CN109735580B - 采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于二十二碳六烯酸和生物柴油的制备，特别是指一种采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法。包括培养微藻、湿藻体破壁、脂肪酶A的转酯化反应制备生物柴油和DHA、富含DHA藻油和生物柴油的分离等工艺步骤；本发明解决了现有技术存在的生物柴油的生产成本较高以及DHA在藻油中的含量低的技术难题。具有所制备的生物柴油的密度、运动黏度和十六烷值等主要技术指标符合国标要求，可大幅度降低生物柴油的生产成本，藻油中DHA含量高等优点。
Description
技术领域
本发明属于二十二碳六烯酸和生物柴油的制备，特别是指一种采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法。
背景技术
近年来，微藻是最有潜力被开发成微藻高附加值产品和生物柴油的生物资源之一。在现有微藻藻种中，破囊壶藻、裂殖壶藻和寇氏隐甲藻一直受到研究者的关注，这是因其具有生长速度快、油脂含量及二十二碳六烯酸(DHA)含量高(Marchan et al.，2018；Zhang，2018；Liu et al.，2015)。DHA是一种长链多不饱和脂肪酸，具有促进大脑发育、预防心血管疾病、抗肿瘤等多种生物学功能(Laye et al.，2018；Mocking et al.，2016；Silvaet al.，2015)。研究表明，与DHA的甘油三酯和脂肪酸乙酯形式相比，DHA的甘油二酯和单甘酯表现出更有优越的生物学特性(Destaillats et al.，2018；Feltes et al.，2012；Andoet al.，2017)。例如与DHA的甘油三酯或脂肪酸乙酯形式相比，摄食DHA单甘酯会更容易将DHA富集至血液、红细胞、大脑等组织，进而发挥其功能(Destaillats et al.，2018)。此外，与甘油三酯组相比，食用富含多不饱和脂肪酸的甘油二酯促进脂肪酸的β-氧化和阻碍脂肪酸的合成，从而降低内脏脂肪的堆积，达到减肥作用(Ando et al.，2017)。因此，近年来，研究者越来越关注开发富含长链多不饱和脂肪酸的甘油二酯和/或单甘酯。
脂肪酶的醇解反应(乙醇为介质)、甘油解反应、酯化反应和水解反应常用于制备富含长链多不饱和脂肪酸的甘油二酯和/或单甘酯(Byreddy et al.，2016；Feltes etal.，2012；He et al.，2017)。与其他酶反应相比，脂肪酶的醇解反应制备富含长链多不饱和脂肪酸的甘油二酯和/或单甘酯具有以下优点(Feltes et al.，2012；Ando et al.，2017；He et al.，2017；Guo et al.，2005)：(1)除了水之外，乙醇是最环保的物质，已被广泛用于食品领域；(2)醇解反应往往具有更高的底物转化率；(3)醇解反应后的甘油酯容易分离；(4)反应副产物脂肪酸乙酯是一种绿色的生物柴油。
生物柴油是一种无毒、可降解的生物能源，可以替代当前的化石燃料(Amini etal.，2017；Tian et al.，2016)。最近研究者已利用破囊壶藻、裂殖壶藻、寇氏隐甲藻等藻粉或藻油开发生物柴油。例如，Johnson和Wen利用直接醇解反应裂殖壶藻藻粉可获得66.37％的生物柴油(Johnson和Wen，2009)。Tian等人利用两步酶催化法(来源于黑曲霉的游离脂肪酶NS81006和南极假丝酵母的固定化脂肪酶B)催化破囊壶藻藻油可制备95％的生物柴油(Tian etal.，2016)。已有大量研究表明利用微藻制备生物柴油的品质指标(如密度、运动黏度和十六烷值)可达到中国生物柴油企业标准(标准代号：Q/WHRD 01-2003)、柴油机燃料调合用生物柴油(BD100)(GB/T 20828-2015)和美国生物柴油标准(ASTM D6751-2003)的技术指标要求(Mitra etal.，2015；刘婉君，2016；孙发强，2015；Lopez etal.，2016；Maedaetal.，2018)。国家质量监督检验检疫总局及国家质量标准化监督委员会于2017年9月1日颁布并实施了由石油化工研究院起草的《B5柴油》的国家标准(标准代号GB 25199-2017)。虽然藻油生物柴油具有上述优点，相比DHA或长链多不饱和脂肪酸，生物柴油是一种低值产品。当前国内外已开发破囊壶藻、裂殖壶藻、寇氏隐甲藻等DHA藻油，并将其应用于婴儿奶粉领域(Amini et al.，2017；Tian et al.，2016)。因此，利用破囊壶藻、裂殖壶藻、寇氏隐甲藻等DHA藻油开发生物柴油，无疑是一种资源的浪费。开发联产技术综合应用DHA藻油，达到资源的综合利用已成为技术及市场发展的迫切需求。
至今，应用于制备生物柴油和富含多不饱和脂肪酸的高附加值产品脂肪酶有南极假丝酵母的脂肪酶A和脂肪酶B、疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶、根毛霉脂肪酶等脂肪酶(Fleteset al.，2012；He et al.，2017；Fernandez-Lafuente，2010；Rodrigues et al.，2010)。这些常用的脂肪酶是以液体或固定化形式存在的(Fletes et al.，2012；He et al.，2017)。与固定化酶相比，利用液体脂肪酶具有价格低廉，已广泛应用于开发油化产品。此外，作为本申请的主要发明人研究发现，在上述所提到的脂肪酶中，南极假丝酵母脂肪酶A利用乙醇介质催化鱼油和等鞭金藻藻油具有歧视ω-3脂肪酸(十八碳四烯酸(SDA)、EPA、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA))的功能，即催化ω-3脂肪酸的速率显著低于其他脂肪酸(如饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸)(He et al.,2016和2017)。同时脂肪酶A表现非位置选择性的特性，达到富集SDA、EPA、DPA和DHA的作用(He et al.，2016和2017)。上述现有技术中通过脂肪酶A催化鱼油和等鞭金藻藻油，获得的DHA含量最高仅为52％。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，通过采用碱性蛋白酶解破壁含DHA的藻粉以及利用液体南极假丝酵母脂肪酶A进行转酯化反应，实现了联产低值的生物柴油和高附加值的DHA，同时有效降低了生物柴油的制造成本，提高了DHA在藻油中的含量。
本发明的整体技术构思是：
采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，包括如下工艺步骤：
A、培养微藻
在灭菌后改良的GPY培养基中采用异养培养的方法培养微藻制成发酵液，接种量为每升培养基接种微藻0.05克-0.2克，在装液量体积比为30％-50％、培养温度为23℃-28℃、转速为150转/分钟-250转/分钟的条件下培养5天-8天；所述的微藻选自破囊壶藻、裂殖壶藻或寇氏隐甲藻；
B、酶解破壁微藻
将步骤A中获得的发酵液高速离心后获得湿微藻藻体，按照每克藻体干重加入5毫升-20毫升蒸馏水以及0.01％-1％碱性蛋白酶的比例在湿微藻藻体中加入蒸馏水及碱性蛋白酶进行酶解，将酶解后的物料高速离心后获得破壁的微藻；
C、脂肪酶A的转酯化反应制备生物柴油和DHA
按照每克已破壁的微藻干重加入3毫升-5毫升的乙醇和20微升-60微升的液体脂肪酶A的比例，在步骤B中获得的破壁的湿微藻中加入乙醇及液体脂肪酶A进行转酯化反应，获得低值的生物柴油和高值化的DHA，转酯化反应的条件是：温度为30℃-40℃，转速为150转/分钟-250转/分钟，时间为60小时-96小时；液体脂肪酶A的选用南极假丝酵母脂肪酶A；
D、富含DHA藻油和生物柴油的分离
将步骤C中转酯化反应后的反应体系中加入正己烷，充分萃取后分离正己烷相并去除萃取剂，得到粗生物柴油；
下层乙醇相高速离心收集乙醇，藻渣采用乙醇充分萃取，合并萃取液并去除乙醇得到富含DHA的藻油。
本发明的具体技术构思还有：
本发明中的破囊壶藻、裂殖壶藻或寇氏隐甲藻可以采用多种现有藻种实现，其选择并不脱离本发明的技术实质，其中较为优选的技术方案是，所述的步骤A中的微藻选自破囊壶藻Thraustochytrium gaertnerium ATCC 148、裂殖壶藻Schizochytrium limacinumATCC 1381、裂殖壶藻Schizochytrium aggregatum ATCC 28209和寇氏隐甲藻Crypthecodinium cohnii ATCC 30340中的一种。
所述的破囊壶藻Thraustochytrium gaertnerium ATCC 148、裂殖壶藻Schizochytrium limacinum ATCC 1381、裂殖壶藻Schizochytrium aggregatum ATCC28209和寇氏隐甲藻Crypthecodinium cohnii ATCC 30340购自美国模式菌种收集中心(American type cul ture col lection)。
为满足破囊壶藻、裂殖壶藻或寇氏隐甲藻生长的需要，优选的技术方案是，步骤A中每升改良的GPY培养基包含如下质量的原料：
海盐15克-30克；葡萄糖5克-20克；蛋白胨3克-10克；酵母膏1克-10克。
为便于快速收集破囊壶藻、裂殖壶藻或寇氏隐甲藻，优选的技术方案是，步骤B中高速离心的条件是：转速为3000转/分钟-6000转/分钟，时间为3分钟-10分钟。
为提高碱性蛋白酶对湿破囊壶藻、裂殖壶藻或寇氏隐甲藻藻体酶解破壁效果，缩短酶解破壁反应时间，优选的技术实现方式是，所述的步骤B中的碱性蛋白酶来源于地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis发酵获得，由山东佛森生物有限公司生产，商品名碱性蛋白酶，酶活为20万U/g。1U的碱性蛋白酶酶活定义为：碱性蛋白酶在温度为40℃和pH为10条件下水解作用1％酪蛋白1分钟所释放1微克酪氨酸。
更为优选的技术方案是，所述的步骤B中的酶解条件是：温度为35℃-55℃，转速为150转/分钟-250转/分钟，酶解时间为4小时-24小时。
为提高转酯化反应性能，即DHA富集能力最高和生物柴油转化率最高，优选的技术实现手段是，步骤C中南极假丝酵母脂肪酶A酶活6KLU/g。1KLU的脂肪酶酶活为，脂肪酶在温度为37℃和pH为7.2条件下水解作用三丁酸甘油酯1分钟释放1毫摩尔的丁酸。
更为优选的技术方案是，步骤C中南极假丝酵母脂肪酶A由丹麦诺维信公司生产，英文缩写CALA，商品名
ADL，酶活6KLU/g。
粗生物柴油和富含DHA藻油的分离优选采用如下技术手段实现：
所述的步骤D中采用正己烷萃取得到粗生物柴油的具体工艺步骤为：将步骤C中转酯化反应后的反应体系中加入6-10倍体积的正己烷，充分萃取后静止分层，收集上层正己烷相；在下层中再加入6-10倍体积的正己烷，萃取并静止分层，收集上层正己烷相，将两次的正己烷相旋转蒸发去除正己烷获得粗生物柴油。
所述的步骤D中富含DHA的藻油的分离具体工艺步骤为：下层乙醇相在转速为3000转/分钟-6000转/分钟的条件下离心3分钟-5分钟，收集乙醇溶液；藻渣用同等体积的无水乙醇，洗涤两次，在转速为3000转/分钟-6000转/分钟的条件下离心3分钟-5分钟，收集乙醇溶液，合并乙醇溶液旋转蒸发去除乙醇，获得富含DHA的藻油。
为验证本发明的技术效果，申请人采用如下方法对本发明所获得的富含DHA藻油、生物柴油的转化率及品质进行测试：
1、测定富含DHA的藻油
取10mg的破囊壶藻、裂殖壶藻或寇氏隐甲藻藻粉，加1mL 0.5M氢氧化钠-甲醇溶液，于80℃反应10分钟；冷却后，加1mL 14％三氟化硼-甲醇溶液，于80℃反应2分钟。反应完成后，冷却至室温，加0.2mL饱和盐溶液(270mg/mL的氯化钠和1.5mg/mL的氯化钾)，振荡10秒后，加入1mL正己烷(含0.5mg十七烷酸甲酯)。充分振荡后，取正己烷，利用气相色谱仪，测定总可皂化的脂肪酸含量。
脂肪酶转酯化反应后，取2mg的反应物，加1mL正己烷(含0.1mg十七烷酸甲酯)，利用气相色谱仪，测定脂肪酸乙酯含量，即生物柴油的量。富含DHA的藻油制备量＝总可皂化的脂肪酸量-生物柴油的量。
脂肪酶转酯化反应后，藻油DHA含量可通过气相色谱仪测定。
2、生物柴油转化率和富含DHA藻油量的测定
反应进行完毕后，取2mg的反应物，加1mL正己烷(含0.1mg十七烷酸甲酯)，利用气相色谱仪，测定脂肪酸乙酯含量。生物柴油的转化率＝(100％×脂肪酸乙酯含量/可皂化的脂肪酸含量)。富含DHA藻油量＝100％-生物柴油转化率。
3、主要品质指标的测定
依据国标(GB 25199-2017)记载，测定所制备的生物柴油中密度、运动黏度和十六烷值等三个主要品质指标。
本发明所具备的实质性特点和取得的显著技术进步在于：
1、采用本发明的方法所制备富含DHA的藻油，其中DHA含量占富含DHA藻油总脂肪酸的75％-93％。所制备藻油中DHA浓度明显高于现有报道藻油中DHA含量。
2、采用本发明的方法所制备的生物柴油的密度(855-890kg/m3)、运动黏度(4.1-4.7mm2/s)和十六烷值(51-58)等主要技术指标，符合国标(GB 25199-2017)中对于生物柴油的主要技术指标要求，生物柴油的转化率可达70％-80％。
3、采用酶解破壁微藻，由于酶反应条件温和、水解酶底物选择性强、商用水解酶的价格低廉(https://www.1688.com，酶活为20万U/g的碱性蛋白酶价格约35元/kg)、酶用量少(低于1％)、其破壁反应过程的能耗较低，可大大降低生产高值化的DHA产品和低值的生物柴油的制备成本，为联产DHA及生物柴油技术的规模化生产提供了有力的科学依据及广阔前景。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，包括如下工艺步骤：
A、培养破囊壶藻Thraustochytrium gaertnerium ATCC 148
在灭菌后改良的GPY培养基中采用异养培养的方法培养破囊壶藻Thraustochytrium gaertnerium ATCC 148制成发酵液，接种量为每升培养基接种破囊壶藻Thraustochytrium gaertnerium ATCC 148 0.05克，装液量为按照体积比30％，培养温度为23℃，转速150转/分钟，培养周期5天；
B、湿破囊壶藻Thraustochytrium gaertnerium ATCC 148破壁
将步骤A中获得的发酵液在转速为3000转/分钟的条件下，高速离心3分钟，去除上清液，再用蒸馏水清洗两次，离心收集微藻细胞获得湿破囊壶藻，按照每克破囊壶藻干重加入5mL蒸馏水以及0.01％碱性蛋白酶的比例在湿藻体中加入蒸馏水及碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件是：温度为35℃、转速为150转/分钟、酶解时间为4小时；将酶解后的物料在转速为3000转/分钟的条件下，高速离心3分钟获得破壁的湿破囊壶藻；
C、脂肪酶A的转酯化反应制备生物柴油和DHA
按照每克已破壁的破囊壶藻干重加入3毫升的乙醇和20微升的南极假丝酵母脂肪酶A的比例，在步骤B中破壁的湿破囊壶藻中加入乙醇及南极假丝酵母脂肪酶A进行转酯化反应后获得低值的生物柴油和高值化的DHA，转酯化反应的条件是：温度为30℃，转速为150转/分钟，时间为60小时。
D、富含DHA藻油和生物柴油的分离
将步骤C中转酯化反应后的反应体系中加入6倍体积的正己烷，充分萃取后，静止分层，收集上层正己烷相。再加入6倍体积的正己烷，萃取并静止分层，收集上层正己烷相，将两次的正己烷相旋转蒸发去除正己烷，即获得粗生物柴油。
下层乙醇相，在转速为3000转/分钟的条件下离心3分钟，收集乙醇。藻渣用同等体积的无水乙醇，洗涤两次，在转速为3000转/分钟的条件下离心3分钟，收集乙醇溶液。将合并后的乙醇溶液旋转蒸发去除乙醇，即获得富含DHA的藻油。
所述的破囊壶藻Thraustochytrium gaertnerium ATCC 148购自美国模式菌种收集中心(American type culture collection)。
步骤A中每升改良的GYP培养基包含如下质量的原料：
海盐15克；葡萄糖5克；蛋白胨3克；酵母膏1克。
步骤B中的碱性蛋白酶来源于地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis发酵获得，由山东佛森生物有限公司生产，商品名碱性蛋白酶，酶活为20万U/g。
所述的步骤C中南极假丝酵母脂肪酶A由丹麦诺维信公司生产，英文缩写CALA，商品名
ADL，酶活6KLU/g。
通过气相色谱仪分析后，采用实施例1的方法获得的生物柴油转化率为70％。生物柴油密度为855kg/m3、运动黏度为4.1mm2/s和十六烷值为51。
富含DHA的藻油量为30％，DHA含量占富含DHA藻油总脂肪酸的75％。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，包括如下工艺步骤：
A、培养裂殖壶藻裂殖壶藻Schizochytrium limacinum ATCC 1381
在灭菌后改良的GPY培养基中采用异养培养的方法培养裂殖壶藻裂殖壶藻Schizochytrium limacinum ATCC 1381制成发酵液，接种量为每升培养基接种裂殖壶藻0.2克，装液量体积比50％，培养温度为28℃，转速250转/分钟，培养周期8天；
B、湿裂殖壶藻裂殖壶藻Schizochytrium limacinum ATCC 1381破壁
将步骤A中获得的发酵液在转速为6000转/分钟的条件下，高速离心10分钟，去除上清液，再用蒸馏水清洗两次，离心收集裂殖壶藻细胞获得湿裂殖壶藻，按照每克裂殖壶藻Schizochytrium limacinum ATCC 1381干重加入20mL蒸馏水以及1％碱性蛋白酶的比例在湿藻体中加入蒸馏水及碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件是：温度为55℃、转速为250转/分钟、酶解时间为24小时；将酶解后的物料在转速为6000转/分钟的条件下高速离心10分钟获得破壁的湿藻体；
C、脂肪酶A的转酯化反应制备生物柴油和DHA
按照每克裂殖壶藻Schizochytrium limacinum ATCC 1381干重加入5mL的乙醇和60μL的南极假丝酵母脂肪酶A的比例，在步骤B中获得的破壁的湿裂殖壶藻中加入乙醇及南极假丝酵母脂肪酶A进行转酯化反应后获得生物柴油，转酯化反应的条件是：温度为40℃，转速为250转/分钟，时间为96小时。
D、富含DHA藻油和生物柴油的分离
将步骤C中转酯化反应后的反应体系中加入10倍体积的正己烷，充分萃取后静止分层，收集上层正己烷相。再加入10倍体积的正己烷，萃取并静止分层收集上层正己烷相。将两次的正己烷相旋转蒸发去除正己烷，即获得粗生物柴油。
下层乙醇相，在转速为6000转/分钟的条件下离心5分钟，收集乙醇。藻渣用同等体积的无水乙醇，洗涤两次，在转速为6000转/分钟的条件下离心5分钟收集乙醇溶液。将合并后乙醇溶液旋转蒸发去除乙醇，即获得富含DHA的藻油。
步骤A中每升改良的GPY培养基包含如下质量的原料：
海盐30克；葡萄糖20克；蛋白胨10克；酵母膏10克。
裂殖壶藻Schizochytrium limacinum ATCC 1381购自美国模式菌种收集中心(American type culture collection)。
通过气相色谱仪分析后，采用实施例2的方法获得的生物柴油转化率为78％。生物柴油密度为890kg/m3、运动黏度为4.7mm2/s、十六烷值为58。
富含DHA的藻油量为22％，DHA含量占富含DHA藻油总脂肪酸的82％。
其余内容同实施例1。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，包括如下工艺步骤：
A、培养裂殖壶藻Schizochytrium aggregatum ATCC 28209
在灭菌后改良的GPY培养基中采用异养培养的方法培养裂殖壶藻Schizochytrium aggregatum ATCC 28209制成发酵液，接种量为每升培养基接种裂殖壶藻Schizochytrium aggregatum ATCC 28209 0.125克，装液量体积比为40％，培养温度为26℃，转速200转/分钟，培养周期6天；
B、湿裂殖壶藻Schizochytrium aggregatum ATCC 28209破壁
将步骤A中获得的发酵液在转速为4500转/分钟的条件下高速离心7分钟，去除上清液，再用蒸馏水清洗两次，离心收集微藻细胞获得湿裂殖壶藻，按照每克裂殖壶藻Schizochytrium aggregatum ATCC 28209干重加入10mL蒸馏水以及0.55％碱性蛋白酶的比例在湿裂殖壶藻藻体中加入蒸馏水及碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件是：温度为45℃、转速为200转/分钟、酶解时间为14小时；将酶解后的物料在转速为5000转/分钟的条件下高速离心7分钟获得破壁的湿藻体；
C、脂肪酶A的转酯化反应制备生物柴油和DHA
按照每克裂殖壶藻Schizochytrium aggregatum ATCC 28209干重加入4mL的乙醇和40μL的南极假丝酵母脂肪酶A的比例，在步骤B中获得的破壁的湿裂殖壶藻中加入乙醇及南极假丝酵母脂肪酶A进行转酯化反应后获得生物柴油，转酯化反应的条件是：温度为35℃，转速为200转/分钟，时间为78小时。
D、富含DHA藻油和生物柴油的分离
将步骤C中转酯化反应后的反应体系中加入8倍体积的正己烷，充分萃取后，静止分层，收集上层正己烷相。再加入8倍体积的正己烷，萃取并静止分层收集上层正己烷相。将两次的正己烷相旋转蒸发去除正己烷，即获得粗生物柴油。
下层乙醇相，在转速为4500转/分钟的条件下离心4分钟，收集乙醇。藻渣用同等体积的无水乙醇，洗涤两次，在转速为4500转/分钟的条件下离心4分钟收集乙醇溶液。将合并的乙醇溶液旋转蒸发去除乙醇，即获得富含DHA的藻油。
步骤A中每升改良的GYP培养基包含如下质量的原料：
海盐22.5克；葡萄糖12.5克；蛋白胨6.5克；酵母膏5.5克。
裂殖壶藻Schizochytrium aggregatum ATCC 28209购自美国模式菌种收集中心(American type culture collection)。
通过气相色谱仪分析后，采用实施例3的方法获得的生物柴油转化率为75％。生物柴油密度为875kg/m3、运动黏度为4.5mm2/s、十六烷值为55。
富含DHA的藻油量为25％，DHA含量占富含DHA藻油总脂肪酸的85％。
其余内容同实施例1。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：
采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，包括如下工艺步骤：
A、培养寇氏隐甲藻Crypthecodinium cohnii ATCC 30340
在灭菌后改良的GPY培养基中采用异养培养的方法培养寇氏隐甲藻Crypthecodinium cohnii ATCC 30340制成发酵液，接种量为每升培养基含有寇氏隐甲藻Crypthecodinium cohnii ATCC 30340 0.15克，装液量体积比为35％，培养温度为25℃，转速170转/分钟，培养周期7天；
B、湿寇氏隐甲藻Crypthecodinium cohnii ATCC 30340破壁
将步骤A中获得的发酵液在转速为5500转/分钟的条件下，高速离心6分钟，去除上清液，再用蒸馏水清洗两次，离心收集寇氏隐甲藻细胞获得湿寇氏隐甲藻，按照每克寇氏隐甲藻Crypthecodinium cohnii ATCC 30340干重加入18mL蒸馏水以及0.25％碱性蛋白酶的比例在湿寇氏隐甲藻藻体中加入蒸馏水及碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件是：温度为40℃、转速为220转/分钟、酶解时间为10小时；将酶解后的物料在转速为4000转/分钟的条件下高速离心6分钟获得破壁的湿寇氏隐甲藻藻体；
C、脂肪酶A的转酯化反应制备生物柴油和DHA
按照每克寇氏隐甲藻Crypthecodinium cohnii ATCC 30340干重加入3.5mL的乙醇和30μL的南极假丝酵母脂肪酶A的比例，在步骤B中获得的破壁的湿寇氏隐甲藻中加入乙醇及南极假丝酵母脂肪酶A进行转酯化反应后获得生物柴油，转酯化反应的条件是：温度为32℃，转速为180转/分钟，时间为84小时。
D、富含DHA藻油和生物柴油的分离
将步骤C中转酯化反应后的反应体系中加入7倍体积的正己烷，充分萃取后，静止分层，收集上层正己烷相。再加入9倍体积的正己烷，萃取并静止分层收集上层正己烷相。将两次的正己烷相旋转蒸发去除正己烷，即获得粗生物柴油。
下层乙醇相，在转速为5500转/分钟的条件下离心3分钟，收集乙醇。藻渣用同等体积的无水乙醇，洗涤两次，在转速为5500转/分钟的条件下离心5分钟收集乙醇溶液。将合并的乙醇溶液旋转蒸发去除乙醇，即获得富含DHA的藻油。
步骤A中每升改良的GYP培养基包含如下质量的原料：
海盐20克；葡萄糖15克；蛋白胨5克；酵母膏8克。
寇氏隐甲藻Crypthecodinium cohnii ATCC 30340购自美国模式菌种收集中心(American type culture collection)。
通过气相色谱仪分析后，采用实施例4的方法获得的生物柴油转化率为80％。生物柴油密度为867kg/m3、运动黏度为4.3mm2/s、十六烷值为53。
富含DHA的藻油量为20％，DHA含量占富含DHA藻油总脂肪酸的93％。
其余内容同实施例1。
Claims (7)
1.采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，其特征在于包括如下工艺步骤：
A、培养微藻
在灭菌后改良的GPY培养基中采用异养培养的方法培养微藻制成发酵液，接种量为每升培养基接种微藻0.05克-0.2克，在装液量体积比为30%-50%、培养温度为23℃-28℃、转速为150转/分钟-250转/分钟的条件下培养5天-8天；所述的微藻选自破囊壶藻、裂殖壶藻或寇氏隐甲藻；
B、酶解破壁微藻
将步骤A中获得的发酵液高速离心后获得湿微藻藻体，按照每克藻体干重加入5毫升-20毫升蒸馏水以及0.01%-1%碱性蛋白酶的比例在湿微藻藻体中加入蒸馏水及碱性蛋白酶进行酶解，将酶解后的物料高速离心后获得破壁的微藻；
C、脂肪酶A的转酯化反应制备生物柴油和DHA
按照每克已破壁的微藻干重加入3毫升-5毫升的乙醇和20微升-60微升的液体脂肪酶A的比例，在步骤B中获得的破壁的湿微藻中加入乙醇及液体脂肪酶A进行转酯化反应，获得低值的生物柴油和高值化的DHA，转酯化反应的条件是：温度为30℃-40℃，转速为150转/分钟-250转/分钟，时间为60小时-96小时；液体脂肪酶A的选用南极假丝酵母脂肪酶A；
D、富含DHA藻油和生物柴油的分离
将步骤C中转酯化反应后的反应体系中加入正己烷，充分萃取后分离正己烷相并去除萃取剂，得到粗生物柴油；
下层乙醇相高速离心收集乙醇，藻渣采用乙醇充分萃取，合并萃取液并去除乙醇得到富含DHA的藻油；
所述的步骤A中的微藻选自破囊壶藻Thraustochytrium gaertnerium ATCC 148、裂殖壶藻Schizochytrium limacinum ATCC 1381、裂殖壶藻Schizochytrium aggregatum ATCC28209和寇氏隐甲藻Crypthecodinium cohnii ATCC 30340中的一种；
所述的步骤B中的酶解条件是：温度为35℃-55℃，转速为150转/分钟-250转/分钟，酶解时间为4小时-24小时。
2.根据权利要求1所述的采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤A中每升改良的GPY培养基包含如下质量的原料：
海盐15克-30克；葡萄糖5克-20克；蛋白胨3克-10克；酵母膏1克-10克。
3.根据权利要求1所述的采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤B中高速离心的条件是：转速为3000转/分钟-6000转/分钟，时间为3分钟-10分钟。
4.根据权利要求1所述的采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤B中的碱性蛋白酶来源于地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis发酵获得，由山东佛森生物有限公司生产，商品名碱性蛋白酶，酶活为20万U/g。
5.根据权利要求1所述的采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤C中南极假丝酵母脂肪酶A由丹麦诺维信公司生产，英文缩写CALA，商品名NovoCor®ADL，酶活6KLU/g。
6.根据权利要求1所述的采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤D中采用正己烷萃取得到粗生物柴油的具体工艺步骤为：将步骤C中转酯化反应后的反应体系中加入6-10倍体积的正己烷，充分萃取后静止分层，收集上层正己烷相；在下层中再加入6-10倍体积的正己烷，萃取并静止分层，收集上层正己烷相，将两次的正己烷相旋转蒸发去除正己烷获得粗生物柴油。
7.根据权利要求1或6中任一项所述的采用脂肪酶选择性催化微藻藻粉联产二十二碳六烯酸和生物柴油的方法，其特征在于所述的步骤D中富含DHA的藻油的分离具体工艺步骤为：下层乙醇相在转速为3000转/分钟-6000转/分钟的条件下离心3分钟-5分钟，收集乙醇溶液；藻渣用同等体积的无水乙醇，洗涤两次，在转速为3000转/分钟-6000转/分钟的条件下离心3分钟-5分钟，收集乙醇溶液，合并乙醇溶液旋转蒸发去除乙醇，获得富含DHA的藻油。
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