CN103361326A - 一种耐热性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及突变质粒、重组菌株和制备方法 - Google Patents

一种耐热性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及突变质粒、重组菌株和制备方法 Download PDF

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本发明提供了一种耐热性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及突变质粒、重组菌株和制备方法，该突变体是对马拉色霉菌（Malassezia globosa）偏甘油酯脂肪酶进行定点饱和突变获得的酶突变体，其中突变位点为116位的Trp。本发明的突变体具有更好的热稳定性能，进而有利于延长酶的使用寿命。

Description

一种耐热性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及突变质粒、重组菌株和制备方法
技术领域
本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种耐热性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及制备方法，还涉及该突变体的重组菌株。
背景技术
脂肪酶（EC3.1.1.3）不仅能催化水解油脂，也能在非水相反应体系中参与酯合成，转酯化，酸解等反应，被广泛的应用于化学，食品，制药和洗涤剂或生物能源工业中。不同于普通脂肪酶，偏甘油酯脂肪酶只能分解甘油二酯或甘油单酯，而不能分解甘油三酯，而其参与的酯化反应也只合成甘油二酯或甘油单酯。甘油二酯或甘油单酯具有良好的表面活性，目前被广泛应用于化妆品、食品、洗涤剂工业中。传统的生产甘油二酯或甘油单酯的工艺耗能大，向环境排放废弃物多，不利于环境保护，而利用酶法来制备甘油二酯或甘油单酯则具有更经济和环保的优点。文献报道的偏甘油酯脂肪酶数量较少，而目前只有来源于卡门柏青霉的一种偏甘油酯脂肪酶被商业化。前期，发明人从球形马拉色霉菌中分离了一种偏甘油酯脂肪酶SMG1，并应用于甘油二酯的合成。对该酶深入研究发现该脂肪酶是一种低温脂肪酶，具有结构稳定性不强的特点。高温会破坏蛋白构象而引起酶制剂活性的丧失。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种热稳定性提高的SMG1脂肪酶突变体。通过理性选择突变位点，是由马拉色霉菌属（Malassezia globosa）SMG1脂肪酶基因（genbank登录号XM_001732152.1），通过对其蛋白结构（PDB：3UUE）的分析，运用定点突变的方法而获得的脂肪酶突变体。进行定点饱和突变获得酶突变体，亲本SMG1氨基酸序列SEQ ID NO：1中在氨基酸取代位置发生突变，采用“原始氨基酸-位置-替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸，所述脂肪酶突变体为：Trp116Ala，Trp116His，Trp116Phe。
本发明的技术方案具体如下：
一种耐热性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体，该突变体是对马拉色霉菌（Malassezia globosa）偏甘油酯脂肪酶进行定点饱和突变获得的酶突变体，其中突变位点为116位的Trp。
所述116位的Trp突变为Ala、His或Phe。
所述突变体的DNA序列为SEQ NO.2、SEQ NO.3或SEQ NO.4。
利用上述突变体制备突变质粒的方法，包括如下步骤：
（1）利用重叠延伸PCR方法引入目的突变氨基酸位点，先分段扩增含有突变氨基酸位点的上下游片段，然后将带有突变位点基因片段拼接成含有突变位点全长基因片段；
（2）将上述扩增产物经DNA纯化后，限制性内切酶Kpn I和Sal I分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZαA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，得到突变质粒。
所述PCR的引物序列如下：
SMG For           5’-GGGGTACCAGCAGTATTTACGCCCGTGGCCG-3’
3'AOX             5’-GGCAAATGGCATTCTGACAT-3’
Trp116His For     5’-GATGCGAAGTTCCATCAAGAAGAC-3’
Trp116His Rev     5’-GTCTTCTTGATGGAACTTCGCATC-3’
Trp116Phe For     5’-GATGCGAAGTTCTTCCAAGAAGAC-3’
Trp116Phe Rev     5’-GTCTTCTTGGAAGAACTTCGCATC-3’
Trp116ala For     5’-GATGCGAAGTTCGCGCAAGAAGAC-3’
Trp116ala Rev     5’-GTCTTCTTGCGCGAACTTCGCATC-3’
一种重组菌株的制备方法，包括如下步骤：
（1）将权利要求4的含有突变体基因的质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至宿主细胞；
（2）将转化液涂布于含有100mg/ml博来霉素的YPD平板中，30℃培养3天后，平板上长出酵母单菌落为重组菌株。
所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33（Pichia pastoris）。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明基于蛋白空间结构信息，对结构内部特殊氨基酸位点周围的空间环境及氨基酸之间包括氢键，离子键，范德瓦尔里等的相互作用进行分析，结合分子生物学技术对特定的氨基酸位点进行改造，通过理性设计突变位点，运用定点突变的方法获得马拉色霉菌属SMG1脂肪酶突变体，可提高获得正向突变的酶突变体的概率，同时也大大减少了突变体筛选的工作量。本发明提高了酶的结构稳定性，进而有利于延长酶的使用寿命。
（2）本发明所得突变体为Trp116Ala，Trp116His，Trp116Phe三个热稳定性提高的突变体，更适合工业生物转化的应用。酶耐热性的提高可以通过酶的半衰期t50来表示，即一定温度下酶活力降低到原始酶活力一半的时间，t50值越大表明酶分子的热稳定性越好。三个SMG-Trp116突变体耐热性均有不同程度的提高。其中SMG1-Trp116Ala突变体的t50为247.55min，比野生型的SMG1脂肪酶的t50提高了4.1，具有更好的热稳定性能。
附图说明
图1为SMG1脂肪酶结构图。图注：盖子闭合状态的SMG1脂肪酶蛋白结构，箭头指向的为Trp116氨基酸残基。
图2为SMG1及其突变体纯化图。泳道M：蛋白分子量Marker，泳道1：SMG1，泳道2：SMG1-Trp116Ala，泳道3：SMG1-Trp116His，泳道4：SMG1-Trp116Phe。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例中涉及到的培养及配方如下：
LB液体培养基：酵母提取液0.5%，蛋白胨1%，NaCl1%,pH7.0。121℃灭菌20min。
YPD培养基:酵母提取液1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，制作平板时加入Agar2%，115℃灭菌20min。用于Zeocin抗生素筛选时，终浓度为1ug/ml。
上述培养基中的单位为%（W/V）。
实施例1
脂肪酶SMG1116氨基酸位点突变体构建
采用定点突变技术构建突变体Trp116Ala，Trp116His，Trp116Phe，利用重叠延伸PCR方法引入目的突变位点，定点突变反应条件：
扩增突变上游片段：
10X pfu buffer： 5
d NTP： 2.5
SMG for： 2.5
Trp116His rev： 2.5
Pfu DNA聚合酶： 1.5
双蒸水： 40
PGAPZα5A-SMG1： 2
扩增突变下游片段：
10X pfu buffer 5
dNTP： 2.5
Trp116His for： 2.5
3’AOX： 2.5
Pfu DNA聚合酶： 1.5
双蒸水： 40
PGAPZα5A-SMG1： 2
扩增带有突变位点的全长基因片段：
10Xpfu buffer： 10
dNTP： 5
SMG for： 5
3’AOX： 5
Pfu DNA聚合酶： 3
双蒸水： 8
上游片段： 5
下游片段： 5
使用的引物，见下表：
Figure BDA00003479662000051
PCR扩增条件：94℃5min；94℃20s，53℃30s，72℃80s，25个循环；72℃7min。重叠延伸PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，限制性内切酶Kpn I和Sal I分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZαA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞。涂布于LB（含25ug/mlzeocion）平板。生长15h后，挑取平板上10个单菌落进行菌落PCR，挑取阳性克隆通过Kpn I和SalI双酶切鉴定并基因测序，结果表明获得了正确的突变质粒。
实施例2
脂肪酶SMG1及其突变体重组菌株及纯化
将突变质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至毕赤酵母X-33感受态态细胞。将转化液涂布于YPD（100ug/ml Zeocin）平板，30℃培养3天后，挑取平板上单菌落于100ml YPD培养基中发酵72小时后，离心并浓缩发酵液进行SDS-PAGE检测，获得能够表达脂肪酶SMG1突变体阳性重组菌株。
将野生型菌株以及各脂肪酶突变体菌株，接种至100ml YPD培养基中，30℃，200rpm振荡培养48-72小时后，收集发酵上清液（10，000rpm，离心20min，4°C）。
将SMG1野生型及其突变体菌株的发酵上清液用0.22um的滤膜抽滤。后用10KD膜胞（Vivaflow200，Sartorius）将发酵液置换成20mM pH8.0Tris-HCl缓冲液，并将发酵液浓缩到大约30ml。浓缩发酵上清利用Q SepharoseTM FastFlow阴离子交换层析柱，流速5ml/min，最后用pH8.0含1M NaCl的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，目标蛋白在80mM盐离子浓度处被洗脱下来。利用SDS-PAGE电泳对纯化的重组蛋白进行纯度鉴定（见附图2）。
实施例3
脂肪酶突变体热稳定性测定
脂肪酶活性测定：反应总体系为200ul，酶活性采用相对酶活性表示，根据酶标仪测得的A405处吸光值相对大小来表示酶活力的大小。
实验组：先加入80ul的50mM pH6.0的磷酸盐缓冲液，然后加入10μL的酶液，将酶标板置于25℃下预热5min。然后加入10ul的pNPC-C8底物溶液，置于25℃反应5min，反应结束后，立即加入100μL的异丙醇终止酶促反应。于酶标仪上测定其吸光值OD405。
对照组：先加入80ul的50mM pH6.0的磷酸盐缓冲液，然后加入10ul的酶液和100ul异丙醇终止液，酶标板置于25℃下预热5min。然后加入10ul的pNPC-C8底物溶液，置于25℃反应5min，测定其OD405。
SMG1脂肪酶半衰期t50测定：
将纯化的酶蛋白于45℃下分别孵育0h，0.5h，1h，1.5h，2h，后4℃放置20min，检测各个酶的残留活力，根据实验组和对照组的数据的差异，并与初始酶活（0h）进行比较获得相对酶活性，将孵育不同时间后所测得的酶活力转换成残留酶活百分比（%）。以残留活性百分比的ln值对时间T(min)作图，直线的斜率为常数K。由t50=ln2/K得到SMG1脂肪酶在该温度下的t50。
突变体 45°C下的半衰期（t50，min） 提高的倍数
SMG1-WT 60.27 1.0
SMG1-Trp116His 130.78 2.1
SMG1-Trp116Phe 80.59 1.33
SMG1-Trp116Ala 247.55 4.1
结果显示，三个SMG-Trp116突变体耐热性均有不同程度的提高。其中SMG1-Trp116Ala突变体的t50为247.55min，比野生型的SMG1脂肪酶的t50提高了4.1，具有更好的热稳定性能。
Figure IDA00003479662900011
Figure IDA00003479662900021

Claims (9)

1.一种耐热性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体，其特征在于，该突变体是对马拉色霉菌（Malassezia globosa）偏甘油酯脂肪酶进行定点饱和突变获得的酶突变体，其中突变位点为116位的Trp。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述116位的Trp突变为Ala、His或Phe。
3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的DNA序列为SEQ NO.2、SEQ NO.3或SEQ NO.4。
4.一种利用权利要求1～3任意一项突变体制得的突变质粒。
5.权利要求4所述突变质粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）利用重叠延伸PCR方法引入目的突变氨基酸位点，先分段扩增含有突变氨基酸位点的上下游基因片段，然后将带有突变位点的基因片段拼接成含有突变位点全长基因片段；
（2）将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶Kpn I和Sal I分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZαA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，得到突变质粒。
6.权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述PCR的引物序列如下：
SMG For           5’-GGGGTACCAGCAGTATTTACGCCCGTGGCCG-3’
3'AOX             5’-GGCAAATGGCATTCTGACAT-3’
Trp116His For     5’-GATGCGAAGTTCCATCAAGAAGAC-3’
Trp116His Rev     5’-GTCTTCTTGATGGAACTTCGCATC-3’
Trp116Phe For     5’-GATGCGAAGTTCTTCCAAGAAGAC-3’
Trp116Phe Rev     5’-GTCTTCTTGGAAGAACTTCGCATC-3’
Trp116ala For     5’-GATGCGAAGTTCGCGCAAGAAGAC-3’
Trp116ala Rev     5’-GTCTTCTTGCGCGAACTTCGCATC-3’
7.一种重组菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将权利要求4的含有突变体基因的质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至宿主细胞；
（2）将转化液涂布于含有100mg/ml博莱霉素的YPD平板中，30℃培养3天后，平板上长出酵母单菌落为重组菌株。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33（Pichia pastoris）。
9.权利要求7或8所述方法制备的重组菌株。
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