CN114277005A - 一种催化效率与热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种催化效率与热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体，属于酶工程和基因工程技术领域。本发明通过对铜绿假单胞菌来源的脂肪氧合酶进行分子改造，经过定点突变或饱和突变，筛选获得催化效率和热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体，催化效率提高了1.4至9.2倍，在50℃下孵育，半衰期T_1/2可达到11.6min，较野生型提升了165.7％。可以显著提高脂肪氧合酶的催化效率和热稳定性，为其工业应用奠定了基础。

Description

一种催化效率与热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体

技术领域

本发明涉及一种催化效率与热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体，属于酶工程和基因工程技术领域。

背景技术

脂肪氧合酶(Lipoxygenase，简称LOX，EC.1.13.11.12)是一种不饱和脂肪酸过氧化物酶，能催化多不饱和脂肪酸与一个或多个顺式、顺式-1,4-戊二烯结构的特异性双加氧反应，生成氢过氧化物，这些氢过氧化物进一步转化为一系列具有生物活性的氧化脂质，其能广泛应用于食品、化工、制药和其他行业。例如，脂肪氧合酶不仅可以通过调节小麦面筋中二硫键的形成显著改善白面包和面食的质地，还可以替代面粉和乳制品的化学漂白剂以获得所需的颜色。脂肪氧合酶产生的氢过氧化物是可再生油工业转化为醇类、羰基化合物、环氧化物、中链羟基脂肪酸和二酸的宝贵中间体，可用于聚合物和生物柴油生产。此外，脂肪氧合酶衍生产品可进一步转化为重要的生物活性脂质介质，用于治疗炎症和癌症。与化学方法相比，上述脂肪氧合酶催化反应具有高度的特异性、安全性、健康性和环境友好性。

商用脂肪氧合酶主要通过提取植物组织或果实来提取。然而，由于原材料中同工酶的混合和低效的提取方法，脂肪氧合酶的质量难以控制。微生物发酵生产的脂肪氧合酶，通过重组表达具有纯度高、特异性强的优点，但催化效率低、稳定性差，不适合于许多工业应用。为了实现脂肪氧合酶在工业上的低成本应用，高催化效率和稳定性至关重要。

研究表明，不同来源的脂肪氧合酶性质相差甚远，而通过分子改造能有效提高酶的催化活性及稳定性，有望实现重组表达的脂肪氧合酶在工业中的广泛应用。目前，LOX分子改造的研究主要集中在结构和功能关系的解析，而通过分子改造来提高LOX催化效率及稳定性的报道则较少。

因此，以低成本的工业应用为目标，提供一种提高脂肪氧合酶催化活性和热稳定性的方法，对于脂肪氧合酶的生产应用具有重要价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供催化效率与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体，所述突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.1序列为亲本，将亲本第141位、第151位、第159位或第582位发生突变。

在一种实施方式中，所述亲本的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，将第141位的脯氨酸突变为半胱氨酸；将第151位的苯丙氨酸突变为精氨酸、丝氨酸或赖氨酸；将第159位的异亮氨酸突变为天冬氨酸或赖氨酸；将第582位的酪氨酸突变为甲硫氨酸。

本发明的第二个目的是提供编码所述脂肪氧合酶突变体的基因。

在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3～9所示。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的重组质粒。

在一种实施方式中，所述重组质粒的表达载体包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体。

在一种实施方式中，以pET22b(+)为载体。

本发明的第四个目的是提供表达所述脂肪氧合酶突变体或含有所述重组质粒的宿主细胞。

在一种实施方式中，以大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)为宿主，表达所述脂肪氧合酶突变体。

本发明的第五个目的是提供一种提高脂肪氧合酶性能的方法，对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪氧合酶进行改造，将其第141位、第151位、第159位或第582位发生突变；所述性能包括热稳定性、催化效率。

在一种实施方式中，将第141位的脯氨酸突变为半胱氨酸；将第151位的苯丙氨酸突变为精氨酸、丝氨酸或赖氨酸；将第159位的异亮氨酸突变为天冬氨酸或赖氨酸；将第582位的酪氨酸突变为甲硫氨酸。

本发明的第六个目的是提供所述脂肪氧合酶突变体的构建方法，包含如下步骤：

(1)基于计算机辅助合理设计，使用定点突变引物通过全质粒扩增获得目标突变体。

(2)使用简并引物通过全质粒PCR对候选氨基酸位点进行饱和诱变。

本发明的第七个目的是提供一种生产所述脂肪氧合酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将所述宿主细胞的单菌落分别接种至20mL LB液体培养基中，于温度37℃、220rpm的条件下培养8-10h，得到种子液；

(2)将种子液以4％(v/v)的接种量接种至LB液体培养基中，于温度25℃、220rpm的条件下培养12h，得到宿主细胞的培养液；

(3)将培养液离心后收集细胞，经均质机破碎后于10000-12000rpm、4℃的条件下离心15-30min，得到培养宿主细胞得到的粗酶液。

(4)将粗酶液进行镍柱亲和层析，得到脂肪氧合酶的纯酶液。

本发明的第八个目的是提供一种催化多不饱和脂肪酸的方法，以多不饱和脂肪酸为底物，利用所述突变体为催化剂，在pH7.0～8.0、20～50℃反应。

在一种实施方式中，在pH7.0～7.5、25～30℃反应。

在一种实施方式中，所述多不饱和脂肪酸包括但不限于亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸。

本发明的第九个目的是提供所述突变体，或所述基因，或所述宿主细胞在催化多不饱和脂肪酸中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过对铜绿假单胞菌来源的脂肪氧合酶进行分子改造，分别对其141、151、159、346、388、392、393、395～397、403、404、639～641位等多个位点进行突变并筛选，最终获得催化效率与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体。与野生型铜绿假单胞菌来源的脂肪氧合酶的催化效率相比，本发明提供的脂肪氧合酶突变体的催化效率较优化前提高了1.4-9.2倍，其在50℃条件下的半衰期最长达到11.6min，较野生型提升了165.7％。显著提高脂肪氧合酶的催化效率和热稳定性，解决了脂肪氧合酶催化效率低和热稳定性差的问题，为其工业化应用奠定了基础。

附图说明

图1为基于半理性设计的候选突变残基分析及突变体文库筛选结果分析图，其中图A为候选残基虚拟饱和突变后的最小自由能热图；图B为阳性突变体的比酶活提高倍数。

图2为候选残基的饱和突变和阳性突变株的筛选结果分析图，其中图A为候选残基的饱和突变比酶活筛选结果分析；图B为阳性突变比酶活提高倍数分析。

图3为PaLOX及其突变体的最适反应温度和热稳定性图，其中图A和图B分别为PaLOX和突变体的最佳反应温度；图C和图D分别为PaLOX和突变体在50℃下的温度稳定性。未孵育的PaLOX或突变体的原始活性为100％。

具体实施方式

LB/种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10。

发酵培养基(g/L)：酵母膏24、胰蛋白胨12、甘油10、K₂HPO₄ 16.43、KH₂PO₄ 2.32。

一个单位的LOX活性(U)定义为：1min内470nm下的吸光值增加0.001即为1个酶活单位。

脂肪氧合酶酶活测定方法：亚油酸在磷酸盐缓冲液(20mM，pH值7.4)中稀释至终浓度为0.32mM，将20μl稀释的LOX酶液与200μl亚油酸底物缓冲液混匀，25℃孵育4min。每隔10s向混合物中添加10μl 1％可溶性淀粉和40μl饱和碘化钾溶液。最后，添加500μl 15.0％的乙酸溶液显色10min，测定470nm下的吸光值。在所有的实验中，以失活LOX作为空白对照。实验数据是三个实验结果的平均值，误差为标准偏差。

蛋白分离纯化：利用镍柱亲和层析的方法对LOX蛋白进行分离纯化，具体过程如下：不同重组菌的细胞提取物均在4℃14000rpm下离心15min取上清液，并用0.22μm的混合纤维素膜过滤除杂。将样品上样于已用缓冲液A预平衡的镍亲和层析柱(Histrap 5ml FF)中，待再次平衡后，用8％缓冲液B洗脱杂蛋白。用20％缓冲液B洗脱目标LOX，随后于预冷的缓冲液A中4℃过夜透析获得纯蛋白。将脱盐的LOX样品用浓缩管进行适当浓缩以便后续实验分析。

实施例1：突变体文库构建

基于计算机辅助合理设计，使用定点突变引物通过全质粒扩增获得目标突变体(将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因连接至pET22b(+)载体的多克隆酶切位点处，构建得到重组质粒)。其次，使用简并引物通过全质粒PCR对候选突变位点进行饱和突变。使用含有NNK(正向引物)和MNN(反向引物)的简并引物在相应的突变位点进行饱和诱变，其中N代表碱基T、A、C或G；K代表T或G，M代表A或C(表1)。PCR使用以下扩增程序进行：在20个循环(包括98℃下10s、60℃下5s和72℃下3min)之前，在98℃下初始变性3min。采用Dpn I酶切PCR反应混合物去除模板，然后纯化回收PCR反应混合物转化大肠杆菌JM109获得阳性克隆。具体引物序列见表1。

表1突变所用引物

实施例2：突变体筛选

从实施例1中构建得到的阳性克隆中提取质粒，将质粒转化至大肠杆菌BL21中表达LOX蛋白。

具体为：

(1)E.coli种子培养：将阳性菌株在LB固体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)上划线，在37℃条件下培养12h，将单菌落接种于装液量为10％的250ml摇瓶中，37℃，220rpm条件下培养8-10h，得到种子液。

(2)E.coli发酵培养条件：种子液按4％的接种量接入LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)装液量为10％的250ml摇瓶中，于37℃、220rpm条件下培养至菌体密度(OD₆₀₀)达到0.5-0.6，加入终浓度为1mM的IPTG，25℃培养24h。

(3)蛋白的收集和纯化：在4℃和5500×g下离心10min收集细胞，用缓冲溶液(20mM磷酸盐缓冲液，20mM K₂HPO₄和KH₂PO₄，pH 7.4)洗涤两次，并用高压匀浆器。在4℃和11000×g下离心30min后，收集上清液。检测LOX活性和蛋白质浓度以计算筛选突变体的LOX活性增加。所有实验均进行三次重复实验。

(4)突变体筛选：根据前期的研究结果，构建了47个阳性候选突变体进行实验验证(图1A)。通过LOX活性测定发现，只有18个突变体的LOX酶活高于200U/ml(这18个突变体展示在图1B中)。随后，将其纯化测定突变体的比酶活性。其中，Tyr582Met的比酶活和催化效率分别提高了15％(图1B)和90％(表3)。

另外选取上述八种氨基酸(Pro141、Phe151、Ile159、Val165、Gly392、Ala639、Arg640和Arg641)构建饱和突变体文库(～160个突变体)，分别对其进行活性筛选，其中30个突变体在初筛过程中表现出较高的活性(图2A)。在第二次筛选后，30个突变体中有6个表现出比PaLOX更高的比酶活(图2B)，分别为突变体Pro141Cys、Phe151Lys、Phe151Arg、Phe151Ser、Ile159Asp和Ile159Lys，对应的比酶活分别为3.4U/mg，3.3U/mg，3.5U/mg，3.1U/mg，4.4U/mg，3.5U/mg，野生型的比酶活为2.8U/mg。

实施例3：突变体酶学性质分析

(1)最适反应温度

将溶有底物的缓冲液A分别在20-60℃的条件下孵育10min，在不同温度下测定LOX活性，以酶活最高者为100％。结果如图3A和3B所示，Phe151Lys、Phe151Ser和Ile159Asp的最佳反应温度为30℃，其他突变体和PaLOX(WT)的最佳反应温度约为25℃。

(2)热稳定性

重组LOX的热稳定性用30℃和50℃条件下酶活性的半衰期(t_1/2，min)来表示。将纯酶用缓冲液A稀释到蛋白浓度为100μg/ml并在不同温度下保温，间隔5min取样测定残余酶活，将残余酶活按照文献所述方式拟合并计算半衰期(t_1/2，min)。结果如图3C和3D所示，在50℃下孵育，突变体Ile159Lys的T_1/2比PaLOX的(WT)7min增加了4.6min，为11.6min，较野生型提高了165.7％(见表2)。

表2 PaLOX和突变体在50℃条件下的半衰期(t_1/2,min)

(3)LOX的动力学常数测定

用缓冲液A配制0.02-0.2mM不同浓度的亚油酸，在25℃条件下分别测定LOX催化不同浓度亚油酸生成氢过氧化物的速率，采用非线性回归拟合计算K_m和k_cat。与PaLOX(k_cat/K_m＝1.0×10⁵s^-1M^-1)相比，这些突变体的催化效率提高了1.4至9.2倍(见表3)。

表3 PaLOX和突变体的反应动力学参数

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种催化效率与热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体

<130> BAA211557A

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 658

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Ser Ile Phe Phe Ser Pro Leu Lys Tyr Leu Gly Ala Glu Gln Gln

1 5 10 15

Arg Ser Ile Asp Ala Ser Arg Ser Leu Leu Asp Asn Leu Ile Pro Pro

20 25 30

Ser Leu Pro Gln Tyr Asp Asn Leu Ala Gly Lys Leu Ala Arg Arg Ala

35 40 45

Val Leu Thr Ser Lys Lys Leu Val Tyr Val Trp Thr Glu Asn Phe Gly

50 55 60

Asn Val Lys Gly Val Pro Met Ala Arg Ser Val Pro Leu Gly Glu Leu

65 70 75 80

Pro Asn Val Asp Trp Leu Leu Lys Thr Ala Gly Val Ile Val Glu Leu

85 90 95

Ile Val Asn Phe Val Ala Ser Leu Pro Ala Ser Ala Ala Ala Gln Phe

100 105 110

Glu Arg Ile Ala Thr Gly Leu Ser Gly Asp Leu Glu Ala Ala Arg Gln

115 120 125

Val His Glu Ala Leu Leu Glu Glu Ala Lys Asn Asp Pro Ala Ala Ala

130 135 140

Gly Ser Leu Leu Leu Arg Phe Thr Glu Leu Gln Thr Arg Val Ile Ala

145 150 155 160

Ile Leu Thr Arg Val Gly Leu Leu Val Asp Asp Ile Leu Lys Ser Ala

165 170 175

Ser Asn Leu Val Gly Leu Asn Arg Phe Arg Ala Val Phe Gly Thr Leu

180 185 190

Arg Leu Pro Glu Val Ala Asp Ser Phe Arg Asp Asp Glu Ala Phe Ala

195 200 205

Tyr Trp Arg Val Ala Gly Pro Asn Pro Leu Leu Ile Arg Arg Val Asp

210 215 220

Ala Leu Pro Ala Asn Phe Pro Leu Gly Glu Glu Gln Phe Arg Arg Val

225 230 235 240

Met Gly Ala Asp Asp Ser Leu Leu Glu Ala Ala Ala Ser Arg Arg Leu

245 250 255

Tyr Leu Leu Asp Tyr Ala Glu Leu Gly Lys Leu Ala Pro Ser Gly Ala

260 265 270

Val Asp Lys Leu Leu Thr Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Ala Pro Ile Ala

275 280 285

Leu Phe Ala Leu Gly Lys Asp Arg Ala Arg Leu Leu Pro Val Ala Ile

290 295 300

Gln Cys Gly Gln Asp Pro Ala Thr His Pro Met Phe Val Arg Pro Ala

305 310 315 320

Glu Ser Glu Ser Asp Leu Tyr Trp Gly Trp Gln Met Ala Lys Thr Val

325 330 335

Val Gln Val Ala Glu Glu Asn Tyr His Glu Met Phe Val His Leu Ala

340 345 350

Gln Thr His Leu Val Ser Glu Ala Phe Cys Leu Ala Thr Gln Arg Thr

355 360 365

Leu Ala Pro Ser His Pro Leu His Val Leu Leu Ala Pro His Phe Glu

370 375 380

Gly Thr Leu Phe Ile Asn Glu Gly Ala Ala Arg Ile Leu Leu Pro Ser

385 390 395 400

Ala Gly Phe Ile Asp Val Met Phe Ala Ala Pro Ile Gln Asp Thr Gln

405 410 415

Ala Thr Ala Gly Gly Asn Arg Leu Gly Phe Asp Phe Tyr Arg Gly Met

420 425 430

Leu Pro Glu Ser Leu Lys Ala Arg Asn Val Asp Asp Pro Leu Ala Leu

435 440 445

Pro Asp Tyr Pro Tyr Arg Asp Asp Gly Leu Leu Val Trp Asn Ala Ile

450 455 460

Arg Gln Trp Ala Ala Asp Tyr Val Ala Val Tyr Tyr Ala Ser Asp Gly

465 470 475 480

Asp Val Thr Ala Asp Val Glu Leu Ala Ala Trp Val Gly Glu Val Ile

485 490 495

Gly Ser Gly Lys Val Ala Gly Phe Arg Pro Ile Thr Gly Arg Ser Gln

500 505 510

Leu Val Glu Val Leu Thr Met Val Ile Phe Thr Ala Ser Ala Gln His

515 520 525

Ala Ala Val Asn Phe Pro Gln Pro Ser Met Met Thr Tyr Ala Pro Ala

530 535 540

Ile Cys Ala Met Ser Ala Ala Pro Ala Pro Asp Ser Pro Ser Gly Lys

545 550 555 560

Ser Glu Ala Asp Trp Leu Lys Met Met Pro Pro Thr Leu Val Ala Leu

565 570 575

Glu Lys Val Asn Ile Tyr His Leu Leu Gly Ser Val Tyr His Gly Arg

580 585 590

Leu Gly Asp Tyr Arg Gln Thr Gly Phe Pro Tyr Ala Pro Val Phe Ser

595 600 605

Asp Arg Arg Val Thr Ala Ser Gly Gly Pro Leu Glu Arg Phe Gln Ala

610 615 620

Arg Leu Lys Glu Val Glu Ala Thr Ile Arg Thr Arg Asn Gln Ala Arg

625 630 635 640

Arg Arg Pro Tyr Glu Tyr Leu Leu Pro Ser Arg Ile Pro Ala Ser Thr

645 650 655

Asn Ile

<210> 2

<211> 1974

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gactcgatat tcttttcacc cttgaaatac ctcggggcgg aacaacagcg atctatcgat 60

gcctcgcgaa gtttgctgga caacctgatt ccgccgagtt tgccgcaata tgacaacctg 120

gccggaaagt tggcgcggcg tgcggtattg accagcaaga aactggtata tgtctggacc 180

gagaacttcg gcaatgtcaa aggcgtgccg atggcccgct cggtgccgct gggcgagttg 240

ccgaatgtcg actggctgtt gaagaccgcc ggggtgatcg tcgagctgat cgtcaatttc 300

gtcgcctcgt tgccggcgtc ggccgcagcg cagttcgagc ggatcgccac cgggctcagc 360

ggtgacctgg aggcggcgcg ccaggtccac gaggcgttgc tggaggaggc gaagaacgat 420

ccggccgcgg ccggcagcct gctgctgcgc ttcacggagt tgcagacgcg ggtgatcgcc 480

atactgacgc gggtcggcct gctggtcgac gatattctca agagcgccag caacctggtt 540

ggcctgaatc gcttccgcgc ggtgttcggc accctgcgcc tgccggaggt cgccgacagc 600

ttccgtgacg acgaagcgtt cgcctactgg cgggtggccg ggcctaatcc gctgctgatc 660

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atgggcgccg acgacagctt gctggaggcc gccgccagcc gccgcctgta tctgctggac 780

tacgccgagc tgggcaagct ggcgccgtcg ggagcggtgg acaaactgct caccgggacg 840

ggcttcgcct atgcgccgat cgccctgttc gcccttggca aggatcgggc gaggctattg 900

ccggtggcca tccagtgcgg tcaggacccc gctacccatc cgatgttcgt gcgtcccgcc 960

gagtcggaga gtgatctgta ctggggttgg cagatggcca agacggtggt ccaggtcgcc 1020

gaggagaact accacgagat gttcgtccac ctggcccaga cccacctggt gagcgaggcg 1080

ttctgcctgg ccacccagcg caccctggcg cccagccatc cgctgcacgt cctgctcgcc 1140

ccgcacttcg agggcaccct gttcatcaac gagggggcgg cgcgtatcct gttgcccagc 1200

gcgggcttca tcgacgtgat gttcgccgcg ccgatccagg acacccaggc caccgccggc 1260

ggcaatcggc tgggtttcga cttctaccgc ggcatgttgc cggagagcct gaaggcgcgg 1320

aacgtcgacg acccgctggc gctaccggac tacccctatc gcgacgacgg cctgctggta 1380

tggaatgcca tccgccagtg ggcggccgac tacgtggcgg tgtactacgc cagcgacggc 1440

gacgtcaccg ctgacgtcga actggcggcc tgggtcggcg aagtgatcgg cagcggcaag 1500

gtggccgggt tccgcccgat caccggtcgc agccaactgg tcgaggtgct gacgatggtg 1560

atcttcactg cctccgcgca acatgcggcg gtcaattttc cccagccttc gatgatgacc 1620

tacgcaccag ccatctgtgc catgagcgcg gcgccggcac cggactcgcc aagcggcaag 1680

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atctatcacc tgctcggttc ggtctaccac ggtcgcctgg gcgactaccg gcagaccggg 1800

ttcccctacg cgccggtgtt ttcggacagg cgggtgaccg ccagcggcgg cccgctggag 1860

cgcttccagg cacgcctgaa ggaggtcgag gcgaccattc gcacgcgcaa ccaggcgcgc 1920

cgcaggccct acgagtacct gttgccgagc cgtatcccgg cgagcaccaa tatc 1974

<210> 3

<211> 1974

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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cgcaggccct acgagtacct gttgccgagc cgtatcccgg cgagcaccaa tatc 1974

<210> 4

<211> 1974

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gactcgatat tcttttcacc cttgaaatac ctcggggcgg aacaacagcg atctatcgat 60

gcctcgcgaa gtttgctgga caacctgatt ccgccgagtt tgccgcaata tgacaacctg 120

gccggaaagt tggcgcggcg tgcggtattg accagcaaga aactggtata tgtctggacc 180

gagaacttcg gcaatgtcaa aggcgtgccg atggcccgct cggtgccgct gggcgagttg 240

ccgaatgtcg actggctgtt gaagaccgcc ggggtgatcg tcgagctgat cgtcaatttc 300

gtcgcctcgt tgccggcgtc ggccgcagcg cagttcgagc ggatcgccac cgggctcagc 360

ggtgacctgg aggcggcgcg ccaggtccac gaggcgttgc tggaggaggc gaagaacgat 420

ccggccgcgg ccggcagcct gctgctgcgc cgcacggagt tgcagacgcg ggtgatcgcc 480

atactgacgc gggtcggcct gctggtcgac gatattctca agagcgccag caacctggtt 540

ggcctgaatc gcttccgcgc ggtgttcggc accctgcgcc tgccggaggt cgccgacagc 600

ttccgtgacg acgaagcgtt cgcctactgg cgggtggccg ggcctaatcc gctgctgatc 660

cgtcgcgtcg atgcgctgcc ggccaacttt ccgctgggcg aggagcagtt ccgccgggtg 720

atgggcgccg acgacagctt gctggaggcc gccgccagcc gccgcctgta tctgctggac 780

tacgccgagc tgggcaagct ggcgccgtcg ggagcggtgg acaaactgct caccgggacg 840

ggcttcgcct atgcgccgat cgccctgttc gcccttggca aggatcgggc gaggctattg 900

ccggtggcca tccagtgcgg tcaggacccc gctacccatc cgatgttcgt gcgtcccgcc 960

gagtcggaga gtgatctgta ctggggttgg cagatggcca agacggtggt ccaggtcgcc 1020

gaggagaact accacgagat gttcgtccac ctggcccaga cccacctggt gagcgaggcg 1080

ttctgcctgg ccacccagcg caccctggcg cccagccatc cgctgcacgt cctgctcgcc 1140

ccgcacttcg agggcaccct gttcatcaac gagggggcgg cgcgtatcct gttgcccagc 1200

gcgggcttca tcgacgtgat gttcgccgcg ccgatccagg acacccaggc caccgccggc 1260

ggcaatcggc tgggtttcga cttctaccgc ggcatgttgc cggagagcct gaaggcgcgg 1320

aacgtcgacg acccgctggc gctaccggac tacccctatc gcgacgacgg cctgctggta 1380

tggaatgcca tccgccagtg ggcggccgac tacgtggcgg tgtactacgc cagcgacggc 1440

gacgtcaccg ctgacgtcga actggcggcc tgggtcggcg aagtgatcgg cagcggcaag 1500

gtggccgggt tccgcccgat caccggtcgc agccaactgg tcgaggtgct gacgatggtg 1560

atcttcactg cctccgcgca acatgcggcg gtcaattttc cccagccttc gatgatgacc 1620

tacgcaccag ccatctgtgc catgagcgcg gcgccggcac cggactcgcc aagcggcaag 1680

agcgaggccg attggttgaa gatgatgccg ccgaccctgg tggcgctgga gaaggtgaac 1740

atctatcacc tgctcggttc ggtctaccac ggtcgcctgg gcgactaccg gcagaccggg 1800

ttcccctacg cgccggtgtt ttcggacagg cgggtgaccg ccagcggcgg cccgctggag 1860

cgcttccagg cacgcctgaa ggaggtcgag gcgaccattc gcacgcgcaa ccaggcgcgc 1920

cgcaggccct acgagtacct gttgccgagc cgtatcccgg cgagcaccaa tatc 1974

<210> 5

<211> 1974

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gactcgatat tcttttcacc cttgaaatac ctcggggcgg aacaacagcg atctatcgat 60

gcctcgcgaa gtttgctgga caacctgatt ccgccgagtt tgccgcaata tgacaacctg 120

gccggaaagt tggcgcggcg tgcggtattg accagcaaga aactggtata tgtctggacc 180

gagaacttcg gcaatgtcaa aggcgtgccg atggcccgct cggtgccgct gggcgagttg 240

ccgaatgtcg actggctgtt gaagaccgcc ggggtgatcg tcgagctgat cgtcaatttc 300

gtcgcctcgt tgccggcgtc ggccgcagcg cagttcgagc ggatcgccac cgggctcagc 360

ggtgacctgg aggcggcgcg ccaggtccac gaggcgttgc tggaggaggc gaagaacgat 420

ccggccgcgg ccggcagcct gctgctgcgc tcgacggagt tgcagacgcg ggtgatcgcc 480

atactgacgc gggtcggcct gctggtcgac gatattctca agagcgccag caacctggtt 540

ggcctgaatc gcttccgcgc ggtgttcggc accctgcgcc tgccggaggt cgccgacagc 600

ttccgtgacg acgaagcgtt cgcctactgg cgggtggccg ggcctaatcc gctgctgatc 660

cgtcgcgtcg atgcgctgcc ggccaacttt ccgctgggcg aggagcagtt ccgccgggtg 720

atgggcgccg acgacagctt gctggaggcc gccgccagcc gccgcctgta tctgctggac 780

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atctatcacc tgctcggttc ggtctaccac ggtcgcctgg gcgactaccg gcagaccggg 1800

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<210> 6

<211> 1974

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gactcgatat tcttttcacc cttgaaatac ctcggggcgg aacaacagcg atctatcgat 60

gcctcgcgaa gtttgctgga caacctgatt ccgccgagtt tgccgcaata tgacaacctg 120

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gagaacttcg gcaatgtcaa aggcgtgccg atggcccgct cggtgccgct gggcgagttg 240

ccgaatgtcg actggctgtt gaagaccgcc ggggtgatcg tcgagctgat cgtcaatttc 300

gtcgcctcgt tgccggcgtc ggccgcagcg cagttcgagc ggatcgccac cgggctcagc 360

ggtgacctgg aggcggcgcg ccaggtccac gaggcgttgc tggaggaggc gaagaacgat 420

ccggccgcgg ccggcagcct gctgctgcgc aagacggagt tgcagacgcg ggtgatcgcc 480

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gagtcggaga gtgatctgta ctggggttgg cagatggcca agacggtggt ccaggtcgcc 1020

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aacgtcgacg acccgctggc gctaccggac tacccctatc gcgacgacgg cctgctggta 1380

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gacgtcaccg ctgacgtcga actggcggcc tgggtcggcg aagtgatcgg cagcggcaag 1500

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atcttcactg cctccgcgca acatgcggcg gtcaattttc cccagccttc gatgatgacc 1620

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<210> 7

<211> 1974

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gactcgatat tcttttcacc cttgaaatac ctcggggcgg aacaacagcg atctatcgat 60

gcctcgcgaa gtttgctgga caacctgatt ccgccgagtt tgccgcaata tgacaacctg 120

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gagaacttcg gcaatgtcaa aggcgtgccg atggcccgct cggtgccgct gggcgagttg 240

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agcgaggccg attggttgaa gatgatgccg ccgaccctgg tggcgctgga gaaggtgaac 1740

atctatcacc tgctcggttc ggtctaccac ggtcgcctgg gcgactaccg gcagaccggg 1800

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<210> 8

<211> 1974

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gactcgatat tcttttcacc cttgaaatac ctcggggcgg aacaacagcg atctatcgat 60

gcctcgcgaa gtttgctgga caacctgatt ccgccgagtt tgccgcaata tgacaacctg 120

gccggaaagt tggcgcggcg tgcggtattg accagcaaga aactggtata tgtctggacc 180

gagaacttcg gcaatgtcaa aggcgtgccg atggcccgct cggtgccgct gggcgagttg 240

ccgaatgtcg actggctgtt gaagaccgcc ggggtgatcg tcgagctgat cgtcaatttc 300

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ggcttcgcct atgcgccgat cgccctgttc gcccttggca aggatcgggc gaggctattg 900

ccggtggcca tccagtgcgg tcaggacccc gctacccatc cgatgttcgt gcgtcccgcc 960

gagtcggaga gtgatctgta ctggggttgg cagatggcca agacggtggt ccaggtcgcc 1020

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atctatcacc tgctcggttc ggtctaccac ggtcgcctgg gcgactaccg gcagaccggg 1800

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cgcttccagg cacgcctgaa ggaggtcgag gcgaccattc gcacgcgcaa ccaggcgcgc 1920

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<210> 9

<211> 1974

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gactcgatat tcttttcacc cttgaaatac ctcggggcgg aacaacagcg atctatcgat 60

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gccggaaagt tggcgcggcg tgcggtattg accagcaaga aactggtata tgtctggacc 180

gagaacttcg gcaatgtcaa aggcgtgccg atggcccgct cggtgccgct gggcgagttg 240

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gtcgcctcgt tgccggcgtc ggccgcagcg cagttcgagc ggatcgccac cgggctcagc 360

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atactgacgc gggtcggcct gctggtcgac gatattctca agagcgccag caacctggtt 540

ggcctgaatc gcttccgcgc ggtgttcggc accctgcgcc tgccggaggt cgccgacagc 600

ttccgtgacg acgaagcgtt cgcctactgg cgggtggccg ggcctaatcc gctgctgatc 660

cgtcgcgtcg atgcgctgcc ggccaacttt ccgctgggcg aggagcagtt ccgccgggtg 720

atgggcgccg acgacagctt gctggaggcc gccgccagcc gccgcctgta tctgctggac 780

tacgccgagc tgggcaagct ggcgccgtcg ggagcggtgg acaaactgct caccgggacg 840

ggcttcgcct atgcgccgat cgccctgttc gcccttggca aggatcgggc gaggctattg 900

ccggtggcca tccagtgcgg tcaggacccc gctacccatc cgatgttcgt gcgtcccgcc 960

gagtcggaga gtgatctgta ctggggttgg cagatggcca agacggtggt ccaggtcgcc 1020

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ggcaatcggc tgggtttcga cttctaccgc ggcatgttgc cggagagcct gaaggcgcgg 1320

aacgtcgacg acccgctggc gctaccggac tacccctatc gcgacgacgg cctgctggta 1380

tggaatgcca tccgccagtg ggcggccgac tacgtggcgg tgtactacgc cagcgacggc 1440

gacgtcaccg ctgacgtcga actggcggcc tgggtcggcg aagtgatcgg cagcggcaag 1500

gtggccgggt tccgcccgat caccggtcgc agccaactgg tcgaggtgct gacgatggtg 1560

atcttcactg cctccgcgca acatgcggcg gtcaattttc cccagccttc gatgatgacc 1620

tacgcaccag ccatctgtgc catgagcgcg gcgccggcac cggactcgcc aagcggcaag 1680

agcgaggccg attggttgaa gatgatgccg ccgaccctgg tggcgctgga gaaggtgaac 1740

atcatgcacc tgctcggttc ggtctaccac ggtcgcctgg gcgactaccg gcagaccggg 1800

ttcccctacg cgccggtgtt ttcggacagg cgggtgaccg ccagcggcgg cccgctggag 1860

cgcttccagg cacgcctgaa ggaggtcgag gcgaccattc gcacgcgcaa ccaggcgcgc 1920

cgcaggccct acgagtacct gttgccgagc cgtatcccgg cgagcaccaa tatc 1974

Claims (10)

1.脂肪氧合酶突变体，其特征在于，以氨基酸序列如SEQ ID NO.1序列为亲本，将亲本第141位、第151位、第159位或第582位发生突变。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，将第141位的脯氨酸取代为半胱氨酸；将第151位的苯丙氨酸取代为赖氨酸、精氨酸或丝氨酸；将第159位的异亮氨酸取代为赖氨酸或天冬氨酸；将第582位酪氨酸取代为甲硫氨酸。

3.编码权利要求1所述脂肪氧合酶突变体的基因。

4.含有权利要求3所述基因的重组质粒。

5.表达权利要求1或2所述突变体或含有权利要求4所述重组质粒的宿主细胞。

6.一种提高脂肪氧合酶性能的方法，其特征在于，对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪氧合酶进行改造，将其第141位、第151位、第159位或第582位发生突变；所述性能包括热稳定性、催化效率。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将第141位的脯氨酸突变为半胱氨酸；将第151位的苯丙氨酸突变为精氨酸、丝氨酸或赖氨酸；将第159位的异亮氨酸突变为天冬氨酸或赖氨酸；将第582位的酪氨酸突变为甲硫氨酸。

8.一种催化多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，以多不饱和脂肪酸为底物，利用权利要求1或2所述突变体为催化剂，在pH7.0～8.0、20～50℃反应。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述多不饱和脂肪酸包括但不限于亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸。

10.权利要求1或2所述突变体，或权利要求3所述基因，或权利要求5所述宿主细胞在催化多不饱和脂肪酸中的应用。

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