WO2012077614A1 - 油脂のランダムエステル交換法及びランダムエステル交換用リパーゼ - Google Patents

油脂のランダムエステル交換法及びランダムエステル交換用リパーゼ Download PDF

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WO2012077614A1
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lipase
geobacillus
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amino acid
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PCT/JP2011/078014
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裕三 小嶋
裕起 藤岡
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天野エンザイム株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6458—Glycerides by transesterification, e.g. interesterification, ester interchange, alcoholysis or acidolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C11C3/04—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fats or fatty oils
    • C11C3/10—Ester interchange
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters

Definitions

  • the present invention relates to a method for random transesterification of fats and oils, a novel lipase suitable for the method, a gene thereof, and the like.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2010-271498 filed on Dec. 6, 2010, the entire contents of which are incorporated by reference.
  • the transesterification reaction of fats and oils is an effective method for modifying the physical properties (melting point, crystallinity, heat resistance, etc.) of fats and oils, and can be roughly divided into two types: (See Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Non-Patent Documents 1 and 2 In recent years, the use of enzymatic random transesterification has attracted attention due to the health problems of trans fatty acids.
  • lipases from the genus Candida, Alcaligenes, Pseudomonas, Humicola (trade name: Novozyme, Lipozyme) TL IM), etc. can be used. (For example, refer to Patent Documents 1 to 3 and Non-Patent Documents 3 and 4).
  • lipase derived from Alkaligenes is most suitable for industrial production in terms of activity and heat resistance (see, for example, Patent Documents 1 and 2).
  • the presence of pathogenicity has been reported in some species of the genus Alkagenes, and it cannot be said that it is suitable as a lipase producing bacterium used for processing edible fats and oils. The same applies to Pseudomonas.
  • lipase derived from the genus Humicola is not suitable for random transesterification because of its strong 1,3-position selectivity.
  • an object of the present invention is to find a microorganism-derived lipase suitable for random transesterification, and to provide a method for random transesterification of fats and oils having high practical value.
  • the present inventors paid attention to Geobacillus microorganisms while advancing studies to solve the above problems.
  • the genus Geobacillus no bacterial species exhibiting pathogenicity has been reported, and lipases produced by this genus were considered preferable as lipases used for processing edible fats and oils.
  • lipases derived from Geobacillus thermocatenulatus and lipases derived from Geobacillus stearothermophilus have been reported (Non-Patent Documents 5 to 7).
  • Non-Patent Documents 5 to 7 Non-Patent Documents 5 to 7
  • random transesterification reactions using these have not been studied, and it has been unclear whether the lipase can be used for random transesterification reactions.
  • Non-Patent Document 5 the Geobacillus thermocatenulotus DSM730 strain and Geobacillus coastophilus ATCC 8005 strain
  • the lipase genetic information described in Non-Patent Document 7 are used. Based on the above, we attempted to obtain the lipase gene from Geobacillus coteophilus JCM12893. The three types of lipase genes that were successfully obtained were expressed in E. coli, enzyme powders were prepared, and random transesterification ability was evaluated. As a result, high random transesterification ability was confirmed for all these lipases.
  • a method for random transesterification of fats and oils comprising a step of allowing a lipase derived from a microorganism belonging to the genus Geobacillus to act on fats and oils.
  • a lipase gene comprising any DNA selected from the group consisting of the following (a) to (f): (a) DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (b) DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; (c) DNA comprising the sequence of SEQ ID NO: 5; (d) DNA that hybridizes under stringent conditions to a sequence complementary to the sequence of SEQ ID NO: 5; (e) DNA that is a DNA sequence degenerate of the sequence of SEQ ID NO: 5; (f) DNA encoding a protein having a lipase activity, comprising a sequence containing substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or more bases based on the sequence of SEQ ID NO: 5.
  • a recombinant vector comprising the lipase gene according to [8].
  • a process for producing a lipase for random transesterification comprising the following steps (1) and (2): (1) culturing Geobacillus thermocatenulotus or Geobacillus coastophilus; (2) A step of recovering the lipase from the culture solution and / or the cells after culturing.
  • Geobacillus thermocatenulotus is Geobacillus thermocatenulotus DSM730 strain
  • Geobacillus coast phyllus is Geobacillus coast phyllus ATCC 8005 strain or Geobacillus coast phyllus HTA426 strain
  • the manufacturing method described [13] A process for producing a lipase for random transesterification comprising the following steps (i) and (ii): (I) culturing the transformant according to [10] under conditions for producing a protein encoded by the lipase gene; (Ii) recovering the produced protein.
  • the homology between the amino acid sequence of lipase GK-N (SEQ ID NO: 1) and the amino acid sequence of lipase GK-A (SEQ ID NO: 2) was 93.3%.
  • the homology between the amino acid sequence of lipase GK-A (SEQ ID NO: 2) and the amino acid sequence of lipase GK-J (SEQ ID NO: 3) was 93.8%.
  • DNA encoding a protein refers to DNA from which the protein is obtained when expressed, that is, DNA having a base sequence corresponding to the amino acid sequence of the protein. Therefore, codon degeneracy is also considered.
  • isolated is used interchangeably with “purified”. “Isolated” when used in relation to the enzyme (lipase) of the present invention is substantially free of components other than the enzyme in the natural material when the enzyme of the present invention is derived from the natural material. It refers to a state (particularly substantially free of contaminating proteins). Specifically, for example, in the isolated enzyme of the present invention, the content of contaminating protein is less than about 20%, preferably less than about 10%, more preferably less than about 5%, even more preferably in terms of weight. Is less than about 1%.
  • the term “isolated” in the case where the enzyme of the present invention is prepared by a genetic engineering technique substantially includes other components derived from the used host cell, culture medium, and the like. It means no state. Specifically, for example, in the isolated enzyme of the present invention, the content of contaminant components is less than about 20%, preferably less than about 10%, more preferably less than about 5%, even more preferably in terms of weight. Less than about 1%.
  • the term “isolated” in the case where the enzyme of the present invention is prepared by a genetic engineering technique substantially includes other components derived from the used host cell, culture medium, and the like. It means no state. Specifically, for example, in the isolated enzyme of the present invention, the content of contaminant components is less than about 20%, preferably less than about 10%, more preferably less than about 5%, even more preferably in terms of weight. Less than about 1%.
  • lipase in an isolated state. The same applies to the term “present enzyme” used in place of lipase.
  • isolated when used with respect to DNA means that, in the case of naturally occurring DNA, it is typically separated from other nucleic acids that coexist in the natural state. However, some other nucleic acid components such as a nucleic acid sequence adjacent in the natural state (for example, a promoter region sequence and a terminator sequence) may be included.
  • an “isolated” state in the case of genomic DNA is preferably substantially free of other DNA components that coexist in the natural state.
  • the “isolated” state in the case of DNA prepared by genetic engineering techniques such as cDNA molecules is preferably substantially free of cell components, culture medium, and the like.
  • the “isolated” state in the case of DNA prepared by chemical synthesis is preferably substantially free of precursors (raw materials) such as dNTP, chemical substances used in the synthesis process, and the like.
  • precursors raw materials
  • dNTP chemical substances used in the synthesis process
  • DNA DNA in an isolated state.
  • the random transesterification method of fats and oils is related with the random transesterification method of fats and oils using an enzyme.
  • a microorganism belonging to the genus Geobacillus produces a lipase having a high random transesterification ability.
  • the method of the present invention uses a lipase derived from a microorganism belonging to the genus Geobacillus.
  • a step of allowing a lipase derived from a microorganism of the genus Geobacillus to act on fats and oils is performed, and random transesterification of the fats and oils, that is, a configuration of triacylglycerol (abbreviated as TG or TAG) in the fats and oils. Rearrange (rearrange) the fatty acids.
  • Geobacillus thermocatenulatus for example, lipase of Geobacillus thermocatenulotus DSM730 strain
  • Geobacillus coast phyllus for example, Geobacillus coastophilus ATCC 8005 strain or Geobacillus coast phyllus HTA426 strain
  • the lipase of (JCM12893) can be used.
  • the amino acid sequence of the lipase of Geobacillus thermocatenulotus DSM730 is SEQ ID NO: 1 (NCBI, DEFINITION: triacylglycerolyllipase [Geobacillus thermocatenulatus].] ACCESSION: CAA64621) The amino acid sequence of the lipase of Geobacillus coastophilus ATCC ⁇ ⁇ 8005 In No. 2, the amino acid sequence of the lipase of Geobacillus coastophilus HTA426 strain is shown in SEQ ID No. 3, respectively.
  • soybean oil, rapeseed oil, rice oil, corn oil, sunflower oil, cottonseed oil, peanut oil, safflower oil, palm oil, palm soft oil, palm fractionated oil, palm kernel oil examples thereof include vegetable oils such as coconut oil and cacao butter, animal oils such as fish oil, lard, beef tallow and milk fat, and fractionated oils thereof, hardened oils, trilaurin, triolein and tripalmitin.
  • the method of the present invention can be used for transesterification between fats and oils and fatty acids or fatty acid esters, as well as transesterification between fats and oils.
  • fatty acid esters are stearic acid, palmitic acid, lauric acid, arachidic acid, behenic acid, oleic acid, linoleic acid, and examples of fatty acid esters are ethyl stearate, ethyl palmitate, ethyl oleate, ethyl linoleate. .
  • a lipase obtained from a Geobacillus microorganism or a culture solution of a Geobacillus microorganism (containing a lipase) is added to fats and oils, for example, at 30 to 100 ° C., preferably at 35 to 70 ° C. for a predetermined time.
  • the reaction is performed (for example, 5 to 48 hours). In order to promote the reaction, stirring may be performed during the reaction.
  • an immobilized lipase may be used.
  • a batch type stirred tank type reactor a flow type stirred tank type reactor, a packed bed type reactor, a fluidized bed type reactor or the like can be used.
  • the random transesterification method of the present invention is useful for improving and improving the physical properties of fats and oils or processed oils (for example, shortening, margarine). For example, improvement of spreadability, improvement of emulsion stability, optimization of solid fat content (SFC), improvement of solidification, selective concentration of specific fatty acids, production of low trans acid oils or processed products of low trans acid oils
  • the random transesterification method of the present invention can be applied.
  • the fats and oils obtained by applying the random transesterification method of the present invention or the processed fats and oils containing the fats and oils have improved physical properties as compared with those before treatment, and have high industrial utility value.
  • the 2nd aspect of this invention is related with the novel lipase which the inventors succeeded in identification and discovered the usefulness.
  • the lipase of the present invention (hereinafter also referred to as “the present enzyme”) includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in one embodiment.
  • the modified protein may have a function equivalent to that of the protein before modification. That is, the modification of the amino acid sequence does not substantially affect the function of the protein, and the function of the protein may be maintained before and after the modification.
  • the present invention provides a protein having an amino acid sequence equivalent to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having lipase activity (hereinafter also referred to as “equivalent protein”).
  • the “equivalent amino acid sequence” herein is partly different from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, but the difference does not substantially affect the function of the protein (here, lipase activity). I mean.
  • the degree of lipase activity is not particularly limited as long as it functions as an enzyme for random transesterification, but it is preferably the same as or higher than the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • “Partial difference in amino acid sequence” typically means deletion or substitution of 1 to several amino acids (upper limit is 3, 5, 7, 10) constituting an amino acid sequence, Alternatively, it means that a mutation (change) has occurred in the amino acid sequence due to addition, insertion, or a combination of 1 to several amino acids (upper limit is 3, 5, 7, 10), for example.
  • the difference in the amino acid sequence here is permissible as long as the lipase activity is retained (there may be some variation in activity).
  • the positions where the amino acid sequences are different are not particularly limited, and differences may occur at a plurality of positions.
  • the term “plurality” as used herein refers to, for example, a number corresponding to less than about 6% of all amino acids, preferably a number corresponding to less than about 3%, and more preferably a number corresponding to less than about 1%. That is, the equivalent protein has, for example, about 94% or more, preferably about 97% or more, more preferably about 99% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • an equivalent protein is obtained by causing a conservative amino acid substitution at an amino acid residue that is not essential for lipase activity.
  • conservative amino acid substitution refers to substitution of a certain amino acid residue with an amino acid residue having a side chain having the same properties.
  • a basic side chain eg lysine, arginine, histidine
  • an acidic side chain eg aspartic acid, glutamic acid
  • an uncharged polar side chain eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine
  • Cysteine eg alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • ⁇ -branched side chains eg threonine, valine, isoleucine
  • aromatic side chains eg tyrosine, phenylalanine, Like tryptophan and histidine.
  • a conservative amino acid substitution is preferably a substitution between amino acid residues within the same family.
  • “Equivalent proteins” may have additional properties. Such properties include, for example, properties that are superior in stability compared to the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and properties that differ in optimum temperature and pH.
  • the identity (%) of two amino acid sequences can be determined by the following procedure, for example.
  • two sequences are aligned for optimal comparison (eg, a gap may be introduced into the first sequence to optimize alignment with the second sequence).
  • a gap may be introduced into the first sequence to optimize alignment with the second sequence.
  • Gapped BLAST described in Altschul et al. (1997) Amino Acids Research 25 (17): 3389-3402 can be used.
  • the default parameters of the corresponding programs eg, XBLAST and NBLAST
  • XBLAST and NBLAST the default parameters of the corresponding programs
  • Examples of other mathematical algorithms that can be used for sequence comparison include those described in Myers and Miller (1988) Comput Appl Biosci. 4: 11-17.
  • Such an algorithm is incorporated in the ALIGN program available on, for example, the GENESTREAM network server (IGH (Montpellier, France) or the ISREC server.
  • the enzyme may be part of a larger protein (eg, a fusion protein).
  • a larger protein eg, a fusion protein
  • sequences added in the fusion protein include sequences useful for purification, such as multiple histidine residues, and additional sequences that ensure stability during recombinant production.
  • the present enzyme having the above amino acid sequence can be easily prepared by a genetic engineering technique. For example, it can be prepared by transforming a suitable host cell (for example, E. coli) with DNA encoding the present enzyme and recovering the protein expressed in the transformant. The recovered protein is appropriately prepared according to the purpose. Thus, if this enzyme is obtained as a recombinant protein, various decorations are possible. For example, if a DNA encoding this enzyme and another appropriate DNA are inserted into the same vector and a recombinant protein is produced using the vector, the peptide consists of a recombinant protein linked to any peptide or protein. This enzyme can be obtained.
  • modification may be performed so that addition of sugar chain and / or lipid, or processing of N-terminal or C-terminal may occur.
  • modification as described above, extraction of recombinant protein, simplification of purification, addition of biological function, and the like are possible.
  • novel lipase gene The third aspect of the present invention relates to a novel lipase gene.
  • the gene of the present invention comprises DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • a specific example of this embodiment is DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is obtained by adding a signal sequence to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the protein encoded by the modified DNA may have the same function as the protein encoded by the DNA before modification. That is, the modification of the DNA sequence does not substantially affect the function of the encoded protein, and the function of the encoded protein may be maintained before and after the modification. Therefore, as another aspect, the present invention provides a DNA (hereinafter also referred to as “equivalent DNA”) that encodes a protein having a base sequence equivalent to the base sequence of SEQ ID NO: 5 and having lipase activity.
  • the “equivalent base sequence” here is partially different from the nucleic acid shown in SEQ ID NO: 5, but the function of the protein encoded by the difference (here, lipase activity) is substantially affected by the difference. It means no nucleotide sequence.
  • a specific example of equivalent DNA is DNA that hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the “stringent conditions” here are conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • Such stringent conditions are known to those skilled in the art, such as Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) and Current protocols in molecular biology (edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987) Can be set with reference to.
  • hybridization solution 50% formamide, 10 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 5 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, 10 ⁇ g / ml denaturation
  • 5 ⁇ Denhardt solution 1% SDS
  • 10% dextran sulfate 10 ⁇ g / ml denaturation
  • incubation at about 42 ° C to about 50 ° C using salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), followed by washing at about 65 ° C to about 70 ° C using 0.1 x SSC, 0.1% SDS can be mentioned.
  • Further preferable stringent conditions include, for example, 50% formamide, 5 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 1 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, 10 ⁇ g / ml as a hybridization solution. Of denatured salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5)).
  • DNA encoding a protein having lipase activity can be mentioned.
  • Base substitution or deletion may occur at a plurality of sites.
  • plurality refers to, for example, 2 to 40 bases, preferably 2 to 20 bases, more preferably 2 to 10 bases, although it varies depending on the position and type of amino acid residues in the three-dimensional structure of the protein encoded by the DNA. It is.
  • Such equivalent DNAs include, for example, restriction enzyme treatment, treatment with exonuclease and DNA ligase, position-directed mutagenesis (MolecularMCloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) Includes substitutions, deletions, insertions, additions, and / or inversions of bases using mutation introduction methods (Molecular Cloning, ingThird Edition, Chapterhap13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) Thus, it can obtain by modifying DNA which has a base sequence shown to sequence number 5.
  • the equivalent DNA can also be obtained by other methods such as ultraviolet irradiation.
  • Still another example of equivalent DNA is DNA in which a base difference as described above is recognized due to a polymorphism represented by SNP (single nucleotide polymorphism).
  • the gene of the present invention was isolated by using standard genetic engineering techniques, molecular biological techniques, biochemical techniques, etc. with reference to the sequence information disclosed in this specification or the attached sequence listing. Can be prepared in a state. Specifically, from the genomic DNA library or cDNA library of Geobacillus coastophilus ATCC 8005 strain, or the intracellular extract of Geobacillus coastophilus ATCC 8005 strain, the gene of the present invention is specifically expressed. It can be prepared by appropriately using a hybridizable oligonucleotide probe / primer. Oligonucleotide probes and primers can be easily synthesized using a commercially available automated DNA synthesizer.
  • a gene having the base sequence of SEQ ID NO: 5 it can be isolated using a hybridization method using the whole base sequence or its complementary sequence as a probe. Further, it can be amplified and isolated using a nucleic acid amplification reaction (for example, PCR) using a synthetic oligonucleotide primer designed to specifically hybridize to a part of the base sequence.
  • a nucleic acid amplification reaction for example, PCR
  • a synthetic oligonucleotide primer designed to specifically hybridize to a part of the base sequence.
  • the target gene can also be obtained by chemical synthesis (Reference: Gene, 60 (1), 115-127 ( 1987)).
  • the present invention further provides a recombinant vector containing the gene of the present invention.
  • the term “vector” refers to a nucleic acid molecule capable of transporting a nucleic acid molecule inserted thereinto into a target such as a cell, and the type and form thereof are not particularly limited. Accordingly, the vector of the present invention can take the form of a plasmid vector, a cosmid vector, a phage vector, or a viral vector (an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a retrovirus vector, a herpes virus vector, etc.).
  • An appropriate vector is selected according to the purpose of use (cloning, protein expression) and in consideration of the type of host cell.
  • Specific examples of vectors include vectors using E. coli as a host (M13 phage or a modified product thereof, ⁇ phage or a modified product thereof, pBR322 or a modified product thereof (pB325, pAT153, pUC8, etc.)), and yeast as a host.
  • Vectors pYepSec1, pMFa, pYES2, etc.
  • vectors using insect cells as hosts pAc, pVL, etc.
  • vectors using mammalian cells as hosts pCDM8, pMT2PC, etc.
  • the recombinant vector of the present invention is preferably an expression vector.
  • “Expression vector” refers to a vector capable of introducing a nucleic acid inserted therein into a target cell (host cell) and allowing expression in the cell.
  • Expression vectors usually contain a promoter sequence necessary for expression of the inserted nucleic acid, an enhancer sequence that promotes expression, and the like.
  • An expression vector containing a selectable marker can also be used. When such an expression vector is used, the presence or absence of the expression vector (and the degree thereof) can be confirmed using a selection marker.
  • Insertion of the gene of the present invention into a vector, insertion of a selectable marker gene (if necessary), insertion of a promoter (if necessary), etc. are performed using standard recombinant DNA techniques (for example, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press and New York, which can be referred to, are known methods using restriction enzymes and DNA ligases).
  • the present invention also provides a host cell (transformant) into which the gene of the present invention has been introduced.
  • the gene of the present invention exists as an exogenous molecule.
  • the transformant of the present invention is preferably prepared by transfection or transformation using the vector of the present invention.
  • transfection and transformation calcium phosphate coprecipitation method, electroporation (Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161-7165 (1984)), lipofection (Felgner, PL et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417 (1984)), microinjection (Graessmann, M.
  • the host cell is not particularly limited as long as the present enzyme (protein encoded by the gene of the present invention) is expressed.
  • Bacillus bacteria such as Bacillus subtillus, Bacillus likemiformis, Bacillus circulans, Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Bifidobacterium
  • Other bacteria such as lactic acid bacteria, Escherichia, Streptomyces, yeasts such as Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torula, Torulopsis, Aspergillus genus, Penicillium genus, Trichoderma genus, Fusarium genus such as Aspergillus oryzae Fungi) and the like.
  • a further aspect of the present invention provides a method for producing a random transesterification lipase.
  • a step of cultivating Geobacillus thermocatenulotus or Geobacillus coastophilus (step (1)) and a step of recovering lipase from the culture solution and / or cells after the culture (Step (2)) is performed.
  • Geobacillus thermocatenulotus in step (1) for example, Geobacillus thermocatenulotus DSM730 strain can be used.
  • Geobacillus coast phyllus for example, Geobacillus coast phyllus ATCC 8005 strain or Geobacillus coast phyllus HTA426 strain can be used.
  • the culture method and culture conditions are not particularly limited as long as the target enzyme is produced. That is, on the condition that the present enzyme is produced, a method and culture conditions suitable for culturing the microorganism to be used can be appropriately set.
  • the culture method may be either liquid culture or solid culture, but preferably liquid culture is used. Taking liquid culture as an example, the culture conditions will be described.
  • any medium can be used as long as the microorganism to be used can grow.
  • carbon sources such as glucose, sucrose, gentiobiose, soluble starch, glycerin, dextrin, molasses, organic acid, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium phosphate, ammonium acetate, or peptone, yeast extract, corn steep liquor, casein
  • Nitrogen sources such as hydrolysates, bran and meat extracts, and further added with inorganic salts such as potassium salts, magnesium salts, sodium salts, phosphates, manganese salts, iron salts and zinc salts can be used.
  • vitamins, amino acids and the like may be added to the medium.
  • the pH of the medium is adjusted to, for example, about 3 to 10, preferably about 7 to 8, and the culture temperature is usually about 10 to 80 ° C., preferably about 30 to 65 ° C. for 1 to 7 days, preferably 2 to Incubate under aerobic conditions for about 4 days.
  • the culture method for example, a shaking culture method or an aerobic deep culture method using a jar fermenter can be used.
  • lipase is recovered from the culture solution or the cells (step (2)).
  • the culture supernatant is filtered, centrifuged, etc. to remove insolubles, concentrated by ultrafiltration membrane, salting out such as ammonium sulfate precipitation, dialysis, ion exchange resin, etc.
  • the present enzyme can be obtained by performing separation and purification by appropriately combining various types of chromatography.
  • the enzyme when recovering from the bacterial cells, can be obtained, for example, by crushing the bacterial cells by pressure treatment, ultrasonic treatment, etc., and then separating and purifying in the same manner as described above.
  • recovering a microbial cell from a culture solution previously by filtration, a centrifugation process, etc. you may perform the said series of processes (crushing, isolation
  • confirmation of expression and confirmation of the expression product can be performed, for example, by measuring lipase activity or measuring random transesterification ability.
  • a lipase for random transesterification is produced using the above transformant.
  • the above-mentioned transformant is cultured under the condition that a protein encoded by the gene introduced therein is produced (step (i)).
  • Culture conditions for transformants are known for various vector host systems, and those skilled in the art can easily set appropriate culture conditions.
  • the produced protein ie, lipase
  • recovery and subsequent purification may be performed in the same manner as in the above embodiment.
  • the purity of the enzyme is not particularly limited.
  • the final form may be liquid or solid (including powder).
  • the purified enzyme is provided, for example, in the form of an enzyme agent.
  • the enzyme agent may contain excipients, buffers, suspension agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline and the like in addition to the active ingredient (enzyme of the present invention).
  • excipient starch, dextrin, maltose, trehalose, lactose, D-glucose, sorbitol, D-mannitol, sucrose, glycerol and the like can be used.
  • Phosphate, citrate, acetate, etc. can be used as the buffer.
  • propylene glycol, ascorbic acid or the like can be used.
  • preservatives phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like can be used.
  • the above-mentioned novel lipase (column 2) can also be provided in the form of an enzyme agent.
  • Lipase genes derived from bacteria belonging to the genus Geobacillus include G. thermocatenulatus DSM730, G. thermocatenulatus DSM730, G. kaustophilus ATCC 8005, and G. kaustophilus ATCC 8005. It was obtained from the chromosome of the strain (G. kaustophilus HTA426 (JCM12893)). Details are as follows.
  • lipase GK-N lipase gene of Geobacillus thermocatenulotus DSM730 strain
  • chromosomal DNA was obtained by a conventional method and stored on the database (GenBank Accession No. X95309).
  • a primer set was designed based on the lipase gene sequence information (SEQ ID NO: 4).
  • a restriction enzyme (PciI) site was added to the 5 ′ primer
  • a restriction enzyme (Hind III) site was added to the 3 ′ primer.
  • 5'-side primer 5'-GGATAACATGTTGAAAGGCTGC-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • 3'-side primer 3'-GCCGGAATTACTTCGAAACTAG-5 '(SEQ ID NO: 9)
  • PCR was performed using the above primer set to obtain the target lipase gene.
  • lipase GK-A lipase (hereinafter abbreviated as “lipase GK-A”) gene of Geobacillus coastophilus ATCC 8005 strain
  • chromosomal DNA obtained from Geobacillus coastophilus ATCC 8005 strain was used as a template, and the above primers PCR was performed using the set (SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9).
  • SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 As a result, the target lipase gene fragment was obtained.
  • the base sequence of the obtained lipase gene is shown in SEQ ID NO: 5.
  • lipase GK-J a lipase gene of Geobacillus coastophilus HTA426 strain
  • chromosomal DNA was obtained by a conventional method.
  • a primer set was designed based on the sequence information (SEQ ID NO: 6, Locus: GK1986, Coordinates: 2031127-2029871).
  • a restriction enzyme (PciI) site was added to the 5 ′ primer
  • a restriction enzyme (Hind III) site was added to the 3 ′ primer.
  • 5'-side primer 5'-GAGAACATGTTGAAATGCTGTCGGCGTG-3 '(SEQ ID NO: 10)
  • 3'-side primer 3'-CCGCTCGAACGTTGGAATTTCGAACATA-5 '(SEQ ID NO: 11)
  • PCR was carried out using the above-mentioned primer set (SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11) using chromosomal DNA obtained from Geobacillus coastophilus HTA426 strain (JCM12893 strain) as a template. As a result, the target lipase gene was obtained.
  • Plasmid vector pTrc99a was cleaved with restriction enzymes NocI and HindIII to obtain plasmid gene fragments.
  • lipase gene expression plasmid vectors pTrcGK-N and pTrcGK are obtained by cleaving lipase gene fragments of lipase GK-N, lipase GK-J and lipase GK-A with restriction enzymes PciI and HindIII and ligating them with ligase, respectively.
  • -J and pTrcGK-A were obtained (FIG. 1).
  • Escherichia coli JM109 was transformed with the vector to obtain a lipase-producing bacterium.
  • the deduced amino acid sequences of lipase GK-N, lipase GK-A and lipase GK-J are shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • the amino acid alignment results of the three lipases are shown in FIG.
  • the amino acid homology between lipase GK-N and lipase GK-A, and the amino acid homology between lipase GK-A and lipase GK-J were 93.3% and 93.8%, respectively.
  • lipase GK-A recombinant Escherichia coli was cultured to obtain wet cell bodies 301 to 16 g of powder, and lipase GK-J recombinant Escherichia coli to obtain wet cell bodies 285 to 19.9 g of powder.
  • composition ratio of tripalmitin (C48) in the triglyceride molecular species by GC analysis and increase the production ratio of C48 (composition ratio of tripalmitin (PPP) in the triglyceride fraction of the reaction fat-triglyceride fraction of the substrate fat
  • composition ratio of PPP composition ratio of tripalmitin
  • the molecular species of Cocoa butter triglyceride used as a substrate were C48 (0.8%), C50 (18.0%), C52 (45.0%), and C54 (34.9%).
  • Candida rugosa-derived lipase has been reported as a lipase that can be used for random transesterification because it has no specificity for the position of glycerides.
  • Rhizopus lipase has been put into practical use as an enzyme for producing cacao substitute fats and has high transesterification ability. Yes.
  • Table 1 shows the hydrolysis activity of the enzyme used and the amount of enzyme powder added to the random transesterification reaction.
  • Table 2 shows the production ratio of PPP (PPP after reaction) and the amount of increase in PPP per hydrolysis activity, which are indicators of random transesterification ability.
  • Lipase GK-N, lipase GK-A and lipase GK-J all showed high random transesterification ability.
  • the increase in PPP per hydrolytic activity is markedly higher for lipase GK-A.
  • Lipase GK-N and lipase GK-J showed almost the same value as lipase PS “Amano” SD.
  • lipase AY-30G and neurase F3G showed very low increase in PPP.
  • lipase GK-A As described above, it was shown that the three lipases successfully obtained (lipase GK-A, lipase GK-N, lipase GK-J) are suitable enzymes for random transesterification. It can be evaluated that lipase GK-A has a particularly high utility value in that the amount of increase in PPP per hydrolytic activity is remarkably high.
  • the present invention provides a novel enzymatic random transesterification method.
  • the method of the present invention is expected to be used and applied to processing of edible fats and oils.

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Abstract

　ランダムエステル交換に適した微生物由来リパーゼを見出し、実用的価値の高い、油脂のランダムエステル交換法を提供することを課題とする。ジオバチルス属微生物由来のリパーゼを用いた、油脂のランダムエステル交換法が提供される。

Description

油脂のランダムエステル交換法及びランダムエステル交換用リパーゼ
　本発明は油脂のランダムエステル交換法、並びに当該方法に適した新規リパーゼ及びその遺伝子等に関する。本出願は、２０１０年１２月６日に出願された日本国特許出願第２０１０－２７１４９８号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
　油脂のエステル交換反応は油脂の物性（融点、結晶性、耐熱性等）を改質するのに有効な方法であり、化学的エステル交換と酵素的エステル交換の2つに大別される（例えば非特許文献１、２を参照）。近年トランス脂肪酸の健康問題から酵素的なランダムエステル交換の利用が注目されている。酵素的ランダムエステル交換には、キャンディダ属（Candida）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、シュードモナス属（Pseudomonas）、フミコーラ属（商品名：ノボザイム社、Lipozyme TL IM）等の由来のリパーゼが利用できるとされている（例えば、特許文献１～３、非特許文献３、４を参照）。
国際公開第２００６／０５９５９２号パンフレット 特許第３７９１９４３号公報 特開２００８－１９４０１１号公報
油化学会誌, 48, 1151-1159 (1999) オレオサイエンス, 6, 145-151 (2006) J. Am. Oil Chem. Soc., 60, 291-294 (1983) J. Am. Oil Chem. Soc., 75, 953-959 (1998) Methods Enzymol., 284, 194-220 (1997) Protein Expr Purif. 22, 388-398 (2001) Nucleic Acids Res. 32, 6292-6303 (2004)
　アルカリゲネス属由来のリパーゼは活性や耐熱性などの点で工業的な製造に最も適していると報告されている（例えば、特許文献１、２を参照）。しかしながら、アルカリゲネス属の一部の菌種には病原性の存在が報告されており、食用油脂の加工に使用するリパーゼの生産菌としては適しているといえない。シュードモナス属についても同様である。一方、フミコーラ属由来のリパーゼは1,3位選択性が強い点において、ランダムエステル交換に適しているとは言い難い。
　そこで本発明は、ランダムエステル交換に適した微生物由来リパーゼを見出し、実用的価値の高い、油脂のランダムエステル交換法を提供することを課題とする。
　以上の課題を解決すべく検討を進める中で本発明者らは、ジオバチルス属（Geobacillus）微生物に注目した。ジオバチルス属については病原性を示す菌種は報告されておらず、本属の産生するリパーゼであれば食用油脂の加工に使用するリパーゼとして好ましいと考えられた。これまでにジオバチルス・サーモカテニュロータス（Geobacillus thermocatenulatus）由来のリパーゼとジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Geobacillus stearothermophilus）由来のリパーゼについて報告がある（非特許文献５～７）。しかしながら、これらを用いたランダムエステル交換反応については検討されておらず、当該リパーゼがランダムエステル交換反応に使用可能か否かは不明であった。そこで、まず非特許文献５に記載されたリパーゼの遺伝情報をもとに、ジオバチルス・サーモカテニュロータスDSM730株及びジオバチルス・コーストフィラスATCC 8005株、非特許文献７に記載されたリパーゼの遺伝情報をもとにジオバチルス・コーストフィラスJCM12893株からそれぞれリパーゼ遺伝子の取得を試みた。取得に成功した当該３種類のリパーゼ遺伝子を大腸菌で発現させて酵素粉末を調製し、ランダムエステル交換能を評価した結果、これら全てのリパーゼで高いランダムエステル交換能が確認された。この結果から、これらのリパーゼ及び本リパーゼとアミノ酸配列の相同性が高いリパーゼはランダムエステル交換能に優れ、産業上極めて利用価値が高いことが明らかとなった。また、ジオバチルス・コーストフィラスATCC 8005株由来の新規リパーゼは、加水分解活性当たりのランダムエステル交換能に優れ、利用価値が特に高いと判断された。以下に示す発明は、主として上記成果ないし知見に基づく。
　［１］ジオバチルス属微生物由来のリパーゼを油脂に作用させるステップを含む、油脂のランダムエステル交換法。
　［２］ジオバチルス属微生物が、ジオバチルス・サーモカテニュロータス（Geobacillus thermocatenulatus）又はジオバチルス・コーストフィラス（Geobacillus kaustophilus）である、［１］に記載の方法。
　［３］ジオバチルス属微生物が、ジオバチルス・サーモカテニュロータスDSM730株、ジオバチルス・コーストフィラスATCC 8005株及びジオバチルス・コーストフィラスHTA426株からなる群より選択されるいずれかの菌株である、［１］に記載の方法。
　［４］リパーゼが、配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列を含む、［１］に記載の方法。
　［５］［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法によって改質された油脂又はそれを含む油脂加工品。
　［６］配列番号２のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と等価なアミノ酸配列を有する、リパーゼ。
　［７］等価なアミノ酸配列が、配列番号２に示すアミノ酸配列と94％以上同一のアミノ酸配列である、［６］に記載のリパーゼ。
　［８］以下の(a)～(f)からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるリパーゼ遺伝子：
　(a)配列番号２のアミノ酸配列をコードするDNA;
　(b)配列番号７のアミノ酸配列をコードするDNA;
　(c)配列番号５の配列を含むDNA;
　(d)配列番号５の配列に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA;
　(e)配列番号５の配列のDNA配列縮重体であるDNA;
　(f)配列番号５の配列を基準として1若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含む配列からなり、リパーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
　［９］［８］に記載のリパーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
　［１０］［８］に記載のリパーゼ遺伝子又は［９］に記載の組換えベクターが導入されている形質転換体。
　［１１］以下のステップ（1）及び（2）を含んでなる、ランダムエステル交換用リパーゼの製造法：
　（1）ジオバチルス・サーモカテニュロータス又はジオバチルス・コーストフィラスを培養するステップ；
　（2）培養後の培養液及び／又は菌体よりリパーゼを回収するステップ。
　［１２］ジオバチルス・サーモカテニュロータスがジオバチルス・サーモカテニュロータスDSM730株であり、ジオバチルス・コーストフィラスがジオバチルス・コーストフィラスATCC 8005株又はジオバチルス・コーストフィラスHTA426株である、［１１］に記載の製造法。
　［１３］以下のステップ（i）及び（ii）を含んでなる、ランダムエステル交換用リパーゼの製造法：
　（i)［１０］に記載の形質転換体を前記リパーゼ遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；
　（ii）産生された前記タンパク質を回収するステップ。
リパーゼ発現用プラスミドベクター（pTrcGK-N、pTrcGK-J及びpTrcGK-A）の構成を示す図。 3種のリパーゼ（GK-N、GK-A及びGK-J）のアミノ酸配列の比較（相同性）。リパーゼGK-Nのアミノ酸配列（配列番号１）とリパーゼGK-Aのアミノ酸配列（配列番号２）の相同性は93.3%であった。また、リパーゼGK-Aのアミノ酸配列（配列番号２）とリパーゼGK-Jのアミノ酸配列（配列番号３）の相同性は93.8%であった。
（用語）
　本発明において「タンパク質をコードするDNA」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるDNA、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するDNAのことをいう。従ってコドンの縮重も考慮される。
　本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。本発明の酵素（リパーゼ）に関して使用する場合の「単離された」とは、本発明の酵素が天然材料に由来する場合、当該天然材料の中で当該酵素以外の成分を実質的に含まない（特に夾雑タンパク質を実質的に含まない）状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では、夾雑タンパク質の含有量は重量換算で全体の約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。一方、本発明の酵素が遺伝子工学的手法によって調製されたものである場合の用語「単離された」とは、使用された宿主細胞に由来する他の成分や培養液等を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素では夾雑成分の含有量は重量換算で全体の約20％未満、好ましくは約10％未満、更に好ましくは約5％未満、より一層好ましくは約1％未満である。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「リパーゼ」と記載した場合は「単離された状態のリパーゼ」を意味する。リパーゼの代わりに使用される用語「本酵素」についても同様である。
　DNAについて使用する場合の「単離された」とは、もともと天然に存在しているDNAの場合、典型的には、天然状態において共存するその他の核酸から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えばゲノムDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、天然状態において共存する他のDNA成分を実質的に含まない。一方、cDNA分子など遺伝子工学的手法によって調製されるDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるDNAの場合の「単離された」状態では、好ましくは、dNTPなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「DNA」と記載した場合には単離された状態のDNAを意味する。
１．油脂のランダムエステル交換法
　本発明の第１の局面は酵素を用いた油脂のランダムエステル交換法に関する。本発明者らの検討の結果、高いランダムエステル交換能を有するリパーゼをジオバチルス属微生物が産生することが明らかとなった。この成果に基づき、本発明の方法ではジオバチルス属微生物由来のリパーゼを用いる。換言すれば、本発明ではジオバチルス属微生物由来のリパーゼを油脂に作用させるステップを行い、当該ステップによって油脂のランダムエステル交換、即ち、油脂中のトリアシルグリセロール（TG又はTAGと略称される）の構成脂肪酸を再編成（再配列）させる。
　ジオバチルス属微生物の具体例はジオバチルス・サーモカテニュロータス（Geobacillus thermocatenulatus）及びジオバチルス・コーストフィラス（Geobacillus kaustophilus）である。ジオバチルス・サーモカテニュロータスであれば、例えば、ジオバチルス・サーモカテニュロータスDSM730株のリパーゼ、ジオバチルス・コーストフィラスであれば、例えば、ジオバチルス・コーストフィラスATCC 8005株又はジオバチルス・コーストフィラスHTA426株（JCM12893）のリパーゼを用いることができる。ジオバチルス・サーモカテニュロータスDSM730株のリパーゼのアミノ酸配列を配列番号１（NCBI, DEFINITION: triacylglycerol lipase [Geobacillus thermocatenulatus]. ACCESSION: CAA64621）に、ジオバチルス・コーストフィラスATCC 8005株のリパーゼのアミノ酸配列を配列番号２に、ジオバチルス・コーストフィラスHTA426株のリパーゼのアミノ酸配列を配列番号３にそれぞれ示す。
　本発明の方法によって処理可能な油脂として、大豆油、ナタネ油、米油、コーン油、ひまわり油、綿実油、落花生油、サフラワー油、パーム油、パーム軟質油、パーム分別油、パーム核油、ヤシ油、カカオバター等の植物油脂、魚油、ラード、牛脂、乳脂等の動物油脂及びこれらの分別油、硬化油、トリラウリン、トリオレイン、トリパルミチン等の合成油脂を例示することができる。本発明の方法は、油脂同士のエステル交換の他、油脂と脂肪酸又は脂肪酸エステルとの間のエステル交換に利用可能である。脂肪酸エステルの例はステアリン酸、パルミチン酸、ラウリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸であり、脂肪酸エステルの例はステアリン酸エチル、パルミチン酸エチル、オレイン酸エチル、リノール酸エチルである。
　本発明の方法では、ジオバチルス属微生物から取得したリパーゼ又はジオバチルス属微生物の培養液（リパーゼを含むもの）を油脂に添加し、例えば30～100℃、好ましくは35～70℃の条件下、所定時間（例えば５時間～４８時間）反応させる。反応を促進させるために、反応中は攪拌するとよい。
　反応に供するリパーゼとして、固定化したリパーゼを使用することにしてもよい。固定化リパーゼによる反応には、回分式攪拌槽型反応器、流通式攪拌槽型反応器、充填層型反応器、流動層型反応器等を利用できる。
　本発明のランダムエステル交換法は油脂又は油脂加工品（例えばショートニング、マーガリン）の物性の改質・改良に有用である。例えば、展延性の向上、エマルジョン安定性の向上、固体脂含有値（SFC）の最適化、固化性の向上、特定の脂肪酸の選択的濃縮、低トランス酸油脂又は低トランス酸油脂加工品の製造等を目的として、本発明のランダムエステル交換法を適用することができる。本発明のランダムエステル交換法を適用して得られる油脂又はそれを含む油脂加工品は、処理前に比して物性に改善を認め、産業上の利用価値が高い。
２．新規リパーゼ
　本発明の第２の局面は、本発明者らが同定に成功し、その有用性を見出した新規リパーゼに関する。本発明のリパーゼ（以下、「本酵素」ともいう）は一態様において配列番号２のアミノ酸配列を含む。ここで、一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部に改変を施した場合において改変後のタンパク質が改変前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちアミノ酸配列の改変がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。そこで本発明は他の態様として、配列番号２に示すアミノ酸配列と等価なアミノ酸配列からなり、リパーゼ活性を有するタンパク質（以下、「等価タンパク質」ともいう）を提供する。ここでの「等価なアミノ酸配列」とは、配列番号２に示すアミノ酸配列と一部で相違するが、当該相違がタンパク質の機能（ここではリパーゼ活性）に実質的な影響を与えていないアミノ酸配列のことをいう。リパーゼ活性の程度は、ランダムエステル交換用の酵素として機能する限り特に限定されないが、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と同程度又はそれよりも高いことが好ましい。
　「アミノ酸配列の一部の相違」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する１～数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１～数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることをいう。ここでのアミノ酸配列の相違はリパーゼ活性が保持される限り許容される（活性の多少の変動があってもよい）。この条件を満たす限りアミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの複数とはたとえば全アミノ酸の約6％未満に相当する数であり、好ましくは約3％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約1％未満に相当する数である。即ち等価タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と例えば約94％以上、好ましくは約97%以上、さらに好ましくは約99%以上の同一性を有する。
　好ましくは、リパーゼ活性に必須でないアミノ酸残基において保存的アミノ酸置換を生じさせることによって等価タンパクを得る。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
　「等価タンパク質」が、付加的な性質を有していてもよい。かかる性質として、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質に比べて安定性に優れているという性質、至適温度や至適pHが異なるという性質などが挙げられる。
　ここで、二つのアミノ酸配列の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい）。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。配列同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数 × 100）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。例えば、XBLASTプログラムでscore = 50、wordlength = 3としてBLASTポリペプチド検索を行えば、同一性の高いアミノ酸配列を得ることが可能である。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTが利用可能である。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくは例えばNCBIのウェブページを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、MyersおよびMiller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばGENESTREAMネットワークサーバー（IGH Montpellier、フランス）またはISRECサーバーで利用可能なALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合は例えば、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ＝12、ギャップペナルティ＝4とすることができる。二つのアミノ酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスを使用し、ギャップ加重＝12、10、8、6、又は4、ギャップ長加重＝2、3、又は4として決定することができる。
　本酵素が、より大きいタンパク質（例えば融合タンパク質）の一部であってもよい。融合タンパク質において付加される配列としては、例えば多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。
　上記アミノ酸配列を有する本酵素は、遺伝子工学的手法によって容易に調製することができる。例えば、本酵素をコードするDNAで適当な宿主細胞（例えば大腸菌）を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜調製される。このように組換えタンパク質として本酵素を得ることにすれば種々の装飾が可能である。例えば、本酵素をコードするDNAと他の適当なDNAとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはN末端若しくはC末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
３．新規リパーゼ遺伝子
　本発明の第３の局面は新規リパーゼ遺伝子に関する。一態様において本発明の遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号７のアミノ酸配列をコードするDNAを含む。当該態様の具体例は、配列番号５の塩基配列からなるDNAである。尚、配列番号７のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列にシグナル配列が付加されたものである。
　ところで、一般に、あるタンパク質をコードするDNAの一部に改変を施した場合において、改変後のDNAがコードするタンパク質が、改変前のDNAがコードするタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちDNA配列の改変が、コードするタンパク質の機能に実質的に影響を与えず、コードするタンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。そこで本発明は他の態様として、配列番号５の塩基配列と等価な塩基配列を有し、リパーゼ活性をもつタンパク質をコードするDNA（以下、「等価DNA」ともいう）を提供する。ここでの「等価な塩基配列」とは、配列番号５に示す核酸と一部で相違するが、当該相違によってそれがコードするタンパク質の機能（ここではリパーゼ活性）が実質的な影響を受けていない塩基配列のことをいう。
　等価DNAの具体例は、配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAである。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃～約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃～約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
　等価DNAの他の具体例として、配列番号５に示す塩基配列を基準として１若しくは複数（好ましくは１～数個）の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、リパーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該DNAがコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば２～４０塩基、好ましくは２～２０塩基、より好ましくは２～１０塩基である。以上のような等価DNAは例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）による変異の導入などを利用して、塩基の置換、欠失、挿入、付加、及び／又は逆位を含むように、配列番号５に示す塩基配列を有するDNAを改変することによって得ることができる。また、紫外線照射など他の方法によっても等価DNAを得ることができる。等価DNAの更に他の例として、SNP（一塩基多型）に代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相違が認められるDNAを挙げることができる。
　本発明の遺伝子は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって単離された状態に調製することができる。具体的には、ジオバチルス・コーストフィラスATCC 8005株のゲノムDNAライブラリー又はcDNAライブラリー、或はジオバチルス・コーストフィラスATCC 8005株の菌体内抽出液から、本発明の遺伝子に対して特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブ・プライマーを適宜利用して調製することができる。オリゴヌクレオチドプローブ・プライマーは、市販の自動化DNA合成装置などを用いて容易に合成することができる。尚、本発明の遺伝子を調製するために用いるライブラリーの作製方法については、例えばMolecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照できる。
　例えば、配列番号５の塩基配列を有する遺伝子であれば、当該塩基配列又はその相補配列の全体又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法を利用して単離することができる。また、当該塩基配列の一部に特異的にハイブリダイズするようにデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅反応（例えばPCR）を利用して増幅及び単離することができる。また、配列番号２に示すアミノ酸配列や配列番号５の塩基配列の情報を元にして、化学合成によって目的とする遺伝子を得ることもできる(参考文献：Gene,60(1), 115-127 (1987))。
　本発明は更に、本発明の遺伝子を含有する組換えベクターを提供する。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいい、その種類、形態は特に限定されるものではない。従って、本発明のベクターはプラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）の形態をとり得る。
　使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例を挙げれば、大腸菌を宿主とするベクター（M13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）など）、酵母を宿主とするベクター（pYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクター（pAc、pVLなど）、哺乳類細胞を宿主とするベクター（pCDM8、pMT2PCなど)等である。
　本発明の組換えベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
　本発明の遺伝子のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
　本発明はまた、本発明の遺伝子が導入された宿主細胞（形質転換体）を提供する。本発明の形質転換体では、本発明の遺伝子が外来性の分子として存在することになる。本発明の形質転換体は、好ましくは、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。トランスフェクション、トランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))、マイクロインジェクション(Graessmann, M. & Graessmann,A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73,366-370(1976))、Hanahanの方法(Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557-580(1983))、酢酸リチウム法(Schiestl, R.H. et al., Curr. Genet. 16, 339-346(1989))、プロトプラスト－ポリエチレングリコール法(Yelton, M.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1470-1474(1984))等によって実施することができる。
　宿主細胞は、本酵素（本発明の遺伝子がコードするタンパク質）が発現する限りにおいて特に限定されず、例えばBacillus subtillus、Bacillus likemiformis、Bacillus circulansなどのBacillus属細菌、Lactococcus、Lactobacillus、Streptococcus、Leuconostoc、Bifidobacteriumなどの乳酸菌、Escherichia、Streptomycesなどのその他の細菌、Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Torula、Torulopsis、などの酵母、Aspergillus oryzae、Aspergillus nigerなどのAspergillus属、Penicillium属、Trichoderma属、Fusarium属などの糸状菌（真菌）などより選択される。
４．ランダムエステル交換用リパーゼの製造法
　本発明の更なる局面はランダムエステル交換用リパーゼの製造法を提供する。本発明の製造法の一態様では、ジオバチルス・サーモカテニュロータス又はジオバチルス・コーストフィラスを培養するステップ（ステップ（1））及び培養後の培養液及び／又は菌体より、リパーゼを回収するステップ（ステップ（2））が行われる。
　ステップ（1）におけるジオバチルス・サーモカテニュロータスとして、例えば、ジオバチルス・サーモカテニュロータスDSM730株を用いることができる。一方、ジオバチルス・コーストフィラスとしては、例えば、ジオバチルス・コーストフィラスATCC 8005株又はジオバチルス・コーストフィラスHTA426株を用いることができる。培養法及び培養条件は、目的の酵素が生産されるものである限り特に限定されない。即ち、本酵素が生産されることを条件として、使用する微生物の培養に適合した方法や培養条件を適宜設定できる。培養法としては液体培養、固体培養のいずれでも良いが、好ましくは液体培養が利用される。液体培養を例にとり、その培養条件を説明する。
　培地としては、使用する微生物が生育可能な培地であれば、如何なるものでも良い。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸などを培地に添加してもよい。培地のpHは例えば約3～10、好ましくは約7～8程度に調整し、培養温度は通常約10～80℃、好ましくは約30～65℃程度で、1～7日間、好ましくは2～4日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
　以上の条件で培養した後、培養液又は菌体よりリパーゼを回収する（ステップ（2））。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。
　他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。尚、発現の確認や発現産物の確認は、例えば、リパーゼ活性の測定、ランダムエステル交換能の測定などにより行うことができる。
　本発明の他の態様では、上記の形質転換体を用いてランダムエステル交換用リパーゼを製造する。この態様の製造法ではまず、それに導入された遺伝子によってコードされるタンパク質が産生される条件下で上記の形質転換体を培養する（ステップ（i））。様々なベクター宿主系に関して形質転換体の培養条件が公知であり、当業者であれば適切な培養条件を容易に設定することができる。培養ステップに続き、産生されたタンパク質（即ち、リパーゼ）を回収する（ステップ（ii））。回収及びその後の精製については、上記態様の場合と同様に行えばよい。
　酵素の精製度は特に限定されない。また、最終的な形態は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。精製後の酵素は例えば酵素剤の形態で提供される。酵素剤は、有効成分（本発明の酵素）の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D-グルコース、ソルビトール、D-マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。尚、上述の新規リパーゼ（２．の欄）についても同様に酵素剤の形態で提供することができる。
１．リパーゼ遺伝子の取得
　ジオバチルス属細菌由来のリパーゼ遺伝子は、ジオバチルス・サーモカテニュロータスDSM730株（G. thermocatenulatus DSM730）、ジオバチルス・コーストフィラスATCC 8005株（G. kaustophilus ATCC 8005）及びジオバチルス・コーストフィラスHTA426株（G. kaustophilus HTA426（JCM12893））の染色体よりそれぞれ取得した。詳細は以下の通りである。
　まず、ジオバチルス・サーモカテニュロータスDSM730株のリパーゼ（以下、「リパーゼGK-N」と略す）遺伝子の取得のために、染色体DNAを常法により取得し、データベース（GenBank Accession No. X95309）上のリパーゼ遺伝子配列情報（配列番号４）を元にプライマーセットを設計した。尚、5'側プライマーには制限酵素(PciI)サイト、3'側プライマーには制限酵素(Hind III)サイトを付加した。
　5'側プライマー：5'-GGATAACATGTTGAAAGGCTGC-3'（配列番号８）
　3'側プライマー：3'-GCCGGAATTACTTCGAAACTAG-5'（配列番号９）
　ジオバチルス・サーモカテニュロータスDSM730株より取得した染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーセットを用いてPCRを行い、目的とするリパーゼ遺伝子を取得した。
　一方、ジオバチルス・コーストフィラスATCC 8005株のリパーゼ（以下、「リパーゼGK-A」と略す）遺伝子の取得のために、ジオバチルス・コーストフィラスATCC 8005株より取得した染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーセット（配列番号８と配列番号９）を用いてPCRを行った。その結果、目的とするリパーゼ遺伝子断片が得られた。取得したリパーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号５に示す。
　また、ジオバチルス・コーストフィラスHTA426株（JCM12893株）のリパーゼ（以下、「リパーゼGK-J」と略す）遺伝子の取得のために、染色体DNAを常法により取得し、非特許文献７のリパーゼ遺伝子配列情報（配列番号６、Locus：GK1986、Coordinates: 2031127-2029871）を元にプライマーセットを設計した。尚、5'側プライマーには制限酵素(PciI)サイト、3'側プライマーには制限酵素(Hind III)サイトを付加した。
　5'側プライマー：5'-GAGAACATGTTGAAATGCTGTCGGCGTG-3'（配列番号１０）
　3'側プライマー：3'-CCGCTCGAACGTTGGAATTTCGAACATA-5'（配列番号１１）
　ジオバチルス・コーストフィラスHTA426株（JCM12893株）より取得した染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーセット（配列番号１０と配列番号１１）を用いてPCRを行った。その結果、目的とするリパーゼ遺伝子が得られた。
２．組換え菌（リパーゼ生産菌）の作製
　プラスミドベクターpTrc99aを制限酵素NocIとHindIIIで切断処理し、プラスミド遺伝子断片を得た。一方、リパーゼGK-N、リパーゼGK-J及びリパーゼGK-Aのリパーゼ遺伝子断片を制限酵素PciIとHindIIIで切断処理し、両者をそれぞれリガーゼで連結することによってリパーゼ遺伝子発現プラスミドベクターpTrcGK-N、pTrcGK-J及びpTrcGK-Aを得た（図１）。続いて、当該ベクターで大腸菌JM109株を形質転換し、リパーゼ生産菌とした。
　リパーゼGK-N、リパーゼGK-A及びリパーゼGK-Jの推定アミノ酸配列を、それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示す。当該3種のリパーゼのアミノ酸のアライメント結果を図２に示す。リパーゼGK-NとリパーゼGK-Aのアミノ酸相同性、及びリパーゼGK-AとリパーゼGK-Jのアミノ酸相同性は、それぞれ93.3%及び93.8%であった。
３．組換え菌の培養方法
　容量500mlの坂口フラスコに、前培養培地としてBacto Tryptone 1%、Bacto Yeast Extract 0.5%及び食塩0.5%を含む液体培地100mlを入れて蒸気殺菌した後、滅菌処理したアンピシリンを50μg/mlになるように添加し、リパーゼGK-N組み換え大腸菌を１白金耳接種した。37℃で16時間振とう培養し前培養液を得た。容量20Lのジャーに大豆ペプトン2%、酵母エキス2%、食塩0.5%、アデカノールLG126（ADECA社製）0.5%からなる液体培地を入れ、蒸気殺菌した後に上記の前培養液を接種し、33℃、攪拌数350rpm、通気0.5vvmで16時間通気培養を行った。培養後、遠心分離して菌体を取得した。
４．培養菌体からの酵素粉末液の取得
　得られた菌体（湿菌体376g）を50mMリン酸緩衝液(pH 7.0)に懸濁し、1Lとした。菌体懸濁液を超高圧式ホモジナイザーLAB2000(SMT社)で破砕(1,000Kg/cm2)し、2Lとして遠心分離した上清を珪藻土ろ過し、清澄液を得た。得られた液を旭化成社製限外濃縮モジュール（AIP1013）にて400mlに濃縮し、0.45μmのメンブランフィルターにてろ過し、ろ液を凍結乾燥して粉末23.8gを得た。
　同様の方法によって、リパーゼGK-A組み換え大腸菌の培養により湿菌体301gから16gの粉末、リパーゼGK-J組み換え大腸菌の培養により湿菌体285gから19.9gの粉末を得た。
４．リパーゼの加水分解活性の測定
（１）操作手順
　0.1mol/Lリン酸塩緩衝液(pH 7.0) 4mL、オリブ油乳化液5mLを試験管に量り、試料溶液1mLを加え、よく振り混ぜ、直ちに37±0.5℃の恒温槽に入れ、正確に30分間放置する。30分後にエタノール／アセトン混液(1:1)を10mL加え、よく振り混ぜる。これに0.05mol/L水酸化ナトリウム液10mL及びエタノール／アセトン混液(1:1)10mLを加え、更に指示薬としてフェノールフタレイン試液2滴を加える。直ちに窒素ガスを液面に吹き付けながらスターラーで攪拌しつつ、0.05mol/L塩酸でpH計を用いてpH 10.00まで滴定し、T30 mLを求める。別に、ブランクとして0.1mol/Lリン酸塩緩衝液(pH 7.0) 4mL、オリブ油乳化液5mLを試験管に量り、エタノール／アセトン混液(1:1)を10mL加え混和した後、試料溶液1mLを加え、以下同様に操作してT0 mLを求める。
（２）活性算出法
　本条件下、1分間に1マイクロモルの脂肪酸の増加をもたらす酵素量を10単位とし次式より算出する。
　脂肪消化力（u/g,u/mL）＝｛50×(T0-T30)／30｝×10×f×n
　T0： ブランクの滴定値(mL)
　T30： 反応液の滴定値(mL)
　50： 0.05 mol/L塩酸(定量用)１mLに対する脂肪酸当量(マイクロモル)
　30： 反応時間(分)
　10： 単位換算係数
　f： 0.05mol/L塩酸(定量用)のファクター
　n： 試料1g又は1mL当たりの希釈倍数
５．ランダムエステル交換能の評価方法
　1gのCocoa butter(大東カカオ)をバイアルに精秤し、各量の酵素粉末とスターラーバーを入れ、密封し60℃で攪拌して反応させた。各時間に反応油をサンプリングし、トリグリセリドとジグリセリドの各分子種をガスクロマトグラフィーにて分析した。ガスクロマトグラフィーの分析では、カラムにはDB-1HT(J&W社, 5 m×0.25 mm, df 0.1μm)を使用し、温度条件は220℃から360℃の昇温とし、検出器にはFIDを使用し、キャリアーガスはヘリウムとした。GC分析によりトリグリセリド分子種中のトリパルミチン（C48）の組成比を算出し、C48の生成比の上昇（反応油脂のトリグリセリド画分中のトリパルミチン（PPP）の組成比－基質油脂のトリグリセリド画分中のPPPの組成比）をランダムエステル化能の指標として各リパーゼを評価した。基質として用いたCocoa butterのトリグリセリドの分子種はC48 (0.8%)、C50 (18.0%)、C52 (45.0%)、C54 (34.9%)であった。
６．ランダムエステル交換能の評価結果
　調製したリパーゼGK-N、リパーゼGK-J及びリパーゼGK-Aを用い、各リパーゼのランダムエステル交換能を評価した。比較対照としてバークホルデリア・セパシア属（Burkholderia cepacia）由来リパーゼ（製品名：リパーゼPS「アマノ」SD、天野エンザイム社製）、キャンディダ・ルゴサ（Candida rugosa）由来リパーゼ（製品名：リパーゼAY-30G、天野エンザイム社製）、リゾプス・ニベウス（Rhizopus niveus）由来リパーゼ（製品名：ニューラーゼF3G、天野エンザイム社製）を使用した。尚、バークホルデリア属細菌由来リパーゼはランダムエステル交換能が高いと報告されているが、近縁種に病原菌が存在し、食品用の酵素製造のための生産菌として適当でないと考えられる。また、キャンディダ・ルゴサ由来リパーゼはグリセリドの位置に対する特異性がないため、ランダムエステル交換に使用できるリパーゼとして報告されている。一方、リゾプス属のリパーゼは、カカオ代替脂を製造する酵素として実用化され高いエステル交換能を有するが、グリセリドの位置に対する特異性が1,3位のためランダムエステル交換には適さないとされている。
　使用した酵素の加水分解活性とランダムエステル交換反応に添加した酵素粉末量を表１に示す。また、ランダムエステル交換能の指標となるPPPの生成比（反応後のPPP）及び加水分解活性当たりのPPPの上昇量を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　リパーゼGK-N、リパーゼGK-A及びリパーゼGK-Jはいずれも、高いランダムエステル交換能を示した。注目すべきことに、加水分解活性当たりのPPPの上昇量はリパーゼGK-Aが顕著に高い。リパーゼGK-N及びリパーゼGK-Jは、リパーゼPS「アマノ」SDとほぼ同等の値を示した。尚、リパーゼAY-30G及びニューラーゼF3GはPPPの上昇が極めて低かった。
　以上のように、取得に成功した3種のリパーゼ（リパーゼGK-A、リパーゼGK-N、リパーゼGK-J）はランダムエステル交換に適した酵素であることが示された。加水分解活性当たりのPPPの上昇量が顕著に高い点において、リパーゼGK-Aは利用価値が特に高いと評価できる。
　本発明は新規な酵素的ランダムエステル交換法を提供する。本発明の方法には特に食用油脂の加工への利用・応用が期待される。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
　本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
　配列番号８～１１：人工配列の説明：PCR用プライマー

Claims (13)

  1. 　ジオバチルス属微生物由来のリパーゼを油脂に作用させるステップを含む、油脂のランダムエステル交換法。
  2. 　ジオバチルス属微生物が、ジオバチルス・サーモカテニュロータス（Geobacillus thermocatenulatus）又はジオバチルス・コーストフィラス（Geobacillus kaustophilus）である、請求項１に記載の方法。
  3. 　ジオバチルス属微生物が、ジオバチルス・サーモカテニュロータスDSM730株、ジオバチルス・コーストフィラスATCC 8005株及びジオバチルス・コーストフィラスHTA426株からなる群より選択されるいずれかの菌株である、請求項１に記載の方法。
  4. 　リパーゼが、配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の方法によって改質された油脂又はそれを含む油脂加工品。
  6. 　配列番号２のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と等価なアミノ酸配列を有する、リパーゼ。
  7. 　等価なアミノ酸配列が、配列番号２に示すアミノ酸配列と94％以上同一のアミノ酸配列である、請求項６に記載のリパーゼ。
  8. 　以下の(a)～(f)からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるリパーゼ遺伝子：
    　(a)配列番号２のアミノ酸配列をコードするDNA;
    　(b)配列番号７のアミノ酸配列をコードするDNA;
    　(c)配列番号５の配列を含むDNA;
    　(d)配列番号５の配列に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA;
    　(e)配列番号５の配列のDNA配列縮重体であるDNA;
    　(f)配列番号５の配列を基準として1若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含む配列からなり、リパーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
  9. 　請求項８に記載のリパーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
  10. 　請求項８に記載のリパーゼ遺伝子又は請求項９に記載の組換えベクターが導入されている形質転換体。
  11. 　以下のステップ（1）及び（2）を含んでなる、ランダムエステル交換用リパーゼの製造法：
    　（1）ジオバチルス・サーモカテニュロータス又はジオバチルス・コーストフィラスを培養するステップ；
    　（2）培養後の培養液及び／又は菌体よりリパーゼを回収するステップ。
  12. 　ジオバチルス・サーモカテニュロータスがジオバチルス・サーモカテニュロータスDSM730株であり、ジオバチルス・コーストフィラスがジオバチルス・コーストフィラスATCC 8005株又はジオバチルス・コーストフィラスHTA426株である、請求項１１に記載の製造法。
  13. 　以下のステップ（i）及び（ii）を含んでなる、ランダムエステル交換用リパーゼの製造法：
    　（i)請求項１０に記載の形質転換体を前記リパーゼ遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ；
    　（ii）産生された前記タンパク質を回収するステップ。
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