CN107475268B

CN107475268B - 来源于木霉的脂肪酶基因及其相关产品与应用

Info

Publication number: CN107475268B
Application number: CN201710695723.1A
Authority: CN
Inventors: 顾金刚; 王宇洲; 马锐; 李世贵; 龚明波; 向杰; 陈敬师
Original assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Current assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Priority date: 2017-08-15
Filing date: 2017-08-15
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2037-08-15
Also published as: CN107475268A

Abstract

本发明公开了来源于木霉的脂肪酶基因及其相关产品与应用。该脂肪酶基因是编码序列为序列2的第13‑1659位的TlLipA基因或编码序列为序列2的第1‑1659位的RTlLipA基因。TlLipA基因或RTlLipA基因表达的蛋白质具有脂肪酶活性，该蛋白质的脂肪酶的最适pH是9.5、最适温度是50℃，该蛋白质的脂肪酶活性可被表面活性剂Triton X100、Tween 20和SDS增强；该蛋白质在pH值6‑9的条件下脂肪酶活性稳定。TlLipA基因或RTlLipA基因表达的蛋白质是对表面活性剂具有强耐受性的碱性嗜温脂肪酶，可应用于洗涤行业。

Description

来源于木霉的脂肪酶基因及其相关产品与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中来源于木霉的脂肪酶基因及其相关产品与应用。

背景技术

脂肪酶(EC 3.1.1.3)被认为是最重要的商业酶之一，在快速增长的生物技术领域引起了极大的关注。脂肪酶可以在油和水的界面催化三酰基甘油水解，释放二酰基甘油酯，长链脂肪酸(>10个碳)和甘油。在水解过程中，脂肪酶与底物酰基结合形成脂肪酶-酰基复合物，然后将酰基转移到水分子的羟基基团上从而实现水解。在非水溶条件下，脂肪酶可以将羧酸的酰基转移到亲核试剂。根据蛋白质结构的相似性，脂肪酶属于α/β水解酶家族，其中催化三联体(通常是丝氨酸，组氨酸和天冬氨酸或谷氨酸)和氧阴离子孔(即活性位点中的口袋)对催化至关重要，其盖子的结构决定了底物对催化位点的可接近性和可结合性。

微生物来源的脂肪酶广泛用于各领域，包括工业，食品，饲料，医疗。自20世纪60年代以来，加酶洗涤剂已被引入全球市场，能够有效去除甘油酯和脂肪酸的脂肪酶成为洗涤剂的主要添加剂之一。脂肪酶在工业和环境上的应用意义包括但不限于：脂肪酶为洗涤剂提供更强的去污力，特别是在低温和轻中度碱性洗涤环境下；具有低底物特异性的脂肪酶能够非常有效地去除顽固性污渍，例如血液或脂肪；脂肪酶不仅具有很高的生物降解能力，而且对水生生态系统无有害影响。然而，几个瓶颈限制了脂肪酶在洗涤剂中的应用，例如低底物特异性的脂肪酶很难获得，严格的洗涤条件(低温和碱性条件)以及脂肪酶对洗涤剂中化学物质的敏感性等等。前期研究表明来源于细菌和酵母的部分脂肪酶具有高温活性，如来自铜绿假单胞菌(嗜热芽孢杆菌)和酵母Kurtzmanomyces sp.的脂肪酶的最适温度为60-75℃，大大高于一般洗涤的温度(20-40℃)。虽然一些细菌来源的脂肪酶具有适碱性，但是在高于pH9.0的条件下酶活很低，大大降低了在洗涤剂中应用的可能。此外，脂肪酶对表面活性剂的敏感性也大大降低了其在洗涤剂中的应用。因此，获得对表面活性剂具有强耐受性的碱性中低温脂肪酶，在洗涤行业具有重大的应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何获得对表面活性剂具有强耐受性的碱性嗜温脂肪酶。

为了解决以上技术问题，本发明提供了下述DNA分子，所述DNA分子为TlLipA基因或RTlLipA基因；

所述TlLipA基因是如下T1)或T2)所示的DNA分子：

T1)编码序列为SEQ ID No.2的第13-1659位的DNA分子；

T2)与T1)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码氨基酸序列是SEQ IDNo.3的第5-552位氨基酸残基的蛋白质的DNA分子；

所述RTlLipA基因是如下R1)或R2)所示的DNA分子：

R1)编码序列为SEQ ID No.2的第1-1659位的DNA分子；

R2)与R1)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码氨基酸序列是SEQ IDNo.3的蛋白质的DNA分子。

上述DNA分子中，所述DNA分子可来源于Trichoderma lentiforme，如来源于Trichoderma lentiforme ACCC 30425。

上述DNA分子中，编码序列为SEQ ID No.2的第13-1659位的DNA分子来源于Trichoderma lentiforme ACCC 30425。

上述DNA分子中，编码序列为SEQ ID No.2的第1-1659位的DNA分子是重组DNA分子。

上述DNA分子中，具有90％以上的同一性可为具有至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

为了解决以上技术问题，本发明提供了具有脂肪酶活性的蛋白质。

本发明所提供的蛋白质，为如下P1)或P2)：

P1)、所述蛋白质的氨基酸序列包括SEQ ID No.3的第5-552位氨基酸残基且具有脂肪酶活性；

P2)、所述蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No.3的第5-552位氨基酸残基具有90％以上的同一性且具有脂肪酶活性。

上述蛋白质中，所述蛋白质可来源于Trichoderma lentiforme，如来源于Trichoderma lentiforme ACCC 30425。

上述蛋白质中，所述蛋白质具体可为氨基酸序列是SEQ ID No.3的第5-552位氨基酸残基的蛋白质或氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质。

其中，氨基酸序列是SEQ ID No.3的第5-552位氨基酸残基的蛋白质名称为TlLipA，来源于Trichoderma lentiforme ACCC 30425；氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质名称为RTlLipA，是重组的蛋白质。

上述蛋白质中，具有90％以上的同一性可为具有至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

本文中，术语“同一性”指与核酸序列或氨基酸的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

与上述蛋白质相关的生物材料也属于本发明的保护范围。所述生物材料具体可为下述B1)至B15)中的任一种：

B1)编码所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为上述T1)或T2)所示的DNA分子。

上述生物材料中，所述重组载体可为pPIC9-RTlLipA，pPIC9-RTlLipA是用核苷酸序列是SEQ ID No.1的第4-1664位的DNA替换pPIC9的EcoRI和NotI识别位点间的片段(包括EcoRI识别位点和NotI识别位点在内的小片段)，保持pPIC9的其它序列不变，得到的RTlLipA基因重组表达载体。

上述生物材料中，所述重组微生物可为E1)或E2)：

E1)所述重组微生物为将所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，所述受体微生物可为C1)-C4)中的任一种:

C1)真核微生物；

C2)酵母；

C3)毕赤酵母属真菌；

C4)巴斯德毕赤酵母，如巴斯德毕赤酵母GS115。

E2)所述重组微生物为将所述pPIC9-RTlLipA导入巴斯德毕赤酵母GS115得到的分泌表达氨基酸序列是SEQ ID No.3的重组蛋白质(名称为RTlLipA)的重组巴斯德毕赤酵母。

上述生物材料中，B9)至B16)可包括繁殖材料也可不包括繁殖材料。

所述DNA分子、所述蛋白质或所述生物材料在制备脂肪酶中的应用也属于本发明的保护范围。

为了解决以上技术问题，本发明提供了制备脂肪酶的方法。

本发明所提供的制备脂肪酶的方法，包括：使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达，得到脂肪酶；所述生物为微生物、植物或非人动物。

上述方法中，所述微生物可为C1)-C4)中的任一种:

C1)真核微生物；

C2)酵母；

C3)毕赤酵母属真菌；

C4)巴斯德毕赤酵母。

上述方法中，使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述蛋白质。

上述方法中，使所述受体微生物可为C1)-C4)中的任一种:

C1)真核微生物；

C2)酵母；

C3)毕赤酵母属真菌；

C4)巴斯德毕赤酵母，如巴斯德毕赤酵母GS115。

上述方法中，所述重组微生物可为将所述pPIC9-RTlLipA导入巴斯德毕赤酵母GS115得到的分泌表达氨基酸序列是SEQ ID No.3的重组蛋白质(名称为RTlLipA)的重组巴斯德毕赤酵母。

上述方法中，在表达后包括收集分泌到胞外的蛋白质(分泌表达的蛋白质)，得到脂肪酶。

实验证明，本发明的TlLipA基因或RTlLipA基因表达的蛋白质具有脂肪酶活性，该蛋白质的脂肪酶的最适pH是9.5、最适温度是50℃，该蛋白质的脂肪酶活性可被表面活性剂Triton X100、Tween 20和SDS增强；该蛋白质在pH值6-9的条件下脂肪酶活性稳定。TlLipA基因或RTlLipA基因表达的蛋白质是对表面活性剂具有强耐受性的碱性嗜温脂肪酶，可应用于洗涤行业。

附图说明

图1为SDS-PAGE电泳图谱。图中，M为蛋白质分子量标准；1为0.3mg/mL纯化的脂肪酶RTlLipA酶液，2为3mg/mL纯化的脂肪酶RTlLipA酶液。

图2为pH对RTlLipA活性的影响(A)、温度对RTlLipA活性的影响(B)、RTlLipA的热稳定性(C)和RTlLipA的pH稳定性(D)。

图3为金属离子和化学试剂对RTlLipA活性的影响。

图4为表面活性剂对RTlLipA活性的影响。

图5为RTlLipA的表面活性剂SDS稳定性。图中，20％、10％、1％和0％分别表示反应体系中SDS的浓度分别为10.0μmM、5.0μmM、0.5μM和0μM。

图6为RTlLipA的表面活性剂Triton X100稳定性。

图7为脂肪酶RTlLipA的底物特异性。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的木霉(Trichoderma lentiforme)ACCC 30425于2008年6月8日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(又称中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。木霉(Trichoderma lentiforme)ACCC30425在下文简称Trichodermalentiforme ACCC 30425。

下述实施例中，Trans1-T1抗噬菌体化学细胞为TransGen Biotech Co.(中国北京)产品，脂肪酶表达载体pPIC9和巴斯德毕赤酵母GS115为Invitrogen(美国加州)产品。

实施例1、制备对表面活性剂具有强耐受性的碱性嗜温脂肪酶

1、制备脂肪酶

将Trichoderma lentiforme ACCC 30425在PDB(马铃薯葡萄糖肉汤)培养基上生长活化，将活化的Trichoderma lentiforme ACCC 30425加入到含有200mL脂肪酶诱导培养基(5g葡萄糖，5g NaNO₃，5g K₂HPO₄，0.3g MgSO₄.7H₂O，0.01gFeSO₄.7H₂O，10g橄榄油，用水定容至1升)的500mL锥形培养瓶中生长，在28℃下180rpm培养5-7天。每天检测脂肪酶活性，并在活性降低时立即用滤纸收集Trichoderma lentiforme ACCC 30425菌丝体。Trichodermalentiforme ACCC30425菌丝体在液氮中快速冷冻，用研钵和研杵粉碎用以基因组DNA的提取。将按照CTAB法提取Trichoderma lentiforme ACCC 30425的基因组DNA作为模板，PCR扩增得到核苷酸序列是SEQ ID No.1的PCR产物。SEQ ID No.1的第10-1656位核苷酸(SEQ IDNo.2的第13-1659位核苷酸)为TlLipA基因，编码氨基酸序列是SEQ ID No.3的第5-552位氨基酸残基的脂肪酶TlLipA。

将该PCR产物和pPIC9质粒由EcoRI和NotI限制性内切核酸酶切割，将TlLipA基因连接到pPIC9载体中并转化到Trans1-T1中。重组质粒被分离并测序。将测序结果表明是用核苷酸序列是SEQ ID No.1的第4-1664位的DNA替换pPIC9的EcoRI和NotI识别位点间的片段(包括EcoRI识别位点和NotI识别位点在内的小片段)，保持pPIC9的其它序列不变，得到的重组表达载体命名为pPIC9-RTlLipA。pPIC9-RTlLipA中含有核苷酸序列为SEQ ID No.2的第1-1659位的DNA分子，该DNA分子即为RTlLipA基因。将pPIC9-RTlLipA导入巴斯德毕赤氏酵母GS115可获得氨基酸序列是SEQ ID No.3的脂肪酶RTlLipA。

将pPIC9-RTlLipA用BglII线性化，利用Pulser Xcell电转仪(Bio-Rad，Hercules，CA)，按照Invitrogen公司的方案(2,000V，200Ω，25μF和5ms)的说明，将线性化质粒电转化入巴斯德毕赤氏酵母GS115感受态细胞中，得到转入pPIC9-RTlLipA的重组巴斯德毕赤氏酵母，将其命名为GS115/pPIC9-RTlLipA。GS115/pPIC9-RTlLipA在MD培养基在32℃下培养2天。将菌落转移到BMGY培养基中，并在30℃下生长2天。通过离心(8000rpm/min)离心收集细胞，并将其重悬于甲醇复合培养基(BMMY)中，在30℃下诱导2天，每天加入甲醇至其浓度为0.5％进行诱导。4℃环境12000g离心10分钟收集上清液，并通过5-kDa分子量截留的Vivaflow 200膜(Vivascience，Germany)浓缩，得到粗酶。将粗酶加载到HiPrepTm 26/10脱盐柱进行脱盐，再在HiTrapQHP柱(GE Healthcare)上进行阴离子交换层析纯化。该阴离子交换层析纯化所用的洗脱程序为NaCl线性梯度洗脱；NaCl线性梯度洗脱采用NaCl线性梯度洗脱液进行洗脱，NaCl线性梯度洗脱液的pH值为8.0，由溶剂和溶质组成；溶质为NaCl，溶剂为pH值为8.0的20mM的Tris–HCl缓冲液；NaCl线性梯度洗脱的时间是5min；NaCl线性梯度洗脱中NaCl的浓度在5min内由0M匀速升至1M。合并含有脂肪酶活性的同一组分，并通过超滤管(5kDa分子量截留)进一步浓缩，冻干，得到纯化的脂肪酶RTlLipA。将纯化的脂肪酶RTlLipA进行SDS-PAGE电泳分离，在SDS-PAGE电泳胶图中显示纯化的脂肪酶RTlLipA为61kDa的单条带(图1)。

2、脂肪酶RTlLipA的酶学特性

将步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA溶于pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液中，得到脂肪酶RTlLipA溶液(酶液)，使用Bradford方法测定脂肪酶RTlLipA溶液的蛋白质浓度，用牛血清白蛋白作为标准。

采用对硝基苯酚(p-NP)法测定步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA的脂肪酶活性。具体方法如下：配制p-NP标准溶液(p-NP的浓度为8mM，用缓冲溶液配制)；将p-NP标准溶液用缓冲溶液稀释成适当的梯度，分别测定吸光度，绘制吸光度-浓度关系曲线。取2.4mL底物溶液(称取适量对硝基苯酚正辛酸酯p-NPO，溶解于缓冲液，p-NPO的浓度为0.8mM)，待测温度下预热5min后加入0.1mL酶液，该待测温度下反应15min后立即加入2.5mL无水乙醇混合均匀，放置5min终止反应；用0.1mL pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液替换0.1mL酶液，其他条件不变，即得空白；于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出酶活力。酶活定义以及计算公式：脂肪酶酶活力单位定义为：在一定条件下，每分钟释放出1μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U)。计算公式：X＝cV/tVˊ(式中：X为脂肪酶活力，U/mL；c为对硝基苯酚浓度，μmol/L；V反应液终体积，mL；Vˊ为酶液的用量，mL；t为作用时间，min。根据酶液中的蛋白质浓度，得出步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA的脂肪酶比活力(U/mg)。

2.1、pH对RTlLipA活性的影响

在37℃(待测温度)下，按照上述对硝基苯酚法在以下缓冲液中测定步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA的脂肪酶活性的最适pH值：25mM柠檬酸-Na₂HPO₄，pH 5.0-7.0和20mMTris-HCl，pH 7.0-10.0。即用该缓冲溶液作为溶剂配制底物溶液和p-NP标准溶液。其中，底物为对硝基苯酚正辛酸酯(p-NPO)。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为：在37℃下，pH9.5的条件下每分钟释放出1μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U)。

结果表明步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA的脂肪酶活性在酸性条件下处于较差状态，同时从pH7开始稳定增加，直到pH达到最佳pH值为9.5(图2中(A))。

2.2、温度对RTlLipA活性的影响

按照上述对硝基苯酚法，用pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液作为溶剂配制底物溶液和p-NP标准溶液。其中，底物为对硝基苯酚正辛酸酯(p-NPO)。

取2.4mL底物溶液，待测温度(分别为20、30、40、45、50和60℃)预热5min后加入0.1mL酶液，相应待测温度下反应15min后立即加入2.5mL无水乙醇混合均匀，放置5min终止反应；用0.1mL pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液替换0.1mL酶液，其他条件不变，即得空白；于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出酶活力。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为：在50℃下，pH9.5的条件下每分钟释放出1μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U)。结果表明最适温度为50℃，活性在最适温度的中温区保持稳定，但由于超热失活，

有明显降低。步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA在50℃的脂肪酶比活力为25U/mg(图2中(B))。

2.3、RTlLipA的热稳定性

按照上述对硝基苯酚法，用pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液作为溶剂配制底物溶液和p-NP标准溶液。其中，底物为对硝基苯酚正辛酸酯(p-NPO)。将步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA溶于pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液中，得到酶液，将该酶液分别在40℃和50℃温育一定时间(0分钟，2分钟，5分钟，10分钟，15分钟，20分钟，30分钟，60分钟和120分钟)，得到待测酶液，在最适反应条件(pH 9.5,50℃，15分钟)下测定残留脂肪酶活性，测定热稳定性。将在40℃温育0分钟的待测酶液的脂肪酶活力定义为100％。

具体方法如下：取2.4mL底物溶液，50℃预热5min后加入0.1mL酶液，50℃反应15min后立即加入2.5mL无水乙醇混合均匀，放置5min终止反应；用0.1mL缓冲溶液替换0.1mL酶液，其他条件不变，即得空白；于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出酶活力。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为：在50℃下，pH9.5的条件下每分钟释放出1μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U)。

结果表明随着温育时间的增加，两者的相对活性数呈下降趋势，温育开始时确实没有显着差异，但在40℃时，活性在80分钟内从80％缓慢下降到50％。相反，50℃线从2min开始，在10min内逐渐从80％降至25％，持续降低至120min(图2中(C)))。

2.4、RTlLipA的pH稳定性

按照上述对硝基苯酚法，用pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液作为溶剂配制底物溶液和p-NP标准溶液。其中，底物为对硝基苯酚正辛酸酯(p-NPO)。分别用2.1的缓冲液(pH5.0-10.0)作为溶剂稀释100倍步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA，得到酶液，将该酶液在37℃保温1小时后，得到待测酶液。将步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA溶于pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液中，得到的脂肪酶RTlLipA溶液(酶液)直接作为测酶液，测得的酶活力定义为100％。

将待测酶液在最适反应条件(pH 9.5,50℃，15分钟)下测定残留脂肪酶活性，测定pH稳定性。具体方法如下：取2.4mL底物溶液，50℃预热5min后加入0.1mL酶液，50℃反应15min后立即加入2.5mL无水乙醇混合均匀，放置5min终止反应；用0.1mL缓冲溶液替换0.1mL酶液，其他条件不变，即得空白；于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出酶活力。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为：在50℃下，pH9.5的条件下每分钟释放出1μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U)。相对酶活在最佳条件下以酶的最大活性的百分比表示，没有任何预温浴。

结果表明从pH5到pH6，中性或微碱性溶液(pH6-9)的活性从22％逐渐上升到70％，百分比稳定在70％到80％之间。而碱性缓冲液中活性急剧下降(图2中(D))。

2.5金属离子和化学试剂对RTlLipA活性的影响

为了找出添加剂对RTlLipA的影响，将添加剂(Mg²⁺，K⁺，Na⁺，Ca²⁺，Ag⁺，Mn²⁺，Zn²⁺，Ni² ⁺、EDTA或β-巯基乙醇)加入到反应体系，它们在反应体系中的浓度均为5mM。没有任何添加剂的体系用作CK(control)，将CK的脂肪酶酶活定义为100％。按照上述对硝基苯酚法，测定残留活性。

按照上述对硝基苯酚法，用pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液作为溶剂配制底物溶液和p-NP标准溶液。其中，底物为对硝基苯酚正辛酸酯(p-NPO)。具体方法如下：取2.4mL底物溶液，50℃预热5min后加入0.1mL酶液(将步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA溶于pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液中，得到酶液)，加入金属离子盐至金属离子的浓度为5mM，或加入EDTA至其浓度为5mM，或加入β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)至其浓度为5mM，50℃反应15min后立即加入2.5mL无水乙醇混合均匀，放置5min终止反应；用0.1mL缓冲溶液替换0.1mL酶液，其他条件不变，即得空白；将没有上述添加剂的体系作为control；于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出酶活力。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为：在50℃下，pH9.5的条件下每分钟释放出1μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U)。其中，金属离子盐分别为MgCl₂，KCl，NaCl，CaCl₂，AgNO₃，MnCl₂，ZnSO₄，ZnCl₂，NiSO₄。将control的脂肪酶酶活定义为100％。

结果表明离子添加没有导致脂肪酶活性的促进。相比之下，除了Ag⁺之外，重金属Mn²⁺，Zn²⁺和Ni²⁺显著限制了活性，与对照相比，脂肪酶活性降低了约10倍。对于轻金属，它们对活性的影响不大。还检测了两种常见的化学试剂EDTA和β-巯基乙醇，其对RTlLipA具有明确的影响(约50％限制)(图3)。

2.6表面活性剂对RTlLipA活性的影响

表面活性剂是洗涤剂中的常见成分，本实验选择了吐温20(Tween20)，吐温80(Tween80)，SDS和Triton X100作为添加剂加入到反应体系中形成四种浓度梯度为0.50％，0.20％，0.10％和0.05％，研究表面活性剂对脂肪酶的影响。将没有任何添加剂的反应体系设定为对照，将对照的脂肪酶酶活定义为100％。按照上述对硝基苯酚法，测定残留活性。具体方法如下：取2.4mL底物溶液(用pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液作为溶剂配制0.8mM的对硝基苯酚正辛酸酯(p-NPO)溶液作为底物溶液)，在50℃预热5min后加入0.1mL酶液(用pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液作为溶剂溶解步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA，得到酶液)，加入Tween20至其在反应体系中的体积浓度分别为0.50％，0.20％，0.10％和0.05％，或加入Tween80至其在反应体系中的体积浓度分别为0.50％，0.20％，0.10％和0.05％，或加入SDS至其在反应体系中的质量百分浓度分别为0.50％，0.20％，0.10％和0.05％，或加入Triton X100至其在反应体系中的体积浓度分别为0.50％，0.20％，0.10％和0.05％，50℃下反应15min或60min后立即加入无水乙醇混合均匀，放置5min终止反应；将0.1mL pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液替换0.1mL酶液，其他条件不变，即得空白；将没有上述添加剂的体系作为对照，在50℃下反应15min的脂肪酶酶活作为100％；于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出脂肪酶的酶活力。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为：在50℃下，pH9.5的条件下每分钟释放出1μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U)。

结果如图4所示，表明向反应体系中加入SDS(0.1％，0.2％和0.5％)，RTlLipA的脂肪酶活性显着增加，此外，SDS组的活性随着反应时间的增加逐渐升高。其次是Triton X100和Tween 20和SDS，它们刺激了活性，添加的越多，它们显示的活性就越高。对于吐温80组，无论加入多少，反应时间长短，与对照相比，活性均有稳定抑制。

2.7、RTlLipA的表面活性剂SDS稳定性

按照上述对硝基苯酚法，用pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液作为溶剂溶解步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA，得到酶液，向该酶液中分别加入SDS，分别得到含有10.0μmM、5.0μmM、0.5μM和0μM的SDS的体系，在37℃温育不同时长(0h，1h，3h，6h)，得到待测酶液，在最适条件(pH 9.5,50℃，15分钟)下测定残留脂肪酶活性，测定RTlLipA的表面活性剂SDS稳定性。将酶液在0μM的SDS 37℃温育0分钟的待测酶液的脂肪酶活力定义为100％。

具体方法如下：取2.4mL底物溶液(用pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液作为溶剂配制0.8mM的对硝基苯酚正辛酸酯(p-NPO)溶液作为底物溶液)，在50℃预热5min后加入0.1mL待测酶液，50℃下反应15min后立即加入无水乙醇混合均匀，放置5min终止反应；将0.1mLpH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液替换0.1mL酶液，其他条件不变，即得空白；于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出脂肪酶的酶活力。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为：在50℃下，pH9.5的条件下每分钟释放出1μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U)。

结果如图5所示，表明在相同的温育时间，添加的SDS越多，获得的脂肪酶活性越大(最多为400％)，但随着温育时间的延长，RTlLipA开始在1小时内逐渐失去活性。

2.8、RTlLipA的表面活性剂Triton X100稳定性

按照上述对硝基苯酚法，用pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液作为溶剂溶解步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA，得到酶液，向该酶液中分别加入Triton X100，分别得到含有体积百分比浓度分别为30％，10％、1％和0％的Triton X100的体系，在37℃温育不同时长(0h，1h，3h，6h)，得到待测酶液，在最适条件(pH 9.5,50℃，15分钟)下测定残留脂肪酶活性，测定RTlLipA的表面活性剂Triton X100稳定性。将酶液在0％的Triton X100 37℃温育0分钟的待测酶液的脂肪酶活力定义为100％。

结果如图6所示，表明在添加了Triton X100的这些实验组中，10％的添加浓度在任何时间都显示比任何其他浓度高的活性，随后是1％。此外，增加浓度的30％不能提供比对照更高的活性，尽管它增加了RTlLipA的稳定性。

2.7、底物特异性和动力学参数

为了确定底物特异性，通过用六种底物，即p-NPB(对硝基苯酚正丁酸酯，C4)，p-NPO(对硝基苯酚正辛酸酯，C8)，p-NPD(对硝基苯酚正癸酸酯，C10)，对p-NPDD(对硝基苯酚月桂酸酯，C12)，p-NPM(对硝基苯酚豆蔻酸酯，C14)和p-NPP(对硝基苯酚棕榈酸酯，C16)。在这种情况下，它们都是具有各种长度的酰基链(C4-C16)的对硝基苯基酯。用pH9.5的20mMTris-HCl缓冲溶液作为溶剂配制底物溶液。

具体方法如下：取2.4mL底物溶液，在50℃预热5min后加入0.1mL酶液(用pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液作为溶剂溶解步骤1中纯化的脂肪酶RTlLipA，得到酶液)，50℃下反应5min后立即加入无水乙醇混合均匀，放置5min终止反应；将0.1mL pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液替换0.1mL酶液，其他条件不变，即得空白；于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出脂肪酶的酶活力。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为：在50℃下，pH9.5的条件下每分钟释放出1μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U)。

结果确定Michaelis-Menten动力学参数K_m和V_max值分别为上述各种底物浓度为0.2-1.6mM时的动力学性质。通过GraphPad Prism 5(GraphPad Software，USA)计算K_m和V_max。实验组各三次重复。k_cat是每秒催化底物的数量。K_m是反应速度最大的底物浓度。k_cat/K_m是衡量酶在亚饱和底物浓度下将底物转化为产物的有效性的量度,即催化效率。

结果表明脂肪酶RTlLipA活性和亲和力随着碳链长度(从C8到C16)逐渐降低，p-NPB(C4)和p-NPD(C10)之间没有很大的差异(图7)。总体而言，p-NPO(C8)是最佳底物(k_cat/K_m，41.0s^-1mM^-1)。

<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

<120> 来源于木霉的脂肪酶基因及其相关产品与应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1667

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ggggaattcg ctcaaggcca agtcaacgtt accattccct ccggcaacat tatgggtagc 60

tcagttgaag atgtcgagtt tttcaagggc attccctttg ctgatccgcc gattggtgaa 120

ttgcgattca agccgccgca aactctgtca actcacctcg gagattttga cgccacgaag 180

aaggccaagt tgtgctccca agggcccgtc ttcactgtct cgtccaaccc tcaagtggca 240

ccttttgccc taaaagccga gagggagtcg ttcggtaacc cagtgcctcc ggagaatgaa 300

tctgaggact gcttgaccgt cactatccat cgacccgccg gcacagaagc tggggatgac 360

ctaccagtac tattctacat attcggagga ggcttcgtga ttggaggcac gtcggcggca 420

atcaatgatc ccaccgtgtt agttcaaacc ggtattgatc tcggaaagcc cttcatcttt 480

gcagccgtca actatcgcgt tggaggctgg ggtttcatgc ccggcgctga aatcctgcgt 540

gatggaagcg ccaatgccgg ccttctcgac caacgcaagg gccttgaatg ggtagctgac 600

aatattgctg cttttggtgg cgatccctcc aaggtcacca tctggggaca atcctctggc 660

tcaatctccg tttttgagca gctggttctc tacgacggcg acaacactta caatggcaac 720

cctctcttcc gcggtgcaat catgaactcg ggatccgtga ctcctgttga ccctgtagat 780

tcggccaagc cccaggcgct gtatgatcac gttgtcaggg tggccaactg cgaaggcgat 840

gattctttgg attgtcttag gagattgccg aacgatcatt tcgctgcggc ggctaattcg 900

attcctggcc tgatatcgta cgagtccttg gctctctcat atctccctag accagacggc 960

gaggtcttga cggcgagtcc tcatgtcctg gcgcgagaag gcaagttccc tgcggtgccg 1020

atgatcttgg cttcacagga agatgaggga acgttgttta gcttcttcca gggggacatg 1080

ggcactacag atatcatcac cgactatctt aacagtctct actttaccaa taccgatcgg 1140

agtctagtca agtcgtttgt tgagacttat agcgaacgac ttgaggacgg aagcccttat 1200

cgcacaggcg attccaagga cttgttctac tacccaggca aaaagagaat cgcctctatc 1260

cttggcgaca tcgttttcac cttggttcgc cgctggacgc tggagaccat tgccgaagtc 1320

tctccagaga cggccctttg gtcgtcgttt gcttcgtaca actataaacc tttggatatt 1380

tttggtcttg ggactaaaca tgggtcagat accgaagtct ttttcgctcg caacaacagt 1440

gacttcccct cgattaccgg ccggacgtat tacatcaact tcgtgtacaa cggggatccc 1500

aatgaggggc tcgatgtgaa tgtcacttgg ttggggtgga aagaagacag gcagcttctg 1560

tggtacaatg cgacggagaa tgggtatttg gctgataatt tcaggaatgg cagctacaac 1620

tttatcaagg agcatatcga ttcactgatc ttctaggcgg ccgcccc 1667

<210> 2

<211> 1659

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1659)

<223>

<400> 2

tacgtagaat tcgctcaagg ccaagtcaac gttaccattc cctccggcaa cattatgggt 60

agctcagttg aagatgtcga gtttttcaag ggcattccct ttgctgatcc gccgattggt 120

gaattgcgat tcaagccgcc gcaaactctg tcaactcacc tcggagattt tgacgccacg 180

aagaaggcca agttgtgctc ccaagggccc gtcttcactg tctcgtccaa ccctcaagtg 240

gcaccttttg ccctaaaagc cgagagggag tcgttcggta acccagtgcc tccggagaat 300

gaatctgagg actgcttgac cgtcactatc catcgacccg ccggcacaga agctggggat 360

gacctaccag tactattcta catattcgga ggaggcttcg tgattggagg cacgtcggcg 420

gcaatcaatg atcccaccgt gttagttcaa accggtattg atctcggaaa gcccttcatc 480

tttgcagccg tcaactatcg cgttggaggc tggggtttca tgcccggcgc tgaaatcctg 540

cgtgatggaa gcgccaatgc cggccttctc gaccaacgca agggccttga atgggtagct 600

gacaatattg ctgcttttgg tggcgatccc tccaaggtca ccatctgggg acaatcctct 660

ggctcaatct ccgtttttga gcagctggtt ctctacgacg gcgacaacac ttacaatggc 720

aaccctctct tccgcggtgc aatcatgaac tcgggatccg tgactcctgt tgaccctgta 780

gattcggcca agccccaggc gctgtatgat cacgttgtca gggtggccaa ctgcgaaggc 840

gatgattctt tggattgtct taggagattg ccgaacgatc atttcgctgc ggcggctaat 900

tcgattcctg gcctgatatc gtacgagtcc ttggctctct catatctccc tagaccagac 960

ggcgaggtct tgacggcgag tcctcatgtc ctggcgcgag aaggcaagtt ccctgcggtg 1020

ccgatgatct tggcttcaca ggaagatgag ggaacgttgt ttagcttctt ccagggggac 1080

atgggcacta cagatatcat caccgactat cttaacagtc tctactttac caataccgat 1140

cggagtctag tcaagtcgtt tgttgagact tatagcgaac gacttgagga cggaagccct 1200

tatcgcacag gcgattccaa ggacttgttc tactacccag gcaaaaagag aatcgcctct 1260

atccttggcg acatcgtttt caccttggtt cgccgctgga cgctggagac cattgccgaa 1320

gtctctccag agacggccct ttggtcgtcg tttgcttcgt acaactataa acctttggat 1380

atttttggtc ttgggactaa acatgggtca gataccgaag tctttttcgc tcgcaacaac 1440

agtgacttcc cctcgattac cggccggacg tattacatca acttcgtgta caacggggat 1500

cccaatgagg ggctcgatgt gaatgtcact tggttggggt ggaaagaaga caggcagctt 1560

ctgtggtaca atgcgacgga gaatgggtat ttggctgata atttcaggaa tggcagctac 1620

aactttatca aggagcatat cgattcactg atcttctag 1659

<210> 3

<211> 552

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

Tyr Val Glu Phe Ala Gln Gly Gln Val Asn Val Thr Ile Pro Ser Gly

1 5 10 15

Asn Ile Met Gly Ser Ser Val Glu Asp Val Glu Phe Phe Lys Gly Ile

20 25 30

Pro Phe Ala Asp Pro Pro Ile Gly Glu Leu Arg Phe Lys Pro Pro Gln

35 40 45

Thr Leu Ser Thr His Leu Gly Asp Phe Asp Ala Thr Lys Lys Ala Lys

50 55 60

Leu Cys Ser Gln Gly Pro Val Phe Thr Val Ser Ser Asn Pro Gln Val

65 70 75 80

Ala Pro Phe Ala Leu Lys Ala Glu Arg Glu Ser Phe Gly Asn Pro Val

85 90 95

Pro Pro Glu Asn Glu Ser Glu Asp Cys Leu Thr Val Thr Ile His Arg

100 105 110

Pro Ala Gly Thr Glu Ala Gly Asp Asp Leu Pro Val Leu Phe Tyr Ile

115 120 125

Phe Gly Gly Gly Phe Val Ile Gly Gly Thr Ser Ala Ala Ile Asn Asp

130 135 140

Pro Thr Val Leu Val Gln Thr Gly Ile Asp Leu Gly Lys Pro Phe Ile

145 150 155 160

Phe Ala Ala Val Asn Tyr Arg Val Gly Gly Trp Gly Phe Met Pro Gly

165 170 175

Ala Glu Ile Leu Arg Asp Gly Ser Ala Asn Ala Gly Leu Leu Asp Gln

180 185 190

Arg Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asp Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly

195 200 205

Asp Pro Ser Lys Val Thr Ile Trp Gly Gln Ser Ser Gly Ser Ile Ser

210 215 220

Val Phe Glu Gln Leu Val Leu Tyr Asp Gly Asp Asn Thr Tyr Asn Gly

225 230 235 240

Asn Pro Leu Phe Arg Gly Ala Ile Met Asn Ser Gly Ser Val Thr Pro

245 250 255

Val Asp Pro Val Asp Ser Ala Lys Pro Gln Ala Leu Tyr Asp His Val

260 265 270

Val Arg Val Ala Asn Cys Glu Gly Asp Asp Ser Leu Asp Cys Leu Arg

275 280 285

Arg Leu Pro Asn Asp His Phe Ala Ala Ala Ala Asn Ser Ile Pro Gly

290 295 300

Leu Ile Ser Tyr Glu Ser Leu Ala Leu Ser Tyr Leu Pro Arg Pro Asp

305 310 315 320

Gly Glu Val Leu Thr Ala Ser Pro His Val Leu Ala Arg Glu Gly Lys

325 330 335

Phe Pro Ala Val Pro Met Ile Leu Ala Ser Gln Glu Asp Glu Gly Thr

340 345 350

Leu Phe Ser Phe Phe Gln Gly Asp Met Gly Thr Thr Asp Ile Ile Thr

355 360 365

Asp Tyr Leu Asn Ser Leu Tyr Phe Thr Asn Thr Asp Arg Ser Leu Val

370 375 380

Lys Ser Phe Val Glu Thr Tyr Ser Glu Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro

385 390 395 400

Tyr Arg Thr Gly Asp Ser Lys Asp Leu Phe Tyr Tyr Pro Gly Lys Lys

405 410 415

Arg Ile Ala Ser Ile Leu Gly Asp Ile Val Phe Thr Leu Val Arg Arg

420 425 430

Trp Thr Leu Glu Thr Ile Ala Glu Val Ser Pro Glu Thr Ala Leu Trp

435 440 445

Ser Ser Phe Ala Ser Tyr Asn Tyr Lys Pro Leu Asp Ile Phe Gly Leu

450 455 460

Gly Thr Lys His Gly Ser Asp Thr Glu Val Phe Phe Ala Arg Asn Asn

465 470 475 480

Ser Asp Phe Pro Ser Ile Thr Gly Arg Thr Tyr Tyr Ile Asn Phe Val

485 490 495

Tyr Asn Gly Asp Pro Asn Glu Gly Leu Asp Val Asn Val Thr Trp Leu

500 505 510

Gly Trp Lys Glu Asp Arg Gln Leu Leu Trp Tyr Asn Ala Thr Glu Asn

515 520 525

Gly Tyr Leu Ala Asp Asn Phe Arg Asn Gly Ser Tyr Asn Phe Ile Lys

530 535 540

Glu His Ile Asp Ser Leu Ile Phe

545 550

Claims

1.DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为TlLipA基因或RTlLipA基因；

所述TlLipA基因是如下T1)或T2)所示的DNA分子：

T1)编码序列为SEQ ID No.2的第13-1659位的DNA分子；

T2)与T1)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码氨基酸序列是SEQ ID No.3的第5-552位氨基酸残基的蛋白质的DNA分子；

所述RTlLipA基因是如下R1)或R2)所示的DNA分子：

R1)编码序列为SEQ ID No.2的第1-1659位的DNA分子；

R2)与R1)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质的DNA分子。

2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于：所述TlLipA基因来源于Trichodermalentiforme。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述Trichodermalentiforme为Trichoderma lentiforme ACCC 30425。

4.蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列是SEQ ID No.3的第5-552位氨基酸残基或SEQ ID No.3。

5.根据权利要求4所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质具有下述1)-4)中的至少一种特性：

1)所述蛋白质的脂肪酶活性被Triton X100增强；

2)所述蛋白质的脂肪酶活性被Tween 20增强；

3)所述蛋白质的脂肪酶活性被SDS增强；

4)所述蛋白质在pH值6-9的条件下脂肪酶活性稳定。

6.与权利要求1、2或3所述的DNA分子相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)编码权利要求4或5所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。

7.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为权利要求1或2所述的DNA分子。

8.权利要求1或2所述的DNA分子、权利要求4或5所述的蛋白质或权利要求6或7所述的生物材料在制备脂肪酶中的应用。

9.一种制备脂肪酶的方法，包括：使权利要求4或5所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达，得到脂肪酶；所述生物为微生物、植物或非人动物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述微生物为真核微生物。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述真核微生物为酵母。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述酵母为毕赤酵母属真菌。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述毕赤酵母属真菌为巴斯德毕赤酵母。