CN112592910B - 一种甘油酯脂肪酶突变体及其应用 - Google Patents

一种甘油酯脂肪酶突变体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112592910B
CN112592910B CN202110008611.0A CN202110008611A CN112592910B CN 112592910 B CN112592910 B CN 112592910B CN 202110008611 A CN202110008611 A CN 202110008611A CN 112592910 B CN112592910 B CN 112592910B
Authority
CN
China
Prior art keywords
glyceride lipase
ala
mutant
val
thr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110008611.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112592910A (zh
Inventor
蓝东明
王永华
杨博
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China University of Technology SCUT
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China University of Technology SCUT filed Critical South China University of Technology SCUT
Publication of CN112592910A publication Critical patent/CN112592910A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112592910B publication Critical patent/CN112592910B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6454—Glycerides by esterification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种甘油酯脂肪酶突变体，其氨基酸构成包括如SEQ ID NO.3所示序列；或其编码基因包括如SEQ ID NO.4所示序列或其反向互补序列。本发明还涉及了该突变体的应用。本发明所述甘油酯脂肪酶突变体，其可在黑曲霉工程菌中高效表达，并具有很好的热稳定性。而且，在相同的催化条件下，该甘油酯脂肪酶突变体酯化合成甘油酯活力为野生型的3.5倍，很适合甘油二酯的工业化生产的应用。

Description

一种甘油酯脂肪酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种甘油酯脂肪酶突变体及其应用。
背景技术
脂肪酶(E.C.3.1.1.3)是一类可以水解甘油三酯产生不同链长游离脂肪酸和甘油的水解酶。其具有高度的化学选择性和立体异构性，反应不需辅酶参与，反应条件温和，副产物少，且催化反应是在油水界面上进行。因此脂肪酶是一种重要的工业用酶，可催化水解、酯合成、酯交换、转酯化等一系列反应，因此在食品、能源、饲料、日化、医药、油脂、化工等传统工业领域已经广泛使用。甘油酯脂肪酶表现出与普通甘油三酯水解脂肪酶特异的底物偏好特性，仅作用于甘油单酯和甘油二酯，对甘油三酯底物不呈现水解活力，重要的是可通过酯化或转酯化等反应类型来生产甘油单酯和甘油二酯等产品。
甘油二酯是食用油的天然组分，是公认安全的食品成分。食用1,3-甘油二酯后不易在体内蓄积,同时具有营养代谢调控，预防和改善肥胖以及相关并发症等功效。目前，甘油二酯的生产方法有化学法和酶法，酶法因其具有环境友好、效率高及产物单一等优点，相对与化学法更有应用前景。然而目前用于酶法制备甘油二酯的工艺存在以下技术难题：(1)甘油酯脂肪酶热稳定性差，易失活，导致生产成本提高；(2)甘油酯脂肪酶催化酯化性能弱，整体催化效率低；(3)甘油酯脂肪酶的重组表达仍使用非GRAS(Generally recognized assafe)菌株进行重组制备，食品安全存在隐患问题。
发明内容
本发明的目的之一本发明为解决现有技术问题，提供了一种甘油酯脂肪酶突变体及其在制备甘油二酯中的应用。
本发明的技术方案具体如下：
一种甘油酯脂肪酶突变体，其氨基酸构成包括如SEQ ID NO.3所示序列；或其编码基因包括如SEQ ID NO.4所示序列或其反向互补序列。
一种甘油酯脂肪酶突变体，其氨基酸构成包括如SEQ ID NO.3所示序列，且该序列存在一个或多个点突变，但生物活性不变，即与SEQ ID NO.3所示序列相同。
本发明通过大量随机突变的筛选，定向筛选获得得到一种热稳定性及酯化效率显著提高的脂肪酶突变体，并可以食品安全菌株黑曲霉为宿主进行高效表达制备，为甘油二酯油脂和安全高效生产提供技术支撑。
本发明还提供了一种种编码上述甘油酯脂肪酶突变体的核苷酸序列。
在其中一些实施例中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.4或其反向互补序列所示。
本发明还提供了一种插入有包括上述的编码甘油酯脂肪酶突变体的核苷酸序列的重组表达载体。
本发明还提供了一种转入有上述重组表达载体的重组工程菌。
在其中一些实施例中，所述重组工程菌的宿主菌为黑曲霉。
本发明还提供上述的甘油酯脂肪酶突变体、和/或上所述的核苷酸序列在制备油脂中的应用。
本发明还提供上述的重组表达载体、和/或上述的重组工程菌在制备油脂中的应用。
在其中一些实施例中，所述油脂是甘油二酯或甘油单酯。
本发明还提供了一种制备甘油二酯或甘油单酯的方法。
一种制备甘油二酯或甘油单酯的方法，将上述的甘油酯脂肪酶突变体与脂肪酸和甘油进行混合反应。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所述甘油酯脂肪酶突变体经过发明人于合适的位点进行突变后具有很好的热稳定性，在同一条件下，野生型甘油酯脂肪酶在60摄氏度孵育的半衰期为42分钟，而所述甘油酯脂肪酶突变体为94分钟。而且，在相同的催化条件下，所述甘油酯脂肪酶突变体酯化合成甘油酯活力为野生型的3.5倍。此外，该甘油酯脂肪酶突变体(F285N)还可在黑曲霉工程菌中高效表达，其发酵酶活可达2500U/mL。本发明所述的甘油酯脂肪酶突变体(F285N)能很好适应于油脂的制备中，特别是能较好地适应甘油二酯的工业化生产应用中。
附图说明
图1：热稳定性甘油酯脂肪酶突变体的筛选。
图2：高酯化活力甘油酯脂肪酶突变体的筛选。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明的一个实施例中，涉及一种甘油酯脂肪酶突变体，其氨基酸构成包括如SEQID NO.3所示序列；或其编码基因如SEQ ID NO.4或其反向互补序列所示。
一种甘油酯脂肪酶突变体，其氨基酸构成包括如SEQ ID NO.3所示序列，且该序列存在一个或多个点突变，但生物活性不变。
在实际应用中，本领域技术人员可以在SEQ ID NO.3所示的序列的一端或两端增加一个或多个氨基酸不影响该突变体的活性，也不改变本发明中所公开的该突变体的特性，即活性与SEQ ID NO.3所示序列的突变体相同。
所述存在一个或多个点突变，指SEQ ID NO.3所示的序列存在一个或多个碱基的突变，或者缺失，但是不影响该突变体的活性，也不改变本发明中所公开的该突变体的特性。
所述生物活性是指相对野生型而言，该突变体具有更好的热稳定性及酯化效率显著提高。而且，能适用黑曲霉表达系统。
此外，本发明所述甘油酯脂肪酶突变体可利用黑曲霉表达系统进行表达，而已公开的其他发明使用的非GRAS(一般认为是安全的菌种)菌种，利用该类宿主生产的酶在食品工业应用受限。并且本发明的经过改造获得是突变体其酯化活力及热稳定性均优于现有开发的米曲霉甘油酯脂肪酶及其突变体。本发明所述甘油酯脂肪酶突变体具有更好的工业化应用前景。
所述甘油酯脂肪酶野生型及其突变体的氨基酸以及编码核苷酸如下。
SEQ ID NO：1
atgcgcttcctctccggcttcgtttctgttctgtcctcagtggccctgttgggttacgcttacccaacggcaattgatgttagagacatccctactacccagctcgaagacttcaagttctgggtgcaatatgcggctgccacctactgccccaataactacgttgccaaagacggcgaaaagctgaattgctctgtgggcaactgccctgatgtcgaggcggccggttctactgtcaagctcagcttctccgatgataccatcaccgacactgccggcttcgtggccgtagacaacaccaacaaggccatcgtcgtcgctttccgtggctcctactctatccgcaactgggtcaccgacgcaaccttcccccaaaccgacccaggactgtgcgacggctgcaaggccgaactgggcttctggaccgcctggaaggtcgtccgcgaccgaatcatcaagaccctggatgagctgaagcccgaacacagcgactacaaaatcgttgtcgtgggccacagtctcggcgccgccatcgcctcgctcgcagctgcggacctgcgcacgaagaattacgacgcgatcctgtacgcctacgccgcgccgcgtgtggccaacaagcctctggccgagttcatcaccaaccagggcaacaactaccgcttcactcacaatgacgaccccgtgcccaagctgccgctcttgactatgggctacgtgcacatcagccctgaatactatatcaccgcgccggacaacactaccgtcaccgacaaccaagtcaccgttctcgatggatacgtgaacttcaagggaaacaccggcacgagcggcggactgcctgacctccttgcgttccactcgcatgtctggtactttatccacgccgatgcctgcaagggtcctggattgccattgcgctaa
SEQ ID NO：2
MRFLSGFVSVLSSVALLGYAYPTAIDVRDIPTTQLEDFKFWVQYAAATYCPNNYVAKDGEKLNCSVGNCPDVEAAGSTVKLSFSDDTITDTAGFVAVDNTNKAIVVAFRGSYSIRNWVTDATFPQTDPGLCDGCKAELGFWTAWKVVRDRIIKTLDELKPEHSDYKIVVVGHSLGAAIASLAAADLRTKNYDAILYAYAAPRVANKPLAEFITNQGNNYRFTHNDDPVPKLPLLTMGYVHISPEYYITAPDNTTVTDNQVTVLDGYVNFKGNTGTSGGLPDLLAFHSHVWYFIHADACKGPGLPLR
SEQ ID NO：3
Atgcgcttcctctccggcttcgtttctgttctgtcctcagtggccctgttgggttacgcttacccaacggcaattgatgttagagacatccctactacccagctcgaagacttcaagttctgggtgcaatatgcggctgccacctactgccccaataactacgttgccaaagacggcgaaaagctgaattgctctgtgggcaactgccctgatgtcgaggcggccggttctactgtcaagctcagcttctccgatgataccatcaccgacactgccggcttcgtggccgtagacaacaccaacaaggccatcgtcgtcgctttccgtggctcctactctatccgcaactgggtcaccgacgcaaccttcccccaaaccgacccaggactgtgcgacggctgcaaggccgaactgggcttctggaccgcctggaaggtcgtccgcgaccgaatcatcaagaccctggatgagctgaagcccgaacacagcgactacaaaatcgttgtcgtgggccacagtctcggcgccgccatcgcctcgctcgcagctgcggacctgcgcacgaagaattacgacgcgatcctgtacgcctacgccgcgccgcgtgtggccaacaagcctctggccgagttcatcaccaaccagggcaacaactaccgcttcactcacaatgacgaccccgtgcccaagctgccgctcttgactatgggctacgtgcacatcagccctgaatactatatcaccgcgccggacaacactaccgtcaccgacaaccaagtcaccgttctcgatggatacgtgaacttcaagggaaacaccggcacgagcggcggactgcctgacctccttgcgaaccactcgcatgtctggtactttatccacgccgatgcctgcaagggtcctggattgccattgcgctaa
SEQ ID NO：4
MRFLSGFVSVLSSVALLGYAYPTAIDVRDIPTTQLEDFKFWVQYAAATYCPNNYVAKDGEKLNCSVGNCPDVEAAGSTVKLSFSDDTITDTAGFVAVDNTNKAIVVAFRGSYSIRNWVTDATFPQTDPGLCDGCKAELGFWTAWKVVRDRIIKTLDELKPEHSDYKIVVVGHSLGAAIASLAAADLRTKNYDAILYAYAAPRVANKPLAEFITNQGNNYRFTHNDDPVPKLPLLTMGYVHISPEYYITAPDNTTVTDNQVTVLDGYVNFKGNTGTSGGLPDLLANHSHVWYFIHADACKGPGLPLR。
以下通过具体实施例，对本发明做进一步的阐述，但是不用于限制本发明的保护范围。
实施例1：甘油酯脂肪酶基因的随机突变
所述SEQ ID NO：1的基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，合成的基因序列以EcoRI及KpnI酶切位点克隆于pGAPZαA载体中，获得pGAPZαA-AOL重组质粒。AOL(Aspergillus oryzae lipase)基因的随机突变操作如下：使用alpha-factor引物:(TACTATTGCCAGCATTGCTGC，SEQ ID NO：5)和3’AOX引物：(GCAAATGGCATTCTGACATCC，SEQ IDNO：6)扩增含重组质粒中的AOL部分，PCR反应使用TaKaRa公司的Taq酶进行扩增，反应体系为：10×buffer 5μl，dNTP mixture(浓度：2.5mM)4μl，引物各1μl，质粒模板0.5μl(约20ng)，Taq酶0.5μl，额外添加0.3-1mM的MnCl2，加双蒸水至50ul。PCR反应程序为94℃10s，94℃20s，56℃20s，72℃1min，72℃5min，25个循环。PCR产物经过PCR纯化试剂盒(上海生工生物工程公司)进行纯化。纯化后的PCR产物通过KpnI和EcoRI酶切位点酶切并克隆至pGAPZαA载体的相应酶切位点，转化入大肠杆菌Top10菌株中，在含25μg/ml博来霉素LB液体培养基中，37℃培养4h。使用质粒提取试剂盒抽提质粒，用SacI进行线性化，通过电击法转化巴斯德毕赤酵母X-33感受态细胞。涂布到含有甘油二酯底物的YPD筛选平板，于30℃培养三天。挑取水解圈最大的转化子接种至3mL YPD培养基中，30℃下以200rpm摇动培养3天。将培养后的菌液以12000rpm离心5min，吸取上清于4℃保藏，用于测定人工底物对硝基苯酚癸酸酯(pNP-C10)水解能力。此外，为进行对比筛选，将本发明人前期筛选的突变体V269D工程菌株(赵格.米曲霉脂肪酶AOL的酶学性质、晶体学及定点突变研究[D].华南理工大学,2018.)以同样的方法进行培养。
实施例2：热稳定性甘油酯脂肪酶突变体的定向筛选
将实施例1中的AOL酶变异体的发酵液上清进行60℃孵育1小时，然后测定样品的残留活力。具体地在96孔酶标板中依次加入80μL的0.1M磷酸盐缓冲液(pH6，含1mg/mL的阿拉伯胶)和10μL用乙醇配对硝基苯酚癸酸酯(pNP-C10)溶液，于30℃预热5min，然后实验组加入10μL酶液，对照组加入10μL蛋白所在的缓冲液反应5min，反应结束后立即加入100μL10％SDS溶液终止反应，于酶标仪上测定OD405处的吸光值。酶活力单位定义为：单位时间内水解对硝基苯酚癸酸酯产生1μmol对硝基苯酸所需要的酶量为1个酶活单位。经过热处理后，保留有较多残留活力的酶变异体用于酯化活力的筛选评估。对大量的克隆进行筛选后，发现其中9个克隆的耐热性能获得提高，分别命名为克隆1-克隆9(后经测序，方案如实例4所示，分别确定为N53S、V72L、S111A、Q125W、W141T、L158I、H172D、A204Y及F285N)，结果如图1所示。其中，克隆9(F285N)的耐热性能最好。
实施例3：高酯化活力甘油酯脂肪酶突变体的定向筛选
将实施例2中耐热性提高的9个克隆和突变体V269D在500mL YPD培养基中进行培养3天，其发酵上清液进行Vivaflow 200(10kDa)切向流超滤膜包进行回流浓缩，待浓缩到较小体积时，加入pH7.0 20mM的磷酸盐缓冲液进行换盐，直至pH达到7.0时为止，然后进行冷冻干燥处理获得酶冻干粉。脂肪酶活力测定流程如下：在25mL锥形瓶中加入11mM甘油、5.5mM的油酸，2％20mM的磷酸盐缓冲液(pH6.0，相对于底物总质量)在最适温度下预热5min，然后加入适当的冻干酶粉，于500rmp条件下反应10min。将全部的反应混合物于10000rpm条件下离心1min。立即收集上层油相到事先滴定过2滴1％酚酞的25mL异丙醇中，再用0.05mol/L KOH标准溶液滴定，记录消耗的KOH体积。1U的酯化活力被定义为在一定条件下每分钟酯化1μmol FAs所需的酶量。每个实验重复3次。AOL突变体对甘油和油酸酯化活力测定用相对酶活表示，以测定的野生型AOL酶活力定为100％。如图2所示，克隆9(F285N)突变体在所有变异体中酯化活力最高，其酯化活力高于V269D，并且是野生型的3.5倍。
实施例4：耐热高酯化活力甘油酯脂肪酶突变体的测序及活性验证
以真菌基因组提取试剂盒获得克隆1-9的基因组后，以TAKARA的Primer Star酶及alpha-factor引物:(TACTATTGCCAGCATTGCTGC)和3’AOX引物：(GCAAATGGCATTCTGACATCC)进行扩增。PCR扩增条件为：98℃3min；98℃10s、55℃30s、72℃5min，30个循环；72℃延伸5min。反应体系：引物各为1μL，Primer Star(2X)为12.5μL，模板为1μL，ddH2O为9.5μL。PCR产物纯化后送生工生物工程有限公司测序。经过测序，克隆1-9分别确定为N53S、V72L、S111A、Q125W、W141T、L158I、H172D、A204Y及F285N。其中耐热高酯化活力甘油酯脂肪酶克隆9的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，并命名为F285N突变体。
耐热高酯化活力甘油酯脂肪酶突变体发酵后的培养液于4℃、10000rpm离心10min，所得上清液通过0.45μm滤膜抽滤以进一步除去菌体和悬浮杂质。抽滤后的上清用Vivaflow200(10kDa)切向流超滤膜包进行回流浓缩，待浓缩到较小体积时，加入2倍体积20mM Tris-HCl(pH8.0)的缓冲液再次回流浓缩，重复多次，直至pH达到8.0时为止。最后将突变体蛋白样品浓缩到50mL。利用阴离子交换层析Q Sepharose Fast Flow进行纯化，纯化重组酶蛋白进一步耐热验证。将纯化后F285N突变体和野生型稀释至一定浓度，于60℃中孵育，在一定的时间间隔取出样品，并测定其残留酯化酶活。接着进一步计算半衰期：以热处理时间(分钟)为横坐标，相对酶活力的ln对数值为纵坐标，然后求其拟合直线，所得拟合直线斜率的相反数kd为失活常数，根据半衰期公式T1/2＝ln2/kd求出其半衰期。结果显示F285N的半衰期为94分钟，而野生型为42分钟。
实施例5：黑曲霉工程菌株的构建
将甘油酯脂肪酶突变体基因亚克隆到黑曲霉表达载体pGMAD载体中，酶切位点为XhoI及XbaI，并转化到黑曲霉菌种中，具体操作如下：黑曲霉单菌落在60mL CD液体培养基中，28℃静置培养4天；收集菌丝体，用0.8M NaCl清洗一次，称取湿重，按质量体积比1:10加入裂解液，30℃，80～130rpm酶解2.5～3h；将得到的原生质体液过滤，回收滤液，3200rpm离心10min，弃上清，分别用预冷的0.6M KCl，S/C溶液洗涤沉淀，离心；原生质体沉淀重悬于适量S/C溶液中，菌体浓度达到约1×106个/mL；在原生质体制备液中加入约10μg的线性化质粒，加入50μL PEG溶液后轻柔地混匀，之后冰浴30min；加入1mL PEG缓冲液，室温放置20min后加入2mL S/C溶液，轻轻混匀，涂布于含有乙酰胺选择培养基的TZ平板，34℃培养5～6天。挑取单克隆的菌丝体至含有溶壁酶的无菌水中研磨，研磨完毕后在30℃下200rpm孵育3～4h，提取黑曲霉工程菌的基因组，进行PCR扩增(AOL-F：ATGCGCTTCCTCTCCGGCTTCGT，SEQ IDNO.7；AOL-R：GCGCAATGGCAATCCAGGACC,SEQ ID NO.8)，验证AOL基因是否有效整合到细胞基因组中。PCR反应使用生工生物公司的Taq酶进行扩增，反应体系为：Taq PCR Master Mix12.5μl，引物各1μl，基因组0.5μl，加双蒸水至25ul。PCR反应程序为94℃4min变性；94℃30s，56℃20s，72℃3min，25个循环；72℃延伸10min。经过核酸凝胶电泳确定AOL基因成功整合到细胞基因组中。同时重组工程菌接种到25mL麦芽糖培养基中，30℃，200rpm培养5～7天，定期取样检测酶酯化活力。经过筛选，获得了酶活较高的重组黑曲霉工程菌，其第7天的发酵酯化酶活为2500U/mL。
实施例6：黑曲霉工程菌株发酵
将黑曲霉工程菌接种到制备好的试管斜面培养基上，在30～32℃培养3～5天至长出孢子。向斜面上加入生理盐水洗涤菌丝体，于30～32℃培养箱静止培养2～3天，按照体积比2％～5％的接种量得到的孢子悬浮液接入液体种子培养基。于25～32℃、转速180～220rpm的摇床上扩大培养2～4天，获得种子液。以体积比为10％～20％接种量将种子液接入发酵罐。发酵过程中，温度控制在30～32℃，通气量维持在6～7vvm，转速控制在600～800rpm，pH维持在4.8～5.2之间，加入种子培养液10～20h后，补加50％麦芽糊精，调控补料速率以维持发酵罐中还原糖含量为10～15g/L，每间隔6～12h取样离心测发酵液酶活和还原糖含量，培养168h后，将黑曲霉发酵液于10000rpm、10min条件下冷冻离心，收集发酵液，粗酶液用0.22μm滤膜抽滤后，进行浓缩及冻干处理。
实施例7合成甘油二酯
称取65g大豆油脂肪酸与10.67g甘油(大豆油脂肪酸与甘油摩尔比为2:1)于250mL的锥形瓶中，并置于转速为500rpm的恒温磁力搅拌器上35℃预热10min，预热结束后，加入240U/g的野生型甘油酯脂肪酶AOL或F285N突变体，然后将其置于40℃的恒温振荡器中配合磁力搅拌子进行抽真空反应，转速为500rpm，于不同的反应时间提取油样，使用HPLC分析反应产物的甘油酯组成。反应12小时后，野生型甘油酯肪酶的酯化产物DAG(甘油二酯)含量为64％，甘油酯肪酶突变体含量为75％，说明F285N突变体合成甘油二酯的效果更好。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种甘油酯脂肪酶突变体及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 921
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcgcttcc tctccggctt cgtttctgtt ctgtcctcag tggccctgtt gggttacgct 60
tacccaacgg caattgatgt tagagacatc cctactaccc agctcgaaga cttcaagttc 120
tgggtgcaat atgcggctgc cacctactgc cccaataact acgttgccaa agacggcgaa 180
aagctgaatt gctctgtggg caactgccct gatgtcgagg cggccggttc tactgtcaag 240
ctcagcttct ccgatgatac catcaccgac actgccggct tcgtggccgt agacaacacc 300
aacaaggcca tcgtcgtcgc tttccgtggc tcctactcta tccgcaactg ggtcaccgac 360
gcaaccttcc cccaaaccga cccaggactg tgcgacggct gcaaggccga actgggcttc 420
tggaccgcct ggaaggtcgt ccgcgaccga atcatcaaga ccctggatga gctgaagccc 480
gaacacagcg actacaaaat cgttgtcgtg ggccacagtc tcggcgccgc catcgcctcg 540
ctcgcagctg cggacctgcg cacgaagaat tacgacgcga tcctgtacgc ctacgccgcg 600
ccgcgtgtgg ccaacaagcc tctggccgag ttcatcacca accagggcaa caactaccgc 660
ttcactcaca atgacgaccc cgtgcccaag ctgccgctct tgactatggg ctacgtgcac 720
atcagccctg aatactatat caccgcgccg gacaacacta ccgtcaccga caaccaagtc 780
accgttctcg atggatacgt gaacttcaag ggaaacaccg gcacgagcgg cggactgcct 840
gacctccttg cgttccactc gcatgtctgg tactttatcc acgccgatgc ctgcaagggt 900
cctggattgc cattgcgcta a 921
<210> 2
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Arg Phe Leu Ser Gly Phe Val Ser Val Leu Ser Ser Val Ala Leu
1 5 10 15
Leu Gly Tyr Ala Tyr Pro Thr Ala Ile Asp Val Arg Asp Ile Pro Thr
20 25 30
Thr Gln Leu Glu Asp Phe Lys Phe Trp Val Gln Tyr Ala Ala Ala Thr
35 40 45
Tyr Cys Pro Asn Asn Tyr Val Ala Lys Asp Gly Glu Lys Leu Asn Cys
50 55 60
Ser Val Gly Asn Cys Pro Asp Val Glu Ala Ala Gly Ser Thr Val Lys
65 70 75 80
Leu Ser Phe Ser Asp Asp Thr Ile Thr Asp Thr Ala Gly Phe Val Ala
85 90 95
Val Asp Asn Thr Asn Lys Ala Ile Val Val Ala Phe Arg Gly Ser Tyr
100 105 110
Ser Ile Arg Asn Trp Val Thr Asp Ala Thr Phe Pro Gln Thr Asp Pro
115 120 125
Gly Leu Cys Asp Gly Cys Lys Ala Glu Leu Gly Phe Trp Thr Ala Trp
130 135 140
Lys Val Val Arg Asp Arg Ile Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Lys Pro
145 150 155 160
Glu His Ser Asp Tyr Lys Ile Val Val Val Gly His Ser Leu Gly Ala
165 170 175
Ala Ile Ala Ser Leu Ala Ala Ala Asp Leu Arg Thr Lys Asn Tyr Asp
180 185 190
Ala Ile Leu Tyr Ala Tyr Ala Ala Pro Arg Val Ala Asn Lys Pro Leu
195 200 205
Ala Glu Phe Ile Thr Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Arg Phe Thr His Asn
210 215 220
Asp Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Leu Leu Thr Met Gly Tyr Val His
225 230 235 240
Ile Ser Pro Glu Tyr Tyr Ile Thr Ala Pro Asp Asn Thr Thr Val Thr
245 250 255
Asp Asn Gln Val Thr Val Leu Asp Gly Tyr Val Asn Phe Lys Gly Asn
260 265 270
Thr Gly Thr Ser Gly Gly Leu Pro Asp Leu Leu Ala Phe His Ser His
275 280 285
Val Trp Tyr Phe Ile His Ala Asp Ala Cys Lys Gly Pro Gly Leu Pro
290 295 300
Leu Arg
305
<210> 3
<211> 921
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcgcttcc tctccggctt cgtttctgtt ctgtcctcag tggccctgtt gggttacgct 60
tacccaacgg caattgatgt tagagacatc cctactaccc agctcgaaga cttcaagttc 120
tgggtgcaat atgcggctgc cacctactgc cccaataact acgttgccaa agacggcgaa 180
aagctgaatt gctctgtggg caactgccct gatgtcgagg cggccggttc tactgtcaag 240
ctcagcttct ccgatgatac catcaccgac actgccggct tcgtggccgt agacaacacc 300
aacaaggcca tcgtcgtcgc tttccgtggc tcctactcta tccgcaactg ggtcaccgac 360
gcaaccttcc cccaaaccga cccaggactg tgcgacggct gcaaggccga actgggcttc 420
tggaccgcct ggaaggtcgt ccgcgaccga atcatcaaga ccctggatga gctgaagccc 480
gaacacagcg actacaaaat cgttgtcgtg ggccacagtc tcggcgccgc catcgcctcg 540
ctcgcagctg cggacctgcg cacgaagaat tacgacgcga tcctgtacgc ctacgccgcg 600
ccgcgtgtgg ccaacaagcc tctggccgag ttcatcacca accagggcaa caactaccgc 660
ttcactcaca atgacgaccc cgtgcccaag ctgccgctct tgactatggg ctacgtgcac 720
atcagccctg aatactatat caccgcgccg gacaacacta ccgtcaccga caaccaagtc 780
accgttctcg atggatacgt gaacttcaag ggaaacaccg gcacgagcgg cggactgcct 840
gacctccttg cgaaccactc gcatgtctgg tactttatcc acgccgatgc ctgcaagggt 900
cctggattgc cattgcgcta a 921
<210> 4
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Arg Phe Leu Ser Gly Phe Val Ser Val Leu Ser Ser Val Ala Leu
1 5 10 15
Leu Gly Tyr Ala Tyr Pro Thr Ala Ile Asp Val Arg Asp Ile Pro Thr
20 25 30
Thr Gln Leu Glu Asp Phe Lys Phe Trp Val Gln Tyr Ala Ala Ala Thr
35 40 45
Tyr Cys Pro Asn Asn Tyr Val Ala Lys Asp Gly Glu Lys Leu Asn Cys
50 55 60
Ser Val Gly Asn Cys Pro Asp Val Glu Ala Ala Gly Ser Thr Val Lys
65 70 75 80
Leu Ser Phe Ser Asp Asp Thr Ile Thr Asp Thr Ala Gly Phe Val Ala
85 90 95
Val Asp Asn Thr Asn Lys Ala Ile Val Val Ala Phe Arg Gly Ser Tyr
100 105 110
Ser Ile Arg Asn Trp Val Thr Asp Ala Thr Phe Pro Gln Thr Asp Pro
115 120 125
Gly Leu Cys Asp Gly Cys Lys Ala Glu Leu Gly Phe Trp Thr Ala Trp
130 135 140
Lys Val Val Arg Asp Arg Ile Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Lys Pro
145 150 155 160
Glu His Ser Asp Tyr Lys Ile Val Val Val Gly His Ser Leu Gly Ala
165 170 175
Ala Ile Ala Ser Leu Ala Ala Ala Asp Leu Arg Thr Lys Asn Tyr Asp
180 185 190
Ala Ile Leu Tyr Ala Tyr Ala Ala Pro Arg Val Ala Asn Lys Pro Leu
195 200 205
Ala Glu Phe Ile Thr Asn Gln Gly Asn Asn Tyr Arg Phe Thr His Asn
210 215 220
Asp Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Leu Leu Thr Met Gly Tyr Val His
225 230 235 240
Ile Ser Pro Glu Tyr Tyr Ile Thr Ala Pro Asp Asn Thr Thr Val Thr
245 250 255
Asp Asn Gln Val Thr Val Leu Asp Gly Tyr Val Asn Phe Lys Gly Asn
260 265 270
Thr Gly Thr Ser Gly Gly Leu Pro Asp Leu Leu Ala Asn His Ser His
275 280 285
Val Trp Tyr Phe Ile His Ala Asp Ala Cys Lys Gly Pro Gly Leu Pro
290 295 300
Leu Arg
305
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tactattgcc agcattgctg c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcaaatggca ttctgacatc c 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgcgcttcc tctccggctt cgt 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcgcaatggc aatccaggac c 21

Claims (10)

1.一种甘油酯脂肪酶突变体，其特征是，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；或其编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3或其反向互补序列所示。
2.根据权利要求1所述的甘油酯脂肪酶突变体，其特征是，所述甘油酯脂肪酶突变体来源于黑曲霉（Aspergillus niger）。
3.一种编码权利要求1或2所述甘油酯脂肪酶突变体的核苷酸。
4.根据权利要求3所述的核苷酸，其特征是，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3或其反向互补序列所示。
5.一种插入有权利要求3或4所述的编码甘油酯脂肪酶突变体的核苷酸的重组表达载体。
6.一种转入有权利要求5所述重组表达载体的重组工程菌。
7.根据权利要求6所述的重组工程菌株，其特征是，所述重组工程菌的宿主菌为黑曲霉。
8.权利要求1或2所述的甘油酯脂肪酶突变体、和/或权利要求3或4所述的核苷酸、和/或权利要求5所述的重组表达载体、和/或权利要求6所述的重组工程菌在油脂制备中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征是，所述油脂是甘油二酯或甘油单酯。
10.一种制备甘油二酯或甘油单酯的方法，其特征是，将权利要求1或2所述的甘油酯脂肪酶突变体与脂肪酸和甘油进行混合反应。
CN202110008611.0A 2020-09-30 2021-01-05 一种甘油酯脂肪酶突变体及其应用 Active CN112592910B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2020110616320 2020-09-30
CN202011061632 2020-09-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112592910A CN112592910A (zh) 2021-04-02
CN112592910B true CN112592910B (zh) 2021-10-15

Family

ID=75206960

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110008611.0A Active CN112592910B (zh) 2020-09-30 2021-01-05 一种甘油酯脂肪酶突变体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112592910B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115161304B (zh) * 2022-05-26 2023-05-30 华南理工大学 米黑根毛霉脂肪酶变异体及其应用
CN116426500B (zh) * 2023-05-18 2024-04-30 华东理工大学 一种高酯化能力的脂肪酶突变体及其表达应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103361326A (zh) * 2013-07-08 2013-10-23 华南理工大学 一种耐热性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及突变质粒、重组菌株和制备方法
CN103627685A (zh) * 2013-11-20 2014-03-12 华南理工大学 一种活性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及其应用
CN108642026A (zh) * 2018-05-17 2018-10-12 华南理工大学 一种偏甘油酯脂肪酶突变体及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106906194A (zh) * 2017-03-09 2017-06-30 华南理工大学 一种偏甘油酯脂肪酶及富含pufa的油脂的酶法脱酸方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103361326A (zh) * 2013-07-08 2013-10-23 华南理工大学 一种耐热性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及突变质粒、重组菌株和制备方法
CN103627685A (zh) * 2013-11-20 2014-03-12 华南理工大学 一种活性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及其应用
CN108642026A (zh) * 2018-05-17 2018-10-12 华南理工大学 一种偏甘油酯脂肪酶突变体及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Thermostable Monoacylglycerol Lipase from Marine Geobacillus sp. 12AMOR1: Biochemical Characterization and Mutagenesis Study;Wei Tang等;《International Journal of Molecular Sciences》;20190212;第20卷(第3期);参见第1-16页 *
Aspergillus oryzae RIB40 unnamed protein product (AO090701000644), partial mRNA;Machida,M.等;《GenBank》;20180404;参见登录号为XM_001823407.3的序列及信息 *
unnamed protein product [Aspergillus oryzae RIB40];Machida,M.等;《GenBank》;20180404;参见登录号为XP_001823459.1的序列及信息 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112592910A (zh) 2021-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112592910B (zh) 一种甘油酯脂肪酶突变体及其应用
CN1187853A (zh) 编码碱性液化α－淀粉酶的基因
JP7297924B2 (ja) ゲンチオオリゴ糖の製造における耐熱性β－グルコシダーゼの使用
EP4006149A1 (en) Mutant glucose oxidase (god) having improved thermal stability and gene and application thereof
CN109385413B (zh) 葡萄糖淀粉酶TlGA1931及其基因和应用
CN110066777B (zh) 一种内切菊粉酶及其在生产低聚果糖中的应用
CN102016033A (zh) β-淀粉酶、编码其的基因和其制造方法
CN106635846B (zh) 一种高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株
CN111471666A (zh) 比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体ga3及其基因和应用
JP4663631B2 (ja) 放線菌由来のａｍｐデアミナーゼ及びその利用
CN111334489A (zh) 比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体ga1、ga2、ga4及其基因和应用
CN109929822B (zh) 一种米曲霉脂肪酶突变体及其应用
CN111826363A (zh) 一种右旋糖酐蔗糖酶突变体及其制备方法与应用
CN112111472B (zh) 一种新型β-木糖苷酶及其制备
WO2012077614A1 (ja) 油脂のランダムエステル交換法及びランダムエステル交換用リパーゼ
JP4370395B2 (ja) タンナーゼ、その遺伝子及びタンナーゼの製造法
CN110982804B (zh) 一种脂肪酶及其在获得富集dha甘油酯中的应用
WO1995032279A1 (fr) Bacterie produisant de la cellulose, obtenue par une transformation par un gene codant pour un enzyme implique dans le metabolisme du saccharose
CN113699176A (zh) 高产溶血磷脂酶黑曲霉重组表达菌株的构建及应用
CN108913677B (zh) 一种定点突变改造的碱性普鲁兰酶及其应用
CN113755509A (zh) 溶血磷脂酶变体及其构建方法和在黑曲霉菌株中的表达
TW202202621A (zh) 新穎啟動子及使用其生產麩胱甘肽的方法
CN110144320A (zh) 一种产麦芽四糖淀粉酶的基因工程菌及其发酵工艺
CN112941059B (zh) 一种l-天冬酰胺酶突变体及其在枯草芽孢杆菌中的表达
AU776922B2 (en) D-gluconolactone oxidase gene and method for producing recombinant D-gluconolactone oxidase

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant