KR20120077750A - ＣａｌＢ 변이체 및 이를 이용한 글리세롤 카보네이트의 제조방법 - Google Patents

ＣａｌＢ 변이체 및 이를 이용한 글리세롤 카보네이트의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 아미노산 사이트 중 162번째 알라닌이 시스테인으로 변이되고, 308번째 류신이 시스테인으로 변이된 CalB 변이체는 고온에서도 열안정성을 확보할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 CalB 변이체를 이용하여 글리세롤로부터 글리세롤 카보네이트를 제조하는 경우, 본 발명에 따른 CalB 변이체가 고온에서 열안정성이 우수하기 때문에 반응속도 및 반응안정성을 증가시킬 수 있으며, 높은 효율로 대량의 글리세롤 카보네이트를 제조할 수 있다.

Description

ＣａｌＢ 변이체 및 이를 이용한 글리세롤 카보네이트의 제조방법{MUTANTS DERIVED FROM CalB AND METHOD FOR PREPARING GLYCEROL CARBONATE USING THE SAME}
CalB(Candida Antarctica Lipase B) 변이체 및 이를 이용한 글리세롤 카보네이트의 제조방법이 개시된다. 더욱 상세하게는, 고온에서 열안정성이 우수한 CalB 변이체 및 이를 이용하여 글리세롤 카보네이트를 고효율 및 안정적으로 합성할 수 있는 글리세롤 카보네이트의 제조방법이 개시된다.
최근 친환경 에너지 사업에 관심이 집중되면서, 바이오디젤에 대한 연구가 확대되고 있다. 따라서 바이오디젤의 생산량은 해마다 증가될 것으로 예측되고 있다. 이처럼, 바이오디젤의 생산량이 증가하면서 바이오디젤의 생산에 따라 발생하는 부산물들의 공급량도 과잉공급 추세에 있다. 상기 바이오디젤의 부산물로서 대표적인 것이 글리세롤이다. 상기 글리세롤은 다양한 글리세롤 유도체로의 변형이 가능하다. 예를 들면, 글리세롤 카보네이트, 에피클로히드린, 글리세롤 에테르, 1,3-프로판디올 등을 들 수 있다. 특히, 상기 글리세롤 카보네이트는 상온에서 맑고 무해할 뿐만 아니라 다양한 용도로 사용 가능하다. 예를 들면, 이차전지의 전해액, 계면 활성제, 각종 코팅제, 의약품, 화장품, 페인트 제거용 조성물 등의 주요 성분으로 사용될 수 있다.
글리세롤로부터 상기 글리세롤 카보네이트를 합성하는 방법으로서 하기 반응식 1 내지 3으로 표시되는 방법 등이 알려져 있다. 하기 반응식 1은 에틸렌 카보네이트(EC) 또는 프로필렌 카보네이트(PC)를 반응물질로 하는 반응방법(Huntsman 합성법)이고, 반응식 2는 우레아(urea)를 반응물질로 하는 방법이며, 반응식 3은 이산화탄소를 이용한 2단계 반응방법이다.
[반응식 1]
Figure pat00001
[반응식 2]
Figure pat00002
[반응식 3]
Figure pat00003

전술한 바와 같이, 지금은 바이오디젤 산업의 팽창과 더불어 바이오디젤의 부산물을 적극적으로 활용하고자 하는 방안이 검토되어야 한다. 특히, 바이오디젤의 부산물인 글리세롤을 이용한 글리세롤 카보네이트의 합성에 있어, 보다 효율적이고 친환경적이며 안정적인 글리세롤 카보네이트의 합성 방법이 요구되고 있고, 글리세롤로부터 글리세롤 카보네이트를 합성하기 위해 사용될 수 있는 촉매 중에는 생촉매인 CalB가 있으며, CalB는 다양한 변이체가 존재한다. 특히, 고온에서의 반응속도 등을 높이기 위해 열안정성이 뛰어난 CalB 변이체가 필요하다.
고온에서 열안정성이 우수한 CalB 변이체 및 이를 이용하여 글리세롤 카보네이트를 고효율 및 안정적으로 합성할 수 있는 글리세롤 카보네이트의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 일실시예에 따른 칸디다 앤탁티카(Candida Antarctica)로부터 분리한 리파아제 B(Lipase B)의 변이체는, 아미노산 사이트 중 162번째 알라닌이 시스테인으로 변이되고, 308번째 류신이 시스테인으로 변이되어 형성된다.
본 발명의 일측에 따르면, 상기 아미노산 사이트 중 162번째 알라닌이 시스테인으로 변이되고, 308번째 류신이 시스테인으로 변이된 CalB 변이체는 로제타 디자인(Rosetta Design) 방식의 컴퓨터 모델링을 통하여 에너지 값이 가장 낮도록 선택될 수 있다.
본 발명의 일측에 따르면, 상기 CalB 변이체에서, 아미노산 사이트는 X선 조사에 따른 B-인자(B-factor) 값이 15 이상인 사이트일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 칸디다 앤탁티카로부터 분리한 리파아제 B의 변이체인 CalB 변이체를 수득하는 방법은 CalB의 아미노산 사이트에서 B-인자 값이 15이상인 사이트를 선택하는 단계 및 상기 아미노산 사이트에서 162번째 알라닌이 시스테인으로 변이되고, 308번째 류신이 시스테인으로 변이되는 단계를 포함한다.
본 발명의 일측에 따르면, 상기 변이는 EcoRI_CalB_F(5'-ccgg GAATTC TTGCCGTCAGGTTCTGACCC-3'), NotI_CalB_R(5'-ccgg GCGGCCGC TCATGGCGTAACGATACC-3'), Q156C_MF(5'-CCT AGT GTC TGG TGT CAG ACGACC-3'), Q156C_MR(5'-GGT CGT CTG ACA CCA GAC ACT AGG-3'), L163C_MF(5'-GGT TCCGCG TGT ACG ACC GCC-3'), L163C_MR(5'-GGC GGT CGT ACA CGC GGA ACC-3'), N169C_MF(5'-GCC CTC CGG TGT GCA GGT GG-3'), N169C_MR(5'-CC ACC TGC ACA CCG GAG GGC-3'), F304C_MF(5'-GCC CGT CCG TGT GCG GTC GGC-3'), F304C_MR(5'-GCC GAC CGC ACA CGG ACG GGC-3'), A162C_MF(5'-CG ACC GGT TCC TGT CTG ACG ACC GCC-3'), A162C_MR(5'-GGC GGT CGT ACA GGA ACC GGT CG-3'), K308C_MF(5'-GCG GTC GGC TGT CGT ACT TGC TCA GG-3'), K308C_MR(5'-CC TGA GCA AGT ACG ACA GCC GAC CGC-3'), S50C_MF(5'-AGC TTT GAT TGT AAT TGG ATT-3'), S50C_MR(5'-AAT CCA ATT ACA ATC AAA GCT-3'), A273C_MF(5'-A CAA AAG GTA TGT GCT GCG GCT T-3') 또는 A273C_MR(5'-A AGC CGC AGC ACA TAC CTT TTG T-3') 등의 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한 점 돌연변이 유발에 의하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 글리세롤 카보네이트의 제조방법은 글리세롤을 포함하는 시작물질을 제1항에 따른 CalB 변이체인 생촉매의 존재하에서 반응시켜 글리세롤 카보네이트를 합성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일측에 따르면, 상기 시작물질은 글리세롤 및 디메틸카보네이트를 포함할 수 있다.
본 발명의 일측에 따르면, 상기 글리세롤은 정제된 글리세롤, 크루드 글리세롤(crude glycerol) 또는 바이오디젤 합성시 생성되는 부산물로서의 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 글리세롤을 포함할 수 있다.
본 발명의 일측에 따르면, 상기 반응은 40℃ 내지 80℃의 온도에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 아미노산 사이트 중 162번째 알라닌이 시스테인으로 변이되고, 308번째 류신이 시스테인으로 변이된 CalB 변이체는 고온에서도 열안정성을 확보할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 CalB 변이체를 이용하여 글리세롤로부터 글리세롤 카보네이트를 제조하는 경우, 본 발명에 따른 CalB 변이체가 고온에서 열안정성이 우수하기 때문에 반응속도 및 반응안정성을 증가시킬 수 있으며, 높은 효율로 대량의 글리세롤 카보네이트를 제조할 수 있다.
도 1은 CalB 변이체의 대응 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 CalB 변이체의 SDS-PAGE를 나타낸 도면이다.
도 3은 분비된 CalB 변이체의 효소 작용 및 Pichia pastoris X33이 함유된 CalB 변이체의 세포 밀도에 있어서 배양 시간의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 CalB 변이체의 효소 작용에 대하여 60분간 40~70℃에서 사전 열처리의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 CalB 변이체의 효소 작용에 대하여 150분간 50℃에서 사전 열처리의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 시차주사형광분석(Differential Scanning Flourimetry; DSF)로 측정한 CalB 변이체에 대한 녹는 점을 비교한 그래프이다.
도 7은 CalB 변이체의 열 탈활성(thermal deactivation)을 나타낸 그래프이다.
도 8은 CalB 야생형의 Linewear-Burk 그래프이다.
도 9는 CalB A162C_K308C의 Linewear-Burk 그래프이다.
이하 본 발명의 일 실시예에 따른 CalB 변이체 및 이를 이용하여 글리세롤 카보네이트를 제조하는 방법을 상세하게 설명하도록 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 CalB 변이체는, 칸디다 앤탁티카(Candida Antarctica)로부터 분리한 리파아제 B(Lipase B)의 변이체에 있어서, 특정의 아미노산 사이트가 이종(異種)의 아미노산으로 변이되어 형성된 CalB(Candida Antarctica Lipase B) 변이체이고, 다음의 두 단계를 거쳐 수득할 수 있다.
첫 번째 단계는 CalB의 아미노산 배열에서, 높은 B-인자(B factor)값을 갖는 사이트(site)를 선택하는 단계이다. 일 예로서, X-선 데이터로부터 얻어진 원자 변위 파라미터(atomic displacement parameter)에 기초하여 높은 B-인자 값을 갖는 적절한 사이트를 선택할 수 있다. 단백질의 폴리펩타이드 백본(backbone)과 사이드 체인(side chain)은 원자의 열 운동(thermal motion)과 운동 에너지(kinetic energy)로 인하여 끊임없이 움직인다. 단백질 결정 구조에 있어서 B-인자는 원자의 평균적인 위치에서의 원자의 변동(fluctuation)을 나타낸다. B-인자는 열 운동(thermal motion)과 위치적인 무질서(positional disorder)로 인해 평형 상태에서 원자 전자 밀도(atomic electron densities)에 번짐(smearing)이 발생하였음을 반영한다. 효소적 트리아드(catalytic triads) 및 입체 특이적 포켓(stereo specificity pockets)과 같이 아미노산 잔기들이 함께 공통된 작용을 나타내는 아미노산을 제외하고, B-인자 값이 15 이상인 아미노산, 즉 열운동과 유연성(flexibility)이 큰 아미노산을 선택한다.
두 번째 단계는 첫 번째 단계에서 선택된 아미노산 사이트(site)를 더욱 견고한(rigid) 아미노산으로 치환하는 단계이다. 상기 로제타 디자인(Rosetta Design)이라고 하는 컴퓨터 모델링을 통하여 더욱 견고한 아미노산으로 치환하는 단계이다. 로제타 디자인 프로그램은 패킹(pack)이 잘 이루어지고, 소수성 원자(hydrophobic atoms)를 입체적 구조 안쪽으로 잘 숨기며, 극성 원자(polar atoms)의 수소결합 포텐셜(hydrogen bonding potential)이 우수한 아미노산 시퀀스를 찾아내는 프로그램이다. 로제타 디자인 프로그램을 통해 최종적으로 에너지값이 가장 작도록 하는 아미노산을 선택할 수 있게 된다. 로제타 디자인 프로그램은 자연적으로 발생된 단백질의 안정화 및 새로운 구조의 단백질 합성에 사용되어 왔다. 또한, 로제타 디자인 프로그램은 단백질의 구조적 안정성을 증가시키기 위해 단백질의 일부분을 다시 디자인하는데 사용된다.
상기 특정의 아미노산 사이트가 이종의 아미노산으로 변이되어 형성된 CalB 변이체는 상기 아미노산 사이트 중 162번째 알라닌이 시스테인으로 변이되고, 308번째 류신이 시스테인으로 변이된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 칸디다 앤탁티카로부터 분리한 리파아제 B의 변이체인 CalB 변이체를 수득하는 방법에 있어서, CalB의 아미노산 사이트에서 B-인자 값이 15 이상인 사이트를 선택하는 단계 및 상기 선택된 사이트를 상기 아미노산 사이트 중 162번째 알라닌이 시스테인으로 변이되고, 308번째 류신이 시스테인으로 변이되는 단계를 포함한다.
상기 변이는 EcoRI_CalB_F(5'-ccgg GAATTC TTGCCGTCAGGTTCTGACCC-3'), NotI_CalB_R(5'-ccgg GCGGCCGC TCATGGCGTAACGATACC-3'), Q156C_MF(5'-CCT AGT GTC TGG TGT CAG ACGACC-3'), Q156C_MR(5'-GGT CGT CTG ACA CCA GAC ACT AGG-3'), L163C_MF(5'-GGT TCCGCG TGT ACG ACC GCC-3'), L163C_MR(5'-GGC GGT CGT ACA CGC GGA ACC-3'), N169C_MF(5'-GCC CTC CGG TGT GCA GGT GG-3'), N169C_MR(5'-CC ACC TGC ACA CCG GAG GGC-3'), F304C_MF(5'-GCC CGT CCG TGT GCG GTC GGC-3'), F304C_MR(5'-GCC GAC CGC ACA CGG ACG GGC-3'), A162C_MF(5'-CG ACC GGT TCC TGT CTG ACG ACC GCC-3'), A162C_MR(5'-GGC GGT CGT ACA GGA ACC GGT CG-3'), K308C_MF(5'-GCG GTC GGC TGT CGT ACT TGC TCA GG-3'), K308C_MR(5'-CC TGA GCA AGT ACG ACA GCC GAC CGC-3'), S50C_MF(5'-AGC TTT GAT TGT AAT TGG ATT-3'), S50C_MR(5'-AAT CCA ATT ACA ATC AAA GCT-3'), A273C_MF(5'-A CAA AAG GTA TGT GCT GCG GCT T-3') 또는 A273C_MR(5'-A AGC CGC AGC ACA TAC CTT TTG T-3') 등의 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한 점 돌연변이 유발에 의하여 이루어진다. CalB 유전자의 부위 특이적 돌연변이 유도는 중복 확장 PCR을 이용하여 수행되는데, 이 방법에서는 야생형 템플(temple) DNA에 돌연변이를 도입하기 위하여 두 순차적인 PCR 두 순환 수행된다. 첫 번째 PCR 순환에서 사용되는 프라이머는 프라이머의 다른 두 쌍이다. 한 쌍은 DNA 야생형의 정방향 프라이머(F) 및 돌연변이 사이트를 포함하는 돌연변이화 역방향 프라이머(MR)이다. 다른 쌍은 돌연변이 사이트를 구성하는 돌연변이화 정방향 프라이머(MF) 및 DNA 야생형의 역방향 프라이머(R)이다. 두 번째 PCR 순환에서 사용되는 프라이머는 DNA 야생형의 정방향 프라이머(F) 및 역방향 프라이머(R)이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 글리세롤 카보네이트의 합성은 시작물질로서 글리세롤 및 디메틸카보네이트를 생촉매 존재 하에서 반응시킴으로써 이루어질 수 있다. 아래 반응식 4는 글리세롤 카보네이트의 합성 과정을 보여준다.
[반응식 4]
Figure pat00004

글리세롤 및 디메틸카보네이트를 시작물질로 하여 글리세롤 카보네이트를 제조함에 있어서 리파아제를 촉매로 사용할 수 있는데, 리파아제는 세제의 제조(detergent formulation), 생계면활성제의 합성(biosurfactant synthesis), 낙농산업(diary industry), 제지 제조(paper manufacture), 영양(nutrition), 화장품(cosmetics) 및 약품 제조(pharmaceutical processing)와 관련된 화학적 공정을 포함하는 다양한 분야에서 유용하게 사용되는 촉매이다.
한편, 상기 글리세롤로는 정제된 글리세롤뿐만 아니라 크루드 글리세롤이나 바이오디젤 합성 시 생성되는 부산물로서의 글리세롤을 사용할 수 있다.
상기 리파아제 촉매로서 일반적으로 사용되는 CalB는 반응온도가 60℃ 이상이 되면 불활성화로 인해 글리세롤 카보네이트의 생성률이 감소될 수 있다. 따라서 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 리파아제로 열적 안정성이 개선된 CalB 변이체를 사용할 수 있으며, 그 결과 40℃ 내지 80℃의 온도에서, 특히 70℃ 내지 80℃의 온도에서도 반응이 이루어질 수 있다.
이하 본 발명의 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 그러나 하기 실시예들에 의하여 본 발명의 기술적 사상이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
시험물질의 준비
최적화된 CalB 유전자는 성신여자대학교의 박성순 교수에게서 제공받은 것을 사용하였다. 제한효소(restriction enzyme) EcoRI, NotI는 Takara 사(일본)에서 구입하였다. QIAquick™ PCR 정제 키트는 QIAGEN 사(독일)에서 구입하였다. Pichia pastoris X33 종 및 pPICZalphaA 플라스미드(plasmid)는 Invitrogen 사(미국)에서 구입하였다. 파라-니트로페놀 팔미트산염(pNPP)는 Sigma-Aldrich 사(미국)에서 구입하였다. 모든 PCR 프라이머는 COSMO GENETECH 사(한국)에서 합성되었다. 모든 물질들은 별도의 정제 과정을 거치지 않고 사용되었다.
컴퓨터 시뮬레이션 설계
Protein Data Bank(www.rcsb.org)에서 얻은 칸디다 앤탁티카 리파아제B의 결정 구조(1TCA)는 CalB의 아미노산 잔기 중에 디설파이드 결합을 형성하기 위한 가능성을 결정하기 위하여 단백질(MODIP) 서버(http://caps.ncbs.res.in/iws/modip.html)에서 디설파이드 결정의 모델링이 제시되었다. 1TCA의 아미노산 잔기(B-인자 값)의 융통성은 상기 Protein Data Bank로부터 얻어졌다. 디설파이드 결합(A급)을 형성하기 위한 가장 높은 가능성을 갖는 아미노산 잔기의 쌍 및 다양한 범위의 B-인자 값들(높음-높음, 높음-낮음, 높음-중간 및 중간-중간)은 시스테인으로의 부위 특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis)를 위하여 선택되었다.
CalB 변이체의 클로닝 및 발현
pPICZalphaA 플라스미드에 서브클로닝(subcloning)을 하기 위하여, 상기 최적화된 CalB 유전자는 PCR로 증폭 및 복제되었다. 정방향 (5'-GCGCGAATTCTTGCCGTCAGGTTCTGACCC-3') 및 역방향(5'-GCGCGCGGCCGCTCATGGCGTAACGATACC-3') 프라이머는 EcoRI 및 NotI의 제한 사이트(restriction sites)를 이용하여 CalB 유전자의 시작 및 끝으로부터 유래한 것이다.
pPICZalphaA-CalB는 Wu 및 Letchworth의 전기 영동 방법을 이용하여 Pichia pastoris X33 종으로 변형되었다. 형질전환주(transformant)는 완화된 메탄올-복합 배양액(Buffered Methanol-complex Medium; BMMY)(1% 효모 추출물, 2% 펩토느 100mM 인산칼륨, pH 6.0, 1.34% YNB, 4x10-5% 비오틴, 0.5% 메탄올) 50ml에 접종되었고, 200rpm에서 96시간 동안 28℃에서 성장시켰다. 유도를 유지하기 위하여 매 24시간마다 0.5%메탄올의 최종 농도에 100% 메탄올이 첨가되었다. 상기 효소를 포함하는 상청액은 10분간 4℃, 4000rpm에서 원심분리하여 상기 세포를 제거하여 수득되었다.
부위 특이적 돌연변이 유도
CalB 유전자의 부위 특이적 돌연변이 유도는 중복 확장 PCR을 이용하여 수행되었다. 이 방법에서 야생형 템플(temple) DNA에 돌연변이를 도입하기 위하여 두 순차적인 PCR 두 순환 수행되었다.
두 DNA 부분(서열 윗부분과 함께 돌연변이 사이트를 포함하는 한 부분 및 서열 아랫부분과 함께 돌연변이 사이트를 구성하는 다른 부분)을 증폭하기 위하여 첫 번째 PCR 순환이 수행되었다. 이 단계에서, 프라이머의 다른 두 쌍이 두 개의 특정한 PCR 튜브에서 사용되었다. 한 쌍은 DNA 야생형의 정방향 프라이머(F) 및 돌연변이 사이트를 포함하는 돌연변이화 역방향 프라이머(MR)이다. 다른 쌍은 돌연변이 사이트를 구성하는 돌연변이화 정방향 프라이머(MF) 및 DNA 야생형의 역방향 프라이머(R)이다. 다른 조건은 표준 PCR 방법에 따라 수행되었다.
두 번째 PCR 순환은 DNA 템플로서 첫 번째 PCR 순환에서 두 개의 증폭된 DNA 부분을 이용하여 중복 DNA 부분을 증폭하기 위하여 수행된다. DNA 야생형의 정방향 프라이머(F) 및 역방향 프라이머(R)가 이 단계에서 사용되었다. 다른 조건은 표준 PCR 방법에 따라 수행되었다. 그 결과, 필요한 돌연변이가 첫 번째 PCR에서 두 개의 증폭된 DNA 부분의 중복 부분에서 제조되었다. 이 과정에서 사용된 모든 프라이머는 표 1에 표시하였다.
프라이머의 이름 서열 (5' 부터 3' 까지)
EcoRI_ CalB_F ccgg GAATTC TTGCCGTCAGGTTCTGACCC
NotI_ CalB_R ccgg GCGGCCGC TCATGGCGTAACGATACC
Q156C_MF CCT AGT GTC TGG TGT CAG ACGACC
Q156C_MR GGT CGT CTG ACA CCA GAC ACT AGG
L163C_MF GGT TCCGCG TGT ACG ACC GCC
L163C_MR GGC GGT CGT ACA CGC GGA ACC
N169C_MF GCC CTC CGG TGT GCA GGT GG
N169C_MR CC ACC TGC ACA CCG GAG GGC
F304C_MF GCC CGT CCG TGT GCG GTC GGC
F304C_MR GCC GAC CGC ACA CGG ACG GGC
A162C_MF CG ACC GGT TCC TGT CTG ACG ACC GCC
A162C_MR GGC GGT CGT ACA GGA ACC GGT CG
K308C_MF GCG GTC GGC TGT CGT ACT TGC TCA GG
K308C_MR CC TGA GCA AGT ACG ACA GCC GAC CGC
S50C_MF AGC TTT GAT TGT AAT TGG ATT
S50C_MR AAT CCA ATT ACA ATC AAA GCT
A273C_MF A CAA AAG GTA TGT GCT GCG GCT T
A273C_MR A AGC CGC AGC ACA TAC CTT TTG T
리파아제 작용
파라-니트로페놀 팔미트산염(pNPP)가 CalB 변이체의 작용을 비교하기 위하여 사용되었다. 파라-니트로페놀에 대한 흡광계수(extinction coefficent)는 405nm, pH 8.0에서 18.56mM-1cm-1이었다. 효소 작용의 한 유닛(unit)은 분당 1μmol의 파라-니트로페놀을 유리시키기 위해 필요한 효소의 양으로써 정의되었다. 본래의 분석은 아세톤니트릴(1%), 에탄올(4%) 및 50mM 트리스-HCl 완화(pH 8.0)(95%)의 용액에 용해된 10mM pNPP가 사용되었다. 상기 효소 용액(50μg/ml) 10μl는 상기 기질 용액 3ml에 첨가되었고, 상기 반응은 30분 동안 45℃에서 수행되었다.
CalB의 열 작용은 다른 온도에서 상기 효소 작용을 측정하는 것으로 평가되었다. 상기 효소 용액은 1시간 동안 40 내지 70℃에서 배양되었고, 10분간 얼음 위에서 냉각되었다. 상기 효소 작용은 위에서 설명한 것과 같이 분석되었다.
시차주사 형광분석법( Differential Scanning Flourimetry )
열 중첩플림(thermal unfolding)은 시차주사 형광분석기, CFX96 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad사, 미국)에 의해 수행되었다. 96-웰 얇은벽 PCR 플레이트(Bio-Rad사, 미국)은 1μM 단백질 시료, 1X SYPRO 오렌지 염료(Invitrogen사, 미국), 150mM NaCl 및 10mM HEPES 완화제(pH 7.0)를 함유한 각 웰로 셋팅되었다. 단백질 대신 dH2O를 함유한 음성제어 웰이 포함되었다. 상기 분석은 30초당 0.5℃ 상승시키면서 30~70℃의 형광 변화를 측정하였다. 여기 및 방사 파장은 각각 490nm 및 575nm였다. 녹는점(Tm)는 제조자의 소프트웨어로 계산된 시작 점 및 최대점 사이의 이행 중간값이었다.
CalB 변이체의 키네틱( kinetic )
a. CalB 변이체의 열적 불활성화
CalB 변이체는 0 내지 150분의 다른 시간 간격동안 50℃에서 배양된 후, 10분 간 얼음에서 냉각하였다. 상기 효소 활성은 위에서 설명한 것과 같이 45℃에서 분석되었다. 상기 데이터는 일차 그래프로 표시되었고, 배양 시간(t)에 대하여 ln(잔기 작용)의 선형 회귀에 의해 결정되는 1차 속도 상수(first-order rate constants)(k d )로 분석되었다. 50℃에서 CalB 변이체의 활성이 초기 대비 절반(t1 /2)으로 감소하는 시간은 다음 식으로 계산되었다.
Figure pat00005

b. CalB 변이체의 키네틱 효율
10μl CalB 변이체들을 이용하여 p-니트로페닐 팔미트산염(pNPP)을 20μM에서 100μM의 농도로 증가시키면서 Tris-HCl 완충용액, pH 8.0(95%), 에탄올(4%)에서 효소 분석을 수행되었다. Linewear-Burk 그래프를 이용하여 CalB 변이체의 Km 및 Vmax를 결정하였다.
[결과]
열 안정성을 향상시키기 위한 단백질 엔지니어링에 대한 목표 잔기의 선택
단백질에 디설파이드 결합을 합리적으로 도입하는 것은 T4 리소자임(lysozyme), 서브틸리신(subtilisin), 대장균 리보뉴클레아제(ribonuclease), 트리코더마 레세이(trichoderma reesei) 엔도-1,4-β-크실라나아제(xylanase) II 등의 열 안정성을 향상시키기 위해 적용되어 왔다. 돌연변이 유도에 있어서 잔기의 바람직한 쌍에 대한 선택은 전체 과정의 성공에 있어서 매우 중요한 역할을 한다. 단백질에서 디설파이드 결합의 모델링을 하기 위한 소프트웨어인 MODIP는 디설파이드 결합의 형성에 기하학적으로 적합한 단백질의 사이트를 예측하기 위하여 개발되었다. MODIP는 하나의 디설파이드 결합 I327C/D375C를 도입하는 것에 의하여 노랑 초파리(Drosophila melanogaster) 아세틸콜린 가수분해 효소(acetylcholinesterase)의 안정성을 향상시키기 위하여 적용되어 왔다.
MODIP에서, 상기 모델링된 디설파이드 결합은 특정한 입체화학적인 인자들(stereo-chemical parameters)을 기초로 평가되었다 (2면각 및 S-S 결합 거리). 상기 모델링된 디설파이드 결합 중 자연적인 디설파이드 결합에서 일어나는 2면각과 같은 이상적인 값의 범위를 갖는 것들은 A 등급으로 배정되었다. S-S 공유결합을 형성하기에 기하학적으로 적절한 것들은 B 등급이며, 디설파이드 결합을 형성하기에 너무 가깝거나 구조가 어긋난 것들은 C 등급으로 배정되었다.
MODIP 서버(http://caps.ncbs.res.in/iws/modip.html)에서 Protein Data Bank로부터 형성된 PBD에서 CalB 구조를 제안한 후에, 표 2와 같이 아미노산 잔기 중에 디설파이드 가교의 가능성의 결과를 얻었다. 상기 결과를 통하여, CalB 구조에서 디설파이드 가교를 형성하기 위한 99개의 가능성이 있다는 것을 알게 되었으며, 상기 쌍들 중 A 등급이면서 가장 높은 가능성을 나타내는 21개 쌍을 선택하여 추가적인 연구를 수행하였다.
[표 2]
Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009

추가적인 디설파이드 가교를 조작하는 데 있어서 본 연구에서 이용한 또 다른 전략은 아미노산 잔기의 B-인자 값이다. B-인자 값은 열적 동작 및 위치적인 무질서의 결과로서 그것들의 균형 상태에 관한 원자의 전자 밀도의 번짐현상을 반영하는 것으로, 단백질의 열 안정성을 향상시키기 위한 전략으로써 잘 알려져 있다. A 등급에서 아미노산 잔기의 B-인자 값은 표 3에 나타내었다.
No. Type 잔기 i 잔기 j
잔기 Res No B-인자 잔기 Res No B-인자
1 본래 CYS 22 7.91 CYS 64 5.32
2 모델 ALA 25 11.43 VAL 30 10.48
3 모델 THR 42 6.79 GLN 46 8.74
4 모델 THR 43 7.29 SER 67 6.12
5 모델 SER 50 8.36 ALA 273 9.73
6 모델 SER 50 8.36 ALA 274 8.99
7 모델 ASP 75 6.64 VAL 78 7.11
8 모델 TRP 155 7.07 GLU 294 7.07
9 모델 GLN 156 5.44 LEU 163 7.46
10 모델 ALA 162 6.50 LYS 308 18.66
11 모델 ALA 166 6.22 ALA 305 11.36
12 모델 ASN 169 9.42 PHE 304 12.16
13 모델 GLN 175 9.01 THR 179 5.06
14 모델 THR 180 4.62 ALA 240 7.18
15 모델 TYR 183 5.42 SER 202 5.20
16 모델 SER 195 6.98 SER 197 7.16
17 모델 GLN 211 7.38 ALA 214 9.06
18 본래 CYS 216 11.51 CYS 258 11.69
19 모델 SER 239 7.44 ALA 248 9.28
20 모델 SER 239 7.44 ASP 252 14.60
21 본래 CYS 293 9.04 CYS 311 10.74
본래의 디설파이드 결합(Cys22-Cys64, Cys216-C258 및 Cys293-Cys311) 및 CalB 야생형의 스테레오 포켓 사이트(stereo pocket site) Thr2(Thr42-Gln46)에 속하는 아미노산 쌍을 제외하고, A 등급의 17개의 남은 아미노산 쌍들은 그들의 굴곡성(B-인자 값) 및 CalB 촉매 활성점으로부터의 거리에 대하여 비교하였다. 그 결과, 비교적 촉매 활성점으로부터 거리가 멀고 B-인자 값의 다양한 쌍(각각 낮음-높음, 낮음-낮음, 중간-중간 및 중간-높음)을 갖는 네 쌍의 아미노산 잔기들(A162-K308, Q156-L163, S50-A273 및 N169-F304)이 부위 특이적 돌연변이 유도를 위하여 선택되었다.
CalB 변이체의 클로닝 및 발현
네 개의 CalB 변이체 쌍(A162-K308, Q156-L163, S50-A273 및 N169-F304)은 PCR 중첩 확장을 통하여 제조되었다. 또한 이들 변이체의 정확한 서열 확인을 위하여 COSMP GENETECH에서 상기 돌연변이를 서열화하였으며, CalB 야생형 및 그 변이체들의 비교 결과는 도 1에 나타냈다. 도 1a에서, CalB 야생형에서 아미노산 N169에 대한 코돈 AAC 코딩은 시스테인에 대하여 코돈 TGT 코딩으로 돌연변이화되었고, 야생형에서 아미노산 F304에 대한 코돈 TTT 코딩은 시스테인에 대하여 코돈 TGT 코딩으로 돌연변이화되었다. 유사하게 CalB 야생형의 A162 및 K308dp 대한 두 개의 코돈 GCG 및 AAA 코딩은 도 1b에 나타낸 것과 같이 시스테인에 대하여 두 개의 코돈 TGT 코딩으로 돌연변이화되었고, 도 1c에 나타낸 것과 같이, 야생형의 S50 및 A273C에 대한 두 개의 코돈 TCT 및 GCG 코딩은 시스테인에 대하여 TGT 코딩으로 돌연변이화되었고, 도 1d에 나타낸 것과 같이 CalB 야생형의 Q156 및 L163에 대한 두 개의 코돈 CAA 및 CTG 코딩은 시스테인에 대하여 TGT 코딩으로 돌연변이화 되었다. 상기 비교 결과를 통하여 네 개의 CalB 돌연변이는 성공적으로 제조되었다고 판단되었다. 따라서 이 돌연변이들은 Pichia pastoris X33에서 형질변환을 위하여 선택되었다.
CalB 돌연변이들의 양성 형질변환주는 그것들의 효소 활성을 확인하기 위하여 선택되었다. 가장 높은 효소 활성을 보이는 형질변환주는 많은 양의 효소를 수득하기 위하여 96시간 동안 28℃, 200rpm, BMMY 배지에서 배양하였다. 96시간 동안 배양한 후에 분비된 CalB의 존재를 확인하기 위하여 SDS-PAGE 분석을 수행하였으며 그 결과는 도 2에 나타내었다. 상기 결과를 통하여 모든 시료들은 CalB의 분자량에 상응하는 약 33kDa 주변의 밴드를 갖는다는 것이 확인할 수 있었으며, 이는 CalB 유전자 변이체들은 Pichia pastoris X33으로부터 성공적으로 발현되었다는 것을 의미한다. CalB 야생형, CalB A162C_K308C 및 CalB S50C_A273C의 밴드 밀도는 CalB Q156C_L163C 및 CalB N169C_L163C와 유사하거나 더 높았다. 이것은 CalB A162C_K308C 및 CalB S50C_A273C의 발현 수준은 그것의 CalB 야생형과 유사하다는 것을 나타낸다. 한편, CalB Q156C_L163C 및 CalB N169C_F304C의 발현 수준은 그것의 CalB 야생형과 비교했을 때 줄어들었다.
CalB 변이체의 효소 활성 및 세포 밀도는 배양 과정 중 매 12시간 마다 측정하였으며, 그 결과는 도 3에 나타내었다((△) CalB 야생형, (▽) CalB A162C_K308C, (◇) CalB S50C_A273C, (□) CalB Q156C_L163C, (○) CalB N169C_F304C). 도 3에 나타낸 것과 같이 배양시간이 증가될 때 CalB 변이체를 함유한 Pichia pastoris X33의 세포 밀도는 증가되었고, 그것들은 96시간 배양 후에 최대의 세포 밀도에 도달했다. 96시간 배양 후 이들 효모의 세포 밀도는 표 4에 나타내었다. 상기 결과를 통하여, CalB 변이체를 함유한 Pichia pastoris X33의 성장 속도는 야생형 균주와 유사하다고 판단되었다. 또한 도 3에서 확인할 수 있는 것처럼, 배양시간이 증가되었을 때 CalB 변이체의 효소 활성은 증가하였으며, 대부분의 CalB 변이체는 96시간 배양 후 가장 높은 효소 활성을 나타내었다. 96시간 배양 후 CalB 변이체들의 효소 활성값은 표 4에 나타내었다. 세포 밀도와 효소 활성을 고려한 고유 활성 (Specific Activity)을 비교할 경우 CalB A162C_K308C 및 CalB S50C_A273C은 CalB 야생형 대비 91.43% 및 41.43%였다. 반면, CalB Q156C_L163C 및 CalB N169C_F304C의 고유 활성은 CalB 야생형과 비교했을 때 각 10.18% 및 4.14%로 매우 낮은 값을 나타내었다. 상기 결과를 통하여 CalB A162C_K308C에서의 돌연변이는 Pichia pastoris X33에서 이 효소의 발현 수준에 중요한 영향을 주지 않는다고 판단되었다. CalB S50C_A273C에서의 돌연변이는 Pichia pastoris X33에서 이 효소의 발현 수준에 상당한 영향을 주었다. 또한 CalB Q156C_L163C 및 CalB N169C_F304C에서의 돌연변이는 Pichia pastoris X33에서 이 효소의 발현 수준에 매우 큰 영향을 주었다.
CalB 변이체 효소 활성
(U/ml)		 세포 밀도
(OD600)		 고유 활성
(U/ml. OD600)		 돌연변이 및 그것의 야생형 사이에서의 고유활성비
(%)
야생형 0.486 17.36 0.028 100
A162C_K308C 0.380 14.84 0.0256 91.43
S50C_A273C 0.195 16.86 0.0116 41.43
Q156C_L163C 0.0524 18.36 0.00285 10.18
N169C_F304C 0.0218 18.76 0.00116 4.14
CalB 변이체의 열 안정성
96시간 배양 후, 효소를 함유한 상청액을 얻기 위하여 모든 CalB 변이체들을 모은 후 4000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 각 효소 상청액은 Amicon 15 울트라-멤브레인을 이용하여 정제수로 완충 교환하였으며, 상기 완충 교환된 CalB 변이체들을 이용하여 열 안정성을 확인하였다. CalB 변이체들의 불활성화 정도는 40~70℃의 범위에서 각 효소를 1시간 동안 배양한 후 아이스 박스에서 10분간 냉각시킨 후 측정하였다.
도 4에 나타낸 것과 같이, 반응온도 40℃에서 거의 모든 CalB의 잔류 활성은 초기 효소 활성과 비교했을 때 감소되었다((△) CalB 야생형, (▽) CalB A162C_K308C, (◇) CalB S50C_A273C, (□) CalB Q156C_L163C, (○) CalB N169C_F304C). 다만 상기 온도에서 두 변이체 CalB A162C_K308C 및 CalB N169C_F304C의 잔류 활성은 CalB 야생형보다 약간 더 높았다(야생형은 초기 활성 대비 70%가 남았으나 이들 변이체는 각각 80% 및 90% 잔류 활성을 나타내었음). 반면, CalB Q156C_L163C의 잔류 활성은 초기 대비 약 50%정도였으며, 상기 온도는 CalB Q156C_L163C의 열 안정성에 매우 큰 영향을 주었다.
상기 배양 온도가 50℃로 상승되었을 때, CalB A162C_K308C의 잔류 활성은 초기 대비 60%로 40%를 나타낸 CalB 야생형보다 1.5배 더 높았다. 반면, 나머지 CalB 변이체는 50℃에서 효소 활성이 매우 감소되었다(CalB S50C_A273C, CalB N169C_F304C 및 CalB Q156C_F304C 각각 20%, 20% 및 5%).
상기 배양 온도가 60℃로 상승되었을 때, CalB A162C_K308C의 잔류 활성은 CalB 야생형의 잔류 활성이 약 25%에 머무른 반면에 약 45%였다. 상기 결과는 다른 변이체 CalB S50C_A273C, CalB N169C_F304C 및 CalB Q156C_F304C는 향상된 열 안정성을 보이지 않은 반면에, CalB A162C_K308C가 CalB 야생형보다 향상된 열 안정성을 나타낸다는 것을 입증했다. 표 5에는 60분간 40~70℃의 범위에서 반응하였을 때, 초기 효소 활성 대비 50%가 남았을 때(T50 60)의 온도를 나타내었다. 상기 결과를 통하여 A162C_K308C 변이체의 T50 60는 CalB 야생형보다 8.5℃ 높은 것이 확인되었다. 반면 나머지 CalB 변이체들은 CalB 야생형과 비교했을 때, T50 60에서의 향상이 보여지지 않았다.
CalB 변이체 T50 60 (℃) Tm (℃)
야생형 46.5 54.8
A162C_K308C 55 55.9
S50C_A273C 43.5 54.6
Q156C_L163C 40.5 46.1
N169C_F304C 45.5 56.3
도 4을 통하여, 50℃는 거의 모든 CalB 변이체의 열 안정성에 매우 큰 영향을 준다는 것을 알 수 있었다. 따라서 50℃에서의 사전 열처리 시간이 CalB 변이체의 열 안정성에 어떤 영향을 주는지 조사하였다. CalB A162C_K308C와 나머지 CalB 변이체들과의 열 안정성의 차이는 150분간 배양 후 쉽게 발견할 수 있었다. CalB A162C_K308C는 CalB 야생형, CalB S50C_A273C, Q156C_L163C 및 N169C_F304C보다 각각 3.2배, 6.8배, 20배 및 8배 높은 잔류 활성을 나타내었다(도 5).
CalB 변이체의 입체 형태적 안정성을 확인하기 위하여, 시차주사 형광분석법(DSF)에 근거한 CalB 변이체의 녹는점(Tm)을 측정하였다. DSF는 상기 단백질 중첩플림 상태로서 노출되는 단백질의 소수성 부분과의 친연성을 갖는 염료의 형광 강도에서의 증가에 의해 측정된다. 상기 단백질이 녹을 때, 단백질의 소수성 영역은 점진적으로 노출된다. DSF 분석의 결과는 도 6에 나타내었다((△) CalB 야생형, (▽) A162C_K308C, (◇) S50C_A273C, (□) Q156C_L163C 및 (○) N169C_F304C). 출발점 및 녹는점으로 간주될 수 있는 최고점 사이의 전이 중간값은 표 5에 나타냈다. A162C_K308C의 Tm은 CalB 야생형보다 1.1℃ 높았다.
상기 결과를 통하여 CalB A162C_K308C는 그 야생형과 비교했을 때 향상된 열 안정성을 보인다고 판단되었다. 반면 나머지 CalB 변이체들은 그 야생형과 비교했을 때 열 안정성이 감소되었다. 추가적인 디설파이드 결합을 도입하는 것에 의하여 단백질의 안정성이 감소하는 것은 노랑 초파리의 아세틸콜린 가수분해 효소, Bacillus amyloliquefaciens의 서브틸리신 및 T4 리조자임의 하나 또는 일부 변이체에서 보고되었다. CalB A162C_K308C는 높은 B-인자 값(K308에 대하여 18.66) 및 낮은 B-인자 값(A162에 대하여 6.5)을 갖는 두 아미노산 잔기로부터 제조되었다. 두 사이트 사이의 교차결합의 형성은 K308 사이트의 강도를 향상시킬 것이다. 이것이 CalB 야생형에 비해 상기 변이체의 열 안정성이 향상되는 이유이다.
CalB 변이체의 키네틱
CalB 변이체의 열 탈활성은 다음의 키네틱 모델에 근거한다.
Figure pat00010
여기서 N은 본래 자연적인 상태, I는 열적으로 비활성화된 상태, kd는 열적 비활성 속도 상수이다. 본 발명에서 CalB 변이체들은 0 내지 150분 동안 30분 간격으로 50℃에서 배양된 후 10분간 아이스박스에서 냉각되었다. 사전 열처리된 CalB 변이체들의 활성을 측정하기 위하여 P-니트로페닐 팔미트산의 가수분해 반응을 이용하였으며, 30분 동안 45℃에서 측정되었다. 상기 효소 활성에서 열처리의 효과는 도 7에 나타내었다((△) CalB 야생형, (▽) A162C_K308C, (◇) S50C_A273C, (□) Q156C_L163C 및 (○) N169C_F304C). 도 7에 나타낸 것과 같이 상기 CalB 변이체의 kd는 표 6에 나타낸 것과 같이 추정된다. CalB 야생형의 kd는 50℃에서 CalB A162C_K308C보다 4.45배 컸다. 이것은 CalB 야생형은 CalB A162C_K308C보다 상기 온도에서 더 빨리 비활성화된다는 것을 의미한다. 또한 표 6에 나타낸 것과 같이 효소의 활성이 초기 대비 50% 남아있을 때까지의 반감기(t1 /2)를 나타내었다. CalB 야생형은 50℃에서 약 49분 후에 그 효소 활성이 50%를 유지했고, CalB A162C_K308C의 초기 활성 대비 50%까지 감소하기 위한 시간은 표 6에 나타낸 것과 같이 약 220분이었다. CalB A162C_K308C의 t1 /2은 CalB 야생형 보다 4.5배 높았다.
CalB 변이체 kd (분-1)a t1 /2 (분)b
야생형 0.01405 49.3
A162C_K308C 0.00316 219.7
S50C_A273C 0.02069 33.5
Q156C_L163C 0.04281 16.2
N169C_F304C 0.01541 45.0
Figure pat00011
상기 조사된 CalB 변이체 중 CalB A162C_K308C는 가장 높은 열 안정성을 나타내었으며, 이 변이체의 키네틱 거동에 있어서의 효과를 알아보기 위하여 pNPP를 기질로 사용한 가수분해 반응에 적용하였다. 효소 활성 분석은 10분간 45℃, 200rpm에서 20 에서 100μM로 pNPP의 농도를 증가시키면서 Tris-HCl 완충액, pH 8.0에서 수행되었다. 상기 키네틱 파라미터를 결정하기 위하여 사용된 상기 Linewear-burk 그래프는 도 8및 도 9에 나타냈다. CalB 야생형은 11.159μM의 Michalis-Menten 상수(Km) 및 10.442μM.s-1의 최대 속도(Vmax)를 나타냈고, CalB A162C_K308C 변이체는 약간 증가된 Km 및 Vmax(각각 12.303μM 및 10.474μM.s-1)(표 7)를 나타냈다. CalB A162C_K308C의 상기 촉매 효율(Vmax/Km으로 표현됨)은 CalB 야생형과 비교했을 때 조금 감소되었다(각각 0.936 및 0.851s-1). CalB A162C_K308C의 상기 돌연변이는 pNPP의 상기 가수분해 반응에서 리파아제의 촉매 작용에 아주 적은 효과를 갖는다는 것을 의미하고, CalB A162C_K308C의 열 안정성은 그 효소 작용에서 거의 영향을 주지 않도록 실제로 향상되었다.
CalB 변이체 Km (μM) Vmax (μM.s-1) Vmax/Km (s-1)
야생형 11.159 10.442 0.936
A162C_K308C 12.303 10.474 0.851
이상에서 실시예를 중심으로 설명하였으나 이는 단지 예시일 뿐 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 본 실시예의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위에서 이상에 예시되지 않은 여러 가지의 변형과 응용이 가능함을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 실시예에 구체적으로 나타난 각 구성요소는 변형하여 실시할 수 있는 것이다. 그리고 이러한 변형과 응용에 관계된 차이점들은 첨부된 청구 범위에서 규정하는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

  1. 칸디다 앤탁티카(Candida Antarctica)로부터 분리한 리파아제 B(Lipase B)의 변이체에 있어서, 아미노산 사이트 중 162번째 알라닌이 시스테인으로 변이되고, 308번째 류신이 시스테인으로 변이되어 형성된 CalB(Candida Antarctica Lipase B) 변이체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아미노산 사이트 중 162번째 알라닌이 시스테인으로 변이되고, 308번째 류신이 시스테인으로 변이된 CalB 변이체는 로제타 디자인(Rosetta Design) 방식의 컴퓨터 모델링을 통하여 에너지 값이 가장 낮도록 선택되어 변이된 CalB 변이체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 CalB 변이체에서, 아미노산 사이트는 X선 조사에 따른 B-인자(B-factor) 값이 15 이상인 사이트인 CalB 변이체.
  4. 칸디다 앤탁티카로부터 분리한 리파아제 B의 변이체인 CalB 변이체를 수득하는 방법에 있어서,
    CalB의 아미노산 사이트에서 B-인자 값이 15 이상인 사이트를 선택하는 단계; 및
    상기 아미노산 사이트에서 162번째 알라닌이 시스테인으로 변이되고, 308번째 류신이 시스테인으로 변이되는 단계를 포함하는 CalB 변이체를 수득하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 변이는 EcoRI_CalB_F(5'-ccgg GAATTC TTGCCGTCAGGTTCTGACCC-3'), NotI_CalB_R(5'-ccgg GCGGCCGC TCATGGCGTAACGATACC-3'), Q156C_MF(5'-CCT AGT GTC TGG TGT CAG ACGACC-3'), Q156C_MR(5'-GGT CGT CTG ACA CCA GAC ACT AGG-3'), L163C_MF(5'-GGT TCCGCG TGT ACG ACC GCC-3'), L163C_MR(5'-GGC GGT CGT ACA CGC GGA ACC-3'), N169C_MF(5'-GCC CTC CGG TGT GCA GGT GG-3'), N169C_MR(5'-CC ACC TGC ACA CCG GAG GGC-3'), F304C_MF(5'-GCC CGT CCG TGT GCG GTC GGC-3'), F304C_MR(5'-GCC GAC CGC ACA CGG ACG GGC-3'), A162C_MF(5'-CG ACC GGT TCC TGT CTG ACG ACC GCC-3'), A162C_MR(5'-GGC GGT CGT ACA GGA ACC GGT CG-3'), K308C_MF(5'-GCG GTC GGC TGT CGT ACT TGC TCA GG-3'), K308C_MR(5'-CC TGA GCA AGT ACG ACA GCC GAC CGC-3'), S50C_MF(5'-AGC TTT GAT TGT AAT TGG ATT-3'), S50C_MR(5'-AAT CCA ATT ACA ATC AAA GCT-3'), A273C_MF(5'-A CAA AAG GTA TGT GCT GCG GCT T-3') 또는 A273C_MR(5'-A AGC CGC AGC ACA TAC CTT TTG T-3')로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한 점 돌연변이 유발에 의하여 이루어지는 CalB 변이체를 수득하는 방법.
  6. 글리세롤을 포함하는 시작물질을 제1항에 따른 CalB 변이체인 생촉매의 존재하에서 반응시켜 글리세롤 카보네이트를 합성하는 단계를 포함하는 글리세롤 카보네이트의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 시작물질은 글리세롤 및 디메틸카보네이트를 포함하는 글리세롤 카보네이트의 제조방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 글리세롤은 정제된 글리세롤, 크루드 글리세롤(crude glycerol) 또는 바이오디젤 합성시 생성되는 부산물로서의 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 글리세롤을 포함하는 글리세롤 카보네이트의 제조방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 반응은 40℃ 내지 80℃의 온도에서 이루어지는 글리세롤 카보네이트의 제조방법.

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