CN103667091B - 一种碱性脂肪酶生产菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

一种碱性脂肪酶生产菌株及其应用，本发明构建的毕赤酵母工程菌能高效表达来源于圆弧青霉的碱性脂肪酶基因，摇瓶发酵酶活可达1630U/mL；本发明的重组碱性脂肪酶的最适作用pH为8.5，最适温度为35℃。本发明所述的含有碱性脂肪酶的洗涤剂组合物去污力强，对环境的污染小，具有很高的推广应用价值。

Description

一种碱性脂肪酶生产菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种碱性脂肪酶生产菌株及其应用。

背景技术

脂肪酶（Lipase），即三酰基甘油酰基水解酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。脂肪酶的基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链，其催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。

脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性等方面存在不同。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围、高稳定性和活性，对底物的特异性，因此对微生物脂肪酶的开发具有重要的意义。

碱性脂肪酶是指在碱性条件下水解的脂肪酶，它能水解天然油脂，产生脂肪酸和甘油，是一种专门在异相系统油水接口上水解特殊酯类的酶。碱性脂肪酶是一种新型洗涤剂用酶，主要用途是作为洗涤剂的新酶种。它的特性是能分解衣物油污成甘油二酯、甘油单酯及脂肪酸等较易溶于水的物质，从而显著提高洗涤剂的效果，尤其是去除黄斑的效果。此外，碱性脂肪酶还可应用于纺织、食品、纤维及造纸工业领域。因此，碱性脂肪酶具有更广的应用价值，成为目前研究的热点之一。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种碱性脂肪酶生产菌株及其应用。本发明通过构建含有圆弧青霉（Penicillium cyclopium）的脂肪酶基因的表达质粒，转化入毕赤酵母中，从而获得高效重组表达该碱性脂肪酶的毕赤酵母工程菌株，从而弥补现有技术的不足。

本发明一方面提供了一种工程菌，其携带有表达脂肪酶的重组质粒。

所述工程菌为毕赤酵母ALip (Pichia pastoris ALip)。

所述脂肪酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。

所述脂肪酶的编码核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。

本发明另一方面提供了上述工程菌在生产脂肪酶中的应用。

本发明构建的毕赤酵母工程菌能高效表达来源于圆弧青霉的碱性脂肪酶基因，摇瓶发酵酶活可达1630U/mL；本发明的重组碱性脂肪酶的最适作用pH为8.5，最适温度为35℃。本发明所述的含有碱性脂肪酶的洗涤剂组合物去污力强，对国际污布EMPA116及EMPA117上的去污效果要好于竞争产品，且对环境的污染小，具有很高的推广应用价值。

附图说明

图1为毕赤酵母工程菌ALip发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图，其中泳道1为毕赤酵母工程菌ALip发酵上清液，泳道2为对照组，箭头所指处的条带即为本发明的重组脂肪酶。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。

除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 3nd Ed. (Singleton et al., 2006)和COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale et al., 2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。

    下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1 碱性脂肪酶基因的克隆

将圆弧青霉（Penicillium cyclopium）过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS); 然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl 10M NH₄AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000 rpm离心10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。利用OMEGA公司的E.Z.N.A. Fungal RNA Kit制备草酸青霉的mRNA，其制备过程参照试剂盒的操作手册。

以提取的圆弧青霉基因组总DNA为模板，设计引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃，7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。

将回收的扩增产物分别连接到pMD18-T载体，获得克隆载体命名pT-ALip，送至北京华大基因研究中心进行测序分析，获得的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，其编码氨基酸序列为为SEQ ID NO:1。通过NCBI Blast比对分析，该序列与圆弧青霉的碱性脂肪酶基因的序列相似性为90%，为一新的等位基因。

实施例2 表达载体的构建

以质粒pT- ALip为模板，利用引物进行PCR扩增，PCR扩增条件是94℃ 5min；94℃ 30S；55℃ 30S，72℃ 2min 30个循环；72℃ 10min。凝胶回收扩增产物，进行XbaI和Kpn I双酶切；对表达质粒pPIC9K也进行XbaI和Kpn I双酶切；用T4连接酶把双酶切产物和表达载体4℃连接过夜；把连接产物导入大肠杆菌DH5α。获得相应的阳性克隆表达质粒命名为pPIC-ALip。

实施例3 毕赤酵母工程菌的构建

表达质粒pPIC- ALip用Sac I酶切电泳鉴定；乙醇沉淀浓缩，测定DNA浓度，以3μg/μL浓度稀释质粒片段保存备用。

制备毕赤酵母GS115电转化感受态细胞，重悬于1 mL预冷的电泳缓冲液中(配方：1mM MgCl₂，10mM HEPES, 250mM 蔗糖, pH 7.8)。在80μL感受态细胞中加入5μL线性化重组质粒pPIC- ALip；电转化（条件为1500V、200Ω、25μF）；最后涂布于MM平板（MM培养基组分：1.34%YNB，4×10^-5%生物素，0.5%甲醇），挑选其中一株重组菌株命名为毕赤酵母ALip（Pichia pastoris ALip）。

实施例4 发酵和酶学性质测定

将上述毕赤酵母工程菌ALip接种于5ml BMGY ( 1％酵母提取物，2％蛋白陈，1. 34 % YNB, 4×10^-5%生物素，l％甘油）, 30℃培养过夜，离心收集菌体，把菌体加入50ml BMMY诱导培养基（1％酵母提取物，2％蛋白陈，1. 34 % YNB, 4×10^-5%生物素，0.5％甲醇），每12小时补加50μL甲醇，诱导培养5天，取上清液进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图1所示，箭头所指31kDa处有一明显的蛋白条带，分子量大小与预测一致，说明本发明构建的毕赤酵母工程菌株能有效重组表达碱性脂肪酶。

脂肪酶活力单位

1g固体酶粉（或1ml液体酶），在一定温度和pH条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。

酶活测定方法：

取两个100ml三角瓶，分别于空白瓶（A）和样品瓶(B)中各加入底物溶液4.00ml和磷酸缓冲液5.00ml，再于A瓶中假如95%乙醇15.00ml，于40℃±0.2℃水浴中预热5min，然后于A、B瓶中各加待测酶液1.00ml，立即混匀计时，准确反应15min后，于B瓶中立即补加95%乙醇15.00ml终止反应，取出；于空白和样品溶液中各加酚酞指示液两滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保存30s，不褪色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。

脂肪酶的酶活力按下列公式计算：

           （V₁ – V₂）×C×50×n              

X₁ =   ------------------------× 1/15               

                  0.05

式中：

X1——样品的酶活力，u ／ml；

      V1——滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液体积，ml；

 V2——滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液体积，ml；

      c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol／L；

      50——0.05mol/L氢氧化钠溶液1.00ml相当于脂肪酸50μmol；

      n——酶液稀释倍数；

      0.05—氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；

      1/15——反应时间15min，以1min计；

      所得实验结果表示至整数。

本发明采用上述测定方法对毕赤酵母工程菌 ALip发酵上清液进行了检测，结果显示，发酵液中脂肪酶的酶活高达1630U/mL，说明该工程菌能高效重组表达圆弧青霉的碱性脂肪酶基因。

（1）最适温度分析

 分别测定上述毕赤酵母工程菌ALip发酵上清液在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，pH9.0的条件下酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线，结果显示，本发明重组表达的碱性脂肪酶的最适作用温度为35℃。

（2）最适pH分析

用pH值分别为2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的缓冲液稀释上述上清液，在温度35℃条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线，结果显示，本发明重组表达的碱性脂肪酶的最适作用pH为9.5。

实施例5 碱性脂肪酶在洗涤剂中的应用

本发明提供了一种液体碱性脂肪酶组合物，包括：本发明的重组碱性脂肪酶、碳酸钙、硼酸钠、甲酸钠、多元醇和山梨酸钾。具体含量见表1。。

表1 液体碱性脂肪酶组分及含量

序号	组   分	重量份
			1	重组碱性脂肪酶	40 – 80
2	碳酸钙	0.1– 0.8
			3	硼酸钠	1 – 4
4	甲酸钠	2 – 15
			5	多元醇	5 – 20
6	山梨酸钾	0.1– 0.5

将上述组分,在35℃温度下搅拌15-30分钟，充分溶解，混合均匀后，冷却至室温，即可制得一种稳定性较好的液体碱性脂肪酶组合物。

利用上述液体碱性脂肪酶组合物和市场竟争产品进行同等酶活（1000u/ml）加量条件下的去污值比较（测试标准：国标 GB/T 13174-2008《衣料用洗涤剂去污力及循环洗涤性能的测定》）。实验结果如表2所示。

表2 液体碱性脂肪酶在市售洗衣液中的去污值测定数据

编号	样品名称	EMP A116	EMP A117
				1	蓝月亮洗衣液2 ml +1000u/ml 本发明的重组碱性脂肪酶	8.25	8.36
2	蓝月亮洗衣液2 ml +1000u/ml 竞争产品碱性脂肪酶	6.84	7.60
				4	国家标准洗衣液2g（不加脂肪酶）	2.14	1.62

由表2的数据可看出：同等酶活加量下，本发明的液体碱性脂肪酶对国际污布EMPA116及EMPA117上的去污效果要好于竞争产品碱性脂肪酶。

本发明构建的毕赤酵母工程菌重组表达的碱性脂肪酶，可广泛应用于洗涤剂领域，不仅能大幅度提高洗涤剂的去污能力，还能有效减少化学洗涤剂对环境的污染。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  青岛蔚蓝生物集团有限公司

 

<120>  一种碱性脂肪酶生产菌株及其应用

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  285

<212>  PRT

<213>  alkaline  lipase  enzyme  sequence

 

<400>  1

 

Met Leu Phe Asn Tyr Gln Ser Leu Leu Met Gly Val Phe Leu Ile Ser

1               5                   10                  15     

 

 

Gln Ser Leu Ser Ala Pro Ile Leu Glu Ser Arg Val Thr Ala Asp Ala

            20                  25                  30         

 

 

Ser Ala Phe Pro Asp Leu His Arg Ala Ala Asn Val Ser Ser Ala Val

        35                  40                  45             

 

 

Tyr Thr Gly Cys Ile Gly Lys Ala Leu Asp Val Thr Met Thr Lys Arg

    50                  55                  60                 

 

 

Ile Tyr Asp Leu Val Thr Asp Thr Asn Gly Phe Val Gly Tyr Ser Thr

65                  70                  75                  80 

 

 

Glu Lys Lys Thr Ile Ala Val Ile Met Arg Gly Ser Thr Thr Ile Thr

                85                  90                  95     

 

 

Asp Phe Val Asn Asp Ile Asp Ile Ala Leu Ile Thr Pro Glu Leu Ser

            100                 105                 110        

 

 

Gly Val Thr Phe Pro Ser Asp Val Lys Ile Met Arg Gly Val His Arg

        115                 120                 125            

 

 

Pro Trp Ser Ala Val His Asp Thr Ile Ile Thr Glu Val Lys Ala Leu

    130                 135                 140                

 

 

Ile Ala Lys Tyr Pro Asp Tyr Thr Leu Glu Ala Val Gly His Ser Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Gly Gly Ala Leu Thr Ser Ile Ala His Val Ala Leu Ala Lys Glu Phe

                165                 170                 175    

 

 

Leu Glu Lys Ser Ile Val Arg Asn Ala Leu Asn Ala Phe Pro Ile Gly

            180                 185                 190         

 

 

Asn Gln Ala Trp Ala Asp Cys Gly Ile Ala Gln Ala Gly Thr Phe Asn

        195                 200                 205            

 

 

Arg Gly Asn Asn Val Leu Asp Gly Val Pro Asn Met Tyr Ser Ser Pro

    210                 215                 220                 

 

 

Leu Val Asn Phe Lys His Tyr Gly Thr Glu Tyr Tyr Ser Ser Gly Thr

225                 230                 235                 240

 

 

Glu Ala Ser Thr Val Lys Cys Glu Gly Lys Leu Glu Lys Ser Cys Ser

                245                 250                 255    

 

 

Ala Gly Asn Gly Arg Tyr Ala Val Thr Pro Gly Leu Ile Ala Arg Ser

            260                 265                 270        

 

 

Gly Val Val Met Leu Thr Ala Gly Ser Gly Ser Met Arg

        275                 280                 285

 

 

<210>  2

<211>  858

<212>  DNA

<213>  alkaline  lipase  gene  sequence

 

<400>  2

atgttgttca actaccaatc tttactcatg ggagtctttc tgatctctca atccctgtct     

 

 60

 

gcacctattt tggagtcgag ggtaactgct gacgcctctg ccttccctga tctgcaccgt     

 

120

 

gcagcaaatg tttcttccgc tgtctacaca ggttgcatcg gaaaggcctt ggatgtcact     

 

180

 

atgaccaaga ggatttatga cctcgtgacc gacaccaatg gattcgtcgg atactccacc     

 

240

 

gagaagaaga ccatcgcggt catcatgagg ggctcgacta ccatcaccga cttcgtgaac     

 

300

 

gacattgaca ttgctctcat cactcctgag ctctcgggcg tgactttccc ctctgatgtg     

 

360

 

aagatcatga gaggtgttca cagaccttgg tccgctgtac acgacaccat cattactgaa     

 

420

 

gtcaaggctc tcattgcgaa gtaccctgat tacactctgg aagcagtcgg acattccctc     

 

480

 

ggtggtgccc tcacatccat tgcccacgtt gccctggcca aggagttcct tgaaaagtca     

 

540

 

attgtgagaa atgcccttaa cgccttcccc atcggcaacc aagcgtgggc cgactgtgga     

 

600

 

attgcgcagg ccggtacctt caaccgcgga aataacgttc ttgacggtgt ccctaacatg     

 

660

 

tactcgagcc cgcttgttaa cttcaagcac tatggaaccg aatactacag ctctggtacc     

 

720

 

gaggctagca ccgtgaagtg tgagggtaag cttgaaaagt cttgctctgc cggcaatggc     

 

780

 

aggtacgctg tcactcccgg tctcatcgca aggtctggtg tggtgatgct tactgcgggg     

 

840

 

tctggctcta tgagatga                                                   

 

858

 

 

 

Claims (3)

1.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的工程菌携带有表达氨基酸序列为SEQ ID NO:1的脂肪酶的重组质粒。

2.如权利要求1所述的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述脂肪酶的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

3.权利要求1所述的毕赤酵母工程菌在生产脂肪酶中的应用。