を用いて形質転換された 。

ＤＮＡ含有プラスミド（ｐＤＡＢｌ　９９）により被覆されたキャリヤー粒子を 、キャリヤー媒体に懸濁する。より詳しくは、プラスミドを金粒子の表面に吸着 する。プラスミドは、酵素β−グルクロニダーゼをコードしくＧＵＳ遺伝子）、 そして３５ｓ　Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ　Ｍｏ５ａｉｃ　Ｖｉｒｕｓ　（ＣａＭ Ｖ）プロモーターの制御下で存在する遺伝子を含む。金粒子は、直径約１．５〜 ０．３μｍの球状粒子である　（Ａｌｆａ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｄａｎｖｅｒ ｓ、　ＭＡから入手できる）。

吸着を達成するためには、５０μｌのプラスミド溶液（０，ＯＩＭのトリス緩衝 液（ｐＨ８、０）及び０．００１Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液 −当たりＤＮＡ１．８μｇ）を、金キャリヤー粒子の懸濁液（蒸留水１ｍｌ当た り金キャリヤー粒子３００■）４００μｌに添加する。

ＤＮＡを、２．５Ｍの塩化カルシウム溶液７４μｌ及び０．１Ｍのスペルミジン 溶液３０μｌの添加により沈殿せしめる。

被覆されたキャリヤー粒子を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管の底に沈降せしめ、そして 得られた透明な液体を完全に排水する。キャリヤー粒子を、エタノール（１００ ％）（キャリヤー媒体）５００μｌに再懸濁する。１つのキャリヤー粒子は、プ ラスミド約１０コピーにより被覆される。

発されたＭＧ　（原芽体）を、８８μｍのメツシュに培養物を通すことによって 分離する。原芽体約１００■のサンプルを、６０鵬のベトリ皿における固化され た寒天ＥＬＳ誘発培地の上部のフィルター紙上に置く。発生の後期段階における ＥＬＳ（培養開始後１９〜２２日）をまた用いた。古い培養物からの標的物質の 調製は類似するが、しかしその分離は１１３μｍのメツシュを用いて行なわれる ことが異なる。

６〜９日間（原芽体）及びまた１９〜２２日間培養された雄性配偶体を、適切な サイズの篩に通すことによって分離した（前記のようにして）。次に、これらを 、約１００ｍｇから成る単層標的に配置し、そして衝撃を加えた。標的部分は、 固化された寒天ＥＬＳ誘導培地の上部に置かれたフィルター紙上で直径１印の円 形から成る。

下記に記載されるのと同じ装置から実質的に成る装置を用いて、単離された雄性 配偶体で被覆された金粒子を促進せしめた。装置１０は、第１，２及び３図によ り詳細に説明されている。

（１）第２図に示されるようなガス３０の源。ヘリウムガスにより満たされたＩ Ａサイズのガスシリンダー（すなわちガス供給手段３１ａ）は、７’　ｘＯ，０ ２’　１．Ｄ、の寸法を有するステンレス鋼細管（すなわちガス供給ライン３３ ）と流体伝達状態で存在する。ガス供給ラインは、Ｖｉｃｔｏｒ　Ｅｑｉｐｍｅ ｎｔＣｏ、から入手できる標準の二段階圧力調節弁（すなわちガス調節弁３２ａ ）と操作的に組合されて存在する。ガス供給ラインは、他方、１／８’Ｏ，Ｄ、 ｘ３’長さの寸法を有する高圧ステンレス鋼チャンバー（すなわちガス溜め３２ ｂ）に通じる。

（２）第３図に見られるような噴射できる物質２０の源。

噴射可能物質の源は、３ａ＋ｆ（ｃｃ）のＬｕｅｒ　Ｌｏｋ滅菌注射器２１ａ（ すなわち噴射可能物質供給手段）から成り、そしてそれは１／１０’のテフロン （Ｂ、　１．　Ｄｕｐｏｎｔ　ｄｅ　ＮｅｍｏｕｒｓＣｏ、の商標）製ＦＥＰ管 （すなわち噴射可能物質供給ライン２３）と流体伝達状態で存在する。

（３）第１図に見られるような回収手段６０゜回収手段は、透明な１／１０’Ｏ ＤのＦＥＰテフロン製流出管である。

（４）第１図に見られるような送出手段５０゜送出し手段は、１０ｃｍＸ　１． 　２ｍｍ０１Ｄ、Ｘｏ、８ｒ、口０皿の寸法を有するパイレックスガラスから成 る。

（５）第４図に示されるような二重三方弁７０゜その弁は、Ｒｈｅｏｄｙｎｅ、 　Ｉｎｃ、、　Ｃｏｔａｔｉ、　ＣＡ　９４９２８から商標モデル７０３０ＡＲ Ｖとして市販されている２つのサブ弁（サブ弁７０ａ及び７０ｂ）から成る。二 重三方弁７０のサブ弁は、ＡｎｓｐｅｃＣｏ、、　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、　Ｍｌ から市販されている空気作動器キット＃４１６８７と操作的に組合されて存在す る。空気作動器は、Ａｕｔｏｍａｔｉｃ　５ｗ１ｔｃｈ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（Ａ ＳＣＯ）、　Ｆｌｏｒｈａｍ　Ｐａｒｋ、　ＮＪから市販されている四方ソレノ イド弁から供給される空気によって駆動される。

（６）第１図に見られるような噴射可能物質溜め４０゜その噴射可能物質溜めは 、１／１６’の０．０．のステンレス鋼から製造された外部ループ４０であり、 第１及び第２三ツロ弁と操作的に組合されて存在する。

第１三ツロ弁は、噴射可能物質供給手段又はガス溜めと噴射可能物質溜めとの間 で選択的な流体伝達を提供する。

第２三ツロ弁は、噴射可能物質溜めと回収手段又は送出し手段との間で選択的な 流体伝達を提供する。

多目的弁は、注射器と噴射可能物質との間で流体伝達を提供し、そしてガス溜め と噴射可能物質溜めとの間で空気伝達を阻止するためにまず設定される。

約１１ｎｉの噴射可能物質（被覆された粒子のキャリヤー媒体懸濁液）を送出す であろう注射器は、噴射可能物質供給ラインと流体伝達状態で配置されている。

噴射可能物質供給ラインは噴射可能物質溜めと流体伝達状態で存在する。

噴射可能物質調節弁２２ａは、噴射可能物質供給手段と噴射可能物質溜めとの間 に流体伝達を提供するために開かれる。

選択された体積の噴射可能物質が噴射可能物質溜め中に放された後、噴射可能物 質弁は閉じられる。

噴射可能物質溜めの体積以上のいづれかの体積の噴射可能物質が回収手段を通し て開放される。

ガス調節弁３２ａは、ガス供給手段とダス溜めとの間に空気伝達を提供するため に開かれる。約１０００ｐｓｉのガス圧がガス溜めに得られる。次に、ガス調節 弁が閉じられる。

ｐＤＡＢ１９９に被覆されたキャリヤー粒子は、真空チャンバーにおける原芽体 及びＥＬＳに向かって送出し手段から出る。推進領域における圧力は約Ｑ、ｌａ ｔｍである。

操作は、弁を通して送出し手段にガス溜めからのガスの通過を阻止し、そして注 射器と噴射可能物質オーバーフロー溜めとの間に流体伝達を提供するために弁を 選択的に設定することによって完結される。

衝撃に続いて、サンプルを液体ＥＬＳ誘発培地に戻し、そして２７℃で約２日間 、暗室でインキュベートした。サンプルを個々の標的のそれぞれから取り、そし てＧＵＳアッセイに配置した。さらに２日後、単離された雄性配偶体におけるＧ ＵＳ遺伝子の発現が、ＧＵＳ組織化学的アッセイを用いて観察される（５−Ｂｒ −４−Ｃ１−３インドリル−β−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｅ）基質サンプルが ＧＵＳ発現のために評価され、これは青色の出現によって示される）。この試験 の結果は下記第７表に与えられる。

第７表 形質転換された単離雄性配偶体におけるＧＵＳ発現６　５０００　１９．６ ８　５０００　９．８ ９　３０００　４．０ １９　２３３　３２．６ ２０　３５５　３８．３ ２２　２１７　１１０．９ ０青色の点の数 他の変動は当業者に明らかであろう。従って、本発明の範囲は、請求の範囲によ り定義されるように意図される。

本発明は寄託された細胞系又は種子によって範囲を限定するものではない。なぜ ならば、寄託された態様は、本発明の１つの観点及び本発明の範囲内で機能的に 等しい細胞系又は種子の１つの例示として意図されるからである。実際、本明細 書に示され、そして記載されるものの他に、本発明の種々の変性が、前記記載及 び添付図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変性は、請求の範囲 内にあるように意図される。

ＦＩＧ、１ 国際調査報告 １＋１＋、、、１１＋６．１　ｉｏ＋＋１ｃｍ＋ｉｏ＊　Ｎ。ρＣＴ／ＵＳ　９ ０１００９３１嘗−・−一・・１−・・轟−、、、ｔ、、＋ｔ、ＰＣＴＡＩＳ９ ０１００９３１国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ　９０１００９３＋ ＳＡ　３５１７５

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．下記段階：（ａ）都合良く葯培養され得る少なくとも１種の供与体トウモロ コシからの少なくとも１種の葯から単離された少なくとも１種の雄性配偶体を供 給し；そして（ｂ）少なくとも１種の胚様構造体（ＥＬＳ）の発生を助成するた めにＥＬＳ誘発培地に前記単離された雄性配偶体をインキュベートすることを含 んで成る方法。
2. ２．前記供与体の葯培養性トウモロコシ植物が：（ａ）少なくとも１種のヘテロ 接合性植物からの葯を供給し； （ｂ）前記供与体植物から得られた葯から、相互交配できる少なくとも２種の雄 性配偶体由来の植物を再生し；（ｃ）Ｆ１固体群を生成するために前記再生され た植物を相互交配し；そして （ｄ）少なくとも１種のＦ２固体群を再生するためにＦ１固体群の個々を自家受 粉又は他家受粉することにより調製される請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記供与体植物が（Ｈ９９×ＦＲ１６）×Ｐａ９１の三系交雑から得られる 請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．前記段階（ｄ）がＦ１固体群の個々を自家受粉することを含んで成る請求の 範囲第２項記載の方法。
5. ５．前記段階（ｄ）で生成されるＦ２固体群が自殖又は葯培養技法の方法により 遺伝的に固定される分離固体群を有する請求の範囲第２項記載の方法。
6. ６．前記供与体植物が１３９／３９−ＤＨ又は１３９／３９−Ｂｕｌｋである請 求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．前記雄性配偶体が、機械的取り出し又は裂開の技法により葯から単離される 請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．前記雄性配偶体が、 （ａ）不連続材料を形成するために、ＥＬＳ誘発培地における単離された雄性配 偶体とＥＬＳ誘発培地の密度よりも高い密度を有するグラジエント培地とを接触 せしめ；（ｂ）ＰｅｒｃｏｌＩ／ＥＬＳ誘発培地の界面で雄性配偶体のバンドを 創造するのに有効な時間及びｒｐｍで前記不連続材料を遠心分離し；そして （ｃ）グラジエント培地／ＥＬＳ誘発培地の界面で雄性配偶体を集めることを含 んで成る密度グラジエントにより葯から単離される請求の範囲第７項記載の方法 。
9. ９．下記段階： 前記単離された雄性配偶体を前記ＥＬＳ誘発培地中で３〜２８日間インキュベー トした後、７４〜８８μｍの範囲のメッシュサイズを有する篩に前記単離された 雄性配偶体を含むＥＬＳ誘発培地を通すことをさらに含んで成る請求の範囲第１ 項記載の方法。
10. １０．下記段階：（ａ）前記ＥＬＳ誘発培地の成分をオートクレーブし、（ｂ） オートクレーブの前又は後のいづれかで、前記ＥＬＳ誘発培地成分と活性炭とを 混合し、そして（ｃ）前記単離された雄性配偶体をインキュベートする前、前記 活性炭を濾去することをさらに含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。
11. １１．少なくとも１種のトウモロコシ植物に再生され得るカルスの発生を助成す るために前記ＥＬＳをカルス誘発培地中でインキュベートする段階をさらに含ん で成る請求の範囲第１項記載の方法。
12. １２．苗の発芽を助成するために前記カルスを植物再生培地上でインキュベート する段階をさらに含んで成る請求の範囲第１１項記載の方法。
13. １３．少なくとも１種の苗を少なくとも１種の完全な生殖性植物に栽培する段階 をさらに含んで成る請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．少なくとも１種の完全な生殖性植物又はその子孫を栽培し、それによって それが種子をつける段階をさらに含んで成る請求の範囲第１３項記載の方法。
15. １５．請求の範囲第１項記載の方法により生成される少なくとも１種のＥＬＳ。
16. １６．請求の範囲第１１項記載の方法により生成される少なくとも１種のカルス 。
17. １７．請求の範囲第１３項記載の方法により生成される少なくとも１種の植物。
18. １８．請求の範囲第１４項記載の方法により生成される少なくとも１種の種子。
19. １９．前記種子が二倍体である請求の範囲第１８項記載のトウモロコシ種子。
20. ２０．少なくとも１種の単離された小胞子から発生せしめられるトウモロコシ種 子。
21. ２１．前記種子が二倍体である請求の範囲第２０項記載のトウモロコシ種子。
22. ２２．ホモ接合条件下でトウチロコシ突然変異体を選択するための方法であって 、単離された雄性配偶体培養物により発生せしめられたトウモロコシの半数体細 胞を用いてインビトロスクリーニング及び選択する段階を含んで成る方法。
23. ２３．トウモロコシにおける遺伝子トランスロケーション、置換及び付加系の生 成のための方法であって、トウモロコシの種間及び属間ハイブリッドの単離され た雄性配偶体の培養を含んで成る方法。
24. ２４．トウモロコシの形質転換のための方法であって、単離された雄性配偶体培 養により発生せしめられたトウモロコシの半数体細胞を供給し、そして粒子衝撃 技法及びマイクロインジェクションから成る群から選択された技法により遺伝子 材料を前記半数体細胞中に挿入することを含んで成る方法。