CN111073876B - 热稳定性提高的枯草芽孢杆菌脂肪酶a - Google Patents

热稳定性提高的枯草芽孢杆菌脂肪酶a Download PDF

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Abstract

本发明公开了热稳定性提高的枯草芽孢杆菌脂肪酶A，属于酶工程技术领域。本发明对现有的枯草芽孢杆菌脂肪酶A进行改造，基于结构分析和定点突变，利用多重计算设计策略，有效提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A的热稳定性，如六位点突变体F17A/V74I/L114P/I135V/M137A/I157L的解折叠温度升高了7.43℃，T50升高了8.4℃，t1/2升高了18.2min；四位点突变体F17A/L114P/M137A/I157L的解折叠温度升高了7.30℃，T50升高了5.9℃，t1/2升高了14.8min。

Description

热稳定性提高的枯草芽孢杆菌脂肪酶A
技术领域
本发明涉及热稳定性提高的枯草芽孢杆菌脂肪酶A，属于酶工程技术领域。
背景技术
脂肪酶是一类催化长链甘油三酯水解的酶，是生物技术应用中最重要的一类生物催化剂，在洗涤剂、造纸、食品、酯类和氨基酸衍生物的生物催化拆分等方面具有广泛的应用，但天然酶分子结构大多不稳定，难以满足工业应用过程中对耐高温的要求。枯草芽孢杆菌脂肪酶A对碱性pH具有很强的耐受性，能够水解具有sn-1和sn-2甘油酯的长脂肪链，对中等长度(C8)的脂肪酸链具有最高的催化活性，在生物柴油和洗涤剂方面具有很大的应用潜力，但野生型枯草芽孢杆菌脂肪酶A的热稳定性低，难以满足工业应用的需求，因此需要对其进行热稳定性提高的改造。
定向进化通过建立突变体文库与高通量筛选方法，是目前蛋白质工程最为常用的蛋白设计改造策略。该策略通过位点饱和突变、易错PCR、DNA重组等技术对酶进行随机突变，在特定的条件下进行筛选，从而获得符合要求的突变体，但这一策略需要经过多轮的突变和筛选，且对筛选的手段很高，耗时耗力。近年来，随着结构生物学和人工智能的发展，利用计算机辅助蛋白质设计改造得到了越来越多的关注和发展。该策略基于结构模拟和能量计算对酶进行设计，选择合适的突变位点对酶进行定点突变，具有更强的目的性、更加高效、快捷。枯草芽孢杆菌脂肪酶由181个氨基酸残基组成，是目前已知三个分子量最小的脂肪酶之一，并且其晶体结构已被解析，结构简单、为典型的α/β水解酶折叠域结构，由中心的六条平行β链组成的β片层，及两侧五个α螺旋包围构成，不包含大多数脂肪酶具有的盖子结构，是少数在油水界面存在时不显示界面激活效应的脂肪酶之一，是作为蛋白计算设计的理想模式蛋白。
发明内容
技术问题：
为了解决上述问题，本发明通过多重计算设计策略改造枯草芽孢杆菌脂肪酶A，先获得热稳定性提高的单点突变体，再经过组合突变进一步提高其热稳定性，该策略能有效指导酶的定向进化，大幅度提高改造效率。
技术方案：
本发明结合提高蛋白核心填充、分析蛋白表面溶剂接触面积和蛋白保守性分析对枯草芽孢杆菌脂肪酶A进行突变位点的计算设计及分析，从而提高酶的热稳定性。
本发明的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第17位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，和/或，将第74位的缬氨酸突变为异亮氨酸，和/或，将第114位的亮氨酸突变为脯氨酸，和/或，将第135的异亮氨酸突变为缬氨酸，和/或，将第137位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，和/或，将第157位的异亮氨酸突变为亮氨酸。
在本发明的一种实施方式中，编码所述亲本酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，经密码子优化后，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二个目的是提供编码上述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体包括F17A，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第17位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；所述F17A的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码所述F17A的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体包括V74I，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第74位的缬氨酸突变为异亮氨酸；所述V74I的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码所述V74I的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体包括L114P，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第114位的亮氨酸突变为脯氨酸；所述L114P的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码所述L114P的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体包括I135V，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第135的异亮氨酸突变为缬氨酸；所述I135V的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码所述I135V的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体包括M137A，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第137位的甲硫氨酸突变为丙氨酸；所述M137A的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，编码所述M137A的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体包括I157L，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第157位的异亮氨酸突变为亮氨酸；所述I157L的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，编码所述I157L的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体包括F17A/V74I，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第17位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，并将第74位的缬氨酸突变为异亮氨酸；所述F17A/V74I的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，编码所述F17A/V74I的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体包括F17A/L114P，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第17位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，并将第114位的亮氨酸突变为脯氨酸；所述F17A/L114P的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，编码所述F17A/L114P的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体包括V74I/L114P，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第74位的缬氨酸突变为异亮氨酸，并将第114位的亮氨酸突变为脯氨酸；所述V74I/L114P的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，编码所述V74I/L114P的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体包括F17A/V74I/L114P，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第17位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，第74位的缬氨酸突变为异亮氨酸，并将第114位的亮氨酸突变为脯氨酸；所述F17A/V74I/L114P的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，编码所述F17A/V74I/L114P的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体包括I135V/I157L，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第135的异亮氨酸突变为缬氨酸，并将第157位的异亮氨酸突变为亮氨酸；所述I135V/I157L的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，编码所述I135V/I157L的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体包括M137A/I157L，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第137位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，并将第157位的异亮氨酸突变为亮氨酸；所述M137A/I157L的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，编码所述M137A/I157L的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.26所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体包括I135V/M137A，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第135的异亮氨酸突变为缬氨酸，并将第137位的甲硫氨酸突变为丙氨酸；所述I135V/M137A的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，编码所述I135V/M137A的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体包括I135V/M137A/I157L，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第135的异亮氨酸突变为缬氨酸，第137位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，并将第157位的异亮氨酸突变为亮氨酸；所述I135V/M137A/I157L的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示，编码所述I135V/M137A/I157L的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体包括F17A/V74I/L114P/I135V/M137A/I157L，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第17位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，第74位的缬氨酸突变为异亮氨酸，第114位的亮氨酸突变为脯氨酸，第135的异亮氨酸突变为缬氨酸，第137位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，并将第157位的异亮氨酸突变为亮氨酸；所述F17A/V74I/L114P/I135V/M137A/I157L的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示，编码所述F17A/V74I/L114P/I135V/M137A/I157L的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体包括F17A/L114P/M137A/I157L，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第17位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，第114位的亮氨酸突变为脯氨酸，第137位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，并将第157位的异亮氨酸突变为亮氨酸；所述F17A/L114P/M137A/I157L的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示，编码所述F17A/L114P/M137A/I157L的基因的核苷酸序列如SEQID NO.34所示。
本发明的第三个目的是提供含上述基因的质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述质粒包括pET系列质粒。
本发明的第四个目的是提供表达上述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的宿主包括大肠杆菌。
本发明的第五个目的是提供一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A的方法，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将第17位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，和/或，将第74位的缬氨酸突变为异亮氨酸，和/或，将第114位的亮氨酸突变为脯氨酸，和/或，将第135的异亮氨酸突变为缬氨酸，和/或，将第137位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，和/或，第157位的异亮氨酸突变为亮氨酸。
本发明的第六个目的是提供一种生产枯草芽孢杆菌脂肪酶A的方法，是以上述基因工程菌为生产菌株，诱导发酵生产枯草芽孢杆菌脂肪酶A。
在本发明的一种实施方式中，向OD600为0.6-0.8的生产菌株培养物中，加入IPTG，20-30℃，200-220rpm诱导发酵8-20h。
本发明还提供上述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体在食品、化工或制药领域的应用。
本发明的有益效果：
本发明对现有的枯草芽孢杆菌脂肪酶A进行改造，基于结构分析和定点突变，利用多重计算设计策略，有效提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A的热稳定性。六位点突变体F17A/V74I/L114P/I135V/M137A/I157L的解折叠温度升高了7.43℃，T50由51.2℃升高为59.6℃，升高了8.4℃，t1/2由原来的2.5min升高为20.7min，升高了18.2min，但酶活只有亲本酶的44.8％，热稳定性提高最大，酶活损失严重；而四位点突变体F17A/L114P/M137A/I157L的解折叠温度升高了7.30℃，T50由51.2℃升高为57.1℃，升高了5.9℃，t1/2由原来的2.5min升高为17.3min，升高了14.8min，酶活为亲本酶的99.7％，热稳定性提高程度与六位点突变体相当，酶活损失少。
附图说明
图1为F17A/V74I/L114P/I135V/M137A/I157L突变体的三维立体结构。
图2为定点突变所采用的引物。
图3为亲本酶与突变体的酶活及热稳定性的检测结果比较。
具体实施方式
酶活测定：于1mL离心管中先加入450μL，pH＝8.0的蛋白缓冲液，再添加25μL 20％的TritonX-100，震荡混匀后加入25μL 50mM的pNPC(p-Nitrophenyl octanoate)溶液，充分混匀后超声2min分装190μL至96孔板中，先于40℃酶标仪中孵育20min，加入10μL酶液反应2min，测定410nm处的吸光值。测酶活所用的酶液都经过纯化脱盐后稀释至0.06±0.02mg/mL。
酶活定义：40℃，pH＝8.0，每分钟水解pNPC生成1μmol pNP(p-Nitrophenol)所需的酶量。
热稳定性测定：
解折叠温度Tm的测定：将纯化脱盐后的样品酶浓度均调节至0.16±0.03mg/mL，取200μL用于圆二色谱仪测定全波长扫描及热变。于190～280nm进行全波长扫描，取220nm作为热变吸光值的测定波长，热变温度范围为20～80℃，升温梯度为1℃/min。
热半失活温度T50的测定：将纯化脱盐的酶液分别于30～60℃(间隔5℃)孵育10min后取出于冰上放置10min，测定其残余酶活。酶浓度与酶活测定中的一致。
热半失活时间t1/2的测定：将纯化脱盐的酶液于55℃分别孵育0～30min(间隔5℃)，取出于冰上放置10min，测定其残余酶活。
实施例1枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体的制备
本发明采用多重计算设计策略，利用Rosetta-VIP对枯草芽孢杆菌脂肪酶A(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)的包装和空腔进行鉴定和分析，结合蛋白可及表面积和进化保守性分析选择合理的突变，选取第17、74、114、135、137、157位进行单独或组合突变(F17A/V74I/L114P/I135V/M137A/I157L突变体的三维立体结构如图1所示)，以期提高酶的热稳定性。
以下将详述本发明改造枯草芽孢杆菌脂肪酶A的方法及其所得到的热稳定性提高的枯草芽孢杆菌脂肪酶A。
大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株及表达载体pET-28a(+)购于Novagen公司；枯草芽孢杆菌脂肪酶A基因bsl由苏州金唯智有限公司合成，合成的基因序列如SEQ ID NO.2所示；利用限制性内切酶Nco I和Hind III双酶切载体pET-28a(+)和基因bsl，胶回收后，加入T4 DNA Ligase于16℃进行过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a-bsl，通过质粒提取获得表达质粒pET28a-bsl。
利用全质粒PCR以表达质粒pET28a-bsl为模板进行聚合酶链式反应，所用的引物参见图2。首先利用PrimeSTAR HS(premix)高保真PCR酶以质粒pET28a-bsl为模板进行全质粒PCR，将PCR产物回收后用T4 Polynucleotide Kinase进行磷酸化处理，70℃处理10min使T4 Polynucleotide Kinase失活后加入T4 DNA Ligase于16℃进行过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，同时用卡那霉素进行初步筛选，通过质粒测序确认基因突变成功。
挑取阳性转化子至含有100μg/mL卡那霉素的20mL LB培养基中置于37℃，220rpm摇床培养10h后，用15％甘油保藏菌株存于-80℃冰箱。
单位点突变体的构建以质粒pET28a-bsl为模板，双位点突变体是以突变成功的单位点突变体的质粒为模板再进行下一个位点的突变，三位点突变体是以突变成功的双位点突变体的质粒为模板再进行下一个位点的突变，四位点突变体是以突变成功的双位点突变体的质粒为模板在进行另外两个位点的突变体，六位点突变体是以突变成功的三点突变为模板进行其他三个位点的突变。
实施例2枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体的表达纯化
将甘油保存的Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a-bsl及其突变菌株平板划线于含卡那霉素的固体LB平板，倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养(8-14h)，挑取单菌落至20mL LB液体培养基中，置于37℃，220rpm摇床培养9h，按1％接种量接种至100mL TB培养基中，置于37℃，220rpm摇床培养至OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为1mM的IPTG，放入25℃，220rpm诱导发酵10h。7000rpm离心10min收集发酵菌体，加入30mL菌体重悬液重悬菌体，超声破碎15min后，4℃，10000rpm离心20min收集破壁上清，经0.45μm膜过滤后上样至蛋白纯化仪进行Ni2+柱亲和层析纯化：先用A液(20mM PBS，含1mM的NaCl，20mM的咪唑)平衡HisTrapHP 1ml Ni2+亲和层析柱15个柱体积，再将破壁上清以1mL/min的流速上样，上样结束后，用10％的B液(20mM PBS，含1M的NaCl，500mM的咪唑)进行梯度洗脱除去杂蛋白，再用10％～100％的B液进行线性洗脱获得目的蛋白，用HiTripTM 5mL Desalting凝胶柱对目的蛋白进行脱盐处理，并更换至pH＝8.0的50mM的磷酸钠缓冲液中，最后用超滤管将目的蛋白浓缩至浓度为0.2mg/mL。
实施例3枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体的热稳定性测定
图3为亲本酶及突变体之间的酶活及热稳定性实验结果比较，将纯化后的野生型(亲本酶)及突变型酶蛋白在相同蛋白浓度的条件下，进行热稳定性及酶活测定。
由图3可知，突变体F17A、V74I、L114P、I135V、M137A、I157L、I135V/I157L、M137A/I157L、I135V/M137A、I135V/M137A/I157L、F17A/V74I、F17A/L114P、V74I/L114P、F17A/V74I/L114P、F17A/V74I/L114P/I135V/M137A/I157L、F17A/L114P/M137A/I157L的解折叠温度，即酶结构降解一半时的温度(Tm，melting temperature)均有所升高，单位点突变体F17A、V74I、L114P、I135V、M137A、I157L的Tm分别升高了2.24℃、0.49℃、0.78℃、1.13℃、3.18℃、0.78℃；双位点突变体I135V/I157L、M137A/I157L、I135V/M137A、F17A/V74I、F17A/L114P、V74I/L114P分别升高了2.65℃、3.43℃、4.04℃、4.03℃、2.86℃、2.86℃；三位点突变体I1335V/M137A/I157L、F17A/V74I/L114P分别升高了5.13℃和4.82℃；四位点突变体F17A/L114P/M137A/I157L升高了7.30℃；六位点突变体F17A/V74I/L114P/I135V/M137A/I157L升高了7.43℃。
单位点突变体F17A、V74I、L114P、I135V、M137A、I157L的热半失活温度T50，即在相同时间内，酶活降低为原始酶活50％对应的温度分别由51.2℃升高为52.2℃、52.5℃、52.7℃、52.7℃、52.0℃、52.5℃，升高了1.0℃、1.3℃、1.5℃、1.5℃、0.8℃、1.3℃；双位点突变体I135V/I157L、M137A/I157L、I135V/M137A、F17A/V74I、F17A/L114P、V74I/L114P的T50分别由51.2℃升高为52.2℃、52.9℃、53.1℃、54.4℃、53.0℃、52.0℃，升高了1℃、1.7℃、1.9℃、3.2℃、1.8℃、0.8℃；三位点突变体I135V/M137A/I157L、F17A/V74I/L114P的T50分别由51.2℃升高为52.9℃、53.1℃，升高了1.7℃、1.9℃；四位点突变体F17A/L114P/M137A/I157L由51.2℃升高为57.1℃，升高了5.9℃；六位点突变体F17A/V74I/L114P/I135V/M137A/I157L的T50由51.2℃升高为59.6℃，升高了8.4℃。
单位点突变体F17A、V74I、L114P、I135V、M137A、I157L的热半失活时间t1/2，即在55℃处理不同时间的酶活降低为原始酶活50％所需要的时长，只有F17A和M137A有所升高，分别由原来的2.5min升高为2.9min、3.7min，升高了0.4min、1.2min；双位点突变体I135V/I157L、M137A/I157L、I135V/M137A、F17A/V74I、F17A/L114P、V74I/L114P的t1/2由原来的2.5min升高为3.4min、6.3min、9.5min、9.8min、5.7min、5.2min，升高了0.9min、3.8min、7min、7.3min、3.2min、2.7min；三位点突变体I135V/M137A/I157L、F17A/V74I/L114P分别由原来的2.5min升高为12.8min、12.0min，升高了10.3min、9.5min；四位点突变体F17A/L114P/M137A/I157L由原来的2.5min升高为17.3min，升高了14.8min；六位点突变体F17A/V74I/L114P/I135V/M137A/I157L的t1/2由原来的2.5min升高为20.7min，升高了18.2min。
单位点突变体F17A、V74I、L114P、I135V、M137A、I157L的酶活分别为野生型(野生型酶活为9.24U/mg)的94％、93.5％、122.0％、73.8％、102.5％、105.8％，除I135V外均能保持较高的酶活；双位点突变体I135V/I157L、M137A/I157L、I135V/M137A、F17A/V74I、F17A/L114P、V74I/L114P的酶活分别为野生型的48.7％、87.1％、44.8％、60.7％、95.6％、86.0％，M137A/I157L、F17A/L114P能保持较高的酶活；三位点突变体I135V/M137A/I157L、F17A/V74I/L114P的酶活分别为野生型的35.5％、57.0％，酶活损失严重；四位点突变体F17A/L114P/M137A/I157L的酶活为野生型的99.7％，酶活与野生型相当；六位点突变体的酶活为野生型的44.8％，酶活损失严重。
综上所述，突变体F17A、V74I、L114P、I135V、M137A、I157L、I135V/I157L、M137A/I157L、I135V/M137A、I135V/M137A/I157L、F17A/V74I、F17A/L114P、V74I/L114P、F17A/V74I/L114P、F17A/V74I/L114P/I135V/M137A/I157L、F17A/L114P/M137A/I157L与亲本酶相比，热稳定性都得到了提高。
对比例1
以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将19位的苯丙氨酸突变为色氨酸，其余同实施例中一致。
结果显示，突变体F19W的Tm值降低了1.82℃，热稳定性降低。
对比例2
以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将58位的苯丙氨酸突变为异亮氨酸，其余同实施例中一致。
结果显示，突变体F58I的Tm值降低了4.30℃，热稳定性大幅度降低。
对比例3
以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将58位的苯丙氨酸突变为亮氨酸，其余同实施例中一致。
结果显示，突变体F58I的Tm值降低了4.00℃，热稳定性大幅度降低。
对比例4
以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将59位的缬氨酸突变为异亮氨酸，其余同实施例中一致。
结果显示，突变体V59I的Tm值降低了1.21℃，热稳定性降低。
对比例5
以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将78位的甲硫氨酸突变为色氨酸，其余同实施例中一致。
结果显示，突变体M78W的Tm值降低了1.97℃，热稳定性降低，且酶活降低为野生型11.8％，酶活损失严重。
对比例6
以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将102位的亮氨酸突变为异亮氨酸，其余同实施例中一致。
结果显示，突变体L102I的Tm值降低了0.52℃，热稳定性降低。
对比例7
以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将20位的丙氨酸突变为异亮氨酸，其余同实施例中一致。
结果显示，突变体A20I的Tm值降低了1.08℃，热稳定性降低。
对比例8
以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将42位的色氨酸突变为亮氨酸，其余同实施例中一致。
结果显示，突变体W42L的Tm值降低了1.53℃，热稳定性降低。
对比例9
以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，将134位的甲硫氨酸突变为亮氨酸，其余同实施例中一致。
结果显示，突变体M134L的Tm值降低了1.27℃，热稳定性降低。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 热稳定性提高的枯草芽孢杆菌脂肪酶A
<160> 47
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 543
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis (strain 168)
<400> 1
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ggaattaaga gctatctcgt atctcagggc tggtcgcggg acaagctgta tgcagttgat 120
ttttgggaca agacaggcac aaattataac aatggaccgg tattatcacg atttgtgcaa 180
aaggttttag atgaaacggg tgcgaaaaaa gtggatattg tcgctcacag catggggggc 240
gcgaacacac tttactacat aaaaaatctg gacggcggaa ataaagttgc aaacgtcgtg 300
acgcttggcg gcgcgaaccg tttgacgaca ggcaaggcgc ttccgggaac agatccaaat 360
caaaagattt tatacacatc catttacagc agtgccgata tgattgtcat gaattactta 420
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tacagcagcc aagtcaacag cctgattaaa gaagggctga acggcggggg ccagaatacg 540
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aaagttctgg acgaaaccgg tgctaaaaaa gttgacatcg ttgctcactc tatgggtggt 240
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Gly Ala Arg Asn Val Gln Ile His Gly Val Gly His Leu Gly Leu Leu
145 150 155 160
Tyr Ser Ser Gln Val Asn Ser Leu Ile Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly
165 170 175
Gly Gln Asn Thr Asn
180
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
tggtgcttct gcaaacttcg ctg 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ccgataccgt gaaccataac aac 23
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gttgacatca ttgctcactc tat 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tttttttagc accggtttcg tcc 23
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ggtaaagctc cgccgggtac cga 23
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
ggtggtcaga cggttagcac 20
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
tgctgacatg gttgttatga act 23
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
gaagagtaga tagaggtgta cag 23
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tgatcgttgc aaactacctg tct 23
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
tgtcagcaga agagtagata gag 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
cggtgttggt cacctgggtc tgc 23
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
tggatctgaa cgttacgagc acc 23

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体，其特征在于，以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，进行了（a）~（d）任一改造：
（a）将第137位的甲硫氨酸突变为丙氨酸；
（b）将第137位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，并将第157位的异亮氨酸突变为亮氨酸；
（c）将第17位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，第114位的亮氨酸突变为脯氨酸，第137位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，并将第157位的异亮氨酸突变为亮氨酸；
（d）将第17位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，第74位的缬氨酸突变为异亮氨酸，第114位的亮氨酸突变为脯氨酸，第135的异亮氨酸突变为缬氨酸，第137位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，并将第157位的异亮氨酸突变为亮氨酸。
2.编码权利要求1所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体的基因。
3.含权利要求2所述的基因的质粒。
4.如权利要求3所述的质粒，其特征在于，所述质粒包括pET系列质粒。
5.表达权利要求1所述枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体的基因工程菌。
6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主包括大肠杆菌。
7.一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的方法，其特征在于，以氨基酸序列如SEQID NO.3所示的枯草芽孢杆菌脂肪酶A为亲本酶，进行（a）~（d）任一改造：
（a）将第137位的甲硫氨酸突变为丙氨酸；
（b）将第137位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，并将第157位的异亮氨酸突变为亮氨酸；
（c）将第17位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，第114位的亮氨酸突变为脯氨酸，第137位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，并将第157位的异亮氨酸突变为亮氨酸；
（d）将第17位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，第74位的缬氨酸突变为异亮氨酸，第114位的亮氨酸突变为脯氨酸，第135的异亮氨酸突变为缬氨酸，第137位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，并将第157位的异亮氨酸突变为亮氨酸。
8.一种生产枯草芽孢杆菌脂肪酶A的方法，其特征在于，以权利要求5或6所述的基因工程菌为生产菌株，诱导发酵生产枯草芽孢杆菌脂肪酶A。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，向OD600为0.6-0.8的生产菌株培养物中，加入IPTG，20-30℃，200-220 rpm诱导发酵8-20 h。
10.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体在食品、化工或制药领域的应用。
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