CN108642025A

CN108642025A - 一种酶活及位置选择性提高的脂肪酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN108642025A
Application number: CN201810472002.9A
Authority: CN
Inventors: 喻晓蔚; 徐岩
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Wuxi Youpuke Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2018-05-17
Publication date: 2018-10-12
Anticipated expiration: 2038-05-17
Also published as: CN108642025B

Abstract

本发明公开了一种酶活及位置选择性提高的脂肪酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明对野生型脂肪酶进行突变，突变体M8A，L10A，D11A，L12A，P17G的比酶活较野生型酶活提高了1.1‑2.4倍，突变体M8A、L10A、T9A的1,3‑位置选择性较野生型提高了4.75‑5倍。酶活及位置选择性是脂肪酶在结构脂质催化应用中的重要参数，本发明将突变体在人乳脂替代品的催化反应中进行了应用，取得了显著的效果。

Description

一种酶活及位置选择性提高的脂肪酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种酶活及位置选择性提高的脂肪酶突变体及其应用，尤其是基于“界面活性”分子设计的酶活及位置选择性提高的脂肪酶突变体，属于基因工程技术领域。

背景技术

甘油三酯(triacylglycerols，TAGs)是由一个甘油分子与三个脂肪酸分子缩合而成的，占食用油成分的95％以上。TAGs中脂肪酸组成、碳链长短和饱和度影响着其物化及营养学性质，因此，研究TAGs的结构、物化性质及其对人体健康的影响一直是油脂科学家关注的重点。研究表明，脂肪酸在TAGs中的酰化位置分布对油脂的氧化稳定性、熔点、凝固点及其营养价值有着非常重要的影响。结构脂质通过改变脂肪酸在三酰甘油骨架上的组成及位置分布，将具有特殊营养或生理功能的脂肪酸结合到特定位置，最大限度的发挥脂肪酸的营养价值和生理功能，作为一类新型的功能脂质，在油脂深加工领域得到了广泛关注。

目前，工业上生产合成结构脂质主要采用化学催化法和酶催化法。化学法一般是以碱金属为催化剂，由于价格便宜、工艺成熟，容易实现大规模生产。但化学法的反应有随机性，反应产物无特异性、位置选择性较差，导致产物副产物多，收率低。与化学法相比，酶法制备技术通过酶的1,3-位置选择性对产品实现精确控制，将所需要的特殊脂肪酸结合到三酰甘油中的特定位置。而且酶法反应条件温和、绿色环保、减少了反应副产物，能够满足人类在医疗和营养保健方面的需要，具有广阔的前景。

脂肪酶(全称Triacylglycerol acylhydrolase,Lipase EC3.1.1.3)，即甘油三酯水解酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，可以催化酯化、醇解、氨解、转酯化和脂类的逆向合成等反应。微生物来源的脂肪酶具有催化温度广、转化效率高、底物专一性强、副产物少等优点，因而被广泛应用于油脂加工、化学、食品、制药和日化等工业领域。

但目前已有的脂肪酶大多为商业化脂肪酶，存在成本高的问题，并且脂肪酶存在活性低、位置选择性差的问题，需要进一步提高活力及位置选择性来提高HMFS的产率。

发明内容

本发明提供了一种脂肪酶突变体，将来源于华根霉的脂肪酶的第8位的甲硫氨酸替换为丙氨酸，或者将第9位的苏氨酸替换为丙氨酸，或者将第10位的亮氨酸替换为丙氨酸，或者将第11位的天冬氨酸替换为丙氨酸，或者将第12位的亮氨酸替换为丙氨酸，或者将第17位的脯氨酸替换为甘氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述来源于华根霉的脂肪酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶突变体优选为将来源于华根霉的脂肪酶的第8位的甲硫氨酸替换为丙氨酸，或者将第9位的苏氨酸替换为丙氨酸，或者将第10位的亮氨酸替换为丙氨酸。

本发明还提供编码所述脂肪酶突变体的基因。

本发明还提供携带所述基因的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pPIC9，pPIC3.5K，pPIC9K，PAO815、pPICZα。

本发明还提供携带所述基因的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞为细菌或真菌细胞。

本发明提供的脂肪酶突变体可用于功能油脂、食品、保健品、医药等领域。

本发明的有益效果：

本发明对野生型脂肪酶进行突变，突变体M8A，L10A，D11A，L12A，P17G的比酶活较野生型酶活提高了1.1-2.4倍，突变体M8A、L10A、T9A的1,3-位置选择性较野生型提高了4.75-5倍。酶活及位置选择性是脂肪酶在结构脂质催化应用中的重要参数，本发明将突变体在人乳脂替代品的催化反应中进行了应用，取得了显著的效果。

附图说明

图1为各个RCL突变体相对野生酶的比酶活；

图2为各个RCL突变体的1,3-位置选择性。

具体实施方式

酶活测定方法：

底物A：0.25g阿拉伯胶、0.52g脱氧胆酸钠溶于50mM pH 8.磷酸钾缓冲并定容至450mL；底物B：0.015g对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)溶于5mL异丙醇。终止液(g·L^-1)：NaOH40g，EDTA钠盐93.05g。

将底物A与底物B以体积比9：1混合，共2.4mL，加入100μL适当稀释的酶液(以灭活的酶液为空白对照)，40℃反应2min，加入62μL终止液。测定产物在410nm处的吸光度。酶活定义为40℃条件下每分钟产生1μmol pNP所需酶量。按照酶活(U·mL^-1)＝(V×A₄₁₀×10⁶)/(ε×t×V’)公式进行计算，其中V表示反应体积(mL)；t表示反应时间(min)；ε表示摩尔消光系数(mL·mM^-1)；V’表示酶液体积(mL)。

实施例1：脂肪酶突变体的构建

通过对脂肪酶前导肽与主体蛋白结构之间相互作用的分析，分别确定关键位点：与盖子有相互作用的E3、V5、D11，与活性中心有相互作用或距离较近的M8、T9、L12、P17，与盖子和活性中心都有相互作用的L10以及与主体蛋白有相互作用但是距离活性中心较远的T22。根据脂肪酶前导肽氨基酸与主体蛋白之间的相互作用，设计突变。引物设计如下：

表1前导肽突变引物

利用点突变试剂盒(Lightning Site Directed Mutagenesis Kit,Stratagene,Agilent technologies,La Jolla,CA,USA)以MBP-proRCL质粒(沙冲，博士学位论文，江南大学，2015年)为模板进行全质粒PCR，并热激转化大肠杆菌JM109感受态，构建JM109 MBP-proRCLE3A，JM109 MBP-proRCL V5A，JM109 MBP-proRCL M8A，JM109 MBP-proRCL T9A，JM109 MBP-proRCL L10A，JM109 MBP-proRCL D11A，JM109 MBP-proRCL L12A，JM109 MBP-proRCL P17G，JM109 MBP-proRCL T22D，测序正确后提取质粒转化大肠杆菌BL21 trxB(DE3)，构建携带编码突变体的基因的重组菌：BL21 trxB(DE3)MBP-proRCL E3A，BL21 trxB(DE3)MBP-proRCL V5A，BL21 trxB(DE3)MBP-proRCL M8A，BL21 trxB(DE3)MBP-proRCL T9A，BL21 trxB(DE3)MBP-proRCL L10A，BL21 trxB(DE3)MBP-proRCL D11A，BL21trxB(DE3)MBP-proRCL L12A，BL21 trxB(DE3)MBP-proRCL P17G，BL21 trxB(DE3)MBP-proRCL T22D。

实施例2：脂肪酶突变体的表达纯化

突变体E3A,V5A,M8A,T9A,L10A,D11A,L12A,P17G,T22D的表达纯化方法：

(1)表达纯化条件优化：在LB固体培养基上挑取携带有突变体基因重组质粒的大肠杆菌E.coli BL21trxB(DE3)单菌落，接种500μL LB液体培养基(含100μg·mL^-1氨苄青霉素抗生素及50μg·mL^-1卡那霉素抗生素)37℃，200rpm培养4-6h。取10μL接种10mL液体LB培养基，37℃，200rpm培养过夜。将10mL液体LB培养基全部转移至含200mL液体LB培养基中37℃，200rpm培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8，分别取20mL至17℃、29℃、37℃加入1mM IPTG，分别诱导过夜、6h及4h。收集1L发酵液，于6000rpm，离心30min收集细胞，将收集得到的细胞重悬于25mL镍柱结合缓冲液中，并置于冰水混合物中。超声破碎条件：工作30s，停顿30s，总计20min。将经过破碎处理后的混合物，于12,000rpm离心45min后，上清液过0.22μm滤膜过滤。将经过膜过滤之后得到的上清液上样SDS-PAGE进行检测。结果表明，17℃、过夜诱导是较佳的表达条件。

(2)表达纯化突变体：在LB固体培养基上挑取含重组质粒的大肠杆菌E.coliBL21trxB(DE3)单菌落，接种500μL LB液体培养基(含100μg·mL^-1氨苄青霉素抗生素及50μg·mL^-1卡那霉素抗生素)37℃，200rpm培养4-6h。取50μL接种50mL液体LB培养基，37℃，200rpm培养过夜。将50mL液体LB培养基全部转移至含950mL液体LB培养基的2L摇瓶中37℃，200rpm培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8，在加入1mM IPTG诱导，于17℃过夜诱导培养。收集1L发酵液，于6000rpm，离心30min收集细胞，将收集得到的细胞重悬于25mL镍柱结合缓冲液中，并置于冰水混合物中。超声破碎条件：工作30s，停顿30s，总计20min。将经过破碎处理后的混合物，于12,000rpm离心45min后，上清液过0.22μm滤膜过滤。将过滤后的样品上样经镍柱结合缓冲液预先平衡过5mL HisTrap HP镍柱，然后采用5倍柱体积的100％镍柱洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，用系统自动收集洗脱峰，并贮存于系统内部的贮存环。然后，系统自动进样至经低盐缓冲液平衡过的Superdex 200 26/600凝胶层析柱，然后对目的蛋白进行洗脱，并采用96孔板收集A₂₈₀洗脱峰。利用SDS-PAGE检测目标蛋白。将纯化后收集的含有目的蛋白的洗脱峰合并，利用10kDa截留量的超滤浓缩管(Millipore)浓缩至7～10mg·mL^-1。浓缩后的MBP-proRCL蛋白分别采用1:40，1:100，1:200(蛋白酶：融合蛋白)的蛋白水解酶Kex2(PeproTech Inc.)室温酶切3h，SDS-PAGE检测酶切效果。

采用上述最适酶切比例对脂肪酶突变体进行酶切来去除MBP融合标签蛋白，将完全酶切的样品上样经镍柱结合缓冲液2平衡过的5mL HisTrap HP镍柱，收集穿透峰(含有脂肪酶)得到脂肪酶蛋白，之后采用100％镍柱洗脱缓冲液洗脱结合在柱子上的MBP融合标签。

实施例3：RCL前导肽突变体的构建表达及动力学分析

在LB固体培养基上挑取含重组质粒的大肠杆菌E.coli BL21trxB(DE3)单菌落，接种500μL LB液体培养基(含100μg·mL^-1氨苄青霉素抗生素及50μg·mL^-1卡那霉素抗生素)37℃，200rpm培养4-6h。取50μL接种50mL液体LB培养基，37℃，200rpm培养过夜。将50mL液体LB培养基全部转移至含950mL液体LB培养基的2L摇瓶中37℃，200rpm培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8，在加入1mM IPTG诱导，于17℃过夜诱导培养。SDS-PAGE检测各突变体全细胞蛋白和上清液蛋白。

野生型酶的比酶活为156.15U/mg，设定野生型相对活力为100％。如图1所示，野生酶WT以及T9A的比酶活相当，与盖子相互作用的突变体E3A的比酶活下降；V5A，M8A，L10A，D11A，L12A，P17G的比酶活较对照有所提高。

实施例4：脂肪酶突变体的位置选择性

sn-1,3位置专一性指数(PSI)越高表明脂肪酶的1,3-位置选择性越高，PSI指数测定方法：参考Matori,M.,T.Asahara,and Y.Ota,Positional specificity of microbiallipases.Journal of Fermentation and Bioengineering,1991.72:397-398.

以三油酸甘油酯为底物，加入50U脂肪酶，pH8.0，40℃条件下反应30min，然后测定反应液中1,2(2,3)-二油酸甘油酯和1,3-二油酸甘油酯的相对含量，计算获得PSI值。结果如图2所示，结果显示，突变体M8A、L10A、T9A的PSI指数由20分别提高到了100、99、95，说明这几个突变体具有很高的1,3-位置选择性。

实施例5：脂肪酶在人乳脂替代品中的应用研究

采用先醇解后酯化的方法合成人乳脂替代品，具体参考文献“Candida sp.99-125脂肪酶替代催化合成高纯人乳脂替代品的研究。张艳，2016，北京化工大学硕士学位论文”中的方法。以三棕榈酸甘油酯为底物，加入乙醇及脂肪酶进行醇解反应，然后分离2-单甘脂，加入油酸及脂肪酶进行酯化反应。结果表明，由具有高的1,3-位置选择性的突变体催化制备获得的人乳脂替代品中1,3-二油酸-2-棕榈酸三甘酯(OPO)的含量较高。在WT、M8A、L10A、T9A作为催化剂的反应中，反应结束后测得甘油三酯中sn-2位棕榈酸的含量分别为75％、95％、93％、90％，同时甘油三酯中油酸在sn-1,3位的比例分别为60％、91％、90％、88％。该结果表明，利用突变体合成人乳脂替代品可以得到高纯度的OPO型酯。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种酶活及位置选择性提高的脂肪酶突变体及其应用

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 296

<212> PRT

<213> 华根霉

<400> 1

Asp Thr Glu Thr Val Gly Gly Met Thr Leu Asp Leu Pro Glu Asn Pro

1 5 10 15

Pro Pro Ile Pro Ala Thr Ser Thr Ala Pro Ser Ser Asp Ser Gly Glu

20 25 30

Val Val Thr Ala Thr Ala Ala Gln Ile Lys Glu Leu Thr Asn Tyr Ala

35 40 45

Gly Val Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg Ser Val Val Pro Gly Thr Lys

50 55 60

Trp Asp Cys Lys Gln Cys Leu Lys Tyr Val Pro Asp Gly Lys Leu Ile

65 70 75 80

Lys Thr Phe Thr Ser Leu Leu Thr Asp Thr Asn Gly Phe Ile Leu Arg

85 90 95

Ser Asp Ala Gln Lys Thr Ile Tyr Val Thr Phe Arg Gly Thr Asn Ser

100 105 110

Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Met Val Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Ser

115 120 125

Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala Gly Phe Leu Ser Ser Tyr Asn

130 135 140

Gln Val Val Lys Asp Tyr Phe Pro Val Val Gln Asp Gln Leu Thr Ala

145 150 155 160

Tyr Pro Asp Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala

165 170 175

Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr Gln Arg Glu Lys Arg Leu

180 185 190

Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Tyr Thr Val Gly Cys Pro Arg Val Gly

195 200 205

Asn Asn Ala Phe Ala Tyr Tyr Val Asp Ser Thr Gly Ile Pro Phe His

210 215 220

Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val Pro His Val Pro Pro Gln Ala

225 230 235 240

Phe Gly Tyr Leu His Pro Gly Val Glu Ser Trp Ile Lys Glu Asp Pro

245 250 255

Ala Asp Val Gln Ile Cys Thr Ser Asn Ile Glu Thr Lys Gln Cys Ser

260 265 270

Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Ile Ala Asp His Leu Thr Tyr Phe

275 280 285

Gly Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu

290 295

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

actgctctta tcaagcgtga tactgctacc gtcggtg 37

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caccgacggt agcagtatca cgcttgataa gagcagt 37

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatactgaaa ccgctggtgg tatgaccttg g 31

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccaaggtcat accaccagcg gtttcagtat c 31

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgtcggtggt gctaccttgg atttgcc 27

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggcaaatcca aggtagcacc accgacg 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggcaaatcca aggtagcacc accgacg 27

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgtcggtggt atggctttgg atttgc 26

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcaaatccaa agccatacca ccgacg 26

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtatgaccgc tgatttgccc gagaaccc 28

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gggttctcgg gcaaatcagc ggtcatac 28

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtatgacctt ggctttgccc gagaaccct 29

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agggttctcg ggcaaagcca aggtcatac 29

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gtatgacctt ggatgctccc gagaaccctc ctcc 34

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggaggagggt tctcgggagc atccaaggtc atac 34

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ccgagaaccc tggtcctatt cctgcc 26

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggcaggaata ggaccagggt tctcgg 26

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cctcctattc ctgccgactc cactgctc 28

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gagcagtgga gtcggcagga ataggagg 28

Claims

1.一种脂肪酶突变体，其特征在于，将来源于华根霉的脂肪酶的第8位的甲硫氨酸替换为丙氨酸，或者将第9位的苏氨酸替换为丙氨酸，或者将第10位的亮氨酸替换为丙氨酸，或者将第11位的天冬氨酸替换为丙氨酸，或者将第12位的亮氨酸替换为丙氨酸，或者将第17位的脯氨酸替换为甘氨酸。

2.根据权利要求1所述的脂肪酶突变体，其特征在于，所述来源于华根霉的脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2任一所述的脂肪酶突变体，其特征在于，所述脂肪酶突变体为将来源于华根霉的脂肪酶的第8位的甲硫氨酸替换为丙氨酸，或者将第9位的苏氨酸替换为丙氨酸，或者将第10位的亮氨酸替换为丙氨酸。

4.编码权利要求1～3任一所述的脂肪酶突变体的基因。

5.携带权利要求4所述基因的载体。

6.根据权利要求5所述载体，其特征在于，所述载体为pPIC9、pPIC3.5K、pPIC9K、PAO815或pPICZα。

7.携带权利要求4所述基因的重组细胞。

8.根据权利要求7所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为细菌或真菌细胞。

9.权利要求1～3任一所述的脂肪酶突变体在功能油脂、食品、保健品、医药领域的应用。

10.权利要求1～3任一所述的脂肪酶突变体，或权利要求4所述的基因，或权利要求5所述的载体，或权利要求7所述的重组细胞在制备人乳脂替代品中的应用。