KR102244489B1 - 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터, 이를 이용한 유박테리움 칼란데리 유전체 편집 방법 및 이를 이용하여 형질전환 된 유박테리움 칼란데리 균주 - Google Patents
유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터, 이를 이용한 유박테리움 칼란데리 유전체 편집 방법 및 이를 이용하여 형질전환 된 유박테리움 칼란데리 균주 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 일 실시예는 CRISPR/Cas9 시스템을 위한 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터를 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터는, 절단 표적 유전자의 가이드 RNA(gRNA)를 인코딩하는 DNA 서열; Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열; 상기 Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 P rbo 프로모터; 대장균 유래의 복제 개시점; 유박테리움 칼란데리용 복제 개시점; 및 형질전환 균주 선별용 마커;를 포함한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 합성가스 생물전환공정에 적합한 아세토젠인 유박테리움 칼란데리 균주에 적용 가능한 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터, 이를 이용한 유박테리움 칼란데리 균주 유전체 편집 방법 및 이를 이용하여 형질전환 된 유박테리움 칼란데리 균주를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템을 위한 유전체 편집 벡터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유박테리움 칼란데리(Eubacterium callanderi) 균주에 적용 가능한 CRISPR/Cas9 시스템을 위한 유전체 편집 벡터에 관한 것이다.
석유기반의 화합물의 이용으로 인한 환경문제 및 에너지 고갈 등의 문제가 갈수록 심각해지면서, 전 세계는 화석연료 사용에 따른 지구온난화 방지를 위하여 이산화탄소 발생량을 줄이는 한편 고유가에 대비하여 다양한 대체에너지 개발에 박차를 가하고 있다.
대표적인 대체에너지원인 합성가스(syngas)는, 천연가스를 리포밍(reforming) 하거나, 석탄, 유기성 폐기물, 바이오매스(biomass)와 같은 고형 원료를 가스화(gasification)시키는 과정을 통해 생산될 수 있다.
이러한 합성가스는 대체에너지원으로 다음과 같은 장점을 가진다.
첫째, 합성가스는 대부분의 탄화수소로부터 전환될 수 있기 때문에 원료 고갈의 위험성이 낮으며, 화석 연료와 비교하여 가격 변동도 적어 안정적인 원료의 확보가 가능하다.
둘째, 합성가스 기반 에너지 전환의 경우 이산화탄소를 방출하는 형태가 아닌, 사용하는 형태가 되므로 이산화탄소 발생에 따른 환경 오염의 우려가 적다.
셋째, 주성분이 수소 및 탄소이므로, 아세트산, 부티르산, 에탄올 및 부탄올 등의 다양한 고부가가치 산물의 형태로 전환될 수 있어 그 활용 가능성이 높고 경제적이다.
이러한 합성가스들은 미생물을 이용한 생물전환공정(biorefinery)을 거쳐 이용될 수 있다. 대표적으로, 아세토젠(Acetogen)으로 통칭되는 혐기성 아세트산 생성균이 이용된다. 아세토젠은 우드-융달(Wood-Ljungdhal) 경로를 통해 일산화탄소, 이산화탄소와 같은 C1 가스를 아세틸-CoA로 고정하며, 이를 아세트산 등의 유기산으로 전환함으로써 세포 생장 동력에 필요한 에너지를 얻는 것을 특징으로 한다.
특히, 아세토젠 중 하나인 유박테리움 칼란데리(Eubacterium callanderi)는 합성가스 발효 및 전환 공정에 적합한 여러 장점을 갖는다.
가장 큰 장점으로는, 다른 여러 아세토젠 균주들이 합성 가스의 주성분 중 하나인 일산화탄소의 독성으로 인하여 그 생장을 저해 받는 것에 반해, 유박테리움 칼란데리는 일산화탄소 존재 하에서도 생장을 저해 받지 않는다.
또한, 타 아세토젠 균주와 비교하여 생장속도 및 가스 소비속도가 빠르고, 전장 유전체 분석이 완료되었으므로 균주 개량에 용이하다는 장점이 있다.
아세토젠을 이용한 합성가스 생물전환공정은 미생물의 생장 속도 및 가스 소비속도에 직접적인 영향을 받게 되므로, 기존의 화학전환공정과 비교하여 상대적으로 낮은 반응 속도 및 생산 효율을 가진다는 문제점이 있었다.
따라서, 생물전환공정의 효율을 높이기 위한 아세토젠의 생산성 향상 및 새로운 고부가가치 산물의 생산을 위하여 균주의 개량은 필수적이다.
그러나 상기와 같이 유박테리움 칼란데리 균주가 일산화탄소 내성 등 합성가스 전환에 이용되기 적합한 필수 장점들을 가짐에도 불구하고, 해당 균주에 적용 및 개량할 수 있는 유전체 편집 시스템의 부존재로 인하여 활발하게 개량 및 활용되지 못하고 있다는 문제점이 있었다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 합성가스 생물전환공정에 적합한 아세토젠인 유박테리움 칼란데리 균주에 적용 가능한 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 상기 유박테리움 칼란데리용 편집 벡터를 이용한 유박테리움 칼란데리 균주 유전체 편집 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 상기 유박테리움 칼란데리용 편집 벡터를 이용하여 형질전환 된 유박테리움 칼란데리 균주를 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 CRISPR/Cas9 시스템을 위한 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터는, 절단 표적 유전자의 가이드 RNA(gRNA)를 인코딩하는 DNA 서열; Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열; 상기 Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 P rbo 프로모터; 대장균 유래의 복제 개시점; 유박테리움 칼란데리용 복제 개시점; 및 형질전환 균주 선별용 마커;를 포함할 수 있다.
상기 절단 표적 유전자는, 유박테리움 칼란데리 균주 내인성 유전자를 포함할 수 있다.
상기 Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열은, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 Cas9 유전자를 포함할 수 있다.
상기 Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열은, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 Cas9 닉케이즈(Cas9 nickase) 유전자를 포함할 수 있다.
상기 P rbo 프로모터는, 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
상기 대장균 유래의 복제 개시점은, CloDF-13, pBBR1, p15A, oriC, pSC101 및 pMB1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 유박테리움 칼란데리용 복제 개시점은, pIP404 replicon을 포함할 수 있다.
상기 형질전환 균주 선별용 마커는, 항생제 내성 유전자를 포함하고,
상기 항생제 내성 유전자는, 암피실린, 에리쓰로마이신, 클로람페니콜, 티암페니콜 및 테트라사이클린 내성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 실시예는 CRISPR/Cas9 시스템을 위한 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터는, 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터에, 상기 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 서열의 3' 말단 측에 연결되는, 상기 절단 표적 유전자의 상류에서 혼성화되는 5' 상동성 암(arm); 상기 5' 상동성 암의 3' 말단 측에 연결되는, 삽입 목적 유전자인 도너(donor) DNA 서열; 및 상기 도너 DNA 서열의 3' 말단 측에 연결되는, 상기 절단 표적 유전자의 하류에서 혼성화되는 3' 상동성 암(arm);을 더 포함할 수 있다.
상기 도너 DNA 서열은, 유박테리움 칼란데리 균주 외인성 유전자를 포함할 수 있다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 실시예는 유박테리움 칼란데리 균주 유전체 편집 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유박테리움 칼란데리 균주 유전체 편집 방법은, 형질전환 대상 유박테리움 칼란데리 균주 내에 제1항에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터를 도입하는 단계; 상기 벡터가 도입된 균주를 선별하는 단계; 및 상기 선별된 균주를 배양하여 형질전환 된 균주를 수득하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 실시예는 형질전환 된 유박테리움 칼란데리 균주를 제공한다.
상기 형질전환 된 유박테리움 칼란데리 균주는, 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터의 도입을 통하여 형질전환 된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 합성가스 생물전환공정에 적합한 아세토젠인 유박테리움 칼란데리 균주에 적용 가능한 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터를 제공할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유박테리움 칼란데리용 편집 벡터를 이용한 유박테리움 칼란데리 균주 유전체 편집 방법을 제공할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유박테리움 칼란데리용 편집 벡터를 이용하여 형질전환 된 유박테리움 칼란데리 균주를 제공할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터의 개열지도를 간략하게 나타낸 도면이다.
도 2는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 Cas9 유전자의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터의 개열지도를 간략하게 나타낸 도면이다.
도 4는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 Cas9 닉케이즈(Cas9 nickase) 유전자의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터인 pECas9 벡터의 구축과정을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 6은 서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 P rbo 프로모터의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 7은 대장균 유래의 복제 개시점인 서열번호 4의 염기 서열로 구성되는 pMB1 ori의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 8은 유박테리움 칼란데리용 복제 개시점인 서열번호 5의 염기 서열로 구성되는 pIP404의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터인 pECas9n 벡터의 구축과정을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리 균주의 pyrF 유전자 넉아웃용 유전체 편집 벡터의 개열지도를 간략하게 나타낸 도면이다.
도 11은 서열번호 14의 염기 서열로 구성되는 가이드 RNA의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 12는 서열번호 15의 염기 서열로 구성되는 5' 상동성 암(arm)의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 13은 서열번호 16의 염기 서열로 구성되는 3' 상동성 암(arm)의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 ΔpyrF 균주와 야생형 유박테리움 칼란데리 균주의 PCR 증폭 및 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 ΔpyrF 균주와 야생형 유박테리움 칼란데리 균주의 우라실 및 5-플루오로틱산 존재 여부에 따른 생장을 확인하여 나타낸 표이다.
도 2는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 Cas9 유전자의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터의 개열지도를 간략하게 나타낸 도면이다.
도 4는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 Cas9 닉케이즈(Cas9 nickase) 유전자의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터인 pECas9 벡터의 구축과정을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 6은 서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 P rbo 프로모터의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 7은 대장균 유래의 복제 개시점인 서열번호 4의 염기 서열로 구성되는 pMB1 ori의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 8은 유박테리움 칼란데리용 복제 개시점인 서열번호 5의 염기 서열로 구성되는 pIP404의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터인 pECas9n 벡터의 구축과정을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리 균주의 pyrF 유전자 넉아웃용 유전체 편집 벡터의 개열지도를 간략하게 나타낸 도면이다.
도 11은 서열번호 14의 염기 서열로 구성되는 가이드 RNA의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 12는 서열번호 15의 염기 서열로 구성되는 5' 상동성 암(arm)의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 13은 서열번호 16의 염기 서열로 구성되는 3' 상동성 암(arm)의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 ΔpyrF 균주와 야생형 유박테리움 칼란데리 균주의 PCR 증폭 및 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 ΔpyrF 균주와 야생형 유박테리움 칼란데리 균주의 우라실 및 5-플루오로틱산 존재 여부에 따른 생장을 확인하여 나타낸 표이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터를 설명한다.
상기 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터는, 절단 표적 유전자의 가이드 RNA(gRNA)를 인코딩하는 DNA 서열; Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열; 상기 Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 P rbo 프로모터; 대장균 유래의 복제 개시점; 유박테리움 칼란데리용 복제 개시점; 및 형질전환 균주 선별용 마커;를 포함할 수 있다.
본 발명의 유전체 편집 및 이를 통한 개량의 대상이 되는 유박테리움 칼란데리(Eubacterium callanderi) 균주는, 합성가스 발효 및 전환 공정에 적합한 여러 장점을 가짐에도 불구하고, 해당 균주 개량을 위해 적용 가능한 유전체 편집 시스템의 부존재로 인하여 활발하게 개량 및 활용되지 못하고 있다는 문제점이 있었다.
이에 본 발명의 발명자들은, 기존의 다른 유박테리움 속 균주에 도입 시 안정적으로 복제되는 것으로 확인된 구성요소들을 조합하여, 유박테리움 칼란데리 균주에 도입 가능한 CRISPR/Cas9 시스템을 위한 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터를 발명하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터는, 종래 유박테리움 칼란데리 균주에 적용할 수 없었던 CRISPR/Cas9 시스템을 위한 유전체 편집 벡터와 달리, 유박테리움 칼란데리 균주에 안정적으로 적용 가능한 것을 특징으로 한다.
상기 절단 표적 유전자는, 유박테리움 칼란데리 균주 내인성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “내인성(內因性, 영어: endogeny 또는 endogeneity)”은, 넓은 의미로는 내부에서 기원 된 행동이나 물질을 나타내며, 생물학에서는 생물체, 조직 또는 세포 내에서 유래된 물질을 뜻한다.
따라서, 본 발명에서 사용되는 상기 용어 “내인성 유전자”는, 특정 균주 내에서 유래된 유전자를 의미하며, 특히 본 발명에서는 유박테리움 칼란데리 균주 내부에서 절단의 표적이 되는 유전자를 의미할 것이다.
상기 절단 표적 유전자의 가이드 RNA(gRNA)를 인코딩하는 DNA 서열로부터 전사된 가이드 RNA는, 상기 절단 표적 유전자의 염기서열과 상보적으로 결합하는 Target specific crRNA sequence 및 tracrRNA를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 가이드 RNA와 결합된 절단 표적 유전자를, Cas9 효소가 절단하며, 상기 절단된 유전자는 Non-homologous end joining 또는 Homologous recombination으로 복구되므로 상기와 같은 유전자 변형으로 인하여 해당 유전자는 더는 정상적인 기능을 수행하지 못하도록 넉아웃(knockout)될 수 있다.
상기 Cas9을 인코딩하는 DNA 서열은, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 Cas9 유전자일 수 있다.
이때, 상기 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 Cas9 유전자는, pCas9으로부터 유래된 것으로, 이는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 또는 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus)로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 Cas9을 인코딩하는 DNA 서열은, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 Cas9 닉케이즈(Cas9 nickase) 유전자일 수 있다.
이때, 상기 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 Cas9 닉케이즈(Cas9 nickase) 유전자는, pNICKClos 1.0 로부터 유래된 것으로, 상기 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 Cas9 유전자로부터 발현된 Cas9 단백질의 열 번째 아미노산을 알라닌으로 치환시킴으로써 얻어진 것일 수 있다.
이때, 상기 Cas9 닉케이즈는 이중 가닥 결실이 아닌 단일 가닥 결실을 일으키는 것일 수 있다.
상기 P rbo 프로모터는, 본 발명의 유박테리움 칼란데리 균주와 동일 속(屬)에 속하는 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum) 균주의 유전체 서열로부터 탐색 된, 유박테리움 리모숨 균주에서 높은 평균 전사체 발현값을 갖는 유전자의 상단부에 존재하는 프로모터와 90% 이상 일치하는 염기 서열을 갖는 것 일 수 있다.
더욱 자세하게는, 상기 P rbo 프로모터는, 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
상기 대장균 유래의 복제 개시점은, CloDF-13, pBBR1, p15A, oriC, pSC101 및 pMB1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
바람직하게는, 상기 대장균 유래의 복제 개시점은, pMB1 ori일 수 있다.
이때, 상기 pMB1 ori은, 기존에 유박테리움 속 균주에 도입되었을 때, 안정적으로 복제되는 것으로 확인된 pJIR418 벡터(Sloan J et al., Elsevier, 27:3, 1992)로부터 유래된 것 일 수 있다.
더욱 자세하게는, 상기 pMB1 ori은, 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
상기 유박테리움 칼란데리용 복제 개시점은, pIP404 replicon일 수 있다.
이때, 상기 pIP404 replicon는, 기존에 유박테리움 속 균주에 도입되었을 때, 안정적으로 복제되는 것으로 확인된 pJIR418 벡터(Sloan J et al., Elsevier, 27:3, 1992)로부터 유래된 것 일 수 있다.
더욱 자세하게는, 상기 pIP404 replicon는, 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
상기 형질전환 균주 선별용 마커는, 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 상기 항생제 내성 유전자는, 암피실린, 에리쓰로마이신, 클로람페니콜, 티암페니콜 및 테트라사이클린 내성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업계에서 이용되는 항생제 내성 유전자라면 제한 없이 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 상기 Cas9을 인코딩하는 DNA 서열이 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 Cas9 유전자인 것을 특징으로 하는, 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터의 개열지도를 간략하게 나타낸 도면이다.
도 2는 상기 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 Cas9 유전자의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 3은 상기 Cas9을 인코딩하는 DNA 서열이 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 Cas9 닉케이즈(Cas9 nickase) 유전자인 것을 특징으로 하는, 본 발명의 다른 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터의 개열지도를 간략하게 나타낸 도면이다.
도 4는 상기 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 Cas9 닉케이즈(Cas9 nickase) 유전자의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 1 내지 도 4를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터의 개략적인 개열지도를 확인할 수 있다.
상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 유박테리움 칼란데리의 특정 표적 유전자의 절단을 통한 넉아웃(Knockout)을 가능하게 하는 CRISPR/Cas9 유전체 편집 시스템용 유전체 편집 벡터를 제공할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터를 설명한다.
상기 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터는, 절단 표적 유전자의 가이드 RNA(gRNA)를 인코딩하는 DNA 서열; Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열; 상기 Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 P rbo 프로모터; 대장균 유래의 복제 개시점; 유박테리움 칼란데리용 복제 개시점; 및 형질전환 균주 선별용 마커; 외에,
상기 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 서열의 3' 말단 측에 연결되는, 상기 절단 표적 유전자의 상류에서 혼성화되는 5' 상동성 암(arm); 상기 5' 상동성 암의 3' 말단 측에 연결되는, 삽입 목적 유전자인 도너(donor) DNA 서열; 및 상기 도너 DNA 서열의 3' 말단 측에 연결되는, 상기 절단 표적 유전자의 하류에서 혼성화되는 3' 상동성 암(arm);을 더 포함할 수 있다.
이때, 상기 도너(donor) DNA 서열은, 유박테리움 칼란데리 균주 외인성 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 용어 “외인성(外因性, 영어: exogeny 또는 exogeneity)”은, 넓은 의미에서, 외부에서 기원된 행동이나 물질을 나타내는 것으로, 생물학에서는 생물체, 조직 또는 세포 외부에서 유래된 물질을 뜻한다.
따라서 본 발명에서 사용되는 상기 용어 “외인성 유전자”는, 특정 균주 내에는 존재하지 않는 외부로부터 유래된 유전자를 의미하며, 이때 외부로부터 유래된 유전자란, 특정 균주 내부에는 존재하지 않는 전혀 신규한 염기서열의 유전자를 의미할 수도 있으나, 특정 균주 내부에 이미 존재하는 유전자의 서열이 일부 변형된 형태의 유전자 또한 포함될 수 있다.
상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 상기 가이드 RNA(gRNA)를 인코딩하는 DNA 서열로부터 전사된 가이드 RNA는 상기 절단 표적 유전자와 상보적으로 결합하고, 상기 가이드 RNA와 결합된 절단 표적 유전자를, Cas9 효소가 절단하며, 상기 5' 상동성 암(arm)은 상기 절단 표적 유전자의 상류에서 혼성화되고, 상기 3' 상동성 암(arm)은 상기 절단 표적 유전자의 하류에서 혼성화되어, 그 사이의 상기 삽입 목적 유전자인 도너(donor) DNA 서열이 상기 절단된 부위로 삽입되게 된다. 따라서, 상기와 같은 시스템을 통해 유박테리움 칼란데리 균주에 외인성 유전자가 도입되어 발현될 수 있다.
따라서, 상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 유박테리움 칼란데리 균주에 특정 목적 유전자를 삽입하여 균주 개량을 가능하게 하는 CRISPR/Cas9 유전체 편집 시스템용 유전체 편집 벡터를 제공할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리 균주 유전체 편집 방법에 대해 설명한다.
상기 유박테리움 칼란데리 균주 유전체 편집 방법은, 형질전환 대상 유박테리움 칼란데리 균주 내에 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터를 도입하는 단계; 상기 벡터가 도입된 균주를 선별하는 단계; 및 상기 선별된 균주를 배양하여 형질전환 된 균주를 수득하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 합성가스 발효 및 전환 공정에 적합한 여러 장점을 갖는 유박테리움 칼란데리 균주의 유전체 편집을 가능하게 하는 유전체 편집 방법을 제공할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 형질전환 된 유박테리움 칼란데리 균주를 설명한다.
상기 형질전환 된 유박테리움 칼란데리 균주는, 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터의 도입을 통하여 형질전환 된 것을 특징으로 하는 것 일 수 있다.
상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 합성가스 발효 및 전환 공정에 향상된 성능을 가지도록 개량된 형질전환 된 유박테리움 칼란데리 균주를 제공할 수 있다.
이하에서는 제조예, 비교예 및 실험예를 통해 본 발명에 대해 더욱 상세하게 설명한다. 하지만 본 발명이 하기 제조예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> pECas9 벡터의 제조
본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터를 제조하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터인 pECas9 벡터의 구축과정을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 6은 서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 P rbo 프로모터의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 7은 대장균 유래의 복제 개시점인 서열번호 4의 염기 서열로 구성되는 pMB1 ori의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 8은 유박테리움 칼란데리용 복제 개시점인 서열번호 5의 염기 서열로 구성되는 pIP404의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 5 내지 도 8을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터의 제조 과정을 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터를 제조하기 위하여, 먼저 백본(back born) 벡터를 준비하였다. 상기 백본 벡터는, 대장균 유래의 복제 개시점인 서열번호 4의 염기 서열로 구성되는 pMB1 ori, 유박테리움 칼란데리용 복제 개시점인 서열번호 5의 염기 서열로 구성되는 pIP404 및 형질전환 균주 선별용 마커로 사용되는 에리쓰로마이신(Erythromycin) 내성 유전자(emR)를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이를 위하여 대한민국 등록특허 제10-2073308호로 개시된 pECPH2::uidA 벡터를 서열번호 6의 염기 서열로 구성되는 forward 프라이머 FW_pJBB 및 서열번호 7의 염기 서열로 구성되는 reverse 프라이머 RV_pJBB를 사용하여 증폭하였다.
상기와 같은 과정을 통하여 본 발명의 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터의 제조를 위한 백본(back born) 벡터를 준비하였다.
상기 백본 벡터에 삽입될, 서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 P rbo 프로모터를 준비하였다. 상기 P rbo 프로모터는, 마찬가지로 상기 pECPH2::uidA 벡터를 서열번호 8의 염기 서열로 구성되는 forward 프라이머 FW_Native H3 및 서열번호 9의 염기 서열로 구성되는 reverse 프라이머 RV_Native H3을 사용하여 증폭하였다.
상기와 같은 과정을 통하여 본 발명의 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터의 제조를 위한 서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 P rbo 프로모터를 준비하였다.
상기 백본 벡터에 삽입될, 서열번호 1의 염기 서열로 구성되는 Cas9 유전자를 준비하였다. 상기 서열번호 1의 염기 서열로 구성되는 Cas9 유전자는, pCas9 벡터(RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Jiang W, Bikard D, Cox D, Zhang F, Marraffini LA. Nat Biotechnol. 2013 Jan 29. doi: 10.1038/nbt.2508. 10.1038/nbt.2508 PubMed 23360965)를 서열번호 10의 염기 서열로 구성되는 forward 프라이머 FW_Cas9 및 서열번호 11의 염기 서열로 구성되는 reverse 프라이머 RV_Cas9를 이용하여 증폭하였다.
상기와 같은 과정을 통하여 본 발명의 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터의 제조를 위한 서열번호 1의 염기 서열로 구성되는 Cas9 유전자를 준비하였다.
상기와 같이 준비한 백본 벡터, 서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 P rbo 프로모터 및 서열번호 1의 염기 서열로 구성되는 Cas9 유전자를 Gibson assembly master mix(NEB)를 이용하여 조합함으로써 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터를 제조하였으며, 이를 pECas9 벡터라 명명하였다.
<제조예 2> pECas9n 벡터의 제조
상기 제조예 1에서 상기 서열번호 1의 염기 서열로 구성되는 Cas9 유전자 대신에 서열번호 2의 염기 서열로 구성되는 Cas9 닉케이즈 유전자를 이용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 과정으로 pECas9n 벡터를 제조하였다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터인 pECas9n 벡터의 구축과정을 간략하게 나타낸 모식도이다.
상기 서열번호 2의 염기 서열로 구성되는 Cas9 닉케이즈 유전자는, pNICKclos1.0 벡터(ref. CRISPR-based genome editing and expression control systems in Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii. Li Q, Chen J, Minton NP, Zhang Y, Wen Z, Liu J, Yang H, Zeng Z, Ren X, Yang J, Gu Y, Jiang W, Jiang Y, Yang S. Biotechnol J. 2016 May 23. doi: 10.1002/biot.201600053. 10.1002/biot.201600053 PubMed 27213844)를 서열번호 12의 염기 서열로 구성되는 forward 프라이머 FW_Cas9n 및 서열번호 13의 염기 서열로 구성되는 reverse 프라이머 RV_Cas9n를 이용하여 증폭하였다.
상기와 같은 과정을 통하여 준비된 서열번호 2의 염기 서열로 구성되는 Cas9 닉케이즈 유전자를 제조예 1과 동일한 과정으로 조합함으로써 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터를 제조하였으며, 이를 pECas9n 벡터라 명명하였다.
표 1은 상기 제조예 1 및 제조예 2에 사용된 프라이머들의 염기서열을 나타낸 표이다.
[표 1]
<실시예 1>
pyrF
유전자 넉아웃용 벡터의 제조
상기 제조예 1로 제조된 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터를 이용한 CRISPR/Cas9 시스템의 작동 여부를 확인하기 위하여, 유박테리움 칼란데리 균주의 pyrF 유전자 넉아웃용 유전체 편집 벡터를 제조하였다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리 균주의 pyrF 유전자 넉아웃용 유전체 편집 벡터의 개열지도를 간략하게 나타낸 도면이다.
도 11은 서열번호 14의 염기 서열로 구성되는 가이드 RNA의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 12는 서열번호 15의 염기 서열로 구성되는 5' 상동성 암(arm)의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 13은 서열번호 16의 염기 서열로 구성되는 3' 상동성 암(arm)의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 10 내지 13을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 유박테리움 칼란데리 균주의 pyrF 유전자 넉아웃용 유전체 편집 벡터의 제조방법을 설명하면, 상기 제조예 1의 유전체 편집 벡터 pECas9 벡터와 pyrF 넉아웃용 DNA 단편을 제한효소 SpeI으로 3시간 처리 후, T4 ligase를 사용하여 연결하였다. 이때, pyrF 넉아웃용 DNA 단편은, 서열번호 14의 염기 서열로 구성되는 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 서열, 서열번호 15의 염기 서열로 구성되는 5' 상동성 암(arm) 및 서열번호 16의 염기 서열로 구성되는 3' 상동성 암(arm)을 포함한다.
상기와 같이 제조된 pyrF 유전자 넉아웃용 벡터를 pECas9-pyrF라 명명하였다.
<실시예 2>
pyrF
결실 유박테리움 칼란데리 균주 제작
상기 실시예 1로 제조된 pECas9-pyrF 벡터를 이용한 CRISPR/Cas9 시스템의 작동 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1로 제조된 pECas9-pyrF 벡터를 유박테리움 칼란데리 균주에 도입하여 pyrF 결실 유박테리움 칼란데리 균주(이하, ΔpyrF 균주라 칭한다)를 제조하였다.
<실험예 1> Δ
pyrF
균주의
pyrF
유전자 넉아웃 확인 실험
본 발명의 일 실시예에 따른 유전체 편집 벡터를 이용한 CRISPR/Cas9 시스템의 유박테리움 칼란데리 균주에의 작동 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2에 따라 제조된 ΔpyrF 균주의 실제 pyrF 유전자 넉아웃을 확인하는 실험을 진행하였다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 ΔpyrF 균주와 야생형 유박테리움 칼란데리 균주의 PCR 증폭 및 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.
도 14를 참조하면, 야생형 균주의 PCR 결과인 1의 경우 2.2 kb의 단편이, ΔpyrF 균주의 PCR 결과인 2의 경우 1.6 kb의 단편이 얻어진 것으로 보아 pyrF가 유전체로부터 결실된 것을 확인할 수 있다.
유박테리움 칼란데리 균주는, 우라실 생합성 경로에 관여하는 pyrF 유전자에 결손이 일어날 경우, ΔpyrF 균주는 우라실 옥소트로프(auxotroph, 영양 요구주)가 되는 것으로 알려져 있다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 ΔpyrF 균주와 야생형 유박테리움 칼란데리 균주의 우라실 및 5-플루오로틱산 존재 여부에 따른 생장을 확인하여 나타낸 표이다.
도 15를 참조하면, 야생형 균주의 경우 우라실이 존재하지 않는 -Uracil 환경에서도 생장이 가능하였으나 5-플루오로틱산에 내성이 없으므로 +FOA 환경에서는 생장하지 못한 것을 확인할 수 있으며, ΔpyrF 균주의 경우 우라실 옥소트로프이므로 우라실이 존재하지 않는 -Uracil 환경에서는 생장하지 못하고 +Uracil 환경에서만 생장한 것으로 보아 ΔpyrF 균주의 pyrF 유전자가 효과적으로 넉아웃 되었음을 확인할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Gwangju Institute of Science and Technology
<120> Genomic editing vector for Eubacterium callanderi, Method for
editing genome of Eubacterium callanderi using the same, and
Transgenic Eubacterium callanderi strains using the same
<130> P-200082
<160> 16
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 4107
<212> DNA
<213> Strelitzia nicolai
<400> 1
atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60
atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120
cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180
gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240
tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300
cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360
aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420
aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480
atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540
gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600
attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660
cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 720
ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780
gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840
caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900
ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960
atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020
caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080
ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140
gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200
aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260
gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320
gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380
cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440
gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500
aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560
tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620
tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680
gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740
tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 1800
attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860
ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920
cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980
cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040
gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100
agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 2160
catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220
gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 2280
attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 2340
atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 2400
gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 2460
gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac 2520
attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 2580
gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 2640
aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 2700
acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 2760
ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 2820
actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 2880
aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 2940
taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000
tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060
atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 3120
aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 3180
cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 3240
gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 3300
cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 3360
gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 3420
tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 3480
aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 3540
tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 3600
tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 3660
caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 3720
cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 3780
cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 3840
attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 3900
ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 3960
cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 4020
gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 4080
gatttgagtc agctaggagg tgactga 4107
<210> 2
<211> 4107
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cas9 nickase gene in which the tenth amino acid is substituted
with alanine for Cas9 protein derived from Streptococcus.
<400> 2
atggataaga aatactcaat aggcttagct atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60
atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120
cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180
gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240
tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300
cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360
aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420
aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480
atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540
gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600
attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660
cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 720
ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780
gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840
caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900
ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960
atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020
caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080
ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140
gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200
aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260
gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320
gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380
cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440
gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500
aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560
tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620
tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680
gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740
tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 1800
attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860
ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920
cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980
cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040
gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100
agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 2160
catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220
gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 2280
attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 2340
atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 2400
gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 2460
gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac 2520
attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 2580
gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 2640
aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 2700
acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 2760
ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 2820
actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 2880
aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 2940
taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000
tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060
atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 3120
aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 3180
cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 3240
gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 3300
cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 3360
gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 3420
tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 3480
aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 3540
tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 3600
tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 3660
caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 3720
cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 3780
cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 3840
attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 3900
ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 3960
cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 4020
gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 4080
gatttgagtc agctaggagg tgactga 4107
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> Eubacterium limosum
<400> 3
attttatagg cattttccgt ttaaagttta aaaattgtgg tataattaat 50
<210> 4
<211> 221
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 4
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 60
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 120
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 180
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg c 221
<210> 5
<211> 1221
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pIP404 replication origin from pJIR750 vector
<400> 5
ttataaaagc ccattttttt tcatatacgt aatatgacgt tctaatgttt ttattggtac 60
ttctaacatt agagtaattt ctttattttt aaagcctttt tctttaaggg cttttatttt 120
ttttcttaat acatttaatt cctctttttt tgttgctttt cctttagctt ttaattgctc 180
ttgataattt tttttacctc taatattttc tcttctctta tattcctttt tagaaattat 240
tattgtcata tatttttgtt cttcttctgt aatttctaat aactctataa gagtttcatt 300
cttatactta tattgcttat ttttatctaa ataacatctt tcagcacttc tagttgctct 360
tataacttct ctttcactta aatgttgtct aaacatacta ttaagttcta aaacatcatt 420
taatgccttc tcaatgtctt ctgtaaagct acaaagataa tatctatata aaaataatat 480
aagctctctg tgtcctttta aatcatattc tcttagttca caaagtttta ttatgtcttg 540
tattcttcca taatataaac ttctttctct ataaatataa tttattttgc ttggtctacc 600
ctttttcctt tcatatggtt ttaattcagg taaaaatcca ttttgtattt ctcttaagtc 660
ataaatatat tcgtactcat ctaatatatt gactactgtt tttgatttag agtttatact 720
tcctggaact cttaatattc tcgttgcatc taaggcttgt ctatctgctc caaagtattt 780
taattgatta tataaatatt cttgaaccgc tttccataat ggtaatgctt tactaggtac 840
tgcatttatt atccatatta aatacattcc tcttccacta tctattacat agtttggtat 900
aggaatactt tgattaaaat aattcttttc taagtccatt aatacctggt ctttagtttt 960
gccagtttta taataatcca agtctataaa cagtgtattt aactctttta tattttctaa 1020
tcgcctacac ggcttataaa aggtatttag agttatatag atattttcat cactcatatc 1080
taaatctttt aattcagcgt atttatagtg ccattggcta tatccttttt tatctataac 1140
gctcctggtt atccaccctt tacttctact atgaatatta tctatatagt tctttttatt 1200
cagctttaat gcgtttctca c 1221
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for back bone vector
<400> 6
gttacatcgg gttacatcga actggatctc aacagcg 37
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for back bone vector
<400> 7
gactagtcag aatcagggga taacgcagga 30
<210> 8
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for Prbo promoter
<400> 8
ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgacta gtctgcacca tcaatgacat 60
cacacagcat aacg 74
<210> 9
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for Prbo promoter
<400> 9
agcctattga gtatttctta tccataataa agacctccta tagtccaaat ataattttga 60
gcagtccgtg 70
<210> 10
<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for Cas9
<400> 10
cacggactgc tcaaaattat atttggacta taggaggtct ttattatgga taagaaatac 60
tcaataggct tagatatcgg cacaaatagc g 91
<210> 11
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for Cas9
<400> 11
atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccgatg taaccccact atttgtctca 60
gctagacttc agtc 74
<210> 12
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for Cas9n
<400> 12
cacggactgc tcaaaattat atttggacta taggaggtct ttattatgga taagaaatac 60
tcaataggct tagctatcgg cacaaatagc 90
<210> 13
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for Cas9n
<400> 13
atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccgatg taaccccgat taagttgggt 60
aacgcc 66
<210> 14
<211> 129
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding Guide RNA for pyrF gene in Eubacterium callanderi
<400> 14
ttgacagcta gctcagtcct aggtataatc ccatcatcgc ggaattttcg ttttagagct 60
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc 120
ggtgctttt 129
<210> 15
<211> 857
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Homology arm for pyrF gene editing in Eubacterium callanderi
<400> 15
acctggtgga ttttgagagc acccgggaat acaccaatgt ctactccaac gatggacaca 60
atgtggacaa tgaagagacc atgaaaaagg ggctggcggc ttccaccgag tacaatttta 120
ttctggccac ccactgtgag ccggaaaccg agactgtgga gcgggacatc gcccttctgc 180
gtgaaacgcc tggacacctg cacgtgtgcc atatcagcaa aaaagatacc ctggaagcca 240
tcaaggccgc caaagcagag ggtctggaca ttacctgtga ggtcaccccg caccatctgt 300
acgcctctgc catggagtat aaggtacacc cgccgttcag aagctacccg gaccgccggg 360
cgctcatcga gggcgcccgg gacggcagca ttgacatctg cggcaccgac cacgccccac 420
acagcgacga ggacaagctg aaaggcgcgc cggggatcaa taattttgag accgcctttg 480
ccatgtacta cactgttttt gagggagcgg gtatttctgt ggaacgcctg agtcagatgc 540
tgagcgaggc gccggctgag cgcatgggga taaaggccgg cctggtcaag gaacgctacg 600
ccggagacct ggttttagtg gatctggacg ctgaggaacg ggtagacccc aggaccttta 660
tctcaaaaag ccacaacacc ccctttggca gggaactgct caagggcaag gtgctcatga 720
catttaaagg aggagagatc gcatatgata atggatcgct tgtataacga agcattaaaa 780
agccccgtct gtgtgggcct ggatacaaaa attgactttc tgccccagta cctgaaggat 840
aaggactggt cagccgg 857
<210> 16
<211> 787
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Homology arm for pyrF gene editing in Eubacterium callanderi
<400> 16
atcagaaggc agagaccccc tgtgagaccg agggctttga agccctgatc cgtgaaaaaa 60
cactggccat gaaggaggac attttaaagt ggctttaatt ttagataacc agtttgtggc 120
cgagggcatt tacaaaatgg acgtggccta cgacggtgaa gtgggcgtcg gccagttttt 180
catgctgaga gcctgggata aggacccgct gctgtcacgg cccatctccg tccataatta 240
cgaaaacggt gtgctcacct tcctgtatca gattgtaggc aagggcaccc agcttttgtc 300
aaaactggaa aaggacgaca ctgtggaatt acagggcccg tacggcaagg gcttcccgga 360
tgtggacgcc gacctggtgg tggtgggcgg cggcattggt gtcgcgcccc tgtactatgt 420
gtgccgcgac ttcaagaaaa aacacccgga ccgcagcctg cgtgtttacc tgggctaccg 480
cgacactgcc tactgtgtgg aggaatttga cgcagtggcc gatgaagtgg tcgtggatat 540
cggcggcatc atcacccacc gggtagaagc ccgttccggc gaggtattct ttacctgcgg 600
cccggaaatc atgatgaaga gcctgtgtga cattgtcccg gccgaaaacc cggtttacgt 660
gtcgctggag gcgcatatgg cctgcggcat cggcgcctgt ctgggctgca cctgcgagac 720
cagtgaaggc aataagaagg tctgtaagga cgggccagtg tttaccagag aggtggcagc 780
cctatga 787
Claims (12)
- 절단 표적 유전자의 가이드 RNA(gRNA)를 인코딩하는 DNA 서열;
Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열;
상기 Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 P rbo 프로모터;
대장균 유래의 복제 개시점;
유박테리움 칼란데리용 복제 개시점; 및
형질전환 균주 선별용 마커;를 포함하는 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터.
- 제1항에 있어서,
상기 절단 표적 유전자는, 유박테리움 칼란데리 균주 내인성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터.
- 제1항에 있어서,
상기 Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열은, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 Cas9 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터.
- 제1항에 있어서,
상기 Cas9 단백질을 인코딩하는 DNA 서열은, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 Cas9 닉케이즈(Cas9 nickase) 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터.
- 제1항에 있어서,
상기 P rbo 프로모터는, 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터.
- 제1항에 있어서,
상기 대장균 유래의 복제 개시점은, CloDF-13, pBBR1, p15A, oriC, pSC101 및 pMB1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터.
- 제1항에 있어서,
상기 유박테리움 칼란데리용 복제 개시점은, pIP404 replicon을 포함하는 것을 특징으로 하는 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터.
- 제1항에 있어서,
상기 형질전환 균주 선별용 마커는, 항생제 내성 유전자를 포함하고,
상기 항생제 내성 유전자는, 암피실린, 에리쓰로마이신, 클로람페니콜, 티암페니콜 및 테트라사이클린 내성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터.
- 제1항에 있어서,
상기 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 서열의 3' 말단 측에 연결되는, 상기 절단 표적 유전자의 상류에서 혼성화되는 5' 상동성 암(arm);
상기 5' 상동성 암의 3' 말단 측에 연결되는, 삽입 목적 유전자인 도너(donor) DNA 서열; 및
상기 도너 DNA 서열의 3' 말단 측에 연결되는, 상기 절단 표적 유전자의 하류에서 혼성화되는 3' 상동성 암(arm);을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터.
- 제9항에 있어서,
상기 도너 DNA 서열은, 유박테리움 칼란데리 균주 외인성 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터.
- 형질전환 대상 유박테리움 칼란데리 균주 내에 제1항에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터를 도입하는 단계;
상기 벡터가 도입된 균주를 선별하는 단계; 및
상기 선별된 균주를 배양하여 형질전환 된 균주를 수득하는 단계;를 포함하는 유박테리움 칼란데리 균주 유전체 편집 방법.
- 제1항에 따른 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터의 도입을 통하여 형질전환 된 것을 특징으로 하는 형질전환 된 유박테리움 칼란데리 균주.
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|---|---|---|---|
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| US17/377,590 US20220017910A1 (en) | 2020-07-17 | 2021-07-16 | Genomic editing vector for eubacterium callanderi, method for editing genome of eubacterium callanderi using the same, and transgenic eubacterium callanderi strains using the same |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020200089015A KR102244489B1 (ko) | 2020-07-17 | 2020-07-17 | 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터, 이를 이용한 유박테리움 칼란데리 유전체 편집 방법 및 이를 이용하여 형질전환 된 유박테리움 칼란데리 균주 |
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| KR1020200089015A KR102244489B1 (ko) | 2020-07-17 | 2020-07-17 | 유박테리움 칼란데리용 유전체 편집 벡터, 이를 이용한 유박테리움 칼란데리 유전체 편집 방법 및 이를 이용하여 형질전환 된 유박테리움 칼란데리 균주 |
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170076822A (ko) | 2009-01-26 | 2017-07-04 | 질레코 인코포레이티드 | 바이오매스의 가공처리방법 |
| KR101896847B1 (ko) * | 2017-09-22 | 2018-09-07 | 한국생명공학연구원 | DNA 절단 활성이 불활성화된 Cpf1을 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물 및 그 용도 |
| KR20190015845A (ko) * | 2017-08-07 | 2019-02-15 | 성균관대학교산학협력단 | 목적 유전자 발현 조절을 위한 대장균 및 코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 벡터 |
| KR20190024783A (ko) * | 2017-08-29 | 2019-03-08 | 광주과학기술원 | 에탄올 비생산성 아세토젠 균주를 에탄올 생성균주로 전환하는 방법 및 상기 에탄올 생성균주로부터 일산화탄소를 이용한 에탄올의 제조방법 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
2020
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-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170076822A (ko) | 2009-01-26 | 2017-07-04 | 질레코 인코포레이티드 | 바이오매스의 가공처리방법 |
| KR20190015845A (ko) * | 2017-08-07 | 2019-02-15 | 성균관대학교산학협력단 | 목적 유전자 발현 조절을 위한 대장균 및 코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 벡터 |
| KR20190024783A (ko) * | 2017-08-29 | 2019-03-08 | 광주과학기술원 | 에탄올 비생산성 아세토젠 균주를 에탄올 생성균주로 전환하는 방법 및 상기 에탄올 생성균주로부터 일산화탄소를 이용한 에탄올의 제조방법 |
| KR101896847B1 (ko) * | 2017-09-22 | 2018-09-07 | 한국생명공학연구원 | DNA 절단 활성이 불활성화된 Cpf1을 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물 및 그 용도 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 2019 한국생물공학회 춘계 학술대회 pp.530 * |
| ACS Synth. Biol Vol.8 No.9 pp.2059-2068 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20220017910A1 (en) | 2022-01-20 |
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