CN103865896A

CN103865896A - 一种碱性脂肪酶突变体

Info

Publication number: CN103865896A
Application number: CN201410088757.0A
Authority: CN
Inventors: 王华明; 徐娟; 吴秀秀; 黄亦钧
Original assignee: SHANGHAI KDN BIOTECH CO Ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI KDN BIOTECH CO Ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2014-03-11
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2034-03-11
Also published as: CN103865896B

Abstract

本发明提供了一种新型的碱性脂肪酶突变体，并通过构建黑曲霉工程菌高效体外表达该脂肪酶突变体，发酵酶活高达4429U/mL。与野生型相比，所述脂肪酶突变体作用pH更宽泛，耐热性和热稳定性更强，有利于该酶及含酶产品的后处理及贮存。所述脂肪酶突变体可广泛应用于洗涤剂中，在相同添加量的情况下，含脂肪酶突变体的洗涤剂对皮脂污布的洗涤效果要显著高于含野生型脂肪酶的洗涤剂，前景广阔。

Description

一种碱性脂肪酶突变体

技术领域

本发明属于功能基因改造与筛选技术领域，具体涉及一种碱性脂肪酶体突变体及其应用。

背景技术

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)又名甘油酯水解酶、三酰基甘油酰基水解酶，是一类可以水解甘油三酯产生不同链长游离脂肪酸和甘油的水解酶。它是生物体内一类重要的代谢酶，从催化特性看，它具有高度的化学选择性和立体异构性，且反应不需辅酶，反应条件温和，副产物少。脂肪酶的一个显著特征是它不同于多数水解酶的催化特性，它是一类非水相酶，其催化反应是在油水界面上进行，对于水溶性底物不起催化作用。不同来源的脂肪酶作用于底物甘油三酯的酯键位置不同。

脂肪酶作为一种重要的工业用酶，可以催化水解、酯合成、酯交换、转酯化等一系列反应，因此在食品、皮革、饲料、洗涤、医药、油脂、化工等传统工业领域应用广泛。

从二十世纪开始，美国等国家就开展了对碱性脂肪酶的研究，并不断推出市场化产品，然而，国内对碱性脂肪酶的研究起步较晚，在碱性脂肪酶发酵菌种、酶学性质、酶活性以及应用效果等方面与国外的先进技术有很大的差距，这样不利于产品的后处理及长期稳定存放，更影响了其产业化、市场化发展。因此，急需开发新的酶学性质优良、产量高的碱性脂肪酶，提高洗涤效果，并降低生产成本，从而促进碱性脂肪酶的广泛应用。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种新型碱性脂肪酶突变体及其在洗涤剂中的应用。本发明通过大量随机突变的筛选，得到一种耐热性、热稳定性均显著提高的脂肪酶突变体，并构建得到高效表达该突变体的黑曲霉工程菌，从而为该突变体的广泛应用奠定基础。

本发明一个方面涉及一种碱性脂肪酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的脂肪酶的第78位氨基酸由Glu变为Arg，第187位氨基酸由Asp变为Arg。

上述碱性脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。

本发明另一方面涉及携带有编码序列为SEQ ID NO：4的碱性脂肪酶突变体基因的重组质粒。

本发明还涉及一种工程菌株，其携带有上述重组质粒。

所述工程菌株为黑曲霉（Aspergillus niger）。

本发明的碱性脂肪酶突变体用于制备洗涤剂。

本发明提供了一种新型的碱性脂肪酶突变体，并通过构建黑曲霉工程菌高效体外表达该脂肪酶突变体，发酵酶活高达4429U/mL。该脂肪酶突变体的最适作用pH为9.5，在pH7.0、9.0、11.0条件下的相对酶活显著高于野生型，作用pH更为宽泛；最适作用温度为35℃，在25-35℃、50-60℃范围内，脂肪酶突变体的相对酶活显著高于野生型，尤其在55℃条件下突变体的相对酶活比野生型提高了约20%，耐热性更强；此外，脂肪酶突变体的热稳定性显著高于野生型，更有利于该酶及含酶产品的后处理及贮存。所述脂肪酶突变体可广泛应用于洗涤剂中，在相同添加量的情况下，含脂肪酶突变体的洗涤剂对皮脂污布的洗涤效果要显著高于含野生型脂肪酶的洗涤剂，前景广阔。

附图说明

图1：黑曲霉lipN和黑曲霉lipN-m1菌株发酵液SDS-PAGE电泳图；其中，箭头所指32kD处，即为重组表达的碱性脂肪酶。

图2：脂肪酶突变体lipN与野生型lipN-m1相对酶活-pH变化曲线。

图3：脂肪酶突变体lipN与野生型lipN-m1相对酶活-温度变化曲线。

图4：脂肪酶突变体lipN与野生型lipN-m1自身热稳定性变化曲线。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不仅限于所提供的具体案例，而应包括本领域技术人员在本说明书基础上，不需经过创造性劳动就能扩展的保护范围。

实施例1：碱性脂肪酶基因的随机突变筛选

根据NCBI上公布的一种脂肪酶（命名为lipN）的基因序列SEQ ID NO:1(GeneBank AF054513)，在其起始密码子ATG前增加9个碱基CTTAAGAGG(下划线所示为AflII酶切位点)，在其终止密码子TGA后增加AGGTCTAGA(下划线所示为XbaI酶切位点)，然后将此序列交由上海生工生物工程股份有限公司根据黑曲霉密码子偏好性进行密码子优化，并由该公司进行合成。

用限制性内切酶AflII和XbaI(Fermentas)对脂肪酶基因进行酶切；同时，用限制性内切酶AflII和XbaI对质粒pGm进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化入Trans5α大肠杆菌(Transgen)，用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitrogen)，测序结果显示，本发明获得的DNA序列为SEQID NO:2，其编码的蛋白序列为SEQ ID NO:1。

使用质粒小量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。获得1个重组质粒，命名为pGm-lipN。

为了改善上述碱性脂肪酶lipN自身的热稳定性，申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR引物lip-F、lip-R如下：

lip-F：AAACTTAAGATGCGGTCCTCCCTGG（下划线为限制性内切酶AflII识别位点）

lip-R：AGGTCTAGATCACAGACAGGTGCCG（下划线为限制性内切酶XbaI识别位点）

以序列为SEQ ID NO:2的核苷酸片段为模板，使用上述的引物（lip-F、lip-R），采用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（Stratagene）进行PCR扩增获得随机突变的碱性脂肪酶扩增产物，扩增后胶回收PCR产物，AflII、XbaI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有碱性脂肪酶突变体的大肠杆菌细胞裂解液。

分别取出30μl裂解液至两块新的96孔板，分别在55℃下测定其脂肪酶酶活。结果发现有些突变体在高温条件下碱性脂肪酶活性显著降低甚至完全没有活性，而有些突变体碱性脂肪酶活性保持不变或者升高。挑选55℃条件下碱性脂肪酶活性最高的突变体进行DNA测序，最终获得了能显著提高脂肪酶lipN耐热性的突变位点组合E78R和D187R。

含E78R和D187R两点突变的脂肪酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：4。与SEQ ID NO：1的脂肪酶相比，E78R脂肪酶突变体的第78位氨基酸由Glu变为Arg，第187位氨基酸由Asp变为Arg，正是由于这两个位置的改变导致突变体的酶学性质发生了变化。

将合成的脂肪酶突变体基因命名为lipN-m1，用引物lip-F、lip-R进行PCR扩增，引物两端引入AflII、XbaI位点。PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃保温10min。

使用凝胶纯化试剂盒(Fermentas)将上述PCR产物纯化。用限制性内切酶AflII、XbaI对纯化后的PCR产物进行酶切；同时，用限制性内切酶AflII、XbaI对质粒pGm进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进Trans5α大肠杆菌(Transgen)，用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitrogen)。

使用质粒中量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。所得1个突变体的重组质粒命名为pGm-lipN-m1。

实施例2：黑曲霉工程菌株的构建

吸取黑曲霉G1孢子悬浮液于CMA平板，待菌落长满整个培养皿，切1/4大小的培养基于200mL CMA液体培养基中，在30℃、200rpm下培养14～16h。

用无菌Miracloth滤布收集菌丝体，并用溶液A清洗一次，在无菌条件下将清洗过的菌丝体转移到40mL原生质体转化溶液中，在30℃、200rpm的条件下温浴1～2h，用显微镜观察原生质体。

用无菌Miracloth滤布过滤上述温浴液体，所得滤液即为原生质体溶液。将原生质体溶液分装于两个50mL无菌的一次性离心管中，并将每管的体积用溶液B定容至45mL，在4000rpm条件下离心8min以获得沉淀并弃去上清液。用20mL溶液B再清洗沉淀两次。将沉淀重悬浮于10mL溶液B中，并用血球计数板对原生质体计数。将原生质体再次离心并弃去上清液，根据血球计数板计数结果，加入适量溶液B重悬沉淀，使得原生质体数目在1×10⁷个/mL。

在冰上，将100μL上述原生质体溶液加入预冷的无菌15mL离心管中，每个转化反应用1管，再加入10μg突变体重组质粒pGm-lipN-m1，12.5μL溶液C，温和混匀后再冰上放置20min。

将MMSA顶层琼脂试管熔化并保持在55℃。从冰中移出上述15mL离心管，并向管中加入1mL溶液C和2mL溶液B，温和混匀各管，所得混合物即为原生质体混合物。向3个顶层琼脂试管中的每一个中加入1mL上述原生质体混合物，并立即倾倒与MMSA平板上，并将平板在30℃下培养7～10d；挑取其中一株阳性转化子命名为黑曲霉lipN-m1（Aspergillus niger lipN-m1）。

通过上述同样的转化方法将野生型重组质粒pGm-lipN克隆到黑曲霉宿主G1中，30℃下培养7～10d；挑取其中一株阳性转化子命名为黑曲霉lipN（Aspergillus niger lipN）。

溶液A：2.5mL1M K₂HPO₄，2.5mL1M KH₂PO₄，48.156g MgSO₄，加入dlH₂O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

溶液B：5mL1M Tris(pH7.5)，2.77g CaCl₂，109.32g山梨醇，加入dlH₂O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

溶液C：250g PEG4000，2.77g CaCl₂，5mL1M Tris(pH7.5)，加入dlH₂O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

CMA培养基：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，1g蛋白胨，15g琼脂，加入dlH₂O至终体积1000mL，高压蒸气灭菌。

实施例3：黑曲霉工程菌株发酵验证及酶活测定

将上述工程菌株黑曲霉lipN和lipN-m1分别接种于30mL TSB发酵培养基中，在30℃，200rpm的条件下培养5d；14000×g，离心10min，收集上清液，进行SDS-PAGE电泳检测分析。结果如图1所示，箭头所指32kD附近可以看到清晰的蛋白条带，与本发明所述碱性脂肪酶的理论分子量大小一致，从而说明本发明构建得到的黑曲霉lipN能重组表达野生型碱性脂肪酶lipN，黑曲霉lipN-m1能重组表达碱性脂肪酶突变体lipN-m1。

（1）碱性脂肪酶活性单位定义

在30℃、pH值为8.0的条件下，每分钟从浓度为6%对硝基苯酚-棕榈酸酯的溶液中降解释放1微摩尔对硝基酚所需要的酶量为一个酶活力单位U。

（2）酶活测定方法

取四支15*150试管(一支空白管，三支样品管)，分别向四支管中，准确加入底物2.7mL；将四支试管同时置于30±0.1℃水浴中，预热5min；取稀释好的酶液，30±0.1℃水浴中℃预热5min；准确向空白试管中加入0.3mL缓冲液，迅速涡旋混合，将混合液倒入1cm比色皿中，作为空白在400nm下调零；准确向样品试管中加入0.3mL酶液，此时开始计时并迅速涡旋混合、倒入比色皿，400nm下记录吸光值变化，每0.5min读取一次数值，即读取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5min，共10次数据。取1～5min内的测定值，用来绘制曲线。

酶活的计算：

式中A—脂肪酶酶活力，u/g(或u/mL)；K—吸光值每分钟增长量；b、k—标准曲线中的截距和斜率；n—酶样品的稀释倍数；V1—所加入基准物的体积，0.3mL；V2—反应体系中所加入酶液的体积，0.3mL；δ—对硝基酚浓度由mg/mL换算成μmol/mL，值为106/103/139.11。

按照上述方法进行酶活检测，结果显示，黑曲霉lipN的发酵液酶活为3476U/mL，而黑曲霉lipN-m1的发酵液酶活为4429U/mL，比黑曲霉lipN提高了27%。

实施例4：碱性脂肪酶酶学性质分析

1、最适作用pH值

分别用pH值为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液稀释黑曲霉lipN和lipN-m1发酵液至合适浓度，然后在40℃条件下分别测定上述发酵液中碱性脂肪酶的酶活力，以原始酶活为100%，计算不同pH条件下碱性脂肪酶的相对酶活。结果如图2所示，野生型脂肪酶lipN与突变体lipN-m1的最适作用pH均为9.5，但是突变体lipN-m1在pH7.0、9.0、11.0条件下的相对酶活要显著高于野生型脂肪酶，从而说明本发明获得的碱性脂肪酶突变体酶活力更高，其作用pH更为宽泛。

2、最适作用温度

分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，pH7.5条件下，测定黑曲霉lipN和lipN-m1发酵液中碱性脂肪酶的酶活力，以发酵液原始酶活为100%，计算不同温度条件下碱性脂肪酶的相对酶活。结果如图3所示，野生型脂肪酶lipN与突变体lipN-m1最适作用温度均为35℃，但在25-35℃、50-60℃范围内，突变体的相对酶活显著高于野生型，尤其在55℃条件下突变体的相对酶活比野生型提高了约20%，从而说明本发明获得的脂肪酶突变体lipN-m1的耐热性得到显著提高。

实施例5：碱性脂肪酶自身热稳定性检测

分别取黑曲霉lipN和lipN-m1的发酵上清液各20ml，置于55℃培养箱中，每隔7天吸取样品检测其脂肪酶活力，以发酵液原始酶活为100%，计算不同时间段碱性脂肪酶的相对酶活。结果如图4所示，野生型脂肪酶lipN在55℃条件下酶活降低速度较快，仅7天后酶活即低于90%；而突变体lipN-m1在21天后酶活仍保持90%以上，从而说明脂肪酶突变体lipN-m1的热稳定性要显著高于野生型。

综上所述，与野生型相比，本发明获得的碱性脂肪酶突变体在没有改变其最适作用温度的情况下，显著提高了其耐热性及其自身的热稳定性，更有利于该酶及含酶产品的后处理及贮存，此外，突变体的pH作用范围更宽泛，更适合应用于洗涤领域，具有广阔的市场空间。

实施例6：碱性脂肪酶在洗涤剂中的应用测试

对比测试加与不加脂肪酶的洗衣液对国标皮脂污布（JB-03）的去污效果。

1、实验方法：参照GB/T13174-2008《衣料用洗涤剂去污力及循环洗涤性能的测定》中的方法进行。

2、脂肪酶测试样品：

脂肪酶lipN和突变体lipN-m1，酶活约为5000U/mL。

3、实验条件：

洗涤设备：RHQL-Ⅲ型立式去污机（中国日用化学工业研究院）

转速：120转/分

洗涤试验温度：分别为30℃国标洗涤温度）

洗涤实验水硬度：250ppm(Ca²⁺/Mg²⁺=3/2)

浸泡/洗涤时间：放污布前预先溶解20分钟/洗涤时间20分钟

白度计型号：WSD-3C（北京康光仪器有限公司）

R457蓝光白度：Wr（不含荧光白度）

污布种类：JB-03（国家标准GB/T13174-2008附录D）

4、实验结果：

从表中结果可知，通过在洗涤剂中添加本发明所述脂肪酶lipN和突变体lipN-m1能显著提高其对皮脂污布的洗涤效果，洗后污布的白度得到明显的提高；而且，在相同添加量的情况下，含脂肪酶突变体lipN-m1的洗涤剂对皮脂污布的洗涤效果要显著高于含野生型脂肪酶lipN的洗涤剂，从而说明本发明获得的脂肪酶突变体比野生型更适合于在洗涤领域的应用，前景广阔。

Claims

1.一种碱性脂肪酶突变体，其特征在于，所述的脂肪酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的脂肪酶的第78位氨基酸由Glu变为Arg，第187位氨基酸由Asp变为Arg。

2.如权利要求1所述的碱性脂肪酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

3.一种编码权利要求1所述的碱性脂肪酶突变体的基因，其核酸序列为SEQID NO：4。

4.一种用于在宿主细胞内表达权利要求1所述的碱性脂肪酶突变体的重组质粒。

5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求3所述的基因。

6.一种工程菌株，其特征在于，所述的工程菌株携带有权利要求4所述的重组质粒。

7.如权利要求6所述的所述工程菌株，其特征在于，所述的工程菌株为黑曲霉（Aspergillus niger）。

8.权利要求1所述的碱性脂肪酶突变体在制备洗涤剂中的应用。

9.一种洗涤剂，其特征在于，所述的洗涤剂包含有权利要求1所述的碱性脂肪酶突变体。