CN104531655B - 痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶及其应用 - Google Patents

痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶及其应用 Download PDF

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Abstract

痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶及其应用,氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。本发明采用复合酶协同催化，可以由含较高亚油酸的植物油直接制得共轭亚油酸，克服了亚油酸异构酶必须以昂贵的游离亚油酸为底物生产共轭亚油酸的缺点，大量地节省了成本。利用重组菌制备复合酶，提高酶活，增加酶产量，不需要购买商业酶，有效节约成本。异构化产物共轭亚油酸成分单一，具有多种生理活性。本方案具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益，有很好的工业化前景。

Description

痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶及其应用
技术领域
本发明属于生物酶法制备共轭亚油酸的技术领域，涉及利用脂肪酶和亚油酸异构酶联合催化制备共轭亚油酸的方法及反应体系。
背景技术
共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid, CLA）是由必需脂肪酸亚油酸（Linoleic Acid, LA）衍生的一系列含有共轭双键的十八碳二烯酸（octadecadienoicacid）的异构体的总称。其中，cis-9,trans-11 CLA和trans-10, cis-12 CLA被认为是主要的生物活性单体，具有多种生理活性，如抗癌症、抗动脉粥样硬化、降血脂、减肥、促进生长等，在医药、食品、保健品和化妆品等行业中具有广阔的应用前景。
天然 CLA主要存在于反刍动物的肉和乳中，相对于专家建议每日需要的CLA食入量，以食用动物的肉和乳作为CLA的摄取方式是远远不够的，因此对CLA合成转化的研究越来越得到广泛的关注。化学合成方法制得的产物往往包含一些活性功能尚不明确的异构体，而亚油酸异构酶（Conjugated linoleic acid isomerase）可特异性地催化亚油酸(LA) 转化为活性CLA异构体，并且反应条件温和，目前已得到众多国内外研究者的关注。来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶（Propionibacterium acnes isomerase，PAI）是为数不多的可以将亚油酸转化生成t10, c12 CLA的几种亚油酸异构酶之一，并且其蛋白晶体结构已经得到解析。对其的酶学性质研究发现其最适反应条件温和且具有较好的反应活性，适合工业化应用。故本研究选用PAI作为联合催化反应体系中的关键酶之一。
然而，游离亚油酸在自然界中很少存在，大多数是通过化学合成所得，因此价格较贵而且不利于扩大转化生产。大豆油中的亚油酸含量很丰富，是亚油酸的经济来源之一，其总脂肪酸中约54%是亚油酸(主要以甘油三酸酯的形式存在)。根据对亚油酸异构酶的底物特异性及蛋白晶体结构分析发现其只能利用游离的亚油酸来异构化产生CLA，而不能利用亚油酸的甘油三酯形式，但这种形式的亚油酸是豆油中亚油酸的主要存在形式。
脂肪酶属于水解酶类（hydrolase），能水解大豆油中的甘油三酯成分释放出游离的脂肪酸，其中亚油酸成分可以作为亚油酸异构酶的特异性底物来催化生成共轭亚油酸。米根霉脂肪酶（Rhizopus oryzae lipase，ROL）是作为一种典型的脂肪酶，目前已得到了广泛的研究，对其的催化水解甘油三酯的能力也得到了众多研究学者的肯定，并且ROL的反应条件温和，对碳链长度为C8-C18的脂肪酸表现出偏爱性，故本实验采用ROL作为联合催化反应体系的另一种关键酶。
大豆油对亚油酸异构酶转化生成CLA来说不是一种合适的底物，但在脂肪酶的协助下，大豆油中以甘油三酯形式存在的亚油酸对亚油酸异构酶来说变得可利用，这为联合催化反应体系的建立提供了理论基础。
发明内容
解决的技术问题：本发明的目的是提供亚油酸异构酶PAI的一种表达载体及重组菌；本发明的另一目的是提供一种制备共轭亚油酸的联合催化方法包括其催化工艺条件和ROL和PAI两种酶的最适添加量，使其能够经济高效地从天然植物油料大豆油直接催化制备共轭亚油酸。
技术方案：痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。
编码上述痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶的基因，该基因的核苷酸序列paiI如SEQ IDNO.2所述。
包含所述核苷酸序列的重组质粒pET20b-paiI。
包含所述核苷酸序列的重组质粒pET20b-paiI的制备方法，其特征在于构建步骤为：将经序列优化获得的基因paiI和pET20b用内切酶Nde I和xho I酶切，连接构建重组质粒pET20b-paiI，获得重组质粒pET20b-paiI。
含有所述重组质粒pET20b-paiI的宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。
痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶的纯化方法，挑取含重组质粒pET20b-paiI的大肠杆菌摇菌培养；当培养至OD600达到0.6-0.8，用终浓度0.5 mM IPTG诱导6-8 h；离心收集菌体并洗涤；用镍离子亲和柱纯化：向洗涤后的菌体中加入1×Binding Buffer重悬菌体，超声破碎菌液后离心，然后取离心液上样，再用1×Binding Buffer洗柱子除去未结合的蛋白质，最后用含有400 mM咪唑的洗脱液洗脱，即得目标蛋白。
所述痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶在协同催化制备共轭亚油酸中的应用。
具体应用方法为：以植物油为原料，痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶和米根霉脂肪酶进行联合协同催化。其中，痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶为天然酶或重组酶的游离形式或固定化形式，米根霉脂肪酶为天然酶或重组酶的游离形式或固定化形式。
工艺条件为：将适量的植物油于冰水浴下进行超声波乳化分散，获得浓度为40%（w/v，g/mL）植物油乳化液；在pH 7.0、35℃的条件下，植物油终浓度为20%，加入分别为1.575 U/g植物油的重组ROL和1395 U/g植物油的重组PAI，复合酶协同催化反应36 h，共轭亚油酸转化率可达80%以上。
所述的重组米根霉脂肪酶ROL（GenBank No. AF229435），氨基酸序列如SEQ IDNO.5所述，由常规克隆获得ROL的全基因序列，按照实施例4所述即可获得ROL重组酶液。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）采用复合酶协同催化，可以由含较高亚油酸的植物油直接制得共轭亚油酸，克服了亚油酸异构酶必须以昂贵的游离亚油酸为底物生产共轭亚油酸的缺点，大量地节省了成本。
（2）利用重组菌制备复合酶，提高酶活，增加酶产量，不需要购买商业酶，有效节约成本。
（3）异构化产物共轭亚油酸成分单一，具有多种生理活性。
（4）本方案具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益，有很好的工业化前景。
附图说明
图1是最适反应条件下，复合酶催化大豆油的反应时间曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，应理解这些方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：PAI基因的设计及合成：
根据密码子使用频率数据库信息Codon Usage Database将编码亚油酸共轭酶基因PAI按大肠杆菌偏好密码子优化。在不改变氨基酸序列的前提下，采用JCat密码子优化软件选择最优密码子，同时参考mRNA的二级结构进行微调使之活化能尽可能高，使mRNA更易于表达。密码子优化后的pai基因交由上海捷瑞生物工程有限公司全基因合成。
实施例2：重组PAI的克隆：
引物：上游引物P1：5’-cgccatatgtctatctccaaagacagccg-3’（含NdeI酶切位点）下游引物P2：5’-ccgctcgagaacgaagaagcgggtaacc-3’（含XholI酶切位点）。
PCR反应体系：1 μL合成序列，1 μL上游引物P1，1μL下游引物P2，25 μL PremixExTaq，22 μL ddH2O。
PCR反应条件：94℃变性10 min；94℃变性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸1.5min，30 Cycles；72℃延伸10 min；4℃保温。
PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化（BIOMIGA，上海）。
将纯化的PCR扩增产物经Nde I、XholI双酶切后，与同样双酶切的表达质粒pET-20b连接，热击转化至E. coli Top10感受态细胞中。在Amp抗生素(100 μg/mL)的LLB平板中挑选单菌落，扩增培养，提取质粒，双酶切鉴定，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测和测序鉴定进而构建出重组表达质粒pET-20b-pai。
实施例3：重组PAI的诱导表达及纯化：
将经鉴定的阳性重组质粒pET-20b-pai转入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中，在含有Amp抗生素(100 μg/mL)的LLB平板上筛选出阳性克隆。将阳性克隆转接到新鲜的5mL的LLB液体培养基中，37℃，180 rpm条件下培养至OD600 0.6~0.8时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，25℃，120 rpm过夜诱导培养。将诱导表达的菌液于4℃ 、8000 rpm 离心5min， 用 20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤细胞两次，最后用6 mL此缓冲液重悬菌体并于冰浴中超声波破碎菌体，4℃、12000 rpm离心20 min，得到上清粗酶液。上清粗酶液经AKTA蛋白纯化仪通过亲和Ni2+柱进行线性梯度洗脱纯化，收集目标蛋白PAI。
实施例4：重组ROL的诱导表达。
将成功克隆有ROL基因的重组质粒pPICZαA-ROL经限制性酶Sac I进行单酶切，使质粒线性化后电击转入毕赤酵母KM71H（购自Invitrogen公司）感受态细胞中。采用橄榄油-MMH-RB活性平板及三辛酸甘油酯平板来筛选产脂肪酶活力较高的重组菌，挑选橄榄油-MMH-RB活性平板中荧光圈大的和三辛酸甘油酯平板中水解圈大的菌落作为重组毕赤酵母工程菌。按Invitrogen公司的毕赤酵母表达手册上的操作进行诱导表达，获得ROL，无需纯化，直接使用。
实施例5：重组亚油酸异构酶PAI和米根霉脂肪酶ROL酶活的测定：
亚油酸异构酶酶活测定方法：在1.65 cm×12.5 cm 螺帽试管中，依次加入4.75mL Na2HPO4-柠檬酸缓冲液（pH 7.0）、0.2 mL重组PAI酶液、50 μL亚油酸乳化液，35℃、180rpm振荡反应1 h后，从中取200 μL加入30 μL 10%三氯乙酸终止反应，再加入1 mL正己烷振荡萃取10 min，离心破除振荡时形成的乳化层，取上层正己烷部分，经适当稀释后测定234nm处的吸光值。由测得的吸光值根据 CLA标准曲线确定生成CLA 的量。定义每分钟生成1 μg的CLA所需酶量为1个酶活单位（U）。
脂肪酶酶活测定方法：以pNPP（p-nitrophenyl palmitate）为底物的分光光度法测定脂肪酶酶活，以13.5 mmol/L的p-NPC为底物，850 μL 0.05 mol/L Tris-HCL pH 7.0缓冲液与100 μL酶液，35℃恒温水浴摇床保温5 min，加入50 μL底物溶液，35℃恒温水浴摇床准确反应5 min，于冰上终止反应。取上清于410 nm处测定吸光值。将对硝基苯酚稀释成适当浓度做标准曲线。酶活力单位定义为：在pH 7.0、35℃条件下，每min水解底物释放1 μmol对硝基苯酚所需要的酶量为1个脂肪酶活力单位。
实施例6：复合酶联合协同催化体系中植物油脂的抽提和检测：
反应结束后，往反应混合物中加正己烷振荡萃取产物中的脂肪酸，冷冻离心（10,000 g，15 min，4℃）破除振荡萃取形成的乳化层，然后收集上层正己烷液体，再用无水硫酸钠去多余水分或水溶性物质，用旋转蒸发仪在40℃下蒸发脱除溶剂正己烷，将浓缩所得的脂肪酸转移至洗净备用的试样容器中。然后通过两步法进行油脂的甲酯化：加入含1%甲醇钠的甲醇溶液，50℃加热15min，使脂肪酸成游离状，加入50 mL盐酸甲醇溶液80℃加热60min进行游离脂肪酸甲醋化，然后旋转蒸发去除甲醇，离心得到脂肪酸甲酯。
制备得到的脂肪酸甲酯的检测分析则是通过配备有FID检测器和DB-WAXETR（30m*0.25 mm，φ 0.25微米，安捷伦，美国）毛细管柱的安捷伦-7890A气相色谱仪：在实验中选择氮气用作载体气体，通气量为2 mL/min，进样口温度设置为240℃，分流比为15:1，温度梯度设定为120℃保温3min，120~190℃升温速度保持在5℃/min，190~210℃升温速度保持1℃/min，最后当温度达到210℃继续保温3 min。亚油酸和t10，c12共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的鉴定是通过与其的标准品进行比较而得到的。通过用峰面积归一化法计算共轭亚油酸甲酯百分率。
实施例7： 联合协同催化大豆油制备共轭亚油酸：
将含有400 g/L大豆油的乳化体系于冰水浴下进行超声波乳化分散，获得浓度为40%（w/v，g/mL）大豆油乳化液。
在pH 7.0、35℃的条件下，大豆油终浓度为20%，重组ROL和PAI的加入量分别为1.57 U/g大豆油、1395 U/g大豆油，复合酶协同催化反应36 h，共轭亚油酸转化率可达86.7%。
实施例8：联合协同催化葵花籽油制备共轭亚油酸：
将含有400 g/L葵花籽油的乳化体系于冰水浴下进行超声波乳化分散，获得浓度为40%（w/v，g/mL）葵花籽油乳化液。
在pH 7.0、35℃的条件下，葵花籽油终浓度为20%，重组ROL和PAI的加入量分别为1.42 U/g葵花籽油、1422 U/g葵花籽油，复合酶协同催化反应36 h，共轭亚油酸转化率可达89.3%。
实施例9：联合协同催化玉米油制备共轭亚油酸：
将含有400 g/L玉米油的乳化体系于冰水浴下进行超声波乳化分散，获得浓度为40%（w/v，g/mL）玉米油乳化液。
在pH 7.0、35℃的条件下，玉米油终浓度为20%，重组ROL和PAI的加入量分别为1.35 U/g玉米油、1504 U/g玉米油，复合酶协同催化反应36 h，共轭亚油酸转化率可达87.6%。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京林业大学
<120> 痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶及其应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 424
<212> PRT
<213> Propionibacterium acnes
<400> 1
Met Ser Ile Ser Lys Asp Ser Arg Ile Ala Ile Ile Gly Ala Gly Pro
1 5 10 15
Ala Gly Leu Ala Ala Gly Met Tyr Leu Glu Gln Ala Gly Phe His Asp
20 25 30
Tyr Thr Ile Leu Glu Arg Thr Asp His Val Gly Gly Lys Cys His Ser
35 40 45
Pro Asn Tyr His Gly Arg Arg Tyr Glu Met Gly Ala Ile Met Gly Val
50 55 60
Pro Ser Tyr Asp Thr Ile Gln Glu Ile Met Asp Arg Thr Gly Asp Lys
65 70 75 80
Val Asp Gly Pro Lys Leu Arg Arg Glu Phe Leu His Glu Asp Gly Glu
85 90 95
Ile Tyr Val Pro Glu Lys Asp Pro Val Arg Gly Pro Gln Val Met Ala
100 105 110
Ala Val Gln Lys Leu Gly Gln Leu Leu Ala Thr Lys Tyr Gln Gly Tyr
115 120 125
Asp Ala Asn Gly His Tyr Asn Lys Val His Glu Asp Leu Met Leu Pro
130 135 140
Phe Asp Glu Phe Leu Ala Leu Asn Gly Cys Glu Ala Ala Arg Asp Leu
145 150 155 160
Trp Ile Asn Pro Phe Thr Ala Phe Gly Tyr Gly His Phe Asp Asn Val
165 170 175
Pro Ala Ala Tyr Val Leu Lys Tyr Leu Asp Phe Val Thr Met Met Ser
180 185 190
Phe Ala Lys Gly Asp Leu Trp Thr Trp Ala Asp Gly Thr Gln Ala Met
195 200 205
Phe Glu His Leu Asn Ala Thr Leu Glu His Pro Ala Glu Arg Asn Val
210 215 220
Asp Ile Thr Arg Ile Thr Arg Glu Asp Gly Lys Val His Ile His Thr
225 230 235 240
Thr Asp Trp Asp Arg Glu Ser Asp Val Leu Val Leu Thr Val Pro Leu
245 250 255
Glu Lys Phe Leu Asp Tyr Ser Asp Ala Asp Asp Asp Glu Arg Glu Tyr
260 265 270
Phe Ser Lys Ile Ile His Gln Gln Tyr Met Val Asp Ala Cys Leu Val
275 280 285
Lys Glu Tyr Pro Thr Ile Ser Gly Tyr Val Pro Asp Asn Met Arg Pro
290 295 300
Glu Arg Leu Gly His Val Met Val Tyr Tyr His Arg Trp Ala Asp Asp
305 310 315 320
Pro His Gln Ile Ile Thr Thr Tyr Leu Leu Arg Asn His Pro Asp Tyr
325 330 335
Ala Asp Lys Thr Gln Glu Glu Cys Arg Gln Met Val Leu Asp Asp Met
340 345 350
Glu Thr Phe Gly His Pro Val Glu Lys Ile Ile Glu Glu Gln Thr Trp
355 360 365
Tyr Tyr Phe Pro His Val Ser Ser Glu Asp Tyr Lys Ala Gly Trp Tyr
370 375 380
Glu Lys Val Glu Gly Met Gln Gly Arg Arg Asn Thr Phe Tyr Ala Gly
385 390 395 400
Glu Ile Met Ser Phe Gly Asn Phe Asp Glu Val Cys His Tyr Ser Lys
405 410 415
Asp Leu Val Thr Arg Phe Phe Val
420
<210> 2
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<212> DNA
<213> Propionibacterium acnes
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catgttggcg gtaaatgcca cagcccgaac taccacggtc gtcgctacga aatgggtgcg 180
atcatgggtg ttccgtctta cgacaccatt caggagatta tggatcgtac cggtgacaaa 240
gttgacggtc cgaaactgcg tcgtgagttc ctgcacgaag atggcgaaat ctatgtgccg 300
gaaaaagatc cggtgcgtgg cccgcaggtg atggcggctg tgcagaagct gggccagctg 360
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ctgatgctgc cgtttgacga atttctggcg ctgaacggtt gcgaagcagc gcgtgatctg 480
tggatcaacc cgttcaccgc gttcggttac ggtcactttg acaacgtgcc ggctgcgtat 540
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caggaagaat gccgccagat ggtgctggac gacatggaaa ccttcggtca cccggtggag 1080
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<213> 人工序列
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<211> 28
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<211> 366
<212> PRT
<213> Rhizopus oryzae
<400> 5
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Ser Ile Gly Lys Arg Asp Asp Asn Leu Val Gly Gly Met Thr Leu Asp
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Leu Pro Ser Asp Ala Pro Pro Ile Ser Leu Ser Gly Ser Thr Asn Ser
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Ala Ser Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile Gln
100 105 110
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Gln Arg Glu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr Val
260 265 270
Gly Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ser
275 280 285
Thr Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val Pro
290 295 300
His Val Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu Ser
305 310 315 320
Trp Ile Lys Ser Gly Thr Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser Glu Ile
325 330 335
Glu Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Leu Leu
340 345 350
Asp His Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu
355 360 365

Claims (1)

1.痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶在协同催化制备共轭亚油酸中的应用，其特征在于以植物油为原料，痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶和米根霉脂肪酶进行联合协同催化；其中，痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶为天然酶或重组酶的游离形式或固定化形式，米根霉脂肪酶为天然酶或重组酶的游离形式或固定化形式；编码上述痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶的基因如SEQ IDNO.2所述，上述米根霉脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所述。
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Assignor: Nanjing Forestry University

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Granted publication date: 20171114

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