TW201718865A - 藉由重組脂肪酶生產生質柴油的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種生產生質柴油的方法，包括提供重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶；使該重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶與非食用油反應；以及從經反應之溶液中分離出該生質柴油。
Description
本發明係有關一種生產生質柴油之方法，尤其係有關一種自非食用油生產生質柴油之方法。
生質柴油係一種可再生且可代替柴油之燃料，一般為脂肪酸甲酯(fatty acid methyl ester,FAME)，且係藉由油品之轉酯化來合成。商業上，大多係使用快速、高產率之鹼催化的化學製程來生產生質柴油，然而，此製程需要高溫、高壓，極為耗能，且具有諸多缺點，例如皂化、副產物甘油難回收、需移除殘留鹽類、產生大量廢水等，易造成環境汙染。因此，相較於使用化學製程來生產生質柴油，可在溫和條件下使用的酵素催化的生質柴油生產製程被視為環境友善型的製程。
生質柴油之生產製程通常需以高成本之精煉油作為原料，例如大豆油、油菜籽油、棉籽油及葵花油。用以生產生質柴油的原料油佔了生產成本的85%以上，對許多缺乏此等食用油的開發中國家而言，生產生質柴油相當昂貴。因此，若能將非食用油用於生產生質柴油，對經濟、
環保將有很大貢獻。
目前已有研究發現，有些酵素催化的生質柴油生產製程可使用較低成本的非食用油，例如，Abulla等人(Rev.Biotechnol.31,53-64.2011)及You等人(Bioresour.Technol.148,202-207.2013)發現，多種來自不同菌株之脂肪酶(lipase)可將痲瘋樹籽油(Jatropha oil)轉換為生質柴油。然而，彼等研究皆使用固定化脂肪酶(immobilized lipase)，雖酵素之固定化有助於改善酵素安定性且易於分離產物和重複使用酵素，然其價格昂貴不利於工業化生產。
皺褶假絲酵母菌脂肪酶(Candida rugosa lipase,CRL)係一種用途極為廣泛的市售酵素。自市售之粗製CRL中可分離出數種脂肪酶異構物(即同功酶(isozyme))，然而，目前已鑑定可編碼脂肪酶之5種C.rugosa基因之表現量不同，且該5種基因所編碼之胺基酸序列間具高度同源性(homology)，故難以直接以工業應用規模自C.rugosa培養物中純化各同功酶。此外，C.rugosa會將其密碼子CTG譯讀為絲胺酸，因而使得在一般宿主細胞(將密碼子CTG譯讀為白胺酸)中表現之重組CRL同功酶之功能性變成無法實施。
有鑑於上述習知技術中所產生之缺失，本發明特此提供一種具高產率之藉由重組酵母菌脂肪酶以生產生質柴油之方法，以期針對習知技術之缺失加以改善。
本發明提供一種生產生質柴油的方法，包括：
(1)提供重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶，其包括與SEQ ID NOs.1至4中之一者至少有90%相似度且與SEQ ID NOs.1至4中之一者具有相同活性之序列；(2)使該重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶與非食用油於第一醇類溶液存在下反應；以及(3)從經反應之溶液中分離出該生質柴油。
於一具體實施例中，該重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶係由重組嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris)表現而得。
於一具體實施例中，該非食用油係選自由痲瘋樹籽油(Jatropha oil)、卡蘭賈籽油(Karanja oil)、蓖麻籽油(castor oil)及其組合所組成群組中之至少一者。
於一具體實施例中，於該(2)之反應物中，該重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶之劑量為每公克非食用油40U至160U，且反應開始時，該非食用油與該第一醇類溶液之莫耳濃度比為1：3至1：4.5。
於一具體實施例中，該(2)之反應物包含水，且以該反應物之重量為基準計，該水含量為30%至50%(wt)。
於一具體實施例中，該(2)係於溫度10℃至37℃進行，且該反應的時間為4小時至72小時。
於一具體實施例中，該(2)進一步包括(2’)於反應開始後，加入第二醇類溶液至該反應物中，且該第二醇類溶液係於反應開始後8小時至24小時內加入。於另一具體實施例中，該第二醇類溶液與該第一醇類溶液相同。於另一具體實施例中，該第一醇類溶液為甲醇。
於一具體實施例中，該重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶係呈液態溶液之形式。於另一具體實施例中，該方法進一步包括(4)回收分離出生質柴油後殘留之含有該重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶之溶液。
本發明復提供一種生產生質柴油的方法，包括：(1)提供重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶，其包括與SEQ ID NOs.1至4中之一者至少有90%相似度且與SEQ ID NOs.1至4中之一者具有相同活性之序列；(2)使該重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶與非食用油於溫度10℃至37℃及第一醇類溶液存在下反應，且該反應開始時，該非食用油與該第一醇類溶液之莫耳濃度比為1：3至1：4.5；以及(3)從經反應之溶液中分離出該生質柴油。
於一具體實施例中，該(2)之反應物包含水，且以該反應物之重量為基準計，該水含量為30%至50%(wt)。
於一具體實施例中，該重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶係由重組嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris)表現而得，且該第一醇類溶液為甲醇。
於一具體實施例中，該(2)進一步包括(2’)於該反應開始後8小時至24小時內加入第二醇類溶液至該反應物中。
本發明所提供之方法能有效利用非食用油進行轉酯化反應，且本發明之方法可使用液態CRL，因此可節省固定化酵素之前處理步驟，並能獲得可與使用固定化酵素之
技術比較之功效，尤其本發明可回收再利用液態CRL，進一步降低成本，故具有發展工業化應用之潛力。
第1圖顯示水含量與CRL2劑量對生產FAME之初始速率的影響。反應條件：水含量20%、30%、40%或50%，CLR2劑量20U、40U或80U，0.5g痲瘋樹籽油，1eq.甲醇，轉速250rpm，37℃，4小時。
第2A至2D圖顯示水含量與CRL2劑量在不同時間點對FAME產率的影響。反應條件：水含量20%(A)、30%(B)、40%(C)或50%(D)，CLR2劑量20U、40U或80U，0.5g痲瘋樹籽油，1eq.甲醇，轉速250rpm，37℃，24小時。
第3圖顯示反應溫度對FAME產率的影響。反應條件：水含量50%，CLR2劑量80U，0.5g痲瘋樹籽油，1eq.甲醇，轉速250rpm，37℃，24小時。
第4圖顯示受質莫耳濃度比在不同時間點對FAME產率的影響。反應條件：水含量50%，CLR2劑量160U，1g痲瘋樹籽油，油與甲醇莫耳濃度比1：3、1：4、1：5及1：6，轉速250rpm，37℃，72小時。
第5A和5B圖顯示不同的甲醇逐步進料方式在不同時間點對FAME產率的影響。第5A圖為反應開始時加入1eq.甲醇，再分別於8小時(●)、16小時(○)及24小時(▼)時加入1eq.甲醇。第5B圖為反應開始時加入1eq.甲醇，再分別於8小時(●)、16小時(○)及24小時(▼)時加入0.5eq.甲醇。符號(△)表示反應過程中並未額外加入甲醇。反應
條件：水含量50%，CLR2劑量80U，0.5g痲瘋樹籽油，轉速250rpm，37℃，72小時。
以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習本技術領域者可由本說明書所揭示之內容了解本發明之其他優點及功效，然本實施例並非用以限定本發明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此，本發明之保護範圍，當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
須注意的是，如本說明書使用，除非明確且不含糊地限定於一個指示物，否則單數形式之「一」及「該」包括複數指示物。除非上下文另有明確指明，否則術語「或」係與術語「及/或」互換使用。同時，本說明書中所使用如「第一」及「第二」等用語，亦僅為便於敘述之明瞭，而非用以限定本揭露可實施之範圍，其相對關係之改變或調整，在無實質變更技術內容下，當亦視為本揭露可實施之範疇。
本發明提供一種藉由重組酵母菌表現重組脂肪酶之生產生質柴油的方法。
如本文所使用，「脂肪酶」(亦稱為三醯基甘油酯水解酶)係一種主要負責水解醯基甘油酯之水解酶。脂肪酶係將脂肪(三酸甘油酯)於自然情況下水解成甘油及脂肪酸之不可或缺之酵素。在有非水媒介存在下，脂肪酶可催化其他合成反應，包括羧基之生物轉化反應，例如酯化反應、轉
酯化反應等。轉酯化反應係指酯類(RCOOR1)與醇類(R2OH)依特定比例混合、反應，而生成出另外一種酯類(RCOOR2)之過程。
如本文所使用，「皺褶假絲酵母菌脂肪酶」係指皺褶假絲酵母菌脂肪酶同功酶，其包括天然的皺褶假絲酵母菌脂肪酶或彼等之變體(後文亦稱為重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶)，例如，SEQ ID NOs.1至4所示之胺基酸序列。「同功酶」係指性質不同但催化反應相同的酶，彼等可以以不同的量出現在一種生物的不同組織或器官中，彼等之差異可以是在蛋白質的一級結構上，也可以是在四級結構或轉譯後修飾上，其存在可被細胞用來根據細胞內特定的生理狀況而對酶活性進行調節。
本發明提供之生產生質柴油的方法包括：(1)提供重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶，其包括與SEQ NOs.1至4中之一者至少有90%相似度且與SEQ NOs.1至4中之一者具有相同活性之序列；(2)使該重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶與非食用油於第一醇類溶液存在下反應；以及(3)從經反應之溶液中分離出該生質柴油。
本發明使用之重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶可由經突變之核甘酸序列編碼而得，其中，該經突變之核甘酸序列與編碼皺褶假絲酵母菌脂肪酶之野生型核甘酸序列具有至少80%相同性。根據本發明之具體實施例，該經突變之核甘酸序列包括SEQ ID NOs.5至8中至少一者所示之序列，或者，該經突變之核甘酸序列包括編碼與SEQ ID NOs.1至
4中之一者所示之胺基酸序列至少有90%(例如95%、98%或100%)相似度之多肽序列之核甘酸序列。
根據本發明之具體實施例，本發明使用之重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶可為重組CRL同功酶CRL1、CRL2、CRL3或CRL4，其分別包括SEQ ID NOs.1至4所示之胺基酸序列，且分別可由SEQ ID NOs.5至8所示之序列編碼。其中，編碼CRL1之SEQ ID NO.5係編碼野生型皺褶假絲酵母菌脂肪酶1(GenBank編號：P20261)之序列(GenBank編號：X64703)之變體；編碼CRL2之SEQ ID NO.6係編碼野生型皺褶假絲酵母菌脂肪酶2(GenBank編號：P32946)之序列(GenBank編號：X64704)之變體；編碼CRL3之SEQ ID NO.7係編碼野生型皺褶假絲酵母菌脂肪酶3(GenBank編號：P32947)之序列(GenBank編號：X66006)之變體；以及編碼CRL4之SEQ ID NO.8係編碼野生型皺褶假絲酵母菌脂肪酶4(GenBank編號：P32948)之序列(GenBank編號：X66007)之變體。
本發明使用之重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶可由嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris,P.pastoris)表現。嗜甲醇酵母菌係普遍用於表現重組蛋白質之表現系統，其具有許多優點，例如：P.pastoris可進行真核細胞的轉譯後修飾，包括蛋白質摺疊、形成雙硫鍵、糖基化等，不像原核細胞因無法進行轉譯後修飾而較易產生沒有活性、不可溶的包涵體(inclusion body)；P.pastoris具有菌體高密度的特性，研究指出在適當的發酵環境下，細胞密度可達500 OD600
U/mL，因此可經由高密度發酵來大量表現所欲蛋白質，有助於降低工業應用之成本；以及，表現載體可提供表達蛋白之分泌訊息(secretion signal)，使重組蛋白分泌至細胞外，加上P.pastoris本身分泌的內源蛋量少，且培養液中不須添加額外的蛋白質，因此純化步驟簡單，可減少純化時產物的損失。
如本文所使用，「重組嗜甲醇酵母菌」係指表現重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶之P.pastoris。根據本發明之具體實施例，本發明使用之用於表現重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶之P.pastoris係包括SEQ NOs.5至8中至少一者所示之序列，其中，SEQ NOs.5至8係分別編碼SEQ ID NOs.1至4所示之胺基酸序列。或者，本發明使用之P.pastoris係包括與SEQ ID NOs.5至8中之一者至少有90%相似度之序列，其編碼與SEQ NOs.1至4中之一者至少有90%相似度且與SEQ NQs.1至4中之一者具有相同活性之序列。較佳地，該P.pastoris係包括SEQ NOs.6至8中至少一者之序列，更佳地，該P.pastoris係包括SEQ NOs.6及8中至少一者之序列。
根據本發明之具體實施例，本發明用以作為生質柴油之原料油品包括，但不限於，食用油(例如大豆油、油菜籽油、棉籽油及葵花油)、非食用油(例如痲瘋樹籽油、卡蘭賈籽油、蓖麻籽油)及廢棄油。較佳地，本發明用以作為生質柴油之原料油品為痲瘋樹籽油。
根據本發明之具體實施例，本發明使用之第一醇類溶
液包括，但不限於，甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇及丁醇。較佳地，本發明係使用甲醇作為反應物中之第一醇類溶液。根據本發明之一較佳具體實施例，當第一醇類溶液為甲醇時，本發明所生產之生質柴油為脂肪酸甲酯。
根據本發明之具體實施例，用於進行(2)之轉酯化反應之重組CRL之劑量可為每公克原料油品40U至160U，例如，當使用0.5g之原料油品時，重組CRL之劑量可介於20U至80U範圍之間；當使用1g之原料油品時，重組CRL之劑量可介於40U至160U範圍之間。較佳地，重組CRL之劑量為每公克原料油品160U。
根據本發明之具體實施例，進行轉酯化反應之反應物亦包含水，且以該反應物之重量為基準計，該水含量為至少30%(wt)，較佳為至少40%(wt)，更佳為至少50%(wt)。
根據本發明之具體實施例，轉酯化反應係於至少10℃進行，較佳為10℃至37℃，更佳為37℃。根據本發明之具體實施例，轉酯化反應係至少反應4小時，較佳為4小時至72小時，更佳為24小時至72小時，又更佳為48小時至72小時。
根據本發明之具體實施例，用於進行轉酯化反應之原料油品與醇類溶液之莫耳濃度比可為1：3至1：4.5，亦即，所使用之醇類溶液可為1eq.至1.5eq.。
根據本發明之具體實施例，本發明之(2)進一步包括(2’)於反應開始後，加入第二醇類溶液至反應物中。根據本發明之具體實施例，該第二醇類溶液包括，但不限於，
甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇及丁醇。較佳地，該第二醇類溶液可與該第一醇類溶液相同。
根據本發明之具體實施例，該第二醇類溶液可於反應開始後8小時至24小時內加入，且加入之第二醇類溶液可為0.5eq.至1eq.。舉例而言，於反應開始後8小時至24小時內可加入0.5eq.之第二醇類溶液至反應物中；於反應開始後16小時至24小時內可加入1eq.之第二醇類溶液至反應物中。
根據本發明之具體實施例，該第二醇類溶液加入後，反應物中之原料油品與醇類溶液(第一及第二醇類溶液)之莫耳濃度比為1：3至1：4.5。較佳地，本發明之方法係於反應開始時，反應物中包括1eq.之第一醇類溶液，於反應開始後24小時加入0.5eq.之第二醇類溶液至反應物中，此時，反應物中之原料油品與醇類溶液之莫耳濃度比為小於等於1：4.5。
根據本發明之具體實施例，本發明所使用之重組CRL可為液態溶液之形式，且本發明之方法進一步包括(4)回收分離出生質柴油後殘留之含有該重組CRL之溶液，其中，該殘留之溶液包括重組CRL。根據本發明之具體實施例，該經回收之殘留溶液可加入原料油品，直接作為進行轉酯化反應之反應物。
以下係藉由特定之具體實施例進一步說明本發明之特點之功效，但非用於限制本發明之範疇。
痲瘋樹種子係得自台灣聿新生物科技股份有限公司及山海觀馬場。卡蘭賈(Karanja)種子及蓖麻(castor)種子分別自台灣北部和南部收集而得。粗製油品係依如de Oliveira等人(Biomass Bioenergy 33,449-453.2009)所述之方式於索氏(Soxhlet)裝置中以正己烷萃取而得。標準脂肪酸酯購自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,USA).
分別帶有重組CRL同功酶CRL1、CRL2、CRL3及CRL4表現載體之4種重組嗜甲醇酵母菌(P.pastoris)菌株係依Chang等人(J.Agric.Food Chem.54,815-822.2006；J.Agric.Food Chem.54,5831-5838.2006)、Lee等人(Biochem.J.366,603-611.2002)及Tang等人(Arch.Biochem.Biophys.387,93-98.2001)所述之方式建立。CRL1、CRL2、CRL3及CRL4之胺基酸序列分別係由SEQ ID NOs.1、2、3及4所示，且分別係由SEQ ID NOs.5、6、7及8所示之核甘酸序列所編碼。
將所建立之重組P.pastoris培養於含有50mL甘油培養基(2%甘油、1%酵母菌萃取物及0.5%硫酸銨)與100μg/mL吉歐黴素(zeocin)之搖瓶中，於20℃及轉速200rpm培養5天。之後，將培養液以7000×g離心10分鐘來收集含有CRL之發酵上清液，再以Amicon Ultra-4 10kDa cut-off離心濾器(Merk KGaA,Darmstadt,Germany)濃縮該發酵上清液，即得CRL酵素溶液。
脂肪酶活性係使用分光光度計(Multiskan FC Microplate Photometer,Thermo Scientific)測定並以p-硝基苯丁酸酯作為受質。進行測定之反應物包含10μL待測酵素溶液、10μL之20mM磷酸緩衝液(pH 7.0)、0.25% Triton X-100及0.5mM受質。反應係於37℃進行，測量並記錄10分鐘內經酵素水解之產物p-硝基酚於405nm所增加之吸光度，藉以計算脂肪酶之初始速率。1單位(U)活性定義為在標準條件下，每分鐘釋放1微莫耳(μmol)p-硝基酚所需之酵素之量。
自實施例2所得之CRL1至CRL4酵素溶液活性分別為：2857U/mL、647U/mL、307U/mL及586U/mL。
本實施例係利用酵素催化轉酯化反應以產生FAME。轉酯化反應係於置於250rpm之培養搖床上之20mL螺蓋玻璃瓶中進行。
首先，將0.5g粗製油品與1當量之甲醇(1當量=3莫耳甲醇/莫耳三酸甘油脂)混合於反應容器中，再將脂肪酶溶液及去礦物質水混合並依相對於所使用之油之質量的重量百分比加至反應容器中，因此脂肪酶溶液亦提供水含量，例如，50μL脂肪酶溶液等於提供50mg之水。將此反應混合物於37℃培育24小時。
本實施例係針對酵素催化之脂肪酸甲酯合成方式進
行產物之初始速率及產量分析，包括下述步驟：將酵素及粗製油品依實施例4所述之方式反應，再於預設時間點自反應混合物中收集產物，並使用氣相層析法進行FAME試驗。
首先，反應混合物係以8000×g離心1分鐘，將含有FAME之上層液置於一乾淨瓶中以進一步分析。取10mg待測產物加入600μL十七烷酸甲酯(1mg/mL，於正己烷中)作為定量分析之內標準品。根據European Standard Method,EN 14103進行FAME含量之量化。藉由配備有火焰離子化偵測器(flame ionization detector)、程式化溫控汽化注射器(programmable temperature vaporizing injector)及TR-BioDiesel(F)管柱(30m×0.25mm；膜厚0.25μm)之Thermo TRACETM 1300氣相層析儀進行FAME分析。使用分裂模式(split mode)(分裂率1：100)將1μL待測產物注射入管柱。使用高純度氮氣作為載體氣體，流速為1mL/min。烘箱溫度以2℃/min之速率自200℃增加至220℃，並維持在260℃ 10分鐘。注射器及偵測器之溫度分別設定為260℃及270℃。
依據實施例1至5所述之方式於重組P.pastoris中表現四種重組酵素(CRL1至CRL4)，並收集發酵上清液，接著測定CRL自痲瘋樹籽油、卡蘭賈籽油及蓖麻籽油轉換為FAME之催化作用。合成FAME之反應混合物包括0.5g待測油品、1eq.甲醇、30%水及40U待測酵素，反應條件為
250rpm，37℃，24小時。
測定結果如表1所示，各重組CRL同功酶皆可催化非食用油轉換成FAME，其中各重組CRL同功酶對痲瘋樹籽油之催化效率皆優於對卡蘭賈籽油及蓖麻籽油之催化效率。由CRL2催化痲瘋樹籽油而得之FAME之產率(36.01%±2.50)與由CRL4催化者(36.90%±0.30)相當，但高於由CRL1催化者(17.31%±1.67)或由CRL3催化者(24.26%±0.92)。根據此結果可知，對於使用痲瘋樹籽油來生產生質柴油而言，CRL2與CRL4為較佳之同功酶。
痲瘋樹籽油中之脂肪酸包括14.6%棕梠酸(16：0)，6.9%硬脂酸(18：0)、46.2%油酸(18：1)及30.8%亞麻油酸(18：2)。由此可知，長鏈脂肪酸於痲瘋樹籽油中占較大比例，顯示CRL2及CRL4適合催化長鏈脂肪酸之轉酯化反應。
於Shah & Gupta(Process Biochem.42,409-414.2007)之研究中指出，市售的CRL無法有效地催化痲瘋樹籽油來
生產FAME。然而，本實施例之結果發現，重組CRL同功酶具有專一性，即不同CRL同功酶處理不同受質。由於市售的CRL缺乏如本案使用之重組CRL，尤其是CRL2及CRL4，故而無催化痲瘋樹籽油之活性。因此，相較於習知技術，本發明提供之使用特定CRL同功酶之方法能夠有效地自痲瘋樹籽油生產生質柴油。
轉酯化反應中，對於維持酵素構型以增加水與油之間可用的界面面積而言，水係必要的。然而，過量的水可能稀釋可用的甲醇量並使轉酯化反應反轉成水解反應。本實施例係測試最適於進行酵素催化生質柴油合成的水含量及酵素劑量。依據實施例4所述之方式進行FAME之合成反應，並調整水含量或酵素劑量。
第1圖顯示不同水含量及不同劑量之CRL2(20U、40U及80U，每0.5g油品)對初始速率及FAME產量影響。結果顯示，水含量為20%時，任何劑量之CRL2皆無法有效地進行催化反應。水含量為30%時則可提供20U之CRL2足夠的界面面積，然由於酵素被稀釋，故水含量增加並不顯著影響初始速率。於40%水含量與40U之CRL2之組別中亦可觀察到類似的情況，而80U之CRL2與50%水含量之組別可達到最高之初始速率(3.25% h-1)。
此外，第2A圖亦顯示當水含量為20%時，並無FAME產生。另，如第2B至2D圖所示，反應進行24小時後，20U之CRL2與30%水含量之組別之FAME產率為34%，優
於20U之CRL2與40%或50%水含量之組別；40U之CRL2與40%水含量之組別之FAME產率為49.1%，優於40U之CRL2與50%水含量之組別；而80U之CRL2之FAME產率隨著水含量增加而增加，當水含量為50%時，產率達到最高之62.9%。由此可知，不同劑量之酵素生產FAME之能力強烈地受到水含量影響。
本實施例係測定最適於進行酵素催化生質柴油合成的溫度。依據實施例4所述之方式進行FAME合成，並調整反應溫度，其中，反應混合物包括0.5g痲瘋樹籽油、66mg甲醇(油與甲醇之莫耳濃度比為1：3)、50%水及80U CRL2。
如第3圖所示，FAME產率於10℃至37℃之範圍內隨反應溫度增加而增加，37℃時產率最高達56.9%，然而，於50℃時產率則快速下降。當反應溫度分別為10℃、20℃、30℃時，CRL2之活性分別為於37℃時之57.7%、84.8%及88.4%。
與先前研究相比，Chang等人(Food Chem.155,140-145.2014)指出，利用CRL2催化大豆油生產生質柴油時，於40℃時獲得最高FAME產率僅40.2%。由此可知，相較於使用精煉之可食用油，本發明提供使用非食用油之方法更能有效地生產生質柴油，且反應溫度較為溫和，有利於工業應用。
將三酸甘油酯完全轉換成FAME時通常需要1化學當量(1eq.)的甲醇。一般而言，加入越多醇類，越能增加轉酯化產率。然而，過量的醇類也抑制了酵素活性，進而降低生質柴油產量。
本實施例係測定最適於進行酵素催化生質柴油合成的受質莫耳濃度。依據實施例4所述之方式進行FAME合成，並調整受質濃度(油：甲醇=1：3至1：6，即1eq.至2eq.甲醇)，其中，反應混合物包括50%水及80U CRL2(每0.5g痲瘋樹籽油)，反應條件為37℃，72小時。
如第4圖所示，油與甲醇之莫耳濃度比為1：3及1：4時可達到較高之FAME產率(93.5%及88.8)，而當莫耳濃度比為1：5或1：6時FAME產量則降低。莫耳濃度比為1：5或1：6時甲醇之量相當於23.0%及26.4%(w/w)(於水相中)。此結果顯示，水中甲醇量越高，將使CRL2去活化，因而使FAME產量降低。
為避免因甲醇而導致的酵素去活化，本實施例利用隨時間逐步地加入甲醇，測定甲醇進料方式對於FAME產率之影響。
依據實施例4所述之方式進行FAME合成，其中，反應開始時先加入1eq.甲醇於反應物中，接著於不同時間點(如8小時、16小時或24小時)再加入1eq.或0.5eq.甲醇，亦即，反應過程中總共加入1.5eq.至2eq.甲醇。結果如第5A圖所示，於8小時額外加入1eq.甲醇會造成CRL2去活
化，並降低FAME產率；而於16小時或24小時額外加入1eq.甲醇所得之產率相當於不額外加入甲醇之組別於72小時時達到之產率。於24小時額外加入1eq.甲醇之組別在48小時時達到91.6%，根據24小時時轉換率約60%來計算，此時反應物中之甲醇總量並未超過1.4eq.(即油：甲醇=1：4.2)。因此，於24小時額外加入1eq.甲醇時之受質莫耳濃度比並不會造成CRL2去活化。
如第5B圖所示，於8小時、16小時及24小時額外加入0.5eq.甲醇時，48小時之FAME產率分別可達94.5%、94.8%及95.3%，皆高於不額外加入甲醇之組別。
由上述結果可知，反應開始時加入1eq.甲醇，並於24小時加入0.5eq.甲醇為最佳之甲醇進料方式，且不會抑制CRL2。此結果亦顯示，本發明提供之方法能以較低成本之方式達到可與使用固定化酵素之習知技術比較之FAME產率。
批次轉酯化反應完成後，將反應混合物離心分為三相，上層為FMAE相，包含FMAE及剩餘的甘油酯。中間層及下層結合稱之為甘油-水相，包含水、所產生之甘油、所使用之CRL及殘留的甲醇。甘油-水相可回收用於下一批次。當重複使用甘油-水相時，殘留的甲醇(約0.5eq.)可被視為下一批次中已加入的甲醇。在第2至4次重複之批次中，起始甲醇之進料量不超過0.5eq.，故可限制總甲醇之量不超過1eq.。於24小時額外加入0.5eq甲醇，總共
反應48小時。重複使用第1、2及3次後所得之FAME產量分別為94.9%、81.1%及53%。此外，在第6天及第3次重複使用後，液態CRL2尚餘56%之活性，而在第8天及第4次重複使用後，尚餘37.5%之活性。
由上可知，本發明鑑定出能將非食用油有效轉化成生質柴油之CRL同功酶，並可藉由重組酵母菌表現系統增加CRL同功酶的表現量，且該CRL同功酶能以液態形式進行轉酯化反應，易於分離而可回收再重複利用，因此，本發明之方法可明顯減少處理程序、降低製程成本以及有效增加最終產物的純度。此外，本發明之方法不需使用強酸鹼性之化學物質，避免對環境造成汙染，並能於溫和條件下進行，適合工業化生產。
上述實施方式僅為例示性說明本發明之原理及其功效，而非用於限制本發明。任何熟習此項技藝之人士均可在不悖離本發明之精神及範疇下，對上述實施例進行修飾與變化。因此，本發明之權利保護範圍，應如後述之申請專利範圍所列。
本申請案引用的參考文獻所列如下，其等個別係以引用方式併入本文。
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本案圖式均為實驗數據圖式，故無指定代表圖。
Claims (20)
- 一種生產生質柴油的方法，包括：(1)提供重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶，其包括與SEQ ID NOs.1至4中之一者至少有90%相似度且與SEQ ID NOs.1至4中之一者具有相同活性之序列；(2)使該重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶與非食用油於第一醇類溶液存在下反應；以及(3)從經反應之溶液中分離出該生質柴油。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶包括SEQ ID NOs.1至4中之一者之序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶係由重組嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris)表現而得。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非食用油係選自由痲瘋樹籽油、卡蘭賈籽油、蓖麻籽油及其組合所組成群組中之至少一者。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，於該(2)之反應物中，該重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶之劑量為每公克非食用油40U至160U。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，於該(2)之反應物中，該反應開始時，該非食用油與該第一醇類溶液之莫耳濃度比為1：3至1：4.5。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該(2)之反 應物包含水，且以該反應物之重量為基準計，該水含量為30%至50%(wt)。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該(2)係於溫度10℃至37℃進行。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該(2)之反應時間為4小時至72小時。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該(2)進一步包括(2’)於該反應開始後，加入第二醇類溶液至該反應物中。
- 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中，該第二醇類溶液係於該反應開始後8小時至24小時內加入。
- 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中，該第二醇類溶液與該第一醇類溶液相同。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶係呈液態溶液之形式。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該第一醇類溶液為甲醇。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該生質柴油為脂肪酸甲酯。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，進一步包括(4)回收分離出該生質柴油後殘留之含有該重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶之溶液。
- 一種生產生質柴油的方法，包括：(1)提供重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶，其包括與 SEQ ID NOs.1至4中之一者至少有90%相似度且與SEQ ID NOs.1至4中之一者具有相同活性之序列；(2)使該重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶與非食用油於溫度10℃至37℃及第一醇類溶液存在下反應，且該反應開始時，該非食用油與該第一醇類溶液之莫耳濃度比為1：3至1：4.5；以及(3)從經反應之溶液中分離出該生質柴油。
- 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中，該(2)之反應物包含水，且以該反應物之重量為基準計，該水含量為30%至50%(wt)。
- 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中，該重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶係由重組嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris)表現而得，且該第一醇類溶液為甲醇。
- 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中，該(2)進一步包括(2’)於該反應開始後8小時至24小時內加入第二醇類溶液至該反應物中。
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