CN110343691B - 突变型肝素酶ⅰ及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种突变型肝素酶Ⅰ及其编码核苷酸序列、包括该核苷酸序列的重组载体和宿主细胞以及应用，涉及分子生物学技术领域。该突变型肝素酶Ⅰ通过对现有肝素酶Ⅰ氨基酸序列可能影响肝素酶I稳定性的蛋白酶酶切位点进行突变，具体地，将现有肝素酶I的氨基酸序列第2位的Gln定点突变为His，第78位Glu定点突变为Met。经过上述突变后得到的突变型肝素酶Ⅰ在不影响肝素酶I的活性的条件下，相对于现有肝素酶I具有更好的稳定性。

Description

突变型肝素酶Ⅰ及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种突变型肝素酶Ⅰ及其制备方法和应用。

背景技术

肝素酶I（heparinaseI）是一类能降解肝素类物质的裂解酶。肝素酶I通过水解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的肝素类侧链破坏细胞外基质和基底膜的基本结构，释放并激活连接在肝素类侧链上的活性物质，与血管生成、肿瘤转移、炎症等病理过程密切相关。在制备低分子肝素、消除体外循环中的肝素抗凝剂、确定肝素精确结构等方面有着重要的用途。但是，现有天然肝素酶I的表达需要向培养基中添加大量的肝素钠进行诱导，且天然肝素酶I产量极低，而且其诱导添加物肝素钠目前只能从动物（主要是猪和牛）小肠粘膜提取，工艺复杂，环境污染大，且价格昂贵，严重限制了肝素酶I的应用。

近年来，随着基因工程技术的快速发展，利用重组细胞生产肝素酶I是一条极有前景的途径。但是现有制得的肝素酶I的稳定性极差，现有制得的肝素酶I以液体形式存放在4℃环境下，在很短的时间内活性即降低为原来的一半，而经过一次冻融、一次冻干，其活性只能保持为原来的45%和25%。而且目前的制备方法酶的活性损失极大，产率很难超过10%，因此，通过分子生物学的方法，研究开发出一种稳定性强的突变型肝素酶Ⅰ，变得十分必要和迫切。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种突变型肝素酶Ⅰ及其应用，本发明通过定点突变的方法对现有肝素酶I中易受蛋白酶攻击的蛋白酶酶切位点进行定点突变改造，改造后的突变型肝素酶Ⅰ在不影响肝素酶I的活性的条件下，相对于现有肝素酶I具有更好的稳定性。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供的一种突变型肝素酶Ⅰ，所述突变型肝素酶Ⅰ包括如Seq No.01所示的氨基酸序列。

本发明提供的一种突变型肝素酶Ⅰ的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（a）、首先合成编码上述突变型肝素酶Ⅰ的核苷酸序列，随后将核苷酸序列与真核细胞重组表达载体结合，得到重组载体；

（b）、将重组载体转入宿主细胞，随后诱导表达，得到突变型肝素酶Ⅰ。

本发明提供的一种上述突变型肝素酶Ⅰ在制备含肝素酶Ⅰ的产品中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的突变型肝素酶Ⅰ，所述突变型肝素酶Ⅰ包括如Seq No.01所示的氨基酸序列。本发明对现有肝素酶Ⅰ的氨基酸序列中可能影响肝素酶I稳定性的蛋白酶酶切位点进行突变，具体地，将现有肝素酶I的氨基酸序列第2位的Gln定点突变为His，第78位Glu定点突变为Met。上述点突变后得到的突变型肝素酶Ⅰ在不影响肝素酶I的活性的条件下，相对于现有肝素酶I具有更好的稳定性。

本发明提供的上述突变型肝素酶Ⅰ可广泛应用于含肝素酶Ⅰ药物的制备中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例5提供的突变型肝素酶I的纯化电泳鉴定结果图；

图2为本发明效果例1提供的37℃加速稳定性实验后的样品蛋白电泳图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，一种突变型肝素酶Ⅰ，所述突变型肝素酶Ⅰ的氨基酸序列如Seq No.01所示。

本发明提供的突变型肝素酶Ⅰ，所述突变型肝素酶Ⅰ包括如Seq No.01所示的氨基酸序列。本发明对现有肝素酶Ⅰ氨基酸序列可能影响肝素酶I稳定性的蛋白酶酶切位点进行突变，具体地，将现有肝素酶I的氨基酸序列第2位的Gln定点突变为His，第78位Glu定点突变为Met。

第2位和第78位的氨基酸位点均是一个蛋白酶识别序列，当肝素酶I被表达出来后，肝素酶I可能会遭受蛋白酶的攻击而被降解，尤其是在肝素酶纯化过程中，菌体被裂解后，释放出大量蛋白酶，肝素酶I极易被降解。因此对第2位和第78位的氨基酸位点进行突变改造，将第2位的Gln定点突变为His，将第78位Glu定点突变为Met，能够显著提高肝素酶I的稳定性。同时，通过活性测定，证明对该位点进行突变改造不会影响肝素酶I的活性。

上述点突变后得到的突变型肝素酶Ⅰ在不影响肝素酶I的活性的条件下，相对于现有肝素酶I具有更好的稳定性。

根据本发明的一个方面，一种突变型肝素酶Ⅰ的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（a）、首先合成编码上述突变型肝素酶Ⅰ的核苷酸序列，随后将核苷酸序列与真核细胞重组表达载体结合，得到重组载体；

（b）、将重组载体转入宿主细胞，随后诱导表达，得到突变型肝素酶Ⅰ。

本发明提供的突变型肝素酶Ⅰ的制备方法，该制备方法通过基因工程的方法将合成得到的编码上述突变型肝素酶Ⅰ的核苷酸序列与真核细胞重组表达载体结合得到重组载体，并将重组载体转入宿主细胞诱导表达，得到突变型肝素酶Ⅰ。该制备方法可以大规模的生产突变型肝素酶Ⅰ，具有生产效率高、经济性强的优势，同时对环境友好，有效缓解了现有肝素酶I产品制备工艺复杂、产量低、环境污染大且价格昂贵的问题。

根据本发明的一个方面，本发明提供的上述突变型肝素酶Ⅰ可广泛应用于含肝素酶Ⅰ的产品的制备中。

下面将结合实施例和效果例对本发明的技术方案进行进一步地说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买得到。

实施例1 突变型肝素酶Ⅰ核苷酸序列的合成并构建表达载体

（a）、检索UniProt库获取肝素黄杆菌肝素酶I的蛋白质序列（AccessionNo.Q05819），将该序列录入密码子偏爱性分析工具Gene designer软件中；

（b）、按照毕赤酵母密码子偏爱性数据表中毕赤酵母的密码子使用偏好，将该蛋白质序列逆翻译为DNA序列，使该DNA序列的密码子均为毕赤酵母偏爱的（使用在线密码子优化工具进行验证）。同时，我们将Q05819的从22位到384位氨基酸的蛋白质序列输入在线工具“PeptideCutter”中，进行潜在蛋白酶切位点预测；

（c）、对潜在的蛋白酶切位点进行突变改造，具体地，将现有肝素酶I的氨基酸序列第2位的Gln定点突变为His，第78位Glu定点突变为Met；

（d）、将改造后的序列送到上海生工进行全序列合成，得到突变型肝素酶Ⅰ核苷酸序列。

随后通过分子生物学常规手段将上述的得到的突变型肝素酶Ⅰ核苷酸序列与pPIC9K真核细胞重组表达载体连接，构建pPIC9k-hepA重组表达载体。

实施例2表达载体的电转化

一、首先制备GS115感受态细胞：

（1）、从YPD平板上挑取酵母GS115单菌落，接种于5ml YPD液体培养基中，于29℃、180rpm振荡培养过夜；接种1mL过夜培养的GS115菌液于100mL YPD培养基中，29℃、180rpm振荡培养至OD600值约为 1.3-1.5；

（2）、取GS115菌液50mL，于4℃、4000rpm离心5min收集菌体，弃上清，吸尽残液；加入40mL冰预冷的无菌水洗涤菌体，于4℃、4000rpm离心5min，弃上清；并重复该步骤一次；

（3）、再加10 mL冰预冷的无菌水洗涤菌体，于4℃4000rpm离心5min，弃上清；用2mL冰预冷的1M山梨醇重悬菌体，于4℃4000rpm离心 5min，弃上清；加入100μL冰预冷的1M山梨醇重悬菌体，使菌液体积大约为 150-200μL，即为GS115感受态细胞。

二、电转化：

（a）、取80μl制备好的GS115感受态细胞，加入实施例1得到的pPIC9k-hepA重组表达载体，缓慢混匀，然后迅速加到预冷的0.2cm电转杯中，660V、100Ω电击一次，迅速取出，缓慢加入lmL预冷的山梨醇，用枪轻柔的吹打均匀，将菌液转至无菌的1.5mL EP管中，用封口膜封住管口，放入30℃水浴锅温育l-2h。

（b）、将pPIC9k-hepA转化酵母菌涂布在MD平板上，28℃，倒置培养2～3天。

实施例3转化克隆的鉴定

参照酵母基因组提取试剂盒的使用方法提取酵母基因组，具体操作步骤如下：

随机挑取实施例2倒置培养2～3天后，平板上长出的酵母单克隆，接种到10mLYPD培养基中，28℃，250rpm振荡培养过夜；取lmL菌液于1.5mL EP管中，12000rpm离心2min；弃上清，用涡旋振荡仪将酵母细胞团充分打散；取300μL酵母裂解液重悬细胞沉淀；放于70℃水浴锅中，温浴15-30min，取出放置冰上5min；

然后自然降温至室温；取100uL蛋白沉淀液，用涡旋振荡仪高速连续振荡混匀20s，冰浴5min；12000rpm离心5min，小心将上清转移至另一新的EP管中；取等体积预冷的异丙醇，轻柔颠倒数十次至出现絮状沉淀，12000rpm离心1min；弃上清，加入1mL 70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心1min；弃上清，待乙醇挥发完全，加入双蒸水重新溶解DNA沉淀。以提取的酵母基因组DNA为模板进行PCR扩增，1.0％ Agarose电泳检测PCR扩增结果。

实施例4突变型肝素酶I的诱导表达

所述突变型肝素酶I的诱导表达包括依次进行的一级菌种的活化和3L发酵体积突变型肝素酶Ⅰ的诱导表达两个步骤：

（1）、一级菌种的活化：

取实施例2得到的pPIC9k-hepA转化酵母菌按1％的接种量接至装有10mLYPD培养基的50mL三角瓶中，于28℃、250rpm振荡培养16-20h，至OD600为2-6，然后以1％的接种量接至含200mLYPD培养基的lL三角瓶中，28℃、250rpm振荡培养24小时左右，作为种子液上罐。

（2）、3L发酵体积突变型肝素酶Ⅰ的诱导表达：

灭菌前，依据发酵罐操作说明对溶氧电极、温度电极、pH电极和甲醇在线控制电极进行校准；然后，准备甘油、磷酸、消泡剂等试剂，配制1.2L BSM培养基；然后连接各组装原件并检查发酵罐各部件组装是否正确，最后进行121℃，30min高压灭菌。接种前，连接3L发酵罐各部件，如冷凝循环水通路：温度电极等，通过冷凝水、转速和通气量使罐体温度快速下降，通过补加氨水调节培养基的pH值，当罐体温度为28℃，pH值为6.0左右时，将空气量调到250vvm，压力0.07MPa，转速850rpm，进行溶氧100％的标定，然后将转速调回至500rpm，空气量100vvm，压力0.07Mpa，进行接种。

发酵过程中，营养生长阶段，培养温度通过循环冷凝水控制温度在28℃，通过氨水和磷酸控制pH在6.0左右，通过调节通气量(0～250L/h)，使溶解氧体积分数(DO)保持在30％左右。

当初始培养基中的甘油耗尽后通过DO控制补加甘油，进入甘油期，当DO高于30％时，开始补加甘油每10s工作1s，待甘油完全耗尽，饥饿1小时后开始进行100％甲醇(补加的甲醇含33.3mL/L的PTM2微量元素)诱导培养，设置甲醇浓度为0.25％。每24h进行取样，进行相关指标测定。发酵96小时后停止发酵，离心收集发酵液。在发酵的整个过程中由发酵罐控制系统进行在线控制和数据采集。

实施例5突变型肝素酶I的纯化

1、取实施例4诱导表达后的发酵液进行低温离心，4000g、4摄氏度离心20min，收集上清。

2、将上清液用超滤系统浓缩至原体积1/10，然后对His Binding buffer（20mMPB，0.5M NaCl，pH7.4）透析过夜，中间换液3次。

3、镍金属螯合层析柱的准备：取直径50mm，高20cm的层析柱一根，按标准方法装填入150mL Ni Sepharose HP（GE healthcare）,用His Eluting buffer（20mM PB，0.5MNaCl，0.5M咪唑，pH7.4）和His Binding buffer依次平衡，将透析好的样品溶液上样，再用His Binding buffer平衡后；

分别用10%和50%的His Eluting buffer洗脱，分别收集洗脱峰，SDS-PAGE电泳鉴定。

所述突变型肝素酶I的纯化数据如表1所示：

表 1 ： 突变型肝素酶 I 的纯化数据

组别	体积（ ml ）	总蛋白（ mg ）	总活性（ IU ）	比活性（ IU/mg ）	得率（ % ）
						发酵液 上清	800	16260	31450	0.28	100
穿透液	900	12290	2784	0.034	---
						10% 洗脱液	200	3600	736	0.43	---
50% 洗脱液	140	262	26724	102	85

注：纯化中所述的“得率”是指目的蛋白大部分所处的组分（被回收的目的蛋白），因穿透和10%组分是为了去除杂蛋白，随杂蛋白一起丢弃的目的蛋白为目的蛋白损失，不计算得率。

根据上表数据可知，目的蛋白位于50%洗脱组分。在纯化过程中，对50%洗脱组分（250mM咪唑洗脱组分）共分4管进行收集，其中，目的蛋白主要集中在管1、2、3中，峰尾所在的第4管目的蛋白含量很低。

所述SDS-PAGE电泳鉴定结果如图1所示。

图1为本发明实施例5提供的突变型肝素酶I的纯化电泳鉴定结果图；其中，从左至右，Lane1为第4管250mM咪唑洗脱组分1；Lane 2为第3管250mM咪唑洗脱组分2；Lane 3为第2管250mM咪唑洗脱组分3；Lane 4为第1管250mM咪唑洗脱组分4；Lane 5为500mM咪唑洗脱组分5；Lane 6为蛋白质marker；Lane 7为镍柱上样样品；Lane 8为镍柱穿透样品。

效果例1

为表明本发明得到的突变肝素酶I相对于现有肝素酶I具有更好的稳定性，现分别用加速实验法和长期稳定性检测方法进行效果实验。具体地，分别将天然提取的肝素酶I和本申请实施例5纯化得到的突变型肝素酶I分装后分别放置于-40℃、4℃和37℃进行稳定性考察，考察结束后分别用232nm光度法进行评价，具体评价结果如表2、3所示，同时对37℃加速稳定性实验后的样品进行蛋白电泳，其结果如图2所示。

具体的232nm光度法检测方法为：取3mL反应缓冲液加入石英比色皿中，加入60μL肝素钠底物，之后加入50μL酶液，混匀后动力学分析模式监测232nm处吸收值变化。时长3min。若酶活太高，可以稀释后检测。

232nm光吸收法：肝素酶以氢消除反应机制来分解肝素与硫酸肝素，这个机制会在糖醛酸的四号碳和五号碳之间产生一个不稳定的双键。由于这个具有不稳定双键的糖醛酸会吸收232nm的紫外光，因此可以用232nm光吸收的变化来测定肝素酶的活性。

表2：4℃长期稳定性检测实验数据

表3：37℃加速稳定性检测实验数据

如图2所示，所述图2为37℃加速稳定性实验后的样品蛋白电泳图，其中，lane1为-40℃冻存肝素酶I样品对照、Lane2为本发明突变肝素酶I样品、Lane3为天然肝素酶I样品、Lane4为分子量marker。

由上图可知，本发明突变肝素酶I样品与-40℃冻存肝素酶I样品在加速稳定性方面没有明显的差异，而天然肝素酶I样品在加速稳定性检测过程中由于蛋白酶酶切等原因，产生了很多小分子量杂带，说明其稳定性较差。由此可知，本发明突变型肝素酶Ⅰ在不影响肝素酶I的活性的条件下，相对于现有肝素酶I具有更好的稳定性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (3)

1.一种突变型肝素酶Ⅰ，其特征在于，所述突变型肝素酶Ⅰ的氨基酸序列如Seq No.01所示。

2.一种根据权利要求1所述突变型肝素酶Ⅰ的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（a）、首先合成编码权利要求1所述的突变型肝素酶Ⅰ的核苷酸序列，随后将核苷酸序列与真核细胞重组表达载体结合，得到重组载体；

（b）、将重组载体转入宿主细胞，随后诱导表达，得到突变型肝素酶Ⅰ。

3.如权利要求1所述的突变型肝素酶Ⅰ在制备含肝素酶Ⅰ的产品中的应用。