CN108277212B

CN108277212B - 脂肪酶突变体Gly183Cys/Gly212Cys及其基因和应用

Info

Publication number: CN108277212B
Application number: CN201711475025.7A
Authority: CN
Inventors: 周银华; 李阳源; 夏雨; 杨玲; 王建荣; 李天碧
Original assignee: Yiduoli Biological Science & Tech Co Ltd Guangdong
Current assignee: Yiduoli Biological Science & Tech Co Ltd Guangdong
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2019-12-10
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN108277212A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种热稳定性提高的脂肪酶TTL突变体TTL‑Gly183Cys/Gly212Cys及其基因和应用。所述脂肪酶TTL突变体TTL‑Gly183Cys/Gly212Cys的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。突变体在80℃水浴5min后剩余酶活为46.2％，提高至亲本脂肪酶的2.52倍。

Description

脂肪酶突变体Gly183Cys/Gly212Cys及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种热稳定性提高的脂肪酶TTL突变体TTL-Gly183Cys/Gly212Cys及其基因和应用。

背景技术

脂肪酶(EC 3.1.1.3)全称三酰基甘油酰水解酶，属于α/β折叠酶家族，是一种丝氨酸水解酶。脂肪酶不仅可以在油水界面上催化天然底物油脂水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸，而且在非水相体系中脂肪酶还可催化酸解、转酯和酯合成等反应。工业饲料用脂肪酶主要来源于微生物，微生物分泌的脂肪酶具有较广的作用pH值和作用温度。随着酶催化技术的不断推广，酶制剂的应用条件也越来越严格，如高温、强酸强碱等特殊条件。脂肪酶作为一种重要的酶种被广泛地应用到食品加工、饲料、洗涤、医药等领域。油脂加工和饲料制粒等工艺通常需在较高温度下进行，热稳定性差的脂肪酶在上述工艺中易失活变性，因此开发高热稳定性脂肪酶一直是学术和产业界努力的目标。

为了得到更优的酶制剂，一方面可以从自然界筛选合适的酶基因，另一个途经就是将现有产业化的酶蛋白通过分子生物学技术进行改造，以适应不同产业的需求。现今改造酶蛋白的策略主要有两个，其一是非理性设计，通过随机突变改造酶的基因，再根据特定的改造目的，筛选出更符合其作用条件的酶蛋白。此策略优点是无须深入研究酶的结构和作用机理，但需要极大的工作量去完成筛选，效率偏低。

有文献报道科学家从突尼斯南部火山地区分离得到一株嗜热裸足菌，其分泌脂肪酶具有较好的耐热性，70℃处理1h后剩余50％酶活。毕赤酵母培养条件简单、易于工业化生产且高效分泌表达外源蛋白，已成功表达多个外源源脂肪酶。本发明利用毕赤酵母高效分泌表达嗜热裸足菌来源的脂肪酶，并以嗜热裸足菌脂肪酶基于为模板，通过定点突变技术获得热稳定性显著提高的脂肪酶突变体。

发明内容

本发明的目的在于提供高热稳定性的脂肪酶TTL。所述高热稳定性脂肪酶TTL，是由亲本脂肪酶TTL进行定点突变，获得的脂肪酶突变体。用于表达所述脂肪酶的突变体的表达载体为pPICZαA和pPIC9K；用于所述表达载体转化的宿主细胞是毕赤酵母X33和GS115。所述脂肪酶突变体为：TTL-Gly183Cys/Gly212Cys。

野生型的脂肪酶基因全长825个碱基(SEQ ID No.1)及其编码的274个氨基酸(SEQID No.2)

SEQ ID NO.1

TCTCCAGTCAGACGTGAGGTTTCTCAGGACTTGTTCGACCAGTTTAATTTGTTCGCTCAGTACTCTGCTGCTGCCTACTGTGCCAAGAATAACGATGCCCCAGCTGGTGCTAACGTTACCTGTAGAGGTTCCATCTGCCCAGAGGTTGAGAAGGCTGACGCCACCTTCTTGTACTCTTTCGAGGACTCTGGAGTTGGTGACGTTACCGGTTTCTTGGCTTTGGACAACACCAACAGATTGATCGTCTTGTCTTTCCGTGGTTCCCGTTCCCTTGAGAATTGGATCGGTAACATTAATTTGGATTTGAAGGGTATCGACGACATCTGCTCTGGTTGCAAGGGACACGATGGTTTCACCTCCTCTTGGAGATCCGTTGCCAACACCTTGACCCAACAGGTTCAGAACGCCGTTAGAGAGCATCCAGACTACCGTGTCGTCTTCACTGGTCACTCTTTGGGTGGTGCTTTGGCTACCGTTGCTGGTGCCTCTTTGAGAGGTAACGGTTACGACATCGACGTTTTCTCCTACGGTGCTCCTCGTGTTGGTAACAGAGCCTTCGCTGTCTTCTTGACCGCTCAGACCGGTGGTACCTTGTACAGAATCACCCATACCAACGATATCGTCCCACGTTTGCCACCAAGAGAGCTTGGATACTCCCACTCTTCCCCAGAGTACTGGATCACCTCCGGTACTTTGGTTCCAGTTACCAAGAACGATATTGTTAAGGTTGAGGGAATTGACTCCACCGACGGTAACAACCAGCCAAATACCCCAGACATTGCTGCCCACTTGTGGTACTTCGGTTTGATTGGTACTTGTTTGTAA

SEQ ID NO.2

SPVRREVSQDLFDQFNLFAQYSAAAYCAKNNDAPAGANVTCRGSICPEVEKADATFLYSFEDSGVGDVTGFLALDNTNRLIVLSFRGSRSLENWIGNINLDLKGIDDICSGCKGHDGFTSSWRSVANTLTQQVQNAVREHPDYRVVFTGHSLGGALATVAGASLRGNGYDIDVFSYGAPRVGNRAFAEFLTAQTGGTLYRITHTNDIVPRLPPRELGYSHSSPEYWITSGTLVPVTKNDIVKVEGIDSTDGNNQPNTPDIAAHLWYFGLIGTCL

突变后脂肪酶基因全长825个碱基(如核苷酸序列SEQ ID NO.3所示)，其编码的274个氨基酸(如氨基酸序列SEQ ID NO.4所示)。

SEQ ID NO.3

TCTCCAGTCAGACGTGAGGTTTCTCAGGACTTGTTCGACCAGTTTAATTTGTTCGCTCAGTACTCTGCTGCTGCCTACTGTGCCAAGAATAACGATGCCCCAGCTGGTGCTAACGTTACCTGTAGAGGTTCCATCTGCCCAGAGGTTGAGAAGGCTGACGCCACCTTCTTGTACTCTTTCGAGGACTCTGGAGTTGGTGACGTTACCGGTTTCTTGGCTTTGGACAACACCAACAGATTGATCGTCTTGTCTTTCCGTGGTTCCCGTTCCCTTGAGAATTGGATCGGTAACATTAATTTGGATTTGAAGGGTATCGACGACATCTGCTCTGGTTGCAAGGGACACGATGGTTTCACCTCCTCTTGGAGATCCGTTGCCAACACCTTGACCCAACAGGTTCAGAACGCCGTTAGAGAGCATCCAGACTACCGTGTCGTCTTCACTGGTCACTCTTTGGGTGGTGCTTTGGCTACCGTTGCTGGTGCCTCTTTGAGATGTAACGGTTACGACATCGACGTTTTCTCCTACGGTGCTCCTCGTGTTGGTAACAGATGTTTCGCTGTCTTCTTGACCGCTCAGACCGGTGGTACCTTGTACAGAATCACCCATACCAACGATATCGTCCCACGTTTGCCACCAAGAGAGCTTGGATACTCCCACTCTTCCCCAGAGTACTGGATCACCTCCGGTACTTTGGTTCCAGTTACCAAGAACGATATTGTTAAGGTTGAGGGTATTGACTCTACCGACGGTAACAACCAGCCAAATACCCCAGACATTGCTGCCCACTTGTGGTACTTCGGTTTGATTGGTACTTGTTTGTAA

SEQ ID NO.4

SPVRREVSQDLFDQFNLFAQYSAAAYCAKNNDAPAGANVTCRGSICPEVEKADATFLYSFEDSGVGDVTGFLALDNTNRLIVLSFRGSRSLENWIGNINLDLKGIDDICSGCKGHDGFTSSWRSVANTLTQQVQNAVREHPDYRVVFTGHSLGGALATVAGASLRCNGYDIDVFSYGAPRVGNRCFAVFLTAQTGGTLYRITHTNDIVPRLPPRELGYSHSSPEYWITSGTLVPVTKNDIVKVEGIDSTDGNNQPNTPDIAAHLWYFGLIGTCL

亲本脂肪酶TTL在80℃水浴5min后剩余酶活为18.3％。本发明利用分子生物学技术定点突变脂肪酶TTL，获得了热稳定性提高的脂肪酶突变体TTL-Ala36Ser/Asp49His/Ala52Val/Asn55Asp。突变体TTL-Gly183Cys/Gly212Cys在80℃水浴5min后剩余酶活为46.2％，提高至亲本脂肪酶的2.52倍。

附图说明

图1含pPICzαA-TTL的毕赤酵母X33重组菌50L罐发酵图。

图2发酵各时间段酶液的蛋白电泳图。

图3脂肪酶TTL的酶学性质图。

图4脂肪酶突变体的酶学性质图

具体实施方式

为了增加脂肪酶的工业应用价值，本发明将脂肪酶基因TTL在毕赤酵母中进行表达，进一步研究此脂肪酶三维结构后，针对其关键特性的氨基酸突变以增进其热稳定性。以下将详述本发明改造脂肪酶的方法及其所得到的改良的脂肪酶。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实验材料和试剂：

1、菌株与载体

大肠杆菌菌株Topl0、毕赤酵母X33，GS115、载体pPICzαA，Ppic9K，Zeocin购自Invitrogen公司。

2、酶与试剂盒

PCR酶，限制性内切酶，质粒提取和凝胶纯化试剂盒购自上海生工公司。

实施例1、脂肪酶TTL在毕赤酵母X33中的高效表达

1.将脂肪酶基因TTL作为目标基因，野生型的脂肪酶基因全长825个碱基(SEQ IDNo.1)及其编码的274个氨基酸(SEQ ID No.2)，利用限制性切酶EcoRI和XbaI酶切后，构建到pPICzαA载体中得到表达载体pPICzαA-TTL，再将pPICzαA-TTL转化Top 10感受态细胞，经抗生素Zeocin筛选后，得到阳性克隆。将上述重组表达载体用SacI进行线性化，线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母X33，得到毕赤酵母重组菌株转化子。将上述重组菌单菌落进行高密度发酵培养。在发酵过程中的定时取样测定酶活，脂肪酶的表达情况如图1所示，发酵189h时脂肪酶酶活为31500U/mL。将上述发酵液中的脂肪酶通过硫酸铵分级沉淀、充分透析、再通过离子交换柱层析纯化，将纯化后的蛋白液进行12％SDS－PAGE检测，结果如图2。

2.脂肪酶活力测定采用橄榄油乳化液水解滴定法，酶活的定义为：脂肪酶在40℃、pH 7.0条件下水解橄榄油乳化液产生1μmol/min脂肪酸所消耗的酶量，即为1个脂肪酶活力单位。脂肪酶热处理采用水浴法，将酶液适当稀释后置于玻璃试管中，在不同温度水浴锅(70℃～90℃)中保温5min。

实施例2、脂肪酶TTL的酶学性质测定

1.脂肪酶TTL的最适反应温度和热稳定性测定

在30℃～80℃下，以10℃为间隔，分别测定脂肪酶的活力，以50℃下的酶活力为对照，测定不同温度下的相对酶活。结果如图3(a)，脂肪酶作用的最适合温度为50℃。将脂肪酶酶液置于玻璃试管中，在不同温度下(70℃～90℃)热处理5min，测定残留脂肪酶活力，以未处理的酶活力为对照，热处理后的酶活与之相比，即得到该温度下剩余的相对酶活。结果如图3(b)，80℃热处理5min后脂肪酶剩余酶活为18.3％。

2.脂肪酶TTL的最适反应pH和pH稳定性测定

在不同pH(3.0～9.0)的缓冲液体系中分别测定脂肪酶的酶活，以pH值7.0的酶活为对照，计算不同pH值下的相对酶活。结果如图3(c)，脂肪酶作用的最适pH值为7.0。向上述不同pH的缓冲液体系中分别加入稀释好的酶液，室温处理2h，测定残留脂肪酶活力，以未处理的酶活力为对照，计算该pH下剩余的相对酶活。测定结果如图3(d)该酶的pH稳定范围较广，在pH5.0～9.0范围内酶活稳定。

实施例3、热稳定性提高的脂肪酶突变体TTL-Gly183Cys/Gly212Cys

1/以质粒pPICZαA-TTL为模板，分别以引物F1、PIC-R和引物R1、PIC-F进行PCR扩增，再将得到2个DNA片段进行融合PCR，得到重组载体pPICZαA-TTL-G183C。以质粒pPICZαA-TTL-G183C为模板，分别以引物F2、PIC-R和引物R2、PIC-F进行PCR扩增，再将得到2个DNA片段进行融合PCR，得到重组载体pPICZαA-TTL-G183CG212C。将上述重组载体转化Top 10感受态细胞，经抗生素Zeocin筛选后，得到阳性克隆。将上述重组表达载体用SacI进行线性化，线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母X33，得到毕赤酵母重组菌株转化子。突变后脂肪酶基因全长825个碱基，由此推导出274个氨基酸。

所用引物如下：

F1:5’-CTCTTTGAGATGTAACGGTTACGACATCGACG-3’

R1:5’-CGTAACCGTTACATCTCAAAGAGGCACCAGC-3’

F2:5’-CTCAGACCTGTGGTACCTTGTACAGAATCACCC-3’

R2:5’-GTACAAGGTACCACAGGTCTGAGCGGTCAAGA-3’

PIC-F：5’-CTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGC-3’

PIC-R：5’-CTTGGAGCGAACGACCTACACCGAA-3’

2、重组脂肪酶的最适反应温度和热稳定性测定

在30℃～80℃下，以10℃为间隔，分别测定脂肪酶的活力，以50℃下的酶活力为对照，测定不同温度下的相对酶活。结果如图4(a)，脂肪酶作用的最适合温度为50℃。将脂肪酶酶液在不同温度(70℃～90℃)热处理5min，测定残留脂肪酶活力，以未处理的酶活力为对照，计算得到该温度下剩余的相对酶活。结果如图4(b)，80℃热处理5min后脂肪酶剩余酶活为46.2％。

3、重组脂肪酶的最适反应pH和pH稳定性测定

在不同pH(3.0～9.0)的缓冲液体系中分别测定脂肪酶的酶活，以pH值7.0的酶活为对照，测定不同pH值下的相对酶活。结果如图4(c)所示：该脂肪酶作用的最适pH值为7.0。向上述不同pH的缓冲液体系中分别加入稀释好的酶液，室温处理2h，测定残留脂肪酶活力，以未处理的酶活力为对照，处理后酶液的酶活与之相比，即得到该pH下剩余的相对酶活。测定结果如图4(d)，该酶的pH稳定范围较广，在pH 5.0～9.0范围内酶活稳定。

序列表

<110> 广东溢多利生物科技股份有限公司

<120> 脂肪酶突变体Gly183Cys/Gly212Cys及其基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctccagtca gacgtgaggt ttctcaggac ttgttcgacc agtttaattt gttcgctcag 60

tactctgctg ctgcctactg tgccaagaat aacgatgccc cagctggtgc taacgttacc 120

tgtagaggtt ccatctgccc agaggttgag aaggctgacg ccaccttctt gtactctttc 180

gaggactctg gagttggtga cgttaccggt ttcttggctt tggacaacac caacagattg 240

atcgtcttgt ctttccgtgg ttcccgttcc cttgagaatt ggatcggtaa cattaatttg 300

gatttgaagg gtatcgacga catctgctct ggttgcaagg gacacgatgg tttcacctcc 360

tcttggagat ccgttgccaa caccttgacc caacaggttc agaacgccgt tagagagcat 420

ccagactacc gtgtcgtctt cactggtcac tctttgggtg gtgctttggc taccgttgct 480

ggtgcctctt tgagaggtaa cggttacgac atcgacgttt tctcctacgg tgctcctcgt 540

gttggtaaca gagccttcgc tgtcttcttg accgctcaga ccggtggtac cttgtacaga 600

atcacccata ccaacgatat cgtcccacgt ttgccaccaa gagagcttgg atactcccac 660

tcttccccag agtactggat cacctccggt actttggttc cagttaccaa gaacgatatt 720

gttaaggttg agggaattga ctccaccgac ggtaacaacc agccaaatac cccagacatt 780

gctgcccact tgtggtactt cggtttgatt ggtacttgtt tgtaa 825

<210> 2

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Pro Val Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asp Gln Phe Asn

1 5 10 15

Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Lys Asn Asn Asp

20 25 30

Ala Pro Ala Gly Ala Asn Val Thr Cys Arg Gly Ser Ile Cys Pro Glu

35 40 45

Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly

50 55 60

Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg Leu

65 70 75 80

Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile Gly

85 90 95

Asn Ile Asn Leu Asp Leu Lys Gly Ile Asp Asp Ile Cys Ser Gly Cys

100 105 110

Lys Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asn Thr

115 120 125

Leu Thr Gln Gln Val Gln Asn Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg

130 135 140

Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala

145 150 155 160

Gly Ala Ser Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr

165 170 175

Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Ala

180 185 190

Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val

195 200 205

Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu

210 215 220

Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Lys Asn Asp Ile

225 230 235 240

Val Lys Val Glu Gly Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro Asn

245 250 255

Thr Pro Asp Ile Ala Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr

260 265 270

Cys Leu

<210> 3

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctccagtca gacgtgaggt ttctcaggac ttgttcgacc agtttaattt gttcgctcag 60

tactctgctg ctgcctactg tgccaagaat aacgatgccc cagctggtgc taacgttacc 120

tgtagaggtt ccatctgccc agaggttgag aaggctgacg ccaccttctt gtactctttc 180

gaggactctg gagttggtga cgttaccggt ttcttggctt tggacaacac caacagattg 240

atcgtcttgt ctttccgtgg ttcccgttcc cttgagaatt ggatcggtaa cattaatttg 300

gatttgaagg gtatcgacga catctgctct ggttgcaagg gacacgatgg tttcacctcc 360

tcttggagat ccgttgccaa caccttgacc caacaggttc agaacgccgt tagagagcat 420

ccagactacc gtgtcgtctt cactggtcac tctttgggtg gtgctttggc taccgttgct 480

ggtgcctctt tgagatgtaa cggttacgac atcgacgttt tctcctacgg tgctcctcgt 540

gttggtaaca gatgtttcgc tgtcttcttg accgctcaga ccggtggtac cttgtacaga 600

atcacccata ccaacgatat cgtcccacgt ttgccaccaa gagagcttgg atactcccac 660

tcttccccag agtactggat cacctccggt actttggttc cagttaccaa gaacgatatt 720

gttaaggttg agggtattga ctctaccgac ggtaacaacc agccaaatac cccagacatt 780

gctgcccact tgtggtactt cggtttgatt ggtacttgtt tgtaa 825

<210> 4

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ser Pro Val Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asp Gln Phe Asn

1 5 10 15

Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Lys Asn Asn Asp

20 25 30

Ala Pro Ala Gly Ala Asn Val Thr Cys Arg Gly Ser Ile Cys Pro Glu

35 40 45

Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly

50 55 60

Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg Leu

65 70 75 80

Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile Gly

85 90 95

Asn Ile Asn Leu Asp Leu Lys Gly Ile Asp Asp Ile Cys Ser Gly Cys

100 105 110

Lys Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asn Thr

115 120 125

Leu Thr Gln Gln Val Gln Asn Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg

130 135 140

Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala

145 150 155 160

Gly Ala Ser Leu Arg Cys Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr

165 170 175

Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Cys Phe Ala Val Phe Leu Thr Ala

180 185 190

Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val

195 200 205

Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu

210 215 220

Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Lys Asn Asp Ile

225 230 235 240

Val Lys Val Glu Gly Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro Asn

245 250 255

Thr Pro Asp Ile Ala Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr

260 265 270

Cys Leu

Claims

1.热稳定性提高的脂肪酶TTL突变体TTL-Gly183Cys/Gly212Cys，其特征在于，所述脂肪酶TTL突变体TTL-Gly183Cys/Gly212Cys的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.热稳定性提高的脂肪酶TTL突变体基因，其特征在于，编码权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪酶TTL突变体TTL-Gly183Cys/Gly212Cys。

3.根据权利要求2所述的热稳定性提高的脂肪酶TTL突变体基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪酶TTL突变体TTL-Gly183Cys/Gly212Cys用于在体外水解油脂的应用。

5.权利要求2所述的热稳定性提高的脂肪酶TTL突变体基因在食品加工、饲料加工、或洗涤剂制备中的应用。