CN102994465A - 一种酶活性及热稳定性提高的脂肪氧合酶及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶活性及热稳定性提高的脂肪氧合酶，是在GenBank PA119公布的基因序列编码的蛋白质基础上，其N端氨基酸缺失，其中缺失尤以缺失30个为佳。使用本方法得到的新型脂肪氧合酶，酶学性质较好的突变株，热稳定性提高2.1倍，比酶活仍能维持初始的90%。改造后的酶更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。

Description

一种酶活性及热稳定性提高的脂肪氧合酶及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种脂肪氧合酶，特别是一种酶活性及热稳定性提高的脂肪氧合酶。
背景技术
微生物脂肪氧合酶（Lipoxygenase，LOX，EC1，13．11．12）属于氧化还原酶，是一类含非血红素铁的蛋白质，能专一催化具有顺，顺4-烯结构的多不饱和脂肪酸，通过分子内加氧，形成具有共轭双键的氢过氧化衍生物，此物质是相当重要的化学和药物合成的中间体，同时能将其转化为酮，是食品风味物质醛与醇的前体物质。因此在食品领域有着广泛的应用前景。但脂肪氧合酶自身的一些缺陷如比酶活、热稳定性等因素，限制了脂肪氧合酶的应用范围。因此基于已得到的脂肪氧合酶在大肠杆菌中的表达平台，利用氨基酸缺失，对脂肪氧合酶进行分子改造，以期得到酶学性质更适合工业应用的脂肪氧合酶。
发明内容
为改善脂肪氧合酶比酶活低，热稳定性差的现状，本研究通过对脂肪氧合酶的N端氨基酸进行缺失，从而使其柔性降低刚性增强，改变催化特性，提高热稳定性。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：在GenBank PA1169公布的基因序列编码的氨基酸基础上，其N端氨基酸缺失，其中N端氨基酸缺失优选20个和30个氨基酸，更优选30个。
产所述脂肪氧合酶的基因工程菌或转基因细胞系也为本发明要求保护的范围。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建所述产脂肪氧合酶基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
1）采用化学全合成或PCR方法克隆编码权利要求1所述编码脂肪氧合酶的基因；
2）将步骤1）获得的基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；
3）将步骤2）获得的重组表达载体转化E.coli Rosetta(DE3)得到基因工程菌。
所述表达载体为pET-22b(+)。
应用所述基因工程菌发酵生产角蛋白酶的方法为以脂肪氧合酶基因工程菌为生产菌株，37℃，培养12h，转接到TB培养基中，接种量为1%。菌体长到OD600为0.6时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到20℃，培养50h。
本发明所用到的培养基：
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L，pH7.0；
TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，甘油8g/L，17mmol/LKH2PO4，72mmol/LK2HPO4。
本发明中脂肪氧合酶活力的测定:
采用分光光度法测定LOX酶活。1个单位LOX酶活定义为：25℃下每分钟催化底物形成1μmol亚油酸氢过氧化物(HPOD)的酶量(U/mL)。酶活测定条件：以亚油酸为底物，在25℃条件下利用Shimadzu UV-2450分光光度计在线测定234nm下吸光值的变化，以吸光值变化曲线初始部分的斜率计算酶活。
底物:0.3mM亚油酸溶于0.15M K2HPO4-KH2PO4缓冲液（pH7.5）。
本发明中脂肪氧合酶热稳定的测定:
重组酶热稳定性用酶在50°C下酶活性的半衰期(min)来表示。将纯化后的酶用buffer A稀释到蛋白浓度为100μg/mL并在50°C保温，间隔测定残余酶活，将残余酶活拟合并计算半衰期。
本发明以脂肪氧合酶在大肠杆菌中的高效表达为改造平台，对脂肪氧合酶成熟酶N端氨基酸进行缺失，得到了酶学性质较好的突变株，热稳定性提高2.1倍，比酶活仍能维持初始的90%。改造后的酶更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。
具体实施方式
实施例1热稳定性提高的脂肪氧合酶
在GenBank PA1169公布的基因序列编码的氨基酸基础上，其N端氨基酸缺失，其中N端氨基酸缺失优选20个和30个氨基酸，更优选30个，所述N端缺失的脂肪氧合酶可以通过化学全合成或PCR方法获得。
实施例2产高活性及热稳定脂肪氧合酶基因工程菌的获得
(1)利用定点突变试剂盒（TaKaRa），设计3对引物（如表1示），以先前以构建的pET-22b(+)/pre-LOX（Lu X,Zhang J,Liu S,Zhang D,Xu Z,Wu J,Li J,Du G，Chen J(2012)Overproduction,purification,and characterization of extracellular lipoxygenase ofPseudomonas aeruginosa in Escherichia coli.Appl Microbiol Biot:Dio10.1007/s00253-012-4457-6）为模版，进行PCR或通过化学全合成的方法，分别缺失脂肪氧合酶N端的10、20、30、40个氨基酸，缺失10个氨基酸命名为D10，以此类推，缺失40个氨基酸命名为D40，转化子由上海生工进行测序。
(2)将测序正确的质粒，转化E.coli Rosetta(DE3)，获得产脂肪氧合酶基因工程菌。
表1
Figure BDA00002661669000031
实施例3高活性及热稳定脂肪氧合酶的验证
(1)接种实施例2中的基因工程菌到LB液体培养基中，37℃，培养12h，转接到TB培养基中，接种量为1%。菌体长到OD600为0.6时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到20℃，培养50h。
(2)收集发酵上清，检测发酵上清酶活，并对样品进行His-镍柱纯化，纯化蛋白。
(3)对纯化的蛋白的热稳定性和最适温度进行测定，结果如表2所示。实验结果表明与野生型相比较，D10比酶活与热稳定性变化不大，但D20与D30在50℃时半衰期分别增加了1.3、2.1倍。同时，D20与D30的最适反应温度也相应的提高了5℃，10℃。表明N端部分缺失有利于提高酶的热稳定性。
(4)对纯化的蛋白的Km值和比酶活进行测定，结果如表2所示。实验结果表明与野生型相比较，D20与D30的Km值有较小的增加，表明缺失N端会影响酶的底物亲和力，但其比酶活的损失却不超过10%。
表2
Figure BDA00002661669000032
Figure BDA00002661669000041
Figure IDA00002661669800011

Claims (8)

1.一种酶活性及热稳定性提高的脂肪氧合酶，其特征在于在GenBank PA1169公布的基因序列编码的脂肪氧合酶基础上，其N端氨基酸缺失。
2.权利要求1所述的脂肪氧合酶，其特征在于所述N端氨基酸缺失20个。
3.权利要求1所述的脂肪氧合酶，其特征在于所述N端氨基酸缺失30个。
4.一种获得权利要求1所述脂肪氧合酶的方法，其特征在于以GenBank PA119公布的基因为出发基因,将其编码脂肪氧合酶N端的序列进行缺失。
5.产权利要求1所述脂肪氧合酶的基因工程菌或转基因细胞系。
6.权利要求5所述产脂肪氧合酶基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
1）采用化学全合成或PCR方法克隆编码权利要求1所述编码脂肪氧合酶的基因；
2）将步骤1）获得的基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；
3）将步骤2）获得的重组表达载体转化E.coli Rosetta(DE3)得到基因工程菌。
7.权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于所述表达载体为pET-22b(+)。
8.应用权利要求6所述基因工程菌发酵生产角蛋白酶的方法，其特征在于以所述脂肪氧合酶基因工程菌为生产菌株，37℃，培养12h，转接到TB培养基中，接种量为1%。菌体长到OD600为0.6时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到20℃，培养50h。
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