CN108753757B

CN108753757B - 超嗜热脂肪酶LipP及其相关生物材料与应用

Info

Publication number: CN108753757B
Application number: CN201810596740.4A
Authority: CN
Inventors: 顾金刚; 王宇洲; 马锐; 李世贵; 龚明波; 向杰; 陈敬师
Original assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Current assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Priority date: 2018-06-11
Filing date: 2018-06-11
Publication date: 2021-09-10
Anticipated expiration: 2038-06-11
Also published as: CN108753757A

Abstract

本发明公开了超嗜热脂肪酶LipP及其相关生物材料与应用。该超嗜热脂肪酶LipP为A1)‑A3)中的任一蛋白质：A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；A2)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第53‑588位的蛋白质；A3)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第54‑588位的蛋白质。该超嗜热脂肪酶的酶反应的最适温度为90℃，酶反应的最适pH为9.5，在37℃、pH值为9.5‑10条件下的脂肪酶酶活是在37℃、pH值为9.5条件下的脂肪酶酶活的82％以上，在80‑90℃、pH值为9.5条件下的脂肪酶酶活是在90℃、pH值为9.5条件下的脂肪酶酶活的96％以上。

Description

超嗜热脂肪酶LipP及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中超嗜热脂肪酶LipP及其相关生物材料与应用。

背景技术

脂肪酶(EC 3.1.1.3)被认为是最重要的商业酶之一，在快速增长的生物技术领域引起了极大的关注。脂肪酶可以在油和水的界面催化三酰基甘油水解，释放二酰基甘油酯，长链脂肪酸(>10个碳)和甘油。在水解过程中，脂肪酶与底物酰基结合形成脂肪酶-酰基复合物，然后将酰基转移到水分子的羟基基团上从而实现水解。在非水溶条件下，脂肪酶可以将羧酸的酰基转移到亲核试剂。

微生物来源的脂肪酶广泛用于各领域，包括工业、食品、饲料和医疗领域。与传统化学催化剂相比，脂肪酶使用领域更为广泛且可重复使用，对环境友好等优点而被重视，但脂肪酶大都对极端温度以及苛刻反应pH比较敏感，必须根据特定的工业环境选择具有特定酶学性质的脂肪酶。根据最适反应温度可以将脂肪酶分为低温、中温、嗜热和超嗜热酶，目前大多数工业生产都是在中高温碱性条件下进行的(45℃以上，pH7以上)。通常在实际应用中使用的化学类催化剂不具备生物学活性，这是酶制剂在工业反应中的一大优势，而在苛刻的工业条件下稳定存在并且持续发挥着催化活性的脂肪酶就显得凤毛麟角了，尤其是超过80℃的最适温度的超嗜热脂肪酶几乎难以找到。许多脂肪酶参与的工业催化反应过程都要求较高的反应温度和较好的热稳定性，如纸架脱脂脱墨、皮毛脱脂以及饲料生产，因此超嗜热脂肪酶在工业领域具有着重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供超嗜热脂肪酶。

本发明所提供的超嗜热脂肪酶是A1)-A5)中的任一蛋白质：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；

A2)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第53-588位的蛋白质；

A3)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第54-588位的蛋白质；

A4)在A2)或A3)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；

A5)将A2)或A3)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有超嗜热脂肪酶活性的蛋白质。

上述超嗜热脂肪酶中，A1)的蛋白质名称为RTLipP-his，A2)的蛋白质名称为RTLipP，A3)的蛋白质名称为TLipP。TLipP是来源于Trichoderma lentiforme ACCC30425的成熟的蛋白质。RTLipP是在TLipP的氨基末端添加甲硫氨酸残基保持TLipP的其它氨基酸残基不变得到的重组蛋白质。RTLipP-his是在TLipP的氨基末端添加SEQ ID No.2的第1-53位氨基酸残基，在TLipP的羧基末端添加SEQ ID No.2的第589-596位氨基酸残基，保持TLipP的其它氨基酸残基不变得到的重组蛋白质。

上述超嗜热脂肪酶中，SEQ ID No.2由596个氨基酸残基组成。

上述超嗜热脂肪酶中，蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化等。

实验证明所述蛋白质具有脂肪酶活性。所述蛋白质在90℃具有脂肪酶的最高酶活力，即所述蛋白质的脂肪酶酶反应的最适温度为90℃。所述蛋白质在pH值为9.5具有脂肪酶的最高酶活力，即所述蛋白质的脂肪酶酶反应的最适pH为9.5。RTLipP-his在37℃、pH值为9.5-10条件下的脂肪酶酶活是在37℃、pH值为9.5条件下的脂肪酶酶活的82％以上。RTLipP-his在80-90℃、pH值为9.5条件下的脂肪酶酶活是在90℃、pH值为9.5条件下的脂肪酶酶活的96％以上。

与所述超嗜热脂肪酶相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

与所述超嗜热脂肪酶相关的生物材料可为下述B1)-B7)中至少一种：

B1)编码所述超嗜热脂肪酶的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下B11)-B13)中任一所示的基因：

B11)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；

B12)核苷酸序列是SEQ ID No.1的第157-1764位的DNA分子；

B13)核苷酸序列是SEQ ID No.1的第160-1764位的DNA分子。

上述生物材料中，B11)是RTLipP-his的优化基因，其名称为RTLipP-his-Y基因；B12)是RTLipP的优化基因，其名称为RTLipP-Y基因；B13)是TLipP的优化基因，其名称为TLipP-Y基因。其中，序列表中的序列1(SEQ ID No.1)由1791个核苷酸组成。

上述生物材料中，B3)所述的重组载体具体可为pET30a(+)-RTLipP-his-Y，pET30a(+)-RTLipP-his-Y是用核苷酸序列是SEQ ID No.1的第151-1770位的DNA分子替换pET30a(+)的EcoRI和XhoI识别位点间的片段(包括EcoRI识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到的重组表达载体。

上述生物材料中，B4)的重组微生物可为将所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，所述受体微生物可为C1)-C4)中的任一种:

C1)原核微生物；

C2)肠杆菌科细菌；

C3)埃希氏菌属细菌；

C4)大肠杆菌，如大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

上述生物材料中，B4)的重组微生物具体可为将所述pET30a(+)-RTLipP-his导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的重组蛋白质(名称为RTLipP-his)的重组大肠杆菌。

上述生物材料中，B5)至B7)可包括繁殖材料也可不包括繁殖材料。

所述蛋白质在作为脂肪酶(如超嗜热脂肪酶)中的应用和所述生物材料在制备脂肪酶(如超嗜热脂肪酶)中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了制备脂肪酶的方法。

本发明所提供的制备脂肪酶的方法，包括：使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达，得到脂肪酶；所述生物为微生物、植物或非人动物。

上述方法中，所述微生物可为C1)-C4)中的任一种:

C1)原核微生物；

C2)肠杆菌科细菌；

C3)埃希氏菌属细菌；

C4)大肠杆菌，如大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

上述方法中，使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述蛋白质。

上述方法中，使所述受体微生物可为上述C1)-C4)中的任一种。

上述方法中，所述重组微生物具体可为将所述pET30a(+)-RTLipP-his导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的重组蛋白质(名称为RTLipP-his)的重组大肠杆菌。

上文中，所有应用的直接目的可以是非疾病治疗目的、非疾病预后目的和/或非疾病诊断目的。

本文中，所述超嗜热脂肪酶是指酶反应的最适温度为80℃以上的脂肪酶，该最适温度是酶反应时间为15分钟的最适温度。

实验证明，本发明的超嗜热脂肪酶的脂肪酶酶反应的最适温度为90℃，脂肪酶酶反应的最适pH为9.5。RTLipP-his在37℃、pH值为9.5-10条件下的脂肪酶酶活是在37℃、pH值为9.5条件下的脂肪酶酶活的82％以上。RTLipP-his在80-90℃、pH值为9.5条件下的脂肪酶酶活是在90℃、pH值为9.5条件下的脂肪酶酶活的96％以上。本发明的超嗜热脂肪酶是碱性超嗜热脂肪酶。与密码子优化前的基因RTLipP-his-W基因相比，密码子优化后的基因RTLipP-his-Y基因使脂肪酶RTLipP-his产量提高了8.5倍；与密码子优化前的基因RTLipP-W基因相比，密码子优化后的基因RTLipP-Y基因使脂肪酶RTLipP-his产量提高了8.5倍；与密码子优化前的基因TLipP-W基因相比，密码子优化后的基因TLipP-Y基因使脂肪酶RTLipP-his产量提高了8.5倍。本发明可用于纸架脱脂脱墨、皮毛脱脂以及饲料生产中。

附图说明

图1为pH对RTLipP-his活性的影响。

图2为温度对RTLipP-his活性的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的木霉(Trichoderma lentiforme)ACCC 30425于2008年6月8日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(又称中国农业微生物菌种保藏管理中心，简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。

下述实施例中，脂肪酶表达载体pET30a(+)和感受态细胞E.coli BL21(DE3)为TransGen Biotech Co.(中国北京)产品。

实施例1、制备脂肪酶

1制备重组菌

1.1制备含有密码子优化基因的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-Y

根据木霉(Trichoderma lentiforme)ACCC 30425全基因组测序技术注释获得的脂肪酶基因cDNA，手动删除信号肽，得到TLipP基因，将该TLipP基因命名为TLipP-W基因。TLipP-W基因是将SEQ ID No.3的第1-159位核苷酸缺失，并将SEQ ID No.3的第1765-1788位核苷酸缺失，保持SEQ ID No.3的其它核苷酸不变得到的DNA分子。TLipP-W基因是木霉(Trichoderma lentiforme)ACCC 30425的原始序列，没有进行密码子优化。TLipP-W基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的第54-588位的蛋白质(其名称为TLipP)。TLipP是野生型蛋白质。

选择合适酶切位点(EcoRI和XhoI)，删除TLipP-W基因原有终止密码子，将所需合成的成熟肽链的DNA序列信息，送往上海捷瑞生物公司，合成密码子优化的适合原核表达的核苷酸序列(合成产物)。将该合成产物用EcoRI和XhoI进行酶切，回收目的片段，用EcoRI和XhoI进行酶切pET30a(+)，回收载体大片段；将回收的目的片段与回收的载体大片段连接，得到连接产物，将连接产物转化到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌。分离该重组大肠杆菌中的重组质粒并测序。将测序结果表明是用核苷酸序列是SEQ ID No.1的第151-1770位的DNA分子替换pET30a(+)的EcoRI和XhoI识别位点间的片段(包括EcoRI识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到的重组表达载体命名为pET30a(+)-RTLipP-his-Y。将含有pET30a(+)-RTLipP-his-Y的重组大肠杆菌命名为E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-Y。

pET30a(+)-RTLipP-his-Y含有RTLipP-his基因，将该RTLipP-his基因命名为RTLipP-his-Y基因，RTLipP-his-Y基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1，是密码子优化基因，RTLipP-his-Y基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质(其名称为RTLipP-his)；pET30a(+)-RTLipP-his-Y含有RTLipP基因，将该RTLipP基因命名为RTLipP-Y基因，RTLipP-Y基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1的第157-1764位，是密码子优化基因，RTLipP-Y基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的第53-588位的蛋白质(其名称为RTLipP)；pET30a(+)-RTLipP-his-Y含有TLipP基因，将该TLipP基因命名为TLipP-Y基因，TLipP-Y基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1的第160-1764位，是密码子优化基因，TLipP-Y基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的第54-588位的蛋白质(其名称为TLipP)。

pET30a(+)-RTLipP-his-Y在E.coli BL21(DE3)中可表达氨基酸序列是SEQ IDNo.2的蛋白质(其名称为RTLipP-his)。BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-Y可产生脂肪酶RTLipP-his。

1.2制备含有未进行密码子优化基因的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-W

按照步骤1.1的方法构建含有pET30a(+)-RTLipP-his-W的重组大肠杆菌，命名为E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-W。

pET30a(+)-RTLipP-his-W是用核苷酸序列是SEQ ID No.3的第151-1770位的DNA分子替换pET30a(+)的EcoRI和XhoI识别位点间的片段(包括EcoRI识别位点和XhoI识别位点在内的小片段)，保持pET30a(+)的其它序列不变，得到的重组表达载体命名为pET30a(+)-RTLipP-his-W。

pET30a(+)-RTLipP-his-W含有RTLipP-his基因，将该RTLipP-his基因命名为RTLipP-his-W基因，RTLipP-his-W基因的核苷酸序列是SEQ ID No.3，是未进行密码子优化基因，RTLipP-his-W基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质(其名称为RTLipP-his)；pET30a(+)-RTLipP-his-W含有RTLipP基因，将该RTLipP基因命名为RTLipP-W基因，RTLipP-W基因的核苷酸序列是SEQ ID No.3的第157-1764位，是未进行密码子优化基因，RTLipP-W基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的第53-588位的蛋白质(其名称为RTLipP)；pET30a(+)-RTLipP-his-W含有TLipP基因，将该TLipP基因命名为TLipP-W基因，TLipP-W基因的核苷酸序列是SEQ ID No.3的第160-1764位，是密码子优化基因，TLipP-W基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的第54-588位的蛋白质(其名称为TLipP)。

pET30a(+)-RTLipP-his-W在E.coli BL21(DE3)中可表达氨基酸序列是SEQ IDNo.2的蛋白质(其名称为RTLipP-his)。BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-W可产生脂肪酶RTLipP-his。

1.3制备含有空载体的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)

将pET30a(+)转化到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌。分离该重组大肠杆菌中的重组质粒并测序。将含有pET30a(+)的重组大肠杆菌命名为E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)，作为空载体对照重组菌。

2表达碱性超嗜热脂肪酶

将E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-Y、E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-W和E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)这三种菌株分别按0.5％的接种量单独接种于30mL的LB小瓶液体培养基(含有50μg/mL硫酸卡那霉素)之中，在37℃、220rpm的振荡摇床中培养活化12-16小时。然后取适量活化好的菌液按1％的接种量，接种到300mL的大瓶LB培养液(含50μg/mL硫酸卡那霉素)之中，在37℃、220rpm的振荡摇床中，连续培养2.5-3小时(利用紫外分光光度计确定培养菌液OD600值为0.8，以含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)，加入IPTG(经过0.22μm滤膜过滤灭菌)至IPTG的含量为0.6mM，在30℃、220rpm的振荡摇床中诱导培养6小时。将上述诱导培养菌液转移至离心杯，于4000rpm转速，离心10分钟，弃上清液，用5mL缓冲液重悬菌体，并回收菌体，将重悬菌体收集至10mL离心管内。在冰水浴条件下，用超声波细胞破碎仪对重悬混浊液进行超声波细胞破碎。设置破碎仪器功率为200W，超声波工作时间4秒，间隔时间3秒，破碎时间为30分钟。破碎完成后，立即于转速12,000rpm、4℃离心菌液10分钟，保留上清液，去除细胞碎片等杂质，该上清液即为诱导表达所获得的粗酶液。

将该粗酶液溶于pH为8.0的20mM Tris-HCl缓冲溶液中，得到待测酶液。

采用对硝基苯酚(p-NP)法测定待测酶液的脂肪酶活性。具体方法如下：配制p-NP标准溶液(p-NP的浓度为8mM，用pH为8.0的20mM Tris-HCl缓冲溶液配制)；将p-NP标准溶液用pH为8.0的20mM Tris-HCl缓冲溶液稀释成适当的梯度，分别测定吸光度，绘制吸光度-浓度关系曲线。取2.4mL底物溶液(称取适量对硝基苯酚棕榈酸酯p-NPP，溶解于pH为8.0的20mM Tris-HCl缓冲溶液，p-NPP的浓度为0.8mM)，37℃下预热5min后加入0.1mL待测酶液，37℃下反应15min后立即加入2.5mL无水乙醇混合均匀，放置5min终止反应；用0.1mL pH为8.0的20mM Tris-HCl缓冲溶液替换0.1mL待测酶液，其他条件不变，即得空白；于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出酶活力。酶活定义以及计算公式：脂肪酶酶活力单位定义为：在37℃下，pH8.0的条件下，每分钟释放出1μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U)。计算公式：X＝cV/tVˊ(式中：X为脂肪酶活力，U/mL；c为对硝基苯酚浓度，μmol/L；V反应液终体积，mL；Vˊ为待测酶液的用量，mL；t为作用时间，min。实验重复三次。根据待测酶液来自的菌体数量，计算E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-Y、E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-W和E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)的脂肪酶产量，结果表明BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-Y产生的脂肪酶RTLipP-his产量为0.19U/10⁸cfu BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-Y，E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-W产生的脂肪酶RTLipP-his产量为0.02U/10⁸cfu E.coliBL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-W，E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)不产脂肪酶。BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-Y的脂肪酶RTLipP-his产量是E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-W的脂肪酶RTLipP-his产量的9.5倍。

说明与密码子优化前的基因RTLipP-his-W基因相比，密码子优化后的基因RTLipP-his-Y基因使脂肪酶RTLipP-his产量提高了8.5倍；与密码子优化前的基因RTLipP-W基因相比，密码子优化后的基因RTLipP-Y基因使脂肪酶RTLipP-his产量提高了8.5倍；与密码子优化前的基因TLipP-W基因相比，密码子优化后的基因TLipP-Y基因使脂肪酶RTLipP-his产量提高了8.5倍。

实施例2、RTLipP-his是碱性超嗜热脂肪酶

将E.coli BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-Y按0.5％的接种量接种于30mL的LB小瓶液体培养基(含有50μg/mL硫酸卡那霉素)之中，在37℃、220rpm的振荡摇床中培养活化12-16小时。然后取适量活化好的菌液按1％的接种量，接种到300mL的大瓶LB培养液(含50μg/mL硫酸卡那霉素)之中，在37℃、220rpm的振荡摇床中，连续培养2.5-3小时(利用紫外分光光度计确定培养菌液OD600值为0.8，以含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)，加入IPTG(经过0.22μm滤膜过滤灭菌)至IPTG的含量为0.6mM，在30℃、220rpm的振荡摇床中诱导培养6小时。将上述诱导培养菌液转移至离心杯，于4000rpm转速，离心10分钟，弃上清液，用5mL缓冲液重悬菌体，并回收菌体，将重悬菌体收集至10mL离心管内。在冰水浴条件下，用超声波细胞破碎仪对重悬混浊液进行超声波细胞破碎。设置破碎仪器功率为200W，超声波工作时间4秒，间隔时间3秒，破碎时间为30分钟。破碎完成后，立即于转速12,000rpm、4℃离心菌液10分钟，保留上清液，去除细胞碎片等杂质，该上清液即为诱导表达所获得的含有脂肪酶RTLipP-his的粗酶液。

1、pH对脂肪酶RTLipP-his活性的影响

将含有脂肪酶RTLipP-his的粗酶液溶于pH值分别为7,8,8.5,9,9.5和10的20mMTris-HCl缓冲溶液中，得到相应pH值的待测酶液。

在37℃(待测温度)下，按照实施1的对硝基苯酚法在以下缓冲液中测定脂肪酶RTLipP-his活性的最适pH值：pH值为7、8、8.5、9、9.5或10的20mM Tris-HCl。即用该缓冲溶液作为溶剂配制底物溶液和p-NP标准溶液。其中，底物为对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为：在37℃下，pH9.5的条件下每分钟释放出1μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U)。其它操作均与实施例1的对硝基苯酚法相同。

结果表明10⁸cfu BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-Y所产生的脂肪酶RTLipP-his在37℃，pH9.5的脂肪酶活力为1.14±0.05U。将脂肪酶RTLipP-his在37℃，pH值为9.5的脂肪酶活力定义为100％，来比较pH值对酶活的影响。脂肪酶RTLipP-his在中性与酸性条件下处于较差状态，同时从pH7开始稳定增加，直到pH达到最佳pH值为9.5。脂肪酶RTLipP-his在37℃、pH值为10时的相对酶活是82.78％(图1)。说明脂肪酶RTLipP-his在37℃、pH值为9.5-10具有82％以上的酶活，是碱性脂肪酶。

2、温度对脂肪酶RTLipP-his活性的影响

将含有脂肪酶RTLipP-his的粗酶液溶于pH值为9.5(pH9.5)的20mM Tris-HCl缓冲溶液中，得到待测酶液。

在pH值为9.5下，采用对硝基苯酚法测定待测酶液的脂肪酶酶活。

用pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液作为溶剂配制底物溶液和p-NP标准溶液。其中，底物为对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)。

取2.4mL底物溶液，待测温度(分别为30℃,40℃,50℃,60℃,65℃,70℃,80℃,90℃和95℃)预热5min后加入0.1mL待测酶液，相应待测温度下反应15min后立即加入2.5mL无水乙醇混合均匀，放置5min终止反应；用0.1mL pH9.5的20mM Tris-HCl缓冲溶液替换0.1mL待测酶液，其他条件不变，即得空白；于410nm测定吸光度。对照标准曲线算出生成的对硝基苯酚浓度，进而计算出酶活力。实验重复三次。脂肪酶酶活力单位定义为：在90℃下，pH9.5的条件下每分钟释放出1μmol对硝基苯酚的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U)。

结果表明10⁸cfu BL21(DE3)/pET30a(+)-RTLipP-his-Y所产生的脂肪酶RTLipP-his在90℃，pH9.5的脂肪酶活力为1.55±0.01U。将脂肪酶RTLipP-his在90℃，pH值为9.5的脂肪酶活力定义为100％，来比较温度对酶活的影响。脂肪酶RTLipP-his的最适温度为90℃，其脂肪酶活性在低温条件下处于较差状态，随着温度的升高，从40℃开始，酶活随着温度提高逐渐增大，当温度达到90℃，酶活达到最高活性在最适温度的超高温区保持稳定，但由于超热失活，超过95℃后酶活开始降低，脂肪酶RTLipP-his在80℃、pH值为9.5时的相对酶活是96.16％(图2)。说明脂肪酶RTLipP-his在80-90℃、pH值为9.5具有96％以上的酶活，是碱性超嗜热脂肪酶。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

<120> 超嗜热脂肪酶LipP及其相关生物材料与应用

<130> GNCFH181281

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1791

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt ctggtgccac gcggttctgg tatgaaagaa 60

accgctgctg ctaaattcga acgccagcac atggacagcc cagatctggg taccgacgac 120

gacgacaagg ccatggctga tatcggatcc gaattcatga atgatagtag cttaccgacc 180

gttgatctgg gctatcagat tcatcgcgca attagtctgg atgaaacctt taatacctat 240

aattttacca atattccgta tgcagaaccg ccgttaggtc cgttacgctt taaagccccg 300

attccgccgc gcggtcgcaa aagtgaaatt caggatggtt caattggtaa aatttgtccg 360

caggccaata ccaaatggaa tggcattggc tcactgtttg cagcagccta tgcagcagat 420

aaactgccgt ttaattatac ccaggccgaa gaaaccttag ccaatagccc gccgcgtgcc 480

ttagatccgc gtgtgaccga agattgtctg gtgttagatg tgttagttcc gaaagcagtg 540

tttcatgaac agtcaaaatc taaaggtgcc ccggtgctgg tgtggattta tggcggtggc 600

tatgcactgg gcgataaaac catgtttggt tcaccgaatg atctgattgc agccacccag 660

caggatgaaa atcagggcgc catttgggtt gccatgaatt atcgtctggg cgcctttggc 720

tttctgagcg gcccgacctt acaggaaacc ggtaccgcaa atgccggctt acatgatcag 780

cgtctcgcac tggaatgggt tcaggaaaat attcataaat ttggcggcga tccggataat 840

gtgaccctga tgggcattag cgccggcggc ggttcagtta tgcatcagat taccgcttac 900

ggtggtctga aaccggcccc gtttcgtcag gccattaccc agtcaagtgc ctttgttccg 960

aatccgggta cccagttaca ggaagatgcc tttaatgatt ttctgtcact gctgaatgtg 1020

agtagtctgg aagaagcacg cgccctggat agcgccaccc tgattgaagc caatgcaaaa 1080

cagattgcag aagccccgca tggtaccttt atttttggcc cgaccgtgga tggcgatttt 1140

gttccgggcg tgccgaccaa actgatttta cagggtagct atagtaaagg cattagtatt 1200

ctatcctctc acatgtctca tgaaggcatt ttttttatta atccgcgtgc cattgatgat 1260

gaaaccctgc tgcgtcagca gttgcgcaat acctttccgc acatgtctaa acgtaatttt 1320

gattttgtgt ttgataccct gtatccgccg acctatgatg gtagctatcc gtataaaacc 1380

ccgttagaac gcgcagaact gattattgca gaaccggtgt ttatttgtaa tcagaatagt 1440

atgctgaata gtgccatgca gcagggcacc gcagcctttg gctatcagtt tagtattccg 1500

ccggccttac atggcggcga tcagccgtat atttttccga atggctcttt tccggatgtt 1560

gatccgatta tttctaattt tattcagcat accattgccg gctttgtgaa taatggcgtg 1620

ccgagcgaac atattgcagg tgcctcaatt ccgccgtatg caaccaataa agcagtgtta 1680

aatctggtga gcgatagtcc gaccattatt cccgacccga ccgcaaatga acgctgtgcc 1740

tggtggcata aagcactgta tagcctcgag caccaccacc accaccactg a 1791

<210> 2

<211> 596

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser

1 5 10 15

Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp

20 25 30

Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp Ile

35 40 45

Gly Ser Glu Phe Met Asn Asp Ser Ser Leu Pro Thr Val Asp Leu Gly

50 55 60

Tyr Gln Ile His Arg Ala Ile Ser Leu Asp Glu Thr Phe Asn Thr Tyr

65 70 75 80

Asn Phe Thr Asn Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro Leu Gly Pro Leu Arg

85 90 95

Phe Lys Ala Pro Ile Pro Pro Arg Gly Arg Lys Ser Glu Ile Gln Asp

100 105 110

Gly Ser Ile Gly Lys Ile Cys Pro Gln Ala Asn Thr Lys Trp Asn Gly

115 120 125

Ile Gly Ser Leu Phe Ala Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Lys Leu Pro Phe

130 135 140

Asn Tyr Thr Gln Ala Glu Glu Thr Leu Ala Asn Ser Pro Pro Arg Ala

145 150 155 160

Leu Asp Pro Arg Val Thr Glu Asp Cys Leu Val Leu Asp Val Leu Val

165 170 175

Pro Lys Ala Val Phe His Glu Gln Ser Lys Ser Lys Gly Ala Pro Val

180 185 190

Leu Val Trp Ile Tyr Gly Gly Gly Tyr Ala Leu Gly Asp Lys Thr Met

195 200 205

Phe Gly Ser Pro Asn Asp Leu Ile Ala Ala Thr Gln Gln Asp Glu Asn

210 215 220

Gln Gly Ala Ile Trp Val Ala Met Asn Tyr Arg Leu Gly Ala Phe Gly

225 230 235 240

Phe Leu Ser Gly Pro Thr Leu Gln Glu Thr Gly Thr Ala Asn Ala Gly

245 250 255

Leu His Asp Gln Arg Leu Ala Leu Glu Trp Val Gln Glu Asn Ile His

260 265 270

Lys Phe Gly Gly Asp Pro Asp Asn Val Thr Leu Met Gly Ile Ser Ala

275 280 285

Gly Gly Gly Ser Val Met His Gln Ile Thr Ala Tyr Gly Gly Leu Lys

290 295 300

Pro Ala Pro Phe Arg Gln Ala Ile Thr Gln Ser Ser Ala Phe Val Pro

305 310 315 320

Asn Pro Gly Thr Gln Leu Gln Glu Asp Ala Phe Asn Asp Phe Leu Ser

325 330 335

Leu Leu Asn Val Ser Ser Leu Glu Glu Ala Arg Ala Leu Asp Ser Ala

340 345 350

Thr Leu Ile Glu Ala Asn Ala Lys Gln Ile Ala Glu Ala Pro His Gly

355 360 365

Thr Phe Ile Phe Gly Pro Thr Val Asp Gly Asp Phe Val Pro Gly Val

370 375 380

Pro Thr Lys Leu Ile Leu Gln Gly Ser Tyr Ser Lys Gly Ile Ser Ile

385 390 395 400

Leu Ser Ser His Met Ser His Glu Gly Ile Phe Phe Ile Asn Pro Arg

405 410 415

Ala Ile Asp Asp Glu Thr Leu Leu Arg Gln Gln Leu Arg Asn Thr Phe

420 425 430

Pro His Met Ser Lys Arg Asn Phe Asp Phe Val Phe Asp Thr Leu Tyr

435 440 445

Pro Pro Thr Tyr Asp Gly Ser Tyr Pro Tyr Lys Thr Pro Leu Glu Arg

450 455 460

Ala Glu Leu Ile Ile Ala Glu Pro Val Phe Ile Cys Asn Gln Asn Ser

465 470 475 480

Met Leu Asn Ser Ala Met Gln Gln Gly Thr Ala Ala Phe Gly Tyr Gln

485 490 495

Phe Ser Ile Pro Pro Ala Leu His Gly Gly Asp Gln Pro Tyr Ile Phe

500 505 510

Pro Asn Gly Ser Phe Pro Asp Val Asp Pro Ile Ile Ser Asn Phe Ile

515 520 525

Gln His Thr Ile Ala Gly Phe Val Asn Asn Gly Val Pro Ser Glu His

530 535 540

Ile Ala Gly Ala Ser Ile Pro Pro Tyr Ala Thr Asn Lys Ala Val Leu

545 550 555 560

Asn Leu Val Ser Asp Ser Pro Thr Ile Ile Pro Asp Pro Thr Ala Asn

565 570 575

Glu Arg Cys Ala Trp Trp His Lys Ala Leu Tyr Ser Leu Glu His His

580 585 590

His His His His

595

<210> 3

<211> 1791

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt ctggtgccac gcggttctgg tatgaaagaa 60

accgctgctg ctaaattcga acgccagcac atggacagcc cagatctggg taccgacgac 120

gacgacaagg ccatggctga tatcggatcc gaattcatga atgattcaag tctcccaaca 180

gtggacctag gctaccagat tcaccgcgcc atctccttag atgaaacatt caacacttac 240

aacttcacca acataccata tgcggaacct cctttaggtc ctctgagatt taaagcaccc 300

attccaccta gaggtcggaa gtctgagatc caagatggta gtattggaaa gatctgtcct 360

caagctaata ctaaatggaa tgggattgga tccctgtttg ccgctgctta cgcagcagac 420

aagctcccat tcaactacac gcaagctgag gagactttgg ccaattcgcc gcctcgagca 480

ttggatcctc gggtcactga agattgtctc gttttggatg tgctagttcc gaaagcagtc 540

tttcatgaac aatccaagtc aaagggagct cctgtcttag tgtggattta tggaggcggc 600

tatgccctcg gggacaagac catgtttgga agccccaacg accttattgc agccactcag 660

caggatgaaa accaaggtgc tatctgggta gctatgaact atcgccttgg agccttcggg 720

ttcctctcag gccctacctt gcaggagact ggtacagcga atgcaggtct tcatgaccag 780

agactcgctc ttgaatgggt gcaggagaac atccacaagt tcggcggaga tcctgataac 840

gtcactctca tgggtatttc agcgggtggt ggttcagtta tgcaccagat tacggcatac 900

ggcggtttga aaccggcacc attccgccaa gctatcacgc agtcatcagc ctttgttcct 960

aatccaggga ctcaattgca ggaagacgct ttcaacgact ttctctcgct tctcaatgtc 1020

agctctctcg aagaggctcg agctctggac tcggccaccc tgattgaagc aaatgctaaa 1080

cagatcgccg aggcaccaca cggcacattt atctttggcc caactgttga tggcgatttt 1140

gtccctggtg tgccaacgaa actgatcctt cagggttcct attcaaaagg catctctatt 1200

ctatcttctc atatgagcca tgagggaatt ttcttcataa atccacgggc cattgacgac 1260

gaaacgctgt tgcgtcagca gcttcggaat acttttccgc atatgtcaaa aaggaacttt 1320

gactttgtgt tcgacacact atatccgcca acttatgatg ggtcgtatcc ctataaaacc 1380

cctcttgaac gagcggaact tattattgct gaaccagtct tcatctgcaa ccagaactcc 1440

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ccagcgcttc atggtggcga ccagccttat attttcccca atggttcatt ccccgacgtc 1560

gatcctatca tttccaattt cattcaacac accatcgctg gttttgttaa caatggtgtg 1620

ccgtctgaac acattgctgg agcctcgatc cctccgtacg cgaccaacaa agctgttctt 1680

aatttggtct cggactcccc aaccattatc cccgatccaa cagctaacga gagatgtgct 1740

tggtggcata aagctttata tagtctcgag caccaccacc accaccactg a 1791

Claims

1.蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为A1)-A3)中的任一蛋白质：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；

A2)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第53-588位的蛋白质；

A3)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第54-588位的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的脂肪酶酶反应的最适温度为90℃。

3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的脂肪酶酶反应的最适pH为9.5。

4.与权利要求1-3中任一所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)-B4)中至少一种：

B1)编码权利要求1-3中任一所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。

5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下B11)-B13)中任一所示的所述蛋白质的编码基因：

B11)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；

B12)核苷酸序列是SEQ ID No.1的第157-1764位的DNA分子；

B13)核苷酸序列是SEQ ID No.1的第160-1764位的DNA分子。

6.权利要求1-3中任一所述蛋白质在作为脂肪酶中的应用。

7.权利要求4或5所述的生物材料在制备脂肪酶中的应用。

8.一种制备脂肪酶的方法，包括：使权利要求1中任一所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达，得到脂肪酶；所述生物为微生物、植物或非人动物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述微生物为原核微生物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述原核微生物为肠杆菌科细菌。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述肠杆菌科细菌为埃希氏菌属细菌。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述埃希氏菌属细菌为大肠杆菌。