CN103667207B - 一种碱性脂肪酶突变体及其应用 - Google Patents

一种碱性脂肪酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种碱性脂肪酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的脂肪酶第207位氨基酸由Ala变为Gln，第252位氨基酸由Gly变为Asp，第270位氨基酸由Asn变为Gln。本发明的碱性脂肪酶突变体的最适作用温度为15℃，且在15-25℃的较低温条件下仍能保持95%以上的酶活力，比野生型在低温下的酶活水平更高；所述碱性脂肪酶突变体的最适作用pH值为9.5，且在pH9.0-13.0范围内能保持50%以上的酶活，比野生型在碱性条件下的酶活力更高，其作用pH范围更为宽泛。

Description

一种碱性脂肪酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于功能基因改造与筛选技术领域，具体涉及一种碱性脂肪酶体变体及其应用。
背景技术
脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它能催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶的基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链，它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构（Schmid等,1998）。
碱性脂肪酶是在碱性条件下水解的脂肪酶，生产的主要原料为小麦、玉米等农副产物，通过生物发酵技术转化。它可以水解天然油脂，生产脂肪酸和甘油，是一种专门在异相系统油水接口上水解特殊酯类的酶。
目前碱性脂肪酶主要应用于洗涤剂行业，单独或与碱性蛋白酶一起添加在洗涤剂中，作为洗涤剂的一种添加成分，它有助于脂肪油渍和人体皮脂污垢的去除。人们通过对织物的污垢进行分析发现，由人体皮脂腺分泌的皮脂类污垢约占总污垢的四分之三以上，仅靠表面活性剂和助剂的作用是不能完全去除的，添加于洗涤剂中的脂肪酶可将这些难于除去的脂类物质降解为易于出去的物质，从而提高洗涤剂的去污效果。1988年，丹麦NoVo公司报道了碱性脂肪酶在洗涤剂中的应用，并将其投入到工业化生产中。日本狮子油脂公司同年也推出了加脂肪酶的洗衣粉。P&G公司和联合利华公司等中外合资公司也推出了含脂肪酶和蛋白酶的高档洗衣粉，但目前脂肪酶完全依赖进口。国内对碱性脂肪酶的研究起步较晚，在碱性脂肪酶发酵菌种、提取工艺、酶活性以及颗粒酶制备技术等方面与国外的先进技术有很大的差距，急需开发新的酶学性质优良、产量高的碱性脂肪酶，提高洗涤效果，并降低生产成本，从而促进碱性脂肪酶的广泛应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型碱性脂肪酶突变体及其应用，本发明通过定向进化技术对黑葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）的碱性脂肪酶进行突变，筛选到一种耐低温、耐碱的脂肪酶突变体，并构建得到高效表达该突变体的基因工程菌株，有利于实现该突变体的工业化生产和在洗涤领域的广泛应用。
本发明一个方面涉及一种碱性脂肪酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的脂肪酶的第207位氨基酸由Ala变为Gln，第252位氨基酸由Gly变为Asp，第270位氨基酸由Asn变为Gln。
上述脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。
本发明另一方面涉及携带有编码序列为SEQ ID NO：4的脂肪酶突变体基因的重组质粒。
本发明还涉及一种工程菌株，其携带有上述重组质粒。
所述工程菌株为毕赤酵母（Pichia pastoris）。
本发明还涉及上述碱性脂肪酶突变体在洗涤剂中的应用。
本发明提供了一种碱性脂肪酶突变体，并通过构建毕赤酵母工程菌高效体外表达该脂肪酶突变体，发酵酶活高达1697U/mL。本发明所述碱性脂肪酶突变体的最适作用温度为15℃，且在15-25℃的较低温条件下仍能保持95%以上的酶活力，比野生型在低温下的酶活水平更高；所述碱性脂肪酶突变体的最适作用pH值为9.5，且在pH9.0-13.0范围内能保持50%以上的酶活，比野生型在碱性条件下的酶活力更高，其作用pH范围更为宽泛。本发明所述碱性脂肪酶突变体在低温、碱性条件下酶活水平高的特性，特别适合应用于洗涤领域。通过在洗涤剂中添加本发明所述碱性脂肪酶突变体，能显著提高污布的白度，且在低温和碱性条件下效果更好，因此本发明提供的碱性脂肪酶突变体具有更广阔的市场空间。
附图说明
图1:为毕赤酵母Lip3404和毕赤酵母Lip-15发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，其中箭头所指34kD处为重组表达的碱性脂肪酶。
图2:为本发明碱性脂肪酶突变体与野生型的最适作用pH比较图。
图3:为本发明碱性脂肪酶突变体与野生型的最适作用温度比较图。
具体实施方式
以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。
实施例1碱性脂肪酶基因的合成与扩增
使用真菌基因组DNA提取试剂盒(Omega)从黑葡萄穗霉过夜培养物中提取基因组DNA。
以黑葡萄穗霉基因组DNA为模板扩增黑葡萄穗霉中的碱性脂肪酶基因Lip3404，其中所用到的正向引物F序列为(下划线所示序列为EcoRI酶切位点)；
5′-CG GAATTC GCTCCTCTGAGCGCTACAG-3′，
反向引物R序列为(下划线所示序列为NotI酶切位点)：
5′-TAAAGCGGCCGCTTAAGCAGCA GGAGCAGCAG-3′
将该基因用Phusion DNA聚合酶(Thermo scientific)从黑葡萄穗霉基因组DNA中扩增出来。
使用凝胶纯化试剂盒(Fermentas)将上述PCR产物纯化。用限制性内切酶EcoRI和NotI(Fermentas)对纯化后的PCR产物进行酶切；同时，用限制性内切酶EcoRI和NotI对质粒pPIC9K进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进Trans5α大肠杆菌(Transgen)，用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitrogen)。测序结果显示，黑葡萄穗霉中碱性脂肪酶Lip3404的基因序列为SEQ ID NO:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
使用质粒中量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。所得1个重组质粒为pPIC9K-Lip3404。
为了改善碱性脂肪酶Lip3404的低温耐受性，申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR引物Lip-F1、Lip-R1如下：
Lip-F1：GGCGAATTC GCTCCTCTGAGCGCTACAG（下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点）
Lip-R1：ATAGCGGCCGCTTAAGCAGCA GGAGCAGCAG（下划线为限制性内切酶NotI识别位点）
以SEQ ID NO:2为模板，以上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（Stratagene）进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有碱性脂肪酶的大肠杆菌细胞裂解液。
分别取出30ul裂解液至两块新的96孔板，分别在10℃下测定其脂肪酶酶活。结果发现有些突变对脂肪酶的低温耐受性没有影响，有些突变甚至使其低温耐受性降低了，对在10℃下依然保持高活性的突变子进行DNA测序，最终，申请人获得了能提高脂肪酶低温耐受性的突变组合A207Q，G252D和N270Q。
含A207Q，G252D和N270Q三点突变的脂肪酶突变体，其氨基酸序列为SEQID NO：3，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：4由上海捷瑞生物公司合成。
将合成的脂肪酶突变体基因命名为Lip-15，用引物Lip-F1、Lip-R1进行PCR扩增，引物两端引入EcoR I、Not I位点。PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃保温10min。
使用凝胶纯化试剂盒(Fermentas)将上述PCR产物纯化。用限制性内切酶EcoRI和NotI(Fermentas)对纯化后的PCR产物进行酶切；同时，用限制性内切酶EcoRI和NotI对质粒pPIC9K进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进Trans5α大肠杆菌(Transgen)，用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitrogen)。
使用质粒中量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。所得1个重组质粒为pPIC9K-Lip-15。
实施例2毕赤酵母工程菌的构建与筛选
将重组质粒pPIC9K-Lip-15用SalI酶切，电泳鉴定后，经乙醇沉淀浓缩，测定DNA浓度，以3μg/μL浓度稀释质粒片段保存备用。制备毕赤酵母GS115电转化感受态细胞，最后重悬于1mL预冷的电泳缓冲液中(含1mM MgCl2，10mM HEPES,250mM蔗糖,pH7.8)。在80μL感受态细胞中加入5μL线性化重组质粒；电转化（条件为1500V、200Ω、25μF）；最后涂布于MM平板（MM培养基组分：1.34%YNB，4×10-5%生物素，0.5%甲醇），得到重组转化子。
用适量无菌水将MM板上的重组转化子清洗下来，转接到含有1mg/mLG418（抗生素）的液体YPD培养基（1%酵母提取物，2%蛋白陈，2%葡萄糖）中，生长两天后转接4mg/mL G418的液体YPD培养基中，最后将培养基中G418的浓度升至8mg/mL；将获得的高拷贝转化子于YPD平板上划线，培养，挑取单菌落；将其中一株工程菌命名为毕赤酵母Lip-15（Pichia pastoris Lip-15）。
通过上述同样的酶切连接方法将野生型碱性脂肪酶Lip3404克隆到毕赤酵母GS115宿主中，构建得到重组表达野生型脂肪酶的毕赤酵母工程菌，命名为毕赤酵母Lip3404（Pichia pastoris Lip3404）。
实施例3摇瓶诱导表达及酶活测定
将所得的毕赤酵母工程菌Lip-15和毕赤酵母Lip3404接种于5mL BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白陈，1.34%YNB,4×10-5%生物素，l％甘油）,30℃培养过夜，离心收集菌体，把菌体加入50ml BMMY诱导培养基（1％酵母提取物，2％蛋白陈，1.34%YNB,4×10-5%生物素，0.5％甲醇），每12小时补加120μL甲醇；离心去除菌体，得到发酵上清液；将上清液进行SDS-PAGE电泳检测分析，结果如图1所示，箭头所指处即为目的蛋白条带，分子量大小约为34kDa，与本发明所述脂肪酶的理论分子量大小一致。说明本发明构建的毕赤酵母工程菌Lip-15和毕赤酵母Lip3404均能重组表达所述碱性脂肪酶。
（1）碱性脂肪酶活性单位定义
在30℃、pH值为8.0的条件下，每分钟从浓度为6%对硝基苯酚-棕榈酸酯的溶液中降解释放1微摩尔对硝基酚所需要的酶量为一个酶活力单位U。
（2）酶活测定方法
取四支15*150试管(一支空白管，三支样品管)，分别向四支管中，准确加入底物2.7mL；将四支试管同时置于30±0.1℃水浴中，预热5min；取稀释好的酶液，30±0.1℃水浴中℃预热5min；准确向空白试管中加入0.3mL缓冲液，迅速涡旋混合，将混合液倒入1cm比色皿中，作为空白在400nm下调零；准确向样品试管中加入0.3mL酶液，此时开始计时并迅速涡旋混合、倒入比色皿，400nm下记录吸光值变化，每0.5min读取一次数值，即读取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5min，共10次数据。取1～5min内的测定值，用来绘制曲线。
酶活的计算：
酶活力 A = ( K - b ) × δ × V 1 × n k × V 2
式中A—脂肪酶酶活力，u/g(或u/mL)；K—吸光值每分钟增长量；b、k—标准曲线中的截距和斜率；n—酶样品的稀释倍数；V1—所加入基准物的体积，0.3mL；V2—反应体系中所加入酶液的体积，0.3mL；δ—对硝基酚浓度由mg/mL换算成μmol/mL，值为106/103/139.11。
按照上述方法分别测定毕赤酵母Lip-15和毕赤酵母Lip3404发酵上清液的酶活，结果显示，毕赤酵母Lip3404的发酵酶活为116.3U/mL，而毕赤酵母Lip-15的发酵酶活为148.4U/mL，比毕赤酵母Lip3404提高了28%。
实施例4发酵验证
在10升发酵罐上分别进行毕赤酵母Lip-15和毕赤酵母Lip3404的发酵，发酵使用的培养基配方为：硫酸钙1.1g/L、磷酸二氢钾5.5g/L、磷酸二氢铵55g/L、硫酸钾20.3g/L、硫酸镁16.4g/L、氢氧化钾1.65g/L、消泡剂0.05%。
发酵生产工艺：pH值5.0、温度30℃、搅拌速率300rpm、通风量1.0-1.5（v/v）、溶氧控制在20%以上。
整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7%比例接入种子，30℃培养24-26h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80%以上表明该阶段结束，为期约30-60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20%以上，培养时间在150-180h之间。发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。
采用实施例3所述脂肪酶酶活测定方法对上述粗酶液进行检测，结果显示：发酵141小时后，毕赤酵母Lip3404的发酵酶活为1283U/mL，而毕赤酵母Lip-15的发酵酶活为1697U/mL，比毕赤酵母Lip3404提高了32%。
本发明所述毕赤酵母Lip-15能够高效稳定的表达碱性脂肪酶，而且该工程菌株在多次传代后，还能保持遗传上的稳定性。
实施例5碱性脂肪酶酶学性质分析
1、最适作用pH
用pH值分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0的缓冲液分别稀释毕赤酵母Lip3404和毕赤酵母Lip-15发酵上清液，在25℃条件下分别测定其酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图2所示，野生型碱性脂肪酶Lip3404的最适作用pH值为9.0，而碱性脂肪酶突变体Lip-15的最适作用pH值为9.5；野生型在pH10.5的条件下酶活力几乎降为0，但突变体在pH9.0-13.0范围内能保持50%以上的酶活力力。上述结果表明，与野生型相比，本发明突变后的脂肪酶在碱性条件下的酶活力更高，其作用pH范围更为宽泛。
2、最适作用温度
分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，pH9.0条件下测定毕赤酵母Lip3404和毕赤酵母Lip-15发酵上清液的酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图3所示，野生型碱性脂肪酶Lip3404的最适作用温度为25℃，而碱性脂肪酶突变体Lip-15的最适作用温度为15℃，且在15-25℃的较低温条件下仍能保持95%以上的酶活力。上述结果表明，与野生型相比，本发明突变后的脂肪酶最适作用温度更低，在低温下酶活水平更高，因此更适合低温洗涤，有利于节能环保。
综上，本发明所述脂肪酶突变体与野生型相比在低温、碱性条件下酶活水平更高，更适合应用于洗涤领域，具有广阔的市场空间。
实施例6碱性脂肪酶在洗涤剂中的应用试验
1、实验样品
酶样品：本发明所述碱性脂肪酶突变体Lip-15，其酶活为2000U/mL。
洗涤剂样品：
1）蓝月亮深层洁净护理洗衣液（市场购买）；3‰浓度水溶液pH值=7.8
2）白猫超浓缩无磷洗衣粉（市场购买）；2‰浓度水溶液pH值=11.6
3）奥妙全自动高浓度洗衣液（市场购买）3‰浓度水溶液pH值=8.1
2、实验设计
对照组：不加本发明所述碱性脂肪酶突变体的洗衣粉和洗衣液；
实验组：按体积比1‰添加本发明所述碱性脂肪酶突变体的洗衣粉和洗衣液；
通过对比检测对照组和实验组对国标皮脂污布（JB-03）的去污效果验证本发明所述碱性脂肪酶突变体的功效。
3、实验方法
GB/T13174-2008《衣料用洗涤剂去污力及循环洗涤性能的测定》
实验条件：
洗涤实验设备:RHQL—Ⅲ型立式去污机（中国日用化学工业研究院）
转速:120转/分
洗涤试验温度:分别为30℃（国标洗涤温度）和15℃（较低温度）
洗涤实验水硬度:250ppm(Ca2+/Mg2+=3/2)
浸泡/洗涤时间:放污布前预先溶解20分钟/洗涤时间20分钟
白度计型号:WSD-3C（北京康光仪器有限公司）
R457蓝光白度：Wr（不含荧光白度）
污布种类:JB-03（国家标准污布------皮脂，
详细组分见GB/T13174-2008附录D）
4、实验结果：
从上述实验数据可以得知，通过在洗涤剂中添加本发明所述碱性脂肪酶突变体，能显著提高污布的白度，尤其是在低温（15℃）和碱性（pH11.6）条件下，实验组与对照组污布的白度差值较大，从而说明本发明提供的碱性脂肪酶突变体能显著增强洗涤剂对皮脂类污垢的去污效果，且在低温和碱性条件下效果更好，具有广阔的市场空间。

Claims (7)

1.一种碱性脂肪酶突变体，其特征在于，所述的碱性脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。
2.一种基因，其特征在于，所述的基因用于编码权利要求1所述的碱性脂肪酶突变体。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核酸序列为SEQ IDNO：4。
4.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求2所述的基因。
5.一种工程菌株，其特征在于，所述的工程菌株携带有权利要求4所述的重组质粒。
6.如权利要求5所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株为毕赤酵母。
7.权利要求1所述的碱性脂肪酶突变体在洗涤剂中的应用。
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定点突变对扩展青霉脂肪酶热稳定性的改善;蔡少丽等;《应用与环境生物学报》;20130225;第19卷(第1期);第43-47页 *
陈木妹,林琳.D92P点突变对扩展青霉碱性脂肪酶最适作用温度的改善.《生物技术通讯》.2005,第16卷(第1期),第31-33页. *

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