CN116063555A

CN116063555A - Rml脂肪酶嵌合体及其应用

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Publication number: CN116063555A
Application number: CN202210989144.9A
Authority: CN
Inventors: 王永华; 蓝东明; 陈品怡; 王方华
Original assignee: Guangdong Youjiang Biological Manufacturing Research Institute Co ltd; South China University of Technology SCUT
Current assignee: Guangdong Youjiang Biological Manufacturing Research Institute Co ltd; South China University of Technology SCUT
Priority date: 2022-08-17
Filing date: 2022-08-17
Publication date: 2023-05-05

Abstract

本发明公开了一种RML脂肪酶嵌合体及其应用，所述RML脂肪酶嵌合体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述RML脂肪酶嵌合体在具有脂肪酶活力的同时也具有磷脂酶活力，且相较于野生型RML脂肪酶，对磷脂底物的水解活性提高了161倍，更符合磷脂加工中对酶性能的需求，可用于油脂脱胶、磷脂改性、生产溶血磷脂，应用于生物、食品、医药、美容、农业、工业等领域。

Description

RML脂肪酶嵌合体及其应用

技术领域

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体地说，本发明涉及一种具有较高磷脂水解活力的米黑根毛霉脂肪酶(RML)嵌合体及其应用。

背景技术

油脂脱胶的方法有水化脱胶、酸炼脱胶、吸附脱胶、热聚脱胶及化学试剂脱胶等。与其它脱胶方法相比，酶法脱胶可大大节约化学物质的消耗量，几乎不产生废水，在环保、质量等方面具有潜在的优势。一般将磷脂酶等酶制剂的水溶液加入到油水混合物中，通过具有高剪切速率的搅拌器使油水混合物形成乳液，酶在一定的温度下与毛油中的磷脂反应，将磷脂上一位或二位的脂肪酸脱除，使胶质在随后的过程中水化聚集，最后通过高速离心机进行脱除。脱胶是植物油精炼中非常重要的一道工序，脱胶效果好坏将直接影响精炼效率和产品质量。若脱胶不完全，则会加重脱色负担，影响油脂质量和精炼经济效益。

在脱胶用酶的开发方面，研究的关注点大都集中在磷脂酶上。应用新型磷脂酶进行油脂中磷脂脱除的酶法脱胶技术也得到了越来越多人的关注。但实验发现其实脂肪酶也具有磷脂酶的水解活性，因此，可通过筛选脂肪酶或对其进行改造获得高活性的磷脂水解底物。目前诺维信公司成功开发一种脂肪酶嵌合体Lecitase Ultra，用于油脂加工中进行酶法脱胶。诺维信公司推出的Lecitase Ultra是唯一可商品化用于植物油脱胶的一种脂肪酶。但除此之外，报道的嵌合体还较少。国内对脱胶用酶的开发，尤其是基于脂肪酶的脱胶用酶开发还处于起步阶段。

溶血磷脂在食品加工中可作为乳化分散剂、乳化剂使用，且具有一定的抗菌作用，效果优于普通磷脂，目前已被多国批准为天然食品添加剂。溶血磷脂添加在护肤化妆品的应用中，能起到调节改善皮肤呼吸，舒展皮肤皱纹的效果。在医药领域溶血磷脂还具有独特的生理功能作用。目前一般采用具有磷脂酶A1或A2的生物酶进行处理而获得溶血磷脂，对于脂肪酶进行改造获得较高磷脂酶活性的报道较少。

蛋白质工程技术是一种有效改善生物酶催化特性的技术，譬如提升酶热稳定性，提高催化效率及改变底物选择性。应用该技术改造获得兼具脂肪酶活力及磷脂酶水解活力的酶，这在磷脂改性应用领域中将有更佳的应用前景，其可将原料中甘油酯的含量的降低的同时提高溶血磷脂产物的含量，然而目前类似生物酶制剂仍然缺乏。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种RML脂肪酶嵌合体，所述脂肪酶嵌合体，兼具脂肪酶活力及磷脂酶水解活力。

实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：

一种RML脂肪酶嵌合体，所述RML脂肪酶嵌合体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了上述RML脂肪酶嵌合体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或其核苷酸序列为SEQ ID NO.3的反向序列。

本发明还提供了上述RML脂肪酶嵌合体或上述RML脂肪酶嵌合体的编码基因在油脂脱胶中的应用。

本发明还提供了上述RML脂肪酶嵌合体或上述RML脂肪酶嵌合体的编码基因在制备溶血磷脂中的应用。

本发明还提供了一种插入RML脂肪酶嵌合体的编码基因的重组表达载体。

本发明还提供了一种转入上述重组表达载体的重组工程菌。

在其中一些实施例中，所述重组工程菌的宿主菌为毕赤酵母。

本发明还提供上述重组表达载体或上述重组工程菌在油脂脱胶中的应用。

本发明还提供上述重组表达载体或上述重组工程菌在制备溶血磷脂中的应用。

本发明还提供了一种油脂脱胶的方法，利用上述RML脂肪酶嵌合体对油水混合物进行催化反应。

本发明还提供了一种制备溶血磷脂的方法，利用上述RML脂肪酶嵌合体催化磷脂底物转化为溶血磷脂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

在本发明中，通过将一段特殊的多肽基因与米黑根毛霉脂肪酶RML编码基因进行融合表达后，得到RML脂肪酶嵌合体，所述RML脂肪酶嵌合体在具有脂肪酶活力的同时也具有磷脂酶活力，且相较于野生型RML脂肪酶，对磷脂底物的水解活性提高了161倍，更符合磷脂加工中对酶性能的需求，可用于油脂脱胶、生产溶血磷脂，应用于生物、食品、医药、美容、农业、工业等领域。

附图说明

图1为本发明实施例1中经纯化的RML脂肪酶嵌合体的电泳检测图。

图2为本发明实施例4中pH对RML脂肪酶嵌合体的酶活力的影响结果。

图3为本发明实施例5中温度对RML脂肪酶嵌合体的酶活力的影响结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

米黑根毛霉脂肪酶(RML)，属于中温脂肪酶，其水解甘油三酯的最适温度为45℃，最适pH为8.0，在最适温度和最适pH条件下，具有最高的催化效率。为使RML具有更优良的应用效果，目前有关于RML嵌合体，主要集中在提高其热稳定性和提高其甲醇耐受性两种目的而设计。例如，Li等人通过多种计算方法在RML中引入单点突变和二硫键，在36个嵌合体组成的突变文库中，有24个嵌合体表现出了更高的热稳定性，最佳嵌合体在70℃下的半衰期增加了12.5倍，同时催化效率比野生型高39％；Sanches等人通过PAA与醛-葡聚糖形成交联聚合物，固定化脂肪酶RML，形成“纳米胶囊化”结构，通过该方法固定的RML的稳定性提高了439倍，同时具有更加优良的回收利用率和热稳定性；Tian等人采用半理性设计的方法，通过对RML的α螺旋进行N-糖基化修饰，得到的最优嵌合体的酶活力是野生型的66.81倍，甲醇耐受性也有了明显提升，用嵌合体生产生物柴油的产率提高到90.46％。本发明的发明人对RML脂肪酶进行改造，使其具有了很高的磷脂酶活力，可用于油脂脱胶、生产溶血磷脂，应用于生物、食品、医药、美容、农业、工业等领域。

在本发明的其中一个方面，提供了一种RML脂肪酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的嵌合体(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，该嵌合体具有很高的磷脂酶活力。

RML脂肪酶的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：

VPIKRQSNSTVDSLPPLIPSRTSAPSSSPSTTDPEAPAMSRNGPLPSDVETKYGMALNATSYPDSVVQAMSIDGGIRAATSQEINELTYYTTLSANSYCRTVIPGATWDCIHCDATEDLKIIKTWSTLIYDTNAMVARGDSEKTIYIVFRGSSSIRNWIADLTFVPVSYPPVSGTKVHKGFLDSYGEVQNELVATVLDQFKQYPSYKVAVTGHSLGGATALLCALDLYQREEGLSSSNLFLYTQGQPRVGDPAFANYVVSTGIPYRRTVNERDIVPHLPPAAFGFLHAGEEYWITDNSPETVQVCTSDLETSDCSNSIVPFTSVLDHLSYFGINTGLCTHHHHHH

RML脂肪酶嵌合体的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：

VPIKRQSNSTVDSLPPLIPSRTSAPSSSPSTTDPEAPAMSRNGPLPSDVETKYGMALNATSYPDSVVQAMSIDGGIRAATSQEINELTYYTTLSANSYCRTVIPGATWDCIHCDATEDLKIIKTWSTLIYDTNAMVARGDSEKTIYIVFRGSSSIRNWIADLTFVPVSYPPVSGTKVHKGFLDSYGEVQNELVATVLDQFKQYPSYKVAVTGHSLGGATALLCALDLYQREEGLSSSNLFLYTQGQPRVGDPAFANYVVSTGIPYRRTVNERDIVPHLPPAAFGFLHAGEEYWITDNSPETVQVCTSDLETSDCSNSIVPFTSVLDHLSYFQNTESCNHHHHHHH

编码RML脂肪酶嵌合体的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)：

GTGCCAATCAAGAGACAATCAAACAGCACGGTGGATAGTCTGCCACCCCTCATCCCCTCTCGAACCTCGGCACCTTCATCATCACCAAGCACAACCGACCCTGAAGCTCCAGCCATGAGTCGCAATGGACCGCTGCCCTCGGATGTAGAGACTAAATATGGCATGGCTTTGAATGCTACTTCCTATCCGGATTCTGTGGTCCAAGCAATGAGTATTGATGGAGGTATAAGAGCCGCAACCTCACAGGAGATCAATGAATTGACTTATTACACCACATTATCTGCCAACTCATACTGCCGTACTGTCATTCCCGGAGCTACCTGGGACTGTATACATTGTGATGCAACTGAGGACCTGAAAATTATCAAGACTTGGTCCACCTTGATTTATGATACAAATGCAATGGTGGCACGTGGTGACTCCGAAAAAACTATCTATATTGTCTTCAGAGGTTCATCATCGATCAGAAACTGGATTGCTGATTTAACCTTTGTGCCAGTATCATATCCTCCAGTCAGTGGTACAAAAGTACACAAGGGATTCTTGGACAGTTACGGAGAAGTGCAAAATGAGCTTGTTGCTACTGTTCTTGACCAGTTCAAGCAATATCCCTCTTACAAGGTGGCTGTTACAGGTCACTCATTAGGTGGTGCTACTGCTTTGCTTTGCGCCCTGGATCTGTATCAAAGAGAAGAAGGACTGTCATCCTCTAACTTGTTCCTTTACACTCAAGGTCAACCACGTGTAGGTGACCCTGCCTTTGCCAACTACGTTGTTTCCACCGGTATTCCTTACAGGAGGACTGTCAATGAAAGAGATATAGTTCCTCATCTTCCACCTGCAGCTTTTGGTTTTTTGCACGCTGGTGAGGAGTATTGGATTACTGACAATTCTCCAGAGACTGTTCAGGTCTGTACATCTGATCTGGAAACCTCTGATTGTTCTAACTCTATTGTTCCCTTCACAAGTGTTCTTGACCATCTGTCTTACTTTCAAAATACTGAATCATGTAACCATCATCATCATCATCAT

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

实施例1 RML脂肪酶嵌合体表达载体的构建

利用融合PCR技术，将多肽(其核苷酸序列为SEQ ID NO.4)与RML脂肪酶的核苷酸基因序列(母本)进行融合，获得嵌合体表达载体。

多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)：

CAAAATACTGAATCATGTAAC

具体包括以下步骤：

(1)、针对多肽序列，设计3对引物对(如表1)

表1引物表

(2)、以脂肪酶质粒pPICZαA-RML(华南理工大学保存)为模板，表1所示引物对为引物，进行融合PCR扩增，PCR扩增反应体系如表2所示。

表2反应体系

PCR反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸3min，30个循环；72℃延伸5min。

(3)、PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检验，PCR产物经检测确认后，加入Dpn I，酶切去除带甲基化的原始模板链。酶切体系为：8μL PCR产物、1μL buffer，1μL酶液，酶切反应条件为37℃1h。

(4)、将酶切产物转化到大肠杆菌Top10中，37℃过夜培养后，挑取单克隆到LB液体培养基中培养，提取质粒进行基因序列测定，确定目标的多肽已经正确与母本基因进行融合。

本实施例设计并成功构建3个脂肪酶嵌合体载体(即含有RML脂肪酶嵌合体编码基因的表达载体，以下，以引物对1扩增构建得到的命名为RML脂肪酶嵌合体1、以引物对2扩增构建得到的命名为RML脂肪酶嵌合体2、以引物对3扩增构建得到的命名为RML脂肪酶嵌合体3)。

实施例2 RML脂肪酶嵌合体酶蛋白制备与纯化

包括以下步骤：

1、利用电转化法将实施例1构建的3个含有脂肪酶嵌合体编码基因的表达载体，转入毕赤酵母X-33的基因组中，获得基因工程菌。

2、将基因工程菌接种至YPG一级种子培养基中扩大培养，当OD值达到1.6-2时，转接到二级YPG种子培养基中，培养12-16小时。

3、将种子液按1：10的比例接种到发酵罐培养基中，进行高密度发酵，菌体湿重达到150-180g/L时进行诱导表达，诱导剂为甲醇，诱导72-108h后收菌，将菌液在10000rpm下离心20min后收集上清，即为粗酶液。

4、将RML脂肪酶嵌合体粗酶液浓缩并用20mM pH 7.4PBS缓冲液脱盐，上样到阴离子交换层析柱(Q FF,GE Healthcare)，流速2mL/min，随后用20mM pH 7.4PBS缓冲液(含300mM NaCl)洗脱，得到纯化的RML脂肪酶嵌合体。

5、为使蛋白稳定保存，将目的蛋白换盐至pH 7.4的20mM PBS缓冲液中。经过上述步骤，获得纯度在90％以上的RML脂肪酶嵌合体，其SDS-PAGE检测结果如图1所示，泳道1-3分别为RML脂肪酶嵌合体1-3。从图1可以看出，RML脂肪酶嵌合体获得了良好的纯化效果，蛋白分子量分别约为32.0kDa，31.7kDa，31.5kDa。

6、目的蛋白浓度测定：将20μL待测蛋白溶液和200μL Bradford试剂混合，室温下反应5min后测定其A₅₉₅，结合标准曲线计算出RML脂肪酶嵌合体的蛋白浓度分别为1.25mg/mL，1.30mg/mL，1.17mg/mL。

实施例3 RML脂肪酶嵌合体的脂肪酶及磷脂酶活力测定

酶活力测定采用碱式滴定法。

酶活定义：在一定反应条件下，每分钟催化底物水解生成1μmol脂肪酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位，用U表示，即1U。

酶活力通过下列公式计算：

其中：X为比酶活，U/mg；V₁：实验组所消耗的氢氧化钠体积，mL；V₀：对照组所消耗的氢氧化钠体积，mL；t：反应时间，min；c：反应酶液的蛋白浓度，mg/mL；v：反应加入的酶液体积，mL。

具体方法为：

1、在50mL具塞三角瓶中加入4mL大豆卵磷脂乳化液(磷脂酶活力测定底物)或橄榄油乳化液(脂肪酶活力测定底物)和5mL缓冲液于恒温水浴摇床下预热5min，实验组加入1mLRML脂肪酶野生型或RML脂肪酶嵌合体纯酶液，对照组加入1mL对应的失活的酶液，200rpm反应5min后，加入15mL 95％乙醇终止反应。

2、反应结束后，加入2滴1％酚酞溶液，用0.05mol/LNaOH标准溶液滴定，计算NaOH消耗的体积，进而计算出磷脂酶或脂肪酶活力单位。

本实施例测定了RML脂肪酶野生型及3个RML脂肪酶嵌合体的磷脂酶和脂肪酶比活力。结果如表3所示。

表3 RML脂肪酶野生型及嵌合体的酶活力测定结果

从表3结果可知，相较于RML脂肪酶野生型，本发明所构建的3个RML脂肪酶嵌合体的脂肪酶和磷脂酶活力均有所提升，脂肪酶活力分别为野生型的4.7、3.4、2.6倍，磷脂酶活力分别为野生型的161、81、91倍。其中RML脂肪酶嵌合体1的磷脂酶比酶活力最高，为69.52U/mg，脂肪酶比酶活力同样最高，为62.15U/mg，该嵌合体为本发明中的最优嵌合体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该脂肪酶嵌合体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例4 RML脂肪酶嵌合体的最适反应pH测定

本实施例测定了本发明的最优嵌合体，即RML脂肪酶嵌合体1的最适反应pH。具体包括以下步骤：

1、以大豆卵磷脂乳化液为底物，在20mM pH分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0的反应缓冲液(pH 3.0-5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH 6.0-7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液)中，在40℃下测定磷脂酶活力，每组实验重复三次。

2、以pH值为横坐标，比酶活力为纵坐标，作出曲线图。

结果如图2所示，从图2可知，本发明的RML脂肪酶嵌合体的最适反应pH为4.0，相比于RML脂肪酶野生型的最适pH为8.0(由于野生型的磷脂酶活力约为0，难以测出其最适pH，故图中无野生型的曲线)，发生了明显的酸移，说明本发明的RML脂肪酶嵌合体是一种酸性脂肪酶，适合应用于油脂脱胶。

实施例5 RML脂肪酶嵌合体的最适反应温度测定

本实施例测定了本发明的最优嵌合体，即RML脂肪酶嵌合体1的最适反应温度。具体包括以下步骤：

1、以大豆卵磷脂乳化液为底物，在20mM pH为5.0的反应缓冲液(柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)中，分别在30℃，35℃，40℃，45℃，50℃下测定磷脂酶活力，每组实验重复三次。

2、以温度为横坐标，比酶活力为纵坐标，作出曲线图。

结果如图3所示，从图3可知，本发明的RML脂肪酶嵌合体的最适反应温度为40℃，与RML脂肪酶的最适温度(45℃)相差不大(由于野生型的磷脂酶活力约为0，在该实施例中难以测出其最适温度，故图中无野生型的曲线)，表明本发明的RML脂肪酶嵌合体可以在中温下实现良好的催化效果。

实施例6RML脂肪酶嵌合体用于油脂脱胶的效果

包括以下步骤：

1、称取300g大豆毛油，水浴加热至70℃后加入0.18mL 45％柠檬酸，10000rpm下高速均质1min。

2、在70℃下搅拌25min后降温至40℃。加入一定量的4％NaOH溶液调整体系pH为4，加入3％的水和20000U/kg酶液，在10000rpm下高速均质1min后，在500rpm下反应5h。

3、反应结束后，升温至90℃，灭酶10min。10000rpm离心10min，收集上层油相，测定磷含量。油脂中磷含量的分析方法参照GB5537-1985中钼蓝比色法进行。

实验结果如表4所示。

表4 RML脂肪酶嵌合体与野生型对大豆毛油脱胶的效果

从表4可以看出，使用本发明的RML脂肪酶嵌合体进行大豆毛油脱胶，与RML脂肪酶野生型相比，在相同的反应时间和反应条件下，野生型仅能将大豆毛油中磷含量从197.0mg/kg降低至165.3mg/kg，而本发明的RML脂肪酶嵌合体将大豆毛油中的磷含量从197.0mg/kg降低至7.1mg/kg，满足磷脂含量低于10mg/kg的要求，可以实现对大豆毛油良好的脱胶效果，显示其具有应用的价值和前景。

实施例7应用RML脂肪酶嵌合体制备溶血磷脂

以浓度为10％的磷脂酰胆碱为底物，加入0.07％的CaCl₂和适量酶液，混合均匀，在40℃下反应12h。随后通过高效液相色谱测定溶血磷脂的转化率。

高效液相色谱测定溶血磷脂的转化率，样品处理方法：40μL样品与960μL甲醇混匀，10000rpm下离心2min。上清经0.22μm滤膜抽滤后为高效液相色谱样品。

检测器为ELSD检测器，色谱柱为Symmetry C18 column(4.6mm×150mm，5mm，Wasters，USA)，流动相为乙腈：甲醇：水(40：50：10，v/v/v)，流动相流速1.0mL/min，柱温25℃，进样量10μL；N₂流速2L/min，漂流管温度80℃。

实验结果如表5所示。

表5 RML脂肪酶嵌合体与野生型对溶血磷脂的转化率

从表5可以看出，使用RML脂肪酶野生型制备溶血磷脂，转化率仅为17％，而本发明的RML脂肪酶嵌合体生产溶血磷脂的转化率可达到74.9％，有了显著提升。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种RML脂肪酶嵌合体，其特征在于，所述RML脂肪酶嵌合体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.权利要求1所述的RML脂肪酶嵌合体的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，或其核苷酸序列为SEQ ID NO.3的反向序列。

4.权利要求1所述的RML脂肪酶嵌合体、或权利要求2或3所述的RML脂肪酶嵌合体的编码基因在油脂脱胶中的应用。

5.权利要求1所述的RML脂肪酶嵌合体、或权利要求2或3所述的RML脂肪酶嵌合体的编码基因在制备溶血磷脂中的应用。

6.插入权利要求2或3的RML脂肪酶嵌合体的编码基因的重组表达载体。

7.转入权利要求6所述的重组表达载体的重组工程菌。

8.权利要求6所述的重组表达载体、或权利要求7所述的重组工程菌在油脂脱胶或制备溶血磷脂中的应用。

9.一种油脂脱胶的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的RML脂肪酶嵌合体对油水混合物进行催化反应。

10.一种制备溶血磷脂的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的RML脂肪酶嵌合体，催化磷脂底物转化为溶血磷脂。