CN112410318B - 一种新型磷脂酶a2及其基因、制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酶的基因工程技术领域，涉及一种来源于解淀粉芽孢杆菌的新型磷脂酶A2及其基因、工程菌和制备方法，其技术方案是利用分子生物学手段和基因工程技术，通过菌种筛选获得一株能够产生磷脂酶A2的解淀粉芽孢杆菌，通过PCR技术扩增出该新型磷脂酶A2的基因，然后将该新型磷脂酶A2基因，分别在枯草芽孢杆菌表达系统、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌系统中进行表达，获得重组菌株，实现新型磷脂酶A2的制备。同时涉及该新型磷脂酶A2在磷脂改性如油脂脱胶、合成sn‑2位特定酰基磷脂方面的应用。

Description

一种新型磷脂酶A2及其基因、制备方法与应用
技术领域：
本发明涉及一种来源于解淀粉芽孢杆菌的新型磷脂酶A2及其基因、制备方法与应用，具体涉及通过基因工程技术和分子生物学手段获得表达该新型磷脂酶 A2的重组表达菌株，以及该酶在磷脂改性如油脂脱胶、合成sn-2位特定酰基磷脂方面的应用。
背景技术：
磷脂酶A2(phospholipaseA2，PLA2)是一种磷脂sn-2位酰基水解酶，它能够催化甘油磷脂的sn-2位酯键发生水解反应，水解产物为溶血磷脂和脂肪酸，该酶在磷脂的分解代谢中具有非常重要的作用。PLA2不仅在生物体内具有很重要的生理功能，而且具有很高的应用价值，可广泛地应用在科学研究、磷脂改性、油脂精练、饲料添加剂、医疗等诸多方面。
二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)属于不饱和脂肪酸，是组成磷脂、胆固醇的重要成分。近年来大量研究显示，EPA和DHA对维护人体健康有重要作用，EPA具有调节血脂、软化血管，降低血液黏度的作用，可防止脂肪在血管壁的沉积，预防动脉粥样硬化的形成和发展，预防脑血栓、脑溢血、高血压等心血管疾病，有“血管清道夫”之称。而DHA对脑部发育、改善视力、促进生长发育和提高人体免疫尤为重要，被称为“脑黄金”。
磷脂(phosphatidylcholine，PC)是一类自然界中广泛存在的功能性脂质，具有良好的理化特性和生理功能，已被广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。不同结构的磷脂具有不同的生理功能，因此，开发不同结构特性的磷脂具有非常重要的意义。磷脂改性的方法有多种，其中酶法磷脂改性反应条件温和，条件易于控制，对环境无污染，可以专一性的催化制备目标产物，能够保持磷脂的天然构型，并且可以大大减少有毒试剂的使用，应用酶法改性技术是未来工业发展的一个重要的方向。研究表明，同结合在甘油三酯和乙酯上的DHA和EPA 相比，结合在磷脂骨架上的DHA和EPA 生物利用率更高，抗氧化能力更强。
油脂脱胶是植物油精炼的重要工序，脱胶效果的好坏直接影响油脂的品质和精练的经济效益。油脂脱胶包括化学法、物理法和酶法。目前，国内油脂行业普遍采用化学法，但是该方法需要消耗大量的水及酸、碱等化学物质。酶法脱胶是一种新的脱胶方法。在一定条件下，PLA2水解植物油中的非水化磷脂生成溶血磷脂和脂肪酸，而溶血磷脂具有很强的亲水性，可以通过水化作用方便地除去。同传统的脱胶方法相比，PLA2酶法脱胶适应性广，反应条件温和，可大大节约化学物质的消耗量，几乎不产生废水，还能提高脱胶油的产量，在环保、经济、质量等方面具有潜在的优势。
虽然PLA2具有很多应用价值，但距工业生产的需要，特别是与其他酶生产和应用相比，存在很大的差距，主要原因是PLA2酶源狭窄，目前PLA2主要从动物胰脏、蛇毒、蜂毒中提取，也有从动物内脏或微生物中提取PLA2，但是工艺复杂，不利于PLA2的大量生产和利用。因此用异源表达的方式生产高活力的 PLA2是十分必要的。
枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌。枯草芽孢杆菌表达系统具有以下优点：1、能够高效地分泌各种蛋白质；2、许多枯草芽孢杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽孢杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并且生长迅速，对营养物质无特殊要求等优点；4、密码子偏爱性不明显；5、发酵过程简单，枯草芽孢杆菌属于好氧菌，无需厌氧发酵设备，发酵结束后，简单的分离发酵液和菌体，即可进入目的蛋白的分离、纯化回收阶段；6、具有抗逆性，可以生产多种耐热性酶制剂。
解淀粉芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌。解淀粉芽孢杆菌表达系统具有以下优点： 1、在工业生产中，对健康或环境无毒无害；2、细胞壁组成简单，便于蛋白的分泌，并且不含有热源性脂多糖；3、分子生物试验中所用的很多噬菌体和质粒都可作为其转化的工具，且重组DNA比较容易转入。
地衣芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌。解淀粉芽孢杆菌表达系统具有以下优点： 1、蛋白被直接分泌到胞外的培养基中，不会积聚，有利于蛋白的下游回收和纯化，降低整个生产链的操作成本；2、胞外蛋白分泌量大，生长温度较高适合用作工业生产宿主菌；3、作为单细胞生物在发酵过程中可以达到很高的细胞密度，且培养基相对比较简单，成本低、产出高，符合工业生产的要求。
在本发明中，对解淀粉芽孢杆菌基因组中新型磷脂酶A2编码基因进行克隆，新型磷脂酶A2基因在枯草芽孢杆菌表达系统、解淀粉芽孢杆菌表达系统和地衣芽孢杆菌表达系统中进行表达，分别得到枯草芽孢杆菌高活力磷脂酶A2重组菌株、解淀粉芽孢杆菌高活力磷脂酶A2重组菌株和地衣芽孢杆菌高活力磷脂酶A2重组菌株。重组菌株发酵后，经过相应的处理可得新型磷脂酶A2催化剂。在新型磷脂酶A2催化剂的催化下与PC反应，可制备sn-2位为二十二碳六烯酸的磷脂(2-DHA-PC)和sn-2位为二十二碳五烯酸的磷脂(2-EPA-PC)，以及利用磷脂酶 A2催化甘油磷脂的sn-2位酯键发生水解反应生成溶血磷脂的特性，对油脂进行脱胶。
发明内容：
本发明的目的在于克服和避免目前工业上生产磷脂酶A2所存在的不足之处，并提供一种来源于解淀粉芽孢杆菌的新型磷脂酶A2编码基因及表达该新型磷脂酶A2基因的工程菌株。以及该酶在催化甘油磷脂的sn-2位酯键发生水解反应生成溶血磷脂进行油脂脱胶、与PC反应制备sn-2位为二十二碳六烯酸的磷脂 (2-DHA-PC)和sn-2位为二十二碳五烯酸的磷脂(2-EPA-PC)的应用。
本发明实现目的的技术路线如下：以解淀粉芽孢杆菌TCCC 11319的基因组为模板，并根据已报道的解淀粉芽孢杆菌磷脂酶A2基因，分析其保守序列，设计本发明的磷脂酶A2基因的扩增引物P1和P2，其中，上游引物P1和下游引物 P2是用来扩增在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点BamHI、SalI。通过PCR克隆获得解淀粉芽孢杆菌的磷脂酶A2基因pla2，将其与pBSA43载体连接后，构建重组质粒pBSA43-pla2；转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-pla2。再次将验证正确的重组质粒pBSA43-pla2，分别在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中成功表达，得到产高活力新型磷脂酶A2的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得高产的高活力新型磷脂酶A2。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之一为：一种新型磷脂酶A2，所述磷脂酶A2来源于一株经发明人筛选的解淀粉芽孢杆菌，其氨基酸序列如序列表中的SEQ IDNo.2所示；所述磷脂酶A2的编码基因为pla2，碱基序列如序列表中的SEQ ID No.1所示。
所述磷脂酶A2以Palmitoyl thio-PC为底物测定新型磷脂酶A2酶学性质时，最适作用温度为45℃，最适作用pH为7.0；
同时，以Palmitoyl thio-PC为底物测定该新型磷脂酶A2热稳定性和pH稳定性，结果表明：该新型磷脂酶A2在pH＝7下，在30℃、40℃、50℃、60℃和70℃环境中保温2h后残余酶活分别为100％、83.4％、76.5％、58.2％和47.2％；该新型磷脂酶A2在45℃下，pH 8稳定性良好，在45℃下保温5天时，在pH＝8下残余酶活为100％，在pH＝4、pH＝5、pH＝6、pH＝7和pH＝9环境中保温5天的残余酶活分别为11.2％、40.3％、61.1％、81.4％和50％。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之二为：将上述基因重新构建重组载体，并在枯草芽孢杆菌WB600、解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218和地衣芽孢杆菌TCCC11965中高效表达，得到产高活力新型磷脂酶A2的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得高产的高活力新型磷脂酶A2；
用于表达所述的新型磷脂酶A2的宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600，表达载体为pBSA43；
用于表达所述的新型磷脂酶A2的宿主细胞为解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218，表达载体为pBSA43；
用于表达所述的新型磷脂酶A2的宿主细胞为地衣芽孢杆菌TCCC11965，表达载体为pBSA43；
构建重组菌株的实验步骤概述如下：
1、一种来源于解淀粉芽孢杆菌的新型磷脂酶A2基因，构建游离表达该新型磷脂酶A2的重组菌株(枯草芽孢杆菌WB600/pBSA43-pla2)及该新型磷脂酶A2的制备过程包括如下步骤：
(1)设计本发明的磷脂酶A2基因的扩增引物P1和P2，通过PCR克隆获得解淀粉芽孢杆菌的磷脂酶A2基因pla2，将其与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒 pBSA43连接后，构建重组质粒pBSA43-pla2，转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-pla2；得到含有解淀粉芽孢杆菌新型磷脂酶A2编码基因的重组质粒；
(2)将重组质粒pBSA43-pla2转化入枯草芽孢杆菌WB600，构建获得重组菌株WB600/pBSA43-pla2；
(3)将重组菌株进行发酵制备高活力新型磷脂酶A2；
(4)制备高活力新型磷脂酶A2。
2、一种来源于解淀粉芽孢杆菌的新型磷脂酶A2基因，构建游离表达该新型磷脂酶A2的重组菌株(解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218/pBSA43-pla2)及该新型磷脂酶A2的制备过程包括如下步骤：
(1)设计本发明的磷脂酶A2基因的扩增引物P1和P2，通过PCR克隆获得地衣芽孢杆菌的磷脂酶A2基因pla2，将其与与大肠杆菌-解淀粉芽孢杆菌穿梭质粒 pBSA43连接后，构建重组质粒pBSA43-pla2，转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-pla2；得到含有解淀粉芽孢杆菌新型磷脂酶A2编码基因的重组质粒；
(2)将重组质粒pBSA43-pla2转化入解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218，构建获得重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-pla2；
(3)将重组菌株进行发酵制备高活力新型磷脂酶A2；
(4)制备高活力新型磷脂酶A2。
3、一种来源于解淀粉芽孢杆菌的新型磷脂酶A2基因，构建游离表达该新型磷脂酶A2的重组菌株(地衣芽孢杆菌TCCC11965/pBSA43-pla2)及该新型磷脂酶A2的制备过程包括如下步骤：
(1)设计本发明的磷脂酶A2基因的扩增引物P1和P2，通过PCR克隆获得地衣芽孢杆菌的磷脂酶A2基因pla2，将其与与大肠杆菌-地衣芽孢杆菌穿梭质粒 pBSA43连接后，构建重组质粒pBSA43-pla2，转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-pla2；得到含有解淀粉芽孢杆菌新型磷脂酶A2编码基因的重组质粒；
(2)将重组质粒pBSA43-pla2转化入地衣芽孢杆菌TCCC11965，构建获得重组菌株TCCC11965/pBSA43-pla2；
(3)将重组菌株进行发酵制备高活力新型磷脂酶A2；
(4)制备高活力新型磷脂酶A2。
有益效果：
1、本发明通过特定的能够产生磷脂酶A2的高通量菌株筛选，获得一株能够产生磷脂酶A2的菌株，即解淀粉芽孢杆菌，通过PCR扩增获得的该菌株的磷脂酶A2基因，经测序为一段新的碱基序列。
2、本发明中通过枯草芽孢杆菌表达新型酪氨酸酶重组菌株、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌游离表达新型磷脂酶A2重组菌株发酵后制备的新型重组磷脂酶A2具有如下的酶学性质：以Palmitoyl thio-PC为底物测定新型磷脂酶A2酶学性质时，最适作用温度为45℃，最适作用pH为7.0；同时，该新型磷脂酶A2在枯草芽孢杆菌表达系统、解淀粉芽孢杆菌表达系统和地衣芽孢杆菌表达系统内发酵酶活最高值分别为168U/mL、416U/mL、273U/mL。
3、该新型磷脂酶A2对油脂具有较好的脱胶效果，在实际应用中具有较大应用潜力。
4、本发明提供了一种催化制备2-DHA-PC和2-EPA-PC的方法，通过本发明的方法制备的2-DHA-PC和2-EPA-PC在医药、食品及保健品领域具有很大的应用潜力。
附图说明：
图1为本发明新型磷脂酶A2基因的PCR扩增电泳图；
其中：M为DNA Marker，1为磷脂酶A2基因pla2；
图2为实施例2转化子重组质粒pBSA43-pla2酶切验证图；
其中：M为DNA Marker，1为重组质粒pBSA43-pla2经BamHI和SalI双酶切图；
图3为本发明实施例3转化子重组质粒pBSA43-pla2酶切验证图；
其中：M为DNA Marker，1为重组质粒pBSA43-pla2经BamHI和SalI双酶切图；
图4为本发明实施例4转化子重组质粒pBSA43-pla2酶切验证图；
其中：M为DNA Marker，1为重组质粒pBSA43-pla2经BamHI和SalI双酶切图；
图5为最适作用温度曲线；
图6为最适作用pH曲线；
图7为温度稳定性曲线；
图8为pH稳定性曲线。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
本发明所使用的地衣芽孢杆菌为TCCC11965，公开于：Development andapplication of a CRISPR/Cas9 system for Bacillus licheniformis genome editing[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2019,122:329-337，目前保存于天津科技大学微生物菌种保藏管理中心，公众可从该中心获取菌种。
实施例1：解淀粉芽孢杆菌新型磷脂酶A2基因的获得
1、新型磷脂酶A2基因来源于本实验室筛选出的解淀粉芽孢杆菌，利用试剂盒(OMEGA:Bacterial DNA Kit)提取其基因组DNA，其中解淀粉芽孢杆菌基因组DNA的提取步骤如下：
(1)从甘油管中接种划线于LB固体平板中，37℃静置培养12h；
(2)从培养菌体的平板上挑取一单菌落接种于含5mL液体LB培养基中，于 220r/min，37℃条件下培养12h；
(3)将菌液分装到灭菌的1.5mL微量离心管中，12000r/min离心1min收集菌体，弃上清；
(4)将沉淀重悬于100μL TE Buffer/分子水中用枪头反复吹打混匀，并加入 50μL的50mg/mL溶菌酶，37℃培养箱中放置10min；
(5)加入100μL的BTL Buffer以及20μL的蛋白酶K，振荡混匀，55℃水浴 40-50min；
(6)加入5μL RNase A，盖紧管口，温和地将1.5mL的EP管上下翻转6～8 次，室温放置5min；
(7)以12000r/min离心2min，将上清转移到另一EP管中，加200μL BDL Buffer，混合均匀后，65℃水浴10min；
(8)加入200μL无水乙醇，吹吸混匀；
(9)将EP管中的液体转移至吸附柱中静止2min，12000r/min离心1min，将滤液重新倒入吸附柱中静止、离心，重复两次，弃滤液；
(10)加入500μL HBC Buffer，静止两分钟，以12000r/min离心1min，弃滤液；
(11)加入700μL DNA Buffer，静止两分钟，以12000r/min离心1min，弃滤液，重复一次；
(12)以12000r/min空离2min，将吸附柱放到一个新的EP管上晾干；
(13)加入50-100μL的55℃分子水，室温静置3-5min，12000r/min离心1min。
2、通过NCBI基因库查找，根据已报道的解淀粉芽孢杆菌磷脂酶A2基因，分析其保守序列，设计本发明的磷脂酶A2编码基因的扩增引物如下：
上游引物P1(SEQ ID NO.3)：
5’—CGCGGATCCATGTGGACTTGGAAAGCAGA—3’
下游引物P2(SEQ ID NO.4)：
5’—ACGCGTCGACAATATACTGATCTGTAAAGGCTTTC—3’
上游引物P1和下游引物P2是用来扩增在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点BamHI 和SalI。
扩增模板为解淀粉芽孢杆菌基因组DNA，其扩增的反应条件为：
10×Pyrobest BufferⅡ 5μL
dNTP Mixture(2.5mM each) 5μL
上游引物P1 2μL
下游引物P2 2μL
DNA模板 2μL
Pyrobest DNA Polymerase(5U/μL) 0.5μL
ddH<sub>2</sub>O 33.5μL
总体积 50μL
扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸 1min40s反应30个循坏；72℃延伸10min。PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到780bp的条带(图1)，用小量DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，并进行双酶切和纯化回收，得到本发明的解淀粉芽孢杆菌新型磷脂酶A2编码基因 pla2，见序列1。
也可以根据序列1进行全基因合成获得本发明所述的磷脂酶A2基因pla2。实施例2：枯草芽孢杆菌高活力新型磷脂酶A2重组菌的构建
1、表达载体pBSA43的构建
pBSA43是以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个强的芽孢杆菌组成型启动子P43，以及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中果聚糖蔗糖酶信号序列sacB而获得。它带有Ampr基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记；同时也具有Kmr基因，可以在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。
2、新型磷脂酶A2表达载体pBSA43-pla2的构建
将经PCR扩增并经BamHI和SalI双酶切后回收的新型磷脂酶A2基因(pla2) 与同样双酶切的枯草芽孢杆菌表达载体pBSA43用连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，经Amp抗性筛选，挑选阳性转化子，提取转化子质粒，并进行单、双酶切验证和测序，确定构建获得正确的重组菌株 JM109/pBSA43-pla2。
3、重组表达载体pBSA43-pla2转化枯草芽孢杆菌WB600
将1μL(50ng/μL)的pBSA43-pla2重组质粒加入到50μL的枯草芽孢杆菌 WB600感受态细胞中并混匀，之后转移到预冷的电转杯(1mm)中，冰浴1-1.5min 后，电击一次(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-24h，挑取阳性转化子，并进行单、双酶切验证(图2)，确定获得表达pla2的枯草芽孢杆菌重组菌株 WB600/pBSA43-pla2。
实施例3：解淀粉芽孢杆菌高活力新型磷脂酶A2重组菌的构建
1、表达载体pBSA43的构建
pBSA43是以大肠杆菌-解淀粉芽孢杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个强的芽孢杆菌组成型启动子P43，以及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中果聚糖蔗糖酶信号序列sacB而获得。它带有Ampr基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记；同时也具有Kmr基因，可以在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。
2、新型磷脂酶A2表达载体pBSA43-pla2的构建
将经PCR扩增并经BamHI和SalI双酶切后回收的新型磷脂酶A2基因(pla2) 与同样双酶切的解淀粉芽孢杆菌表达载体pBSA43用连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，经Amp抗性筛选，挑选阳性转化子，提取转化子质粒，并进行单、双酶切验证和测序，确定构建获得正确的重组菌株 JM109/pBSA43-pla2。
3、重组表达载体pBSA43-pla2转化解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218
将1μL(50ng/μL)的pBSA43-pla2重组质粒加入到50μL的解淀粉芽孢杆菌 CGMCCNo.11218感受态细胞中并混匀，之后转移到预冷的电转杯(1mm)中，冰浴1-1.5min后，电击一次(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入 1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃摇床震荡培养3h 之后，将复苏物涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-24h，挑取阳性转化子，并进行单、双酶切验证(图3)，确定获得表达pla2的解淀粉芽孢杆菌重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-pla2。
实施例4：地衣芽孢杆菌高活力新型磷脂酶A2重组菌的构建
1、表达载体pBSA43的构建
pBSA43是以大肠杆菌-地衣芽孢杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个强的芽孢杆菌组成型启动子P43，以及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中果聚糖蔗糖酶信号序列sacB而获得。它带有Ampr基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记；同时也具有Kmr基因，可以在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。
2、新型磷脂酶A2表达载体pBSA43-pla2的构建
将经PCR扩增并经BamHI和SalI双酶切后回收的新型磷脂酶A2基因(pla2) 与同样双酶切的地衣芽孢杆菌表达载体pBSA43用连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞中，经Amp抗性筛选，挑选阳性转化子，提取转化子质粒，并进行单、双酶切验证和测序，确定构建获得正确的重组菌株 JM109/pBSA43-pla2。
3、重组表达载体pBSA43-pla2转化地衣芽孢杆菌TCCC11965
将1μL(50ng/μL)的pBSA43-pla2重组质粒加入到50μL的地衣芽孢杆菌 TCCC11965感受态细胞中并混匀，之后转移到预冷的电转杯(1mm)中，冰浴 1-1.5min后，电击一次(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1mL 复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)。37℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-24h，挑取阳性转化子，并进行单、双酶切验证，确定获得表达pla2的地衣芽孢杆菌重组菌株 TCCC11965/pBSA43-pla2。
实施例5：磷脂酶A2酶活的测定
(1)PLA2的酶活测定原理
微孔比色法是一种最新发展出的PLA2酶活测定法。其基本原理是基于 Aarsman等在1976年建立的巯基显色法，即合成一种磷脂酰胆碱类似物2-硫代十六酰乙基磷酸胆碱(2-hexadecanoylthio-l-ethyl-phosphorylcholine，Palmitoyl thio-PC)作为底物，该底物中的sn-2位是硫酯键，仍可受PLA2的水解，并释放出游离巯基，游离巯基与5.5’-二硫代硝基苯甲酸(DTNB)反应后，在410nm波长附近有最大吸收，反应在96孔板中进行，用酶标仪测定吸收值，测定吸收值后可以换算出巯基的量，最终可以求出PLA2的酶活力。
酶活力定义为：以Palmitoyl thio-PC为底物，在37℃，pH＝8.0的条件下，每分钟产生1nmol游离巯基的酶量定义为一个酶活力单位，记为U/mL。
(2)PLA2酶活的测定方法
基础液：0.2mol/L，pH＝8.0Tris-HCl缓冲液90ml，加入20mmol/L CaCl2， 5mmol/LDTNB，5mmol/L脱氧胆酸钠各20ml，充分混匀；
工作液：5mmol/L Palmitoyl thio-PC 1ml加基础液15ml，充分混匀；
对照液：蒸馏水1ml，加基础液15ml，充分混匀。
Figure BDA0002847872910000111
PLA2的测定步骤
混匀，37℃温育1h，测410nm波长A值，空白调零。
磷脂酶A2的最适温度：在pH＝7的条件下分别测定其在15-55℃之间的酶活。
磷脂酶A2的最适pH：在其最适温度的条件下分别测定其在pH＝4.0-8.0之间的酶活。
磷脂酶A2的热稳定性：在最适pH条件下，在30-70℃之间保温0-2h后，测定残余酶活，每隔20min测一次。
磷脂酶A2的pH稳定性：在最适温度，pH＝4.0-9.0之间保温5天后，测定残余酶活。
酶活的测定为三次平行实验，结果取平均值。
(3)酶活力计算
磷脂酶A2活力(U/mL)＝73.5×(A测定孔-A对照孔)
通过上述方法测定新型磷脂酶A2的酶学性质，该新型磷脂酶A2酶学性质如下：
以Palmitoyl thio-PC为底物测定新型磷脂酶A2酶学性质时，最适作用温度为45℃(图5)，最适作用pH为7.0(图6)；
以Palmitoyl thio-PC为底物测定该新型磷脂酶A2热稳定性和pH稳定性，结果表明：该新型磷脂酶A2在pH＝7下，在30℃、40℃、50℃、60℃和70℃环境中保温2h后残余酶活分别为100％、83.4％、76.5％、58.2％和47.2(图7)；该新型磷脂酶A2在45℃下，pH 8稳定性良好，在45℃下保温5天时，在pH＝8下残余酶活为100％，在pH＝4、pH＝5、pH＝6、pH＝7和pH＝9环境中保温5天的残余酶活分别为11.2％、40.3％、61.1％、81.4％和50％(图8)。
实施例6：新型磷脂酶A2在枯草芽孢杆菌重组菌株中的表达及制备
①将枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-pla2接种于含卡纳霉素 (50μg/mL)LB液体培养基中，37℃，220r/min培养过夜；
②按1％接种量转接于50mL的LB培养基中，37℃，220r/min培养48h，4000 r/min离心15min后收集上清获得高活力磷脂酶A2粗酶液，以Palmitoyl thio-PC 为底物在45℃，pH＝7.0的条件下，测定新型磷脂酶A2粗酶液酶活力。枯草芽孢杆菌表达新型磷脂酶A2重组菌株发酵后磷脂酶A2酶活可达到168U/mL；
③随后收集上清，先以25％饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到65％，沉淀目的蛋白。溶解后透析除盐，再将盐析脱盐后得到的活性组分用 0.02mol/LTris-HCl(pH 8.0)缓冲液溶解，上样至离子交换层析柱后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含0～1mol/LNaCl的0.02mol/LTris-HCl(pH 8.0)缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白。离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/L NaCl的 0.02mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液平衡，上样至凝胶柱后用相同的缓冲液以 0.5mL/min的速度洗脱，获得纯化的酶液。纯化后酶液经冷冻干燥制得高活力磷脂酶A2纯酶酶粉。
实施例7：新型磷脂酶A2在解淀粉芽孢杆菌重组菌株中的表达及制备
①将解淀粉芽孢杆菌重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-pla2接种于含卡纳霉素(50μg/mL)LB液体培养基中，37℃，220r/min培养过夜；
②按1％接种量转接于50mL的LB培养基中，37℃，220r/min培养48h，4000 r/min离心15min后收集上清获得高活力磷脂酶A2粗酶液，以Palmitoyl thio-PC 为底物在45℃，pH＝7.0的条件下，测定新型磷脂酶A2粗酶液酶活力。解淀粉芽孢杆菌表达新型磷脂酶A2重组菌株发酵后磷脂酶A2酶活可达到416U/mL；
③随后采用实施例6的方法，使用分级盐析法沉淀酶蛋白，收集蛋白质沉淀，溶解后透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得高活力磷脂酶 A2纯酶酶粉。
实施例8：新型磷脂酶A2在地衣芽孢杆菌重组菌株中的表达及制备
①将地衣芽孢杆菌重组菌株TCCC11965/pBSA43-pla2接种于含卡纳霉素 (50μg/mL)LB液体培养基中，37℃，220r/min培养过夜；
②按1％接种量转接于50mL的LB培养基中，37℃，220r/min培养48h，4000 r/min离心15min后收集上清获得高活力磷脂酶A2粗酶液，以Palmitoyl thio-PC 为底物在45℃，pH＝7.0的条件下，测定新型磷脂酶A2粗酶液酶活力。地衣芽孢杆菌表达新型磷脂酶A2重组菌株发酵后磷脂酶A2酶活可达到273U/mL；
③随后采用实施例6的方法，使用分级盐析法沉淀酶蛋白，收集蛋白质沉淀，溶解后透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得高活力磷脂酶 A2纯酶酶粉。
实施例9：新型磷脂酶A2的酶活提高
将本发明中的重组磷脂酶A2氨基酸序列在NCBI上BLAST进行同源比对，发现本发明中来自解淀粉芽孢杆菌的磷脂酶A2序列与NCBI上解淀粉来源的磷脂酶A2序列(WP_065982134.1)相似度为98.46％，采用实施例2、3、4相同的方法将二者在枯草芽孢杆菌重组菌株WB600中进行表达、发酵并测定发酵液酶活，结果显示本发明的新型磷脂酶A2酶活约是WP_065982134.1的3.3倍。
实施例10：新型磷脂酶A2进行油脂脱胶
准确称量压榨后没有经过任何加工的花生油50g，水浴加热到70℃时，加入0.13mL45％柠檬酸溶液，10000r/min均质1min；在70℃下继续搅拌(500r/min) 反应25min，使花生油与柠檬酸混合均匀；500r/min机械搅拌20min。4000r/min 离心10min，取上清，冷却至40℃后，45％的柠檬酸溶液，调pH至6.0，500r/min，搅拌5min；再加入2.0mL去离子水和2000UPLA2(本发明实施例6-8任意实施例制备)，10000r/min，均质1min，在40℃和500r/min的条件下反应3h。反应结束后，将反应体系放入90℃的水浴锅中10min(灭酶活)，快速转移至离心机上，以5000r/min离心10min，收集上层油层，进行磷含量检测，发现花生油经过酶法脱胶后的磷含量由100.8mg/kg降至2.6mg/kg，符合油脂精炼的要求。
实施例11：以新型磷脂酶A2制备2-DHA-PC、2-EPA-PC
以PC、DHA和EPA为底物，PLA2(本发明实施例6-8任意实施例制备) 为催化剂制备2-DHA-PC和2-EPA-PC。反应体系为：PC的质量为160mg、EPA 和DHA的质量为280mg溶于5g甘油，磷脂酶A2酶粉1300U溶于0.5mL 1mmoL/L pH＝8.0的Tris-HCl缓冲溶液(含3mmoL/LCaCl2)，混合，反应温度为50℃、反应转速为500rpm/min、反应时间为32h时。PC和EPA、DHA经PLA2催化得到2-DHA-PC以及2-EPA-PC的转化率分别为66％和60％。
2-DHA-PC转化率(％)＝2-DHA-PC/PC×100％；
2-EPA-PC转化率(％)＝2-EPA-PC/PC×100％。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种新型磷脂酶A2及其基因、制备方法与应用
<130> 1
<141> 2020-12-21
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 780
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 1
atgtggactt ggaaagcaga caagcccgtc ggtaccattg tcataatctg gggggcaagc 60
gaataccacg ggcgttataa atggctcgtt gaaatgtgga gatcttccgg atataacgtg 120
gtgatgggtt ttttgcccgg tcagggaaca tccacccgcg ccagagggca tattcgctct 180
ttccaagaat acattgatga agtagatata tggattgata aagcgagaac gcttgaatcg 240
cccgttttcc ttttgttcca cagcatgggc ggactgattg cgatagaatg gtttaagcag 300
cagagaaatc cccgcattac ggcactcatt ttatcatcac cttgtcttgg gctgcaaata 360
aaagtcaata aagtgcttga ttttgcgtct aaaggactga atgtcctcac cccgtccctc 420
agagtggact ccggtttatc acctgatatg gcgacgagga atgcggatat gattgaagcg 480
gatcaaaacg attctttata tgtcacgaaa gtatctgtaa gatggtacag agagctttta 540
aaaaccattg atgccgctat ggtgccgact gatgcgtttt taaaagtgcc gcttttgctt 600
atgcagggcg gcgatgacaa aatcgttgat aaaatgaagg tccgcaaatg gttttccggt 660
gtggcttccc ataataaagc ataccggata tgggaagggc tttatcatga aatttttaat 720
gaaccggaaa gagaagctgt gtttaaggcg gcgaaagcct ttacagatca gtatatttga 780
<210> 2
<211> 259
<212> PRT
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 2
Met Trp Thr Trp Lys Ala Asp Lys Pro Val Gly Thr Ile Val Ile Ile
1 5 10 15
Trp Gly Ala Ser Glu Tyr His Gly Arg Tyr Lys Trp Leu Val Glu Met
20 25 30
Trp Arg Ser Ser Gly Tyr Asn Val Val Met Gly Phe Leu Pro Gly Gln
35 40 45
Gly Thr Ser Thr Arg Ala Arg Gly His Ile Arg Ser Phe Gln Glu Tyr
50 55 60
Ile Asp Glu Val Asp Ile Trp Ile Asp Lys Ala Arg Thr Leu Glu Ser
65 70 75 80
Pro Val Phe Leu Leu Phe His Ser Met Gly Gly Leu Ile Ala Ile Glu
85 90 95
Trp Phe Lys Gln Gln Arg Asn Pro Arg Ile Thr Ala Leu Ile Leu Ser
100 105 110
Ser Pro Cys Leu Gly Leu Gln Ile Lys Val Asn Lys Val Leu Asp Phe
115 120 125
Ala Ser Lys Gly Leu Asn Val Leu Thr Pro Ser Leu Arg Val Asp Ser
130 135 140
Gly Leu Ser Pro Asp Met Ala Thr Arg Asn Ala Asp Met Ile Glu Ala
145 150 155 160
Asp Gln Asn Asp Ser Leu Tyr Val Thr Lys Val Ser Val Arg Trp Tyr
165 170 175
Arg Glu Leu Leu Lys Thr Ile Asp Ala Ala Met Val Pro Thr Asp Ala
180 185 190
Phe Leu Lys Val Pro Leu Leu Leu Met Gln Gly Gly Asp Asp Lys Ile
195 200 205
Val Asp Lys Met Lys Val Arg Lys Trp Phe Ser Gly Val Ala Ser His
210 215 220
Asn Lys Ala Tyr Arg Ile Trp Glu Gly Leu Tyr His Glu Ile Phe Asn
225 230 235 240
Glu Pro Glu Arg Glu Ala Val Phe Lys Ala Ala Lys Ala Phe Thr Asp
245 250 255
Gln Tyr Ile
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
cgcggatcca tgtggacttg gaaagcaga 29
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
acgcgtcgac aatatactga tctgtaaagg ctttc 35

Claims (3)

1.一种磷脂酶A2，其特征在于，所述磷脂酶A2的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述磷脂酶A2在油脂脱胶方面的应用。
3.权利要求1所述磷脂酶A2在合成2-DHA-PC或2-EPA-PC方面的应用。
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