CN115161304B - 米黑根毛霉脂肪酶变异体及其应用 - Google Patents

米黑根毛霉脂肪酶变异体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种米黑根毛霉脂肪酶变异体及其应用，所述米黑根毛霉脂肪酶变异体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述变异体相较于野生型脂肪酶，其最适反应温度由原来的45℃变为35℃，且在最适反应温度35℃下的比活力由原来的13.09U/mg上升为78.54U/mg，活力提高到野生型脂肪酶的6倍，且最适反应pH发生了明显酸移，本发明的米黑根毛霉脂肪酶变异体更符合食品加工等行业中对脂肪酶的温度和活力需求，具有较好的应用前景。

Description

米黑根毛霉脂肪酶变异体及其应用
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体地说，本发明涉及一种中低温高活性的米黑根毛霉脂肪酶(RML)变异体及其应用。
背景技术
在食品加工业中，为了避免食品在高温反应下发生不良反应，需要在中低温下进行加工。由于中低温脂肪酶在中低温条件下具有很好的催化活性，中低温脂肪酶已经成为现代食品工业中不可分割的一部分。近年来，大量微生物脂肪酶制剂在乳制品加工业中广泛应用，其主要用于乳品的增香、加速乳品的熟化，生产乳制品替代品以及黄油和脂类的脂解。
在加工过程中，中低温脂肪酶能在较低温条件下水解油脂、乳酯类物质后，主要产生C4和C6短链脂肪酸，能增添或者改进干酪及其他乳制品的香味和风味；而产生的中碳链脂肪酸(C10～C14)能使产品产生皂苷似风味。此外，由于脂肪酸参与到类似微生物反应的过程中，能促使乳制品中形成一些新风味物质，如甲基酮类、乳酯类和风味酯类等。
传统加工方法中，动物组织来源的脂肪酶可以用于乳制品加工中增香部分，尤其是牛和猪的胰腺，以及一些反刍动物的消化道组织等。不同来源的脂肪酶特性不同，也会产生不同的风味。例如在不同奶源的乳制品加工中使用中低温脂肪酶，可以在很大程度上改善原有的不良风味，并且能增进乳制品的营养价值，也会有新的风味的生成。
除此之外，中低温脂肪酶在油脂加工中也有重要的应用价值。利用微生物脂肪酶1.3-位置的特异性可以选择性地水解油脂中特定的酯键，从而提高食用油脂的营养价值。在较低温度下进行水解的一个优点就是，不饱和脂肪酸的降解也会相对减少，甚至从高度不饱和油脂中不需要分馏就可以得到纯度较高的自然脂肪酸。此外，根据脂肪酶和预处理底物的特异性，部分水解后，会得到浓缩的、纯化的混合脂肪酸或者具有部分独特性质的甘油酯。除此之外，中低温脂肪酶还能在较低温度条件下快速的脱去油脂，能避免食品在加工过程中由于长时间的高温影响而改变原有的风味与质量。
因此筛选能在中低温下具有高效催化活性的脂肪酶具有重要意义。目前，中低温脂肪酶获取主要是通过两条途径：(1)、从自然环境中(多指寒冷环境)生活的低温微生物中获得；(2)、对已有开发具有价值的产脂肪酶的菌株进行诱变、分子改造等，提高其在中低温环境下的活性和对底物的催化效率。
但目前报道的耐低温、中低温脂肪酶种类较少，难以满足应用需求。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种米黑根毛霉脂肪酶变异体，所述脂肪酶变异体在中低温下具有高活性。
实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：
一种米黑根毛霉脂肪酶变异体，所述米黑根毛霉脂肪酶变异体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述米黑根毛霉脂肪酶变异体的编码基因，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示，或其核苷酸序列为SEQ ID NO.3的反向序列。
本发明还提供了上述米黑根毛霉脂肪酶突变体或上述米黑根毛霉脂肪酶突变体的编码基因在食品加工中的应用。
本发明还提供了一种插入米黑根毛霉脂肪酶变异体的编码基因的重组表达载体。
本发明还提供了一种转入上述重组表达载体的重组工程菌。
在其中一些实施例中，所述重组工程菌的宿主菌为毕赤酵母。
本发明还提供上述重组表达载体或上述重组工程菌在食品加工中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
在本发明中，通过将一段特殊的多肽基因与米黑根毛霉脂肪酶编码基因进行融合表达后，得到米黑根毛霉脂肪酶变异体，所述米黑根毛霉脂肪酶变异体相较于野生型米黑根毛霉脂肪酶，最适反应温度由原来的45℃变为35℃，其比活力有了显著提升(35℃下的比活力由原来的13.09U/mg上升为78.54U/mg，活力提高到野生型脂肪酶的6倍)，且在20℃-35℃温度范围内都有较高的比活力(可以在不需加热的工艺下进行酶处理)；此外，本发明的米黑根毛霉脂肪酶变异体的最适反应pH为4.0，发生了明显的酸移(野生型脂肪酶的最适pH为8.0)，说明本发明的米黑根毛霉脂肪酶变异体是一种酸性脂肪酶；因此，本发明的米黑根毛霉脂肪酶变异体更符合食品加工等行业中对脂肪酶的温度、pH和活力需求，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中经纯化的米黑根毛霉脂肪酶变异体的电泳检测图。
图2为本发明实施例4中温度对米黑根毛霉脂肪酶野生型及变异体的酶活力的影响结果。
图3为本发明实施例5中pH对米黑根毛霉脂肪酶野生型及变异体的酶活力的影响结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
米黑根毛霉脂肪酶(RML)，属于中温脂肪酶，其水解甘油三酯的最适温度为45℃，最适pH为8.0，在最适温度和最适pH条件下，具有最高的催化效率。为使RML具有更优良的应用效果，目前有关于RML突变体，主要集中在提高其热稳定性和提高其甲醇耐受性两种目的而设计。例如，Li等人通过多种计算方法在RML中引入单点突变和二硫键，在36个突变体组成的突变文库中，有24个突变体表现出了更高的热稳定性，最佳突变体在70℃下的半衰期增加了12.5倍，同时催化效率比野生型高39％；Sanches等人通过PAA与醛-葡聚糖形成交联聚合物，固定化脂肪酶RML，形成“纳米胶囊化”结构，通过该方法固定的RML的稳定性提高了439倍，同时具有更加优良的回收利用率和热稳定性；Tian等人采用半理性设计的方法，通过对RML的α螺旋进行N-糖基化修饰，得到的最优突变体的酶活力是野生型的66.81倍，甲醇耐受性也有了明显提升，用突变体生产生物柴油的产率提高到90.46％。由于RML脂肪酶的最适反应温度偏高，最适反应pH是碱性，都会限制其在食品加工中的应用。因为对于一些风味成分比较重要的食品(如奶酪等)，酶处理的温度高会导致风味的额外损失，且在实际应用中的能耗也会更高，而在粮油食品加工尤其是植物油脱胶中，碱性脂肪酶也并不适用。因此，本发明的发明人对RML脂肪酶进行改造，使其更适合应用于食品加工中。
在本发明的其中一个方面，提供了一种RML脂肪酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的变异体(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，该变异体使得RML脂肪酶的最适反应温度由原来的45℃变为35℃，且在35℃下的比活力由原来的13.09U/mg上升为78.54U/mg，活力提高到野生型脂肪酶的6倍，更符合食品加工等行业中对脂肪酶的温度和活力需求，具有较好的应用前景。
RML脂肪酶的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：
VPIKRQSNSTVDSLPPLIPSRTSAPSSSPSTTDPEAPAMSRNGPLPSDVETKYGMALNATSYPDSVVQAMSIDGGIRAATSQEINELTYYTTLSANSYCRTVIPGATWDCIHCDATEDLKIIKTWSTLIYDTNAMVARGDSEKTIYIVFRGSSSIRNWIADLTFVPVSYPPVSGTKVHKGFLDSYGEVQNELVATVLDQFKQYPSYKVAVTGHSLGGATALLCALDLYQREEGLSSSNLFLYTQGQPRVGDPAFANYVVSTGIPYRRTVNERDIVPHLPPAAFGFLHAGEEYWITDNSPETVQVCTSDLETSDCSNSIVPFTSVLDHLSYFGINTGLCTHHHHHH
RML脂肪酶变异体的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：
VPIKRQSNSTVDSLPPLIPSRTSAPSSSPSTTDPEAPAMSRNGPLPSDVETKYGMALNATSYPDSVVQAMSIDGGIRAATSQEINELTYYTTLSANSYCRTVIPGATWDCIHCDATEDLKIIKTWSTLIYDTNAMVARGDSEKTIYIVFRGSSSIRNWIADLTFVPVSYPPVSGTKVHKGFLDSYGEVQNELVATVLDQFKQYPSYKVAVTGHSLGGATALLCALDLYQREEGLSSSNLFLYTQGQPRVGDPAFANYVVSTGIPYRRTVNERDIVPHLPPAAFGFLHAGEEYWITDNSPETVQVCTSDLETSDCSNSIVPFTSVLDHLSYFGINTGLCTQATDACNAGGFSWRRYRSAESVDKRATMTDAELEKKLNSYVQMDKEYVKNNQARSHHHHHH
编码RML脂肪酶变异体的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)：
GTGCCAATCAAGAGACAATCAAACAGCACGGTGGATAGTCTGCCACCCCTCATCCCCTCTCGAACCTCGGCACCTTCATCATCACCAAGCACAACCGACCCTGAAGCTCCAGCCATGAGTCGCAATGGACCGCTGCCCTCGGATGTAGAGACTAAATATGGCATGGCTTTGAATGCTACTTCCTATCCGGATTCTGTGGTCCAAGCAATGAGTATTGATGGAGGTATAAGAGCCGCAACCTCACAGGAGATCAATGAATTGACTTATTACACCACATTATCTGCCAACTCATACTGCCGTACTGTCATTCCCGGAGCTACCTGGGACTGTATACATTGTGATGCAACTGAGGACCTGAAAATTATCAAGACTTGGTCCACCTTGATTTATGATACAAATGCAATGGTGGCACGTGGTGACTCCGAAAAAACTATCTATATTGTCTTCAGAGGTTCATCATCGATCAGAAACTGGATTGCTGATTTAACCTTTGTGCCAGTATCATATCCTCCAGTCAGTGGTACAAAAGTACACAAGGGATTCTTGGACAGTTACGGAGAAGTGCAAAATGAGCTTGTTGCTACTGTTCTTGACCAGTTCAAGCAATATCCCTCTTACAAGGTGGCTGTTACAGGTCACTCATTAGGTGGTGCTACTGCTTTGCTTTGCGCCCTGGATCTGTATCAAAGAGAAGAAGGACTGTCATCCTCTAACTTGTTCCTTTACACTCAAGGTCAACCACGTGTAGGTGACCCTGCCTTTGCCAACTACGTTGTTTCCACCGGTATTCCTTACAGGAGGACTGTCAATGAAAGAGATATAGTTCCTCATCTTCCACCTGCAGCTTTTGGTTTTTTGCACGCTGGTGAGGAGTATTGGATTACTGACAATTCTCCAGAGACTGTTCAGGTCTGTACATCTGATCTGGAAACCTCTGATTGTTCTAACTCTATTGTTCCCTTCACAAGTGTTCTTGACCATCTGTCTTACTTTGGTATCAACACAGGATTGTGTACTCAAGCTACTGACGCATGTAACGCAGGTGGCTTTTCCTGGAGAAGATATAGATCTGCTGAATCTGTCGATAAGAGAGCAACTATGACTGACGCCGAGTTGGAAAAGAAGCTAAACTCTTACGTGCAAATGGATAAAGAGTATGTCAAGAACAATCAGGCCAGGTCCCATCATCATCATCATTAAGGTACCTCGAGCCGCGGCGGCCGCCAGCTTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATCAT
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1 RML脂肪酶变异体表达载体的构建
利用融合PCR技术，将多肽(其核苷酸序列为SEQ ID NO.4)与RML脂肪酶的核苷酸基因序列(母本)进行融合，获得变异体表达载体。
多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)：
CAAGCTACTGACGCATGTAACGCAGGTGGCTTTTCCTGGAGAAGATATAGATCTGCTGAATCTGTCGATAAGAGAGCAACTATGACTGACGCCGAGTTGGAAAAGAAGCTAAACTCTTACGTGCAAATGGATAAAGAGTATGTCAAGAACAATCAGGCCAGGTCC
具体包括以下步骤：
(1)、针对多肽序列，设计4对引物对(如表1)
表1引物表
Figure BDA0003664786710000071
/>
Figure BDA0003664786710000081
(2)、以脂肪酶质粒pPICZαA-RML(华南理工大学保存)为模板，表1所示引物对为引物，进行融合PCR扩增，PCR扩增反应体系如表2所示。
表2反应体系
Figure BDA0003664786710000082
Figure BDA0003664786710000091
PCR反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸5min。
(3)、PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检验，PCR产物经检测确认后，加入Dpn I，酶切去除带甲基化的原始模板链。酶切体系为：8μL PCR产物、1μL buffer，1μL酶液，酶切反应条件为37℃1h。
(4)、将酶切产物转化到大肠杆菌Top10中，37℃过夜培养后，挑取单克隆到LB液体培养基中培养，提取质粒进行基因序列测定，确定目标的多肽已经正确与母本基因进行融合。
本实施例设计并成功构建4个脂肪酶变异体载体(即含有RML脂肪酶变异体编码基因的表达载体)。
实施例2 RML变异体酶蛋白制备与纯化
包括以下步骤：
1、利用电转化法将实施例1构建的4个含有脂肪酶变异体编码基因的表达载体，转入毕赤酵母X-33的基因组中，获得基因工程菌。
2、将基因工程菌接种至YPG一级种子培养基中扩大培养，当OD值达到1.6-2时，转接到二级YPG种子培养基中，培养12-16小时。
3、将种子液按1：10的比例接种到发酵罐培养基中，进行高密度发酵，菌体湿重达到150-180g/L时进行诱导表达，诱导剂为甲醇，诱导72-108h后收菌，将菌液在10000rpm下离心20min后收集上清，即为粗酶液。
4、将RML脂肪酶变异体粗酶液浓缩并用20mM pH 7.4PBS缓冲液脱盐，上样到阴离子交换层析柱(Q FF,GE Healthcare)，流速2mL/min，随后用20mM pH 7.4PBS缓冲液(含300mM NaCl)洗脱，得到纯化的RML脂肪酶变异体。
5、为使蛋白稳定保存，将目的蛋白换盐至pH 7.4的20mM PBS缓冲液中。经过上述步骤，获得纯度在90％以上的RML脂肪酶变异体，其SDS-PAGE检测结果如图1所示。从图1可以看出：泳道1-4分别为RML脂肪酶变异体1、2、3、4，RML脂肪酶变异体均获得了良好的纯化效果，蛋白分子量分别约为30kDa，32kDa，32kDa，32kDa。
6、目的蛋白浓度测定：将20μL待测蛋白溶液和200μL Bradford试剂混合，室温下反应5min后测定其A595，结合标准曲线计算出RML脂肪酶变异体1～4的蛋白浓度分别为1.17mg/mL，0.92mg/mL，0.87mg/mL，1.27mg/mL。
实施例3 RML脂肪酶变异体的脂肪酶活力测定
酶活力测定采用碱式滴定法。
酶活定义：在一定反应条件下，每分钟催化底物水解生成1μmol脂肪酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位，用U表示，即1U。
酶活力通过下列公式计算：
Figure BDA0003664786710000101
其中：X为比酶活，U/mg；V1：实验组所消耗的氢氧化钠体积，mL；V0：对照组所消耗的氢氧化钠体积，mL；t：反应时间，min；c：反应酶液的蛋白浓度，mg/mL；v：反应加入的酶液体积，mL。
具体方法为：
1、在50mL具塞三角瓶中加入4mL橄榄油乳化液和5mL缓冲液于恒温水浴摇床下预热5min，实验组加入1mL RML脂肪酶野生型或RML脂肪酶变异体纯酶液，对照组加入1mL对应的失活的酶液，200rpm反应5min后，加入15mL 95％乙醇终止反应。
2、反应结束后，加入2滴1％酚酞溶液，用0.05mol/LNaOH标准溶液滴定，计算NaOH消耗的体积，进而计算出脂肪酶活力单位。
本实施例测定了RML脂肪酶野生型及4个RML脂肪酶变异体的脂肪酶比活力。结果如表3所示。
表3 RML脂肪酶野生型及变异体的酶活力测定结果
Figure BDA0003664786710000111
从表3结果可知，相较于RML脂肪酶野生型，本发明所构建的4个RML脂肪酶变异体的脂肪酶活力均有所提升。其中1号RML脂肪酶变异体的脂肪酶比酶活力最高，为78.54U/mg，是野生型的6倍，该变异体为本发明中的最优突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该脂肪酶变异体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例4 RML脂肪酶变异体的最适反应温度测定
本实施例测定了本发明的最优突变体，即RML脂肪酶变异体1的最适反应温度。具体包括以下步骤：
1、以橄榄油乳化液为底物，在20mM pH为4.0的反应缓冲液(柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)中，分别在20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃下测定脂肪酶活力，每组实验重复三次。
2、以温度为横坐标，比酶活力为纵坐标，作出曲线图。
结果如图2所示，从图2可知，本发明的RML脂肪酶变异体的最适反应温度为35℃，相比于RML脂肪酶的最适温度45℃，下降了10℃。且RML脂肪酶变异体在一个较广的温度范围内(20℃～35℃)，其比酶活力都是较高的(超过60U/mg)，表明本发明的RML脂肪酶变异体可以在较低温度下实现良好的催化效果。
实施例5 RML脂肪酶变异体的最适反应pH测定
本实施例测定了本发明的最优突变体，即RML脂肪酶变异体1的最适反应pH。具体包括以下步骤：
1、以橄榄油乳化液为底物，在20mM pH分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的反应缓冲液(pH 3.0-5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH 6.0-8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液)中，在35℃下测定脂肪酶活力，每组实验重复三次。
3、以温度为横坐标，比酶活力为纵坐标，作出曲线图。
结果如图3所示，从图3可知，本发明的RML脂肪酶变异体的最适反应pH为4.0，相比于RML脂肪酶野生型的最适pH为8.0，发生了明显的酸移，说明本发明的RML脂肪酶变异体是一种酸性脂肪酶，可以应用于粮油食品加工等领域。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 华南理工大学、广东优酶生物制造研究院有限公司
<120> 米黑根毛霉脂肪酶变异体及其应用
<130> 1
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro
1 5 10 15
Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr
20 25 30
Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Asp
35 40 45
Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser Tyr Pro Asp
50 55 60
Ser Val Val Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr
65 70 75 80
Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn
85 90 95
Ser Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His
100 105 110
Cys Asp Ala Thr Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu
115 120 125
Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr
130 135 140
Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala
145 150 155 160
Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys
165 170 175
Val His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu
180 185 190
Val Ala Thr Val Leu Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val
195 200 205
Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala
210 215 220
Leu Asp Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn
245 250 255
Tyr Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg
260 265 270
Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala
275 280 285
Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val
290 295 300
Cys Thr Ser Asp Leu Glu Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro
305 310 315 320
Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly
325 330 335
Leu Cys Thr His His His His His His
340 345
<210> 2
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro
1 5 10 15
Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr
20 25 30
Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Asp
35 40 45
Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser Tyr Pro Asp
50 55 60
Ser Val Val Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr
65 70 75 80
Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn
85 90 95
Ser Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His
100 105 110
Cys Asp Ala Thr Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu
115 120 125
Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr
130 135 140
Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala
145 150 155 160
Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys
165 170 175
Val His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu
180 185 190
Val Ala Thr Val Leu Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val
195 200 205
Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala
210 215 220
Leu Asp Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn
245 250 255
Tyr Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg
260 265 270
Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala
275 280 285
Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val
290 295 300
Cys Thr Ser Asp Leu Glu Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro
305 310 315 320
Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly
325 330 335
Leu Cys Thr Gln Ala Thr Asp Ala Cys Asn Ala Gly Gly Phe Ser Trp
340 345 350
Arg Arg Tyr Arg Ser Ala Glu Ser Val Asp Lys Arg Ala Thr Met Thr
355 360 365
Asp Ala Glu Leu Glu Lys Lys Leu Asn Ser Tyr Val Gln Met Asp Lys
370 375 380
Glu Tyr Val Lys Asn Asn Gln Ala Arg Ser His His His His His His
385 390 395 400
<210> 3
<211> 1300
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgccaatca agagacaatc aaacagcacg gtggatagtc tgccacccct catcccctct 60
cgaacctcgg caccttcatc atcaccaagc acaaccgacc ctgaagctcc agccatgagt 120
cgcaatggac cgctgccctc ggatgtagag actaaatatg gcatggcttt gaatgctact 180
tcctatccgg attctgtggt ccaagcaatg agtattgatg gaggtataag agccgcaacc 240
tcacaggaga tcaatgaatt gacttattac accacattat ctgccaactc atactgccgt 300
actgtcattc ccggagctac ctgggactgt atacattgtg atgcaactga ggacctgaaa 360
attatcaaga cttggtccac cttgatttat gatacaaatg caatggtggc acgtggtgac 420
tccgaaaaaa ctatctatat tgtcttcaga ggttcatcat cgatcagaaa ctggattgct 480
gatttaacct ttgtgccagt atcatatcct ccagtcagtg gtacaaaagt acacaaggga 540
ttcttggaca gttacggaga agtgcaaaat gagcttgttg ctactgttct tgaccagttc 600
aagcaatatc cctcttacaa ggtggctgtt acaggtcact cattaggtgg tgctactgct 660
ttgctttgcg ccctggatct gtatcaaaga gaagaaggac tgtcatcctc taacttgttc 720
ctttacactc aaggtcaacc acgtgtaggt gaccctgcct ttgccaacta cgttgtttcc 780
accggtattc cttacaggag gactgtcaat gaaagagata tagttcctca tcttccacct 840
gcagcttttg gttttttgca cgctggtgag gagtattgga ttactgacaa ttctccagag 900
actgttcagg tctgtacatc tgatctggaa acctctgatt gttctaactc tattgttccc 960
ttcacaagtg ttcttgacca tctgtcttac tttggtatca acacaggatt gtgtactcaa 1020
gctactgacg catgtaacgc aggtggcttt tcctggagaa gatatagatc tgctgaatct 1080
gtcgataaga gagcaactat gactgacgcc gagttggaaa agaagctaaa ctcttacgtg 1140
caaatggata aagagtatgt caagaacaat caggccaggt cccatcatca tcatcattaa 1200
ggtacctcga gccgcggcgg ccgccagctt tctagaacaa aaactcatct cagaagagga 1260
tctgaatagc gccgtcgacc atcatcatca tcatcatcat 1300
<210> 4
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caagctactg acgcatgtaa cgcaggtggc ttttcctgga gaagatatag atctgctgaa 60
tctgtcgata agagagcaac tatgactgac gccgagttgg aaaagaagct aaactcttac 120
gtgcaaatgg ataaagagta tgtcaagaac aatcaggcca ggtcc 165
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catctgtctt actttggtat caacacagga ttgtgtactc aagctactga cgcatgtaa 59
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<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catgcgtcag tagcttgagt acacaatcct gtgttgatac caaagtaaga cagatggtc 59
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catctgtctt actttcaagc tactgacgca tgtaaccatc atcatcatca tcattaagg 59
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
taatgatgat gatgatgatg gttacatgcg tcagtagctt gaaagtaaga cagatggtc 59
<210> 9
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcaaatgga taaagagtat gtcaagaaca atcaggccag gtcccatcat catcatcatc 60
att 63
<210> 10
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aactatgact gacgccgagt tggaaaagaa gctaaactct tacgtgcaaa tggataaag 59
<210> 11
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atatcttctc caggaaaagc cacctgcgtt acatgcgtca gtagcttgaa agtaagacag 60
atg 63
<210> 12
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcgtcagtca tagttgctct cttatcgaca gattcagcag atctatatct tctccagga 59
<210> 13
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
catctgtctt actttcaagc tactgacgca tgtaacaagc tactgacgca tgtaacgca 59
<210> 14
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gttacatgcg tcagtagctt gttacatgcg tcagtagctt gaaagtaaga cagatggtc 59

Claims (10)

1.一种米黑根毛霉脂肪酶变异体，其特征在于，所述米黑根毛霉脂肪酶变异体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的米黑根毛霉脂肪酶变异体的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
4.权利要求1所述的米黑根毛霉脂肪酶变异体、或权利要求2或3所述的米黑根毛霉脂肪酶变异体的编码基因在食品加工中的应用。
5.一种插入权利要求2或3的米黑根毛霉脂肪酶变异体的编码基因的重组表达载体。
6.一种转入权利要求5所述的重组表达载体的重组工程菌。
7.根据权利要求6所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌的宿主菌为毕赤酵母。
8.权利要求5所述的重组表达载体、或权利要求6或7所述的重组工程菌在食品加工中的应用。
9.一种米黑根毛霉脂肪酶变异体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求6或7所述的重组工程菌株进行诱导表达、纯化，即得。
10.根据权利要求9所述的米黑根毛霉脂肪酶变异体的制备方法，其特征在于，所述诱导表达的诱导剂为甲醇。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110923216A (zh) * 2018-09-19 2020-03-27 江苏师范大学 一种生产米黑根毛霉脂肪酶pRML酶粉的方法
CN112592910A (zh) * 2020-09-30 2021-04-02 华南理工大学 一种甘油酯脂肪酶突变体及其应用

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米黑根毛霉脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质研究;罗文等;林产化学与工业(第01期);第19910-19918页 *

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