CN102174432A - 一种耐有机溶剂高活性脂肪酶产生菌及其所产脂肪酶的基因和应用 - Google Patents
一种耐有机溶剂高活性脂肪酶产生菌及其所产脂肪酶的基因和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物工程与酶工程技术领域，具体涉及了一种耐有机溶剂脂肪酶产生菌BurkholderiacepaciaRQ-3，其耐有机溶剂脂肪酶的基因，以及该耐有机溶剂脂肪酶在有机相中催化拆分手性醇的应用。该菌株为革兰氏阴性菌株，其保藏登记号为：CCTCC No.M2010330，其耐有机溶剂脂肪酶产量高，具有较宽的pH适应范围，温度稳定性较好，对多种有机溶剂有较好的耐受性，其在手性醇拆分中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物工程与酶工程技术领域，具体涉及一种耐有机溶剂脂肪酶产生菌，其耐有机溶剂脂肪酶的基因，以及该耐有机溶剂脂肪酶在有机相中催化拆分手性醇的应用。
技术背景
脂肪酶(EC3．1．1．3)是一种酯键水解酶，它可在油水界面催化长链甘油三酸酯水解形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸，在洗涤、制革、食品、生物化工、造纸、医药、环保等行业被广泛应用。
脂肪酶在有机相中可以完成酯化、交换及转酯等反应，并具有区域选择性、立体选择性、较高的稳定性，尤其是它的立体选择催化特性，可以用于化学法难以进行的消旋化合物的拆分、不对称合成等。近年来，国内外学者已经致力于应用脂肪酶在有机体系中实现手性化合物，尤其是药物中间体的立体选择性水解或拆分，如利用微生物脂肪酶可完成酮基布洛芬、反应停、心得安等手性药物的立体选择性水解或拆分。与传统的化学方法相比，酶催化拆分外消旋化合物具有反应条件温和、节省能源、专一性强、副反应少、产品纯度高、反应步骤简单、不需手性源、产品成本低等优点。
脂肪酶在有机溶剂中容易变性或使酶活力下降，虽然国内外许多学者已经研究了不同方法来增加酶在有机溶剂中的稳定性，但其还是无法满足工业化的需求。因此寻找天然耐有机溶剂的脂肪酶，使其在有机溶剂或含有机溶剂的环境中具有较高的催化活性，已成为脂肪酶研究领域的一个重要方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种耐有机溶剂脂肪酶的产生菌、耐有机溶剂脂肪酶、耐有机溶剂脂肪酶基因以及该脂肪酶在有机相中催化手性醇拆分的应用。
为了实现本发明的目的，本发明首先从油污土壤等样品中筛选获得一株有机溶剂脂肪酶产生菌，分类命名为洋葱伯克霍尔德氏菌Burkholderia cepacia RQ-3，保藏日期为2010年12月5日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏登记号为CCTCC NO：M 2010330。
本发明对洋葱伯克霍尔德氏菌Burkholderia cepacia RQ-3的生物学特征进行鉴定，该菌株为革兰氏阴性菌株，菌落呈浅黄色，圆形，边缘整齐，光滑湿润；显微镜观察菌体为杆菌，0.8～1.0×1.6～3.2mm，专性好氧，生长的最适温度为30℃～35℃。其生理生化特性表现在：不出现反硝化反应、明胶反应结果为阳性，氧化酶阳性，可分解脂肪，可利用D-核糖、D-阿拉伯糖、海藻糖等，不可利用麦芽糖。
经BIOLOG全自动细菌鉴定仪鉴定，Sim值为0.535（24h培养），结果显示该菌属于Burkholderia属；16S rDNA序列分析结果表明，该菌株与数据库中多株Burkholderia cepacia菌的同源性为99%。综合BIOLOG和16S rDNA分析结果，该菌株鉴定为Burkholderia cepacia，命名为Burkholderia cepacia RQ-3。
本发明对Burkholderia cepacia RQ-3进行了产酶条件优化，优化后产酶量高达71 U/mL，比优化前21.9 U/mL提高了2.2倍。
本发明对该菌产生的胞外酶进行了纯化，经过一步Phenyl-Sepharose FF层析，分离纯化得到电泳纯的耐有机溶剂脂肪酶，命名为脂肪酶RQ-3，纯化后脂肪酶的比活性达到4142.3 U/mg。
本发明对脂肪酶RQ-3进行了酶学性质的研究，实验证明该脂肪酶对多种有机溶剂都具有良好的耐受性，有机溶剂体系（十六烷、十四烷、异丙醇、乙醇等）中脂肪酶的稳定性提高，半衰期延长。脂肪酶RQ-3的最适反应pH为9.0，在pH 6.0～10.0的范围具有很高的稳定性。其最佳反应温度为40℃，此酶的最佳人工底物为对硝基苯酚豆蔻酯（C14）。
本发明分离克隆到该菌株所产耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的编码基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列： atggccagga cgatgcgttc cagggtggcg gcaggggtag tggcatgcgc gatgagcatc gcgccgttcg cggggacgac cgcggtgatg a cgctcgcga cgacgcacgc ggcaatggcg gccaccgcgc ccgccgctgg ctacgcggcg acgcgttacc cgatcatcct cgtgcacggg ct ctcgggta ccgacaagta cgccggcgtg ctcgagtatt ggtacggcat ccaggaggac ctgcaacaga acggtgcgac cgtctacgtc gcg aacctgt cgggtttcca gagcgacgac ggcccgaacg ggcgcggcga acagttgctc gcttacgtga agacggtgct cgcggcgacg gggg cgacca aggtcaatct cgtcggtcac agccagggcg gcctctcgtc gcgctatgtt gctgccgtcg cgcccgatct cgttgcgtcg gtgac gacga tcggcacgcc gcatcgcggc tccgaattcg ccgacttcgt gcaggacgtg ctcgcgtacg atccgaccgg gctttcgtca tcggtg atcg ccgcgttcgt caatgtgttc gggatcctga cgagcagcag ccacaacgcc aaccaggacg cgctcgccgc actgcagacg ctgacca ccg cacgggccgc cacctacaac cagaactatc cgagcgcggg cctgggtgcg ccgggcagtt gccagaccgg tgcgccgacc gaaaccgt cg gcggcaacac gcacctgctg tattcgtggg ccggcacggc gatccagccg acgctctccg tgttcggcgt cacgggcgcg acggacacg a gcacccttcc gctcgtcgat ccggcgaacg tgctcgacct gtcgacgctt gcgctgttcg gcaccggcac ggtgatgatc aaccgcggct ccgggcagaa cgacgggctc gtgtcgaaat gcagtgcgct gttcggcaag gtgctgagca cgaactacaa gtggaaccac ctcgacgaga tcaaccagct gctcggcgtg cgcggcgcgt atgcggaaga tccggtcgcg gtgatccgca cgcatgcgaa ccggctgaag ctggcgggcg t
本发明还提供耐有机溶剂脂肪酶RQ-3在有机相酶催化手性醇反应中的应用。所述的有机相酶催化反应可以为拆分1-苯乙醇反应。所述的耐有机溶剂脂肪酶在有机溶剂正己烷体系中，催化底物1-苯乙醇和乙烯乙酸酯进行酯交换反应，转化率达45～50％，eep值>99%。
本发明的有益效果在于菌株Burkholderia cepacia RQ-3的耐有机溶剂脂肪酶RQ-3产率较高，发酵36 h脂肪酶活力达到71 U/mL；耐有机溶剂脂肪酶RQ-3易纯化、比活高，经过一步疏水层析后比活达到4142.3U/mg；该脂肪酶作用pH范围广、温度稳定性良好，在疏水性和亲水性有机溶剂中都有较好的耐受性，表明其在双相和有机相催化尤其是手性拆分方面有很好的应用前景。
附图说明
图1显示耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1，Marker；泳道2，粗酶液；泳道3，纯酶液（经疏水层析后得到的纯酶液）；
图2显示耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的最适反应pH；
图3显示耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的pH稳定性（在各pH条件下放置1h后的剩余酶活）；
图4显示耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的最适反应温度；
图5显示耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的温度稳定性（在各温度条件下放置1h后的剩余酶活）；
图6显示耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的底物特异性，其中p-Nitrophenyl acetate (C2)为对硝基苯酚乙酸酯,p-Nitrophenyl butyrate (C4)为对硝基苯酚丁酸酯，p-Nitrophenyl caprate (C8)为对硝基苯酚辛酸酯，p-Nitrophenyl decanoate (C10)为对硝基苯酚癸酸酯，p-Nitrophenyl myristate (C14)为对硝基苯酚豆蔻酸酯，p-Nitrophenyl palmitate (C16)为对硝基苯酚棕榈酸酯，p-Nitrophenyl stearate (C18)为对硝基苯酚硬脂酸酯（C18）。
具体实施方式
实施例一
本实验说明产耐有机溶剂脂肪酶天然菌株的筛选程序。
初筛采用如下方法：以植物油为唯一碳源，不同浓度环己烷、甲苯、DMSO等有机溶剂为筛选压力从油污土壤等样品中筛选获得耐有机溶剂极端微生物。采用吐温80平板培养基，具体配方为：酵母膏5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 10g/L，吐温80 10mL/L，CaCl2 1 g/L，琼脂20 g/L。将所筛选到的耐有机溶剂微生物接种于吐温80平板，根据沉淀圈与菌落大小的比值，初步筛选脂肪酶产量高的菌株。此方法筛选到具有脂肪酶产量高的耐有机溶剂极端微生物5株。
为了进一步检测所分泌脂肪酶的溶剂耐受性，对5株菌的脂肪酶产生能力和所产脂肪酶的耐有机溶剂性质进行全面的检测。将所筛选到的高活力菌株接种到产酶发酵培养基，具体配方为：糊精5 g/L，蛋白胨15 g/L，K2HPO4??3H2O 1.8g/L，MgSO4??7H2O 0.7 g/L，橄榄油5mL/L，pH 8.0。培养温度为30℃，培养时间为36 h，摇床转速为180 rmp。发酵结束后，8000 rmp 4℃离心10min，取上清为粗酶液。取粗酶液1.5 mL分别加入0.5mL的十六烷、壬烷、正辛烷、异辛烷、正庚烷、正己烷、异丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亚砜（DMSO），于30℃、150 rpm震荡处理24 h，以pNPP为底物检测脂肪酶剩余酶活；选取具有最高剩余活力的菌株作为耐有机溶剂脂肪酶产生菌株。
脂肪酶活力检测方法（以对硝基苯酚棕榈酸酯为底物）为：A溶液：50mM的Na2HPO4??12H2O-NaH2PO4??2H2O缓冲液（pH 7.0），其中含有0.6%（m/v）Triton X-100和0.1%（m/v）的阿拉伯树胶；B溶液：称取3 mg的对硝基苯酚棕榈酸酯(p-Nitrophenylpalmitate, pNPP)，溶解在1 mL的异丙醇中；A溶液与B溶液按体积比9:1制成浓度为16.5 mM的对硝基苯酚棕榈酸酯底物溶液。反应体系中先加入10 ??L稀释适当倍数的酶液，以灭活的酶液为空白对照，再加入240 ??L底物溶液，在酶标仪中进行反应，反应温度为40℃，反应时间为10 min，在410 nm波长下检测反应结束时生成的对硝基苯酚(pNP)的量。每1个单位（U）脂肪酶酶活定义为，在相应条件下，每分钟催化产生1 ??mol对硝基苯酚(pNP)所需的酶量。通过酶活性检测以及有机溶剂稳定性检测，其中一株具有优良耐受性的脂肪酶产生菌株所产脂肪酶活力达到21.9U/mL，该菌株编号RQ-3。
实施例二
本实验说明耐有机溶剂脂肪酶产生菌RQ-3的生物学性质、鉴定及其产酶条件研究。
菌株RQ-3的生物学性质：该菌株为革兰氏阴性菌株，菌落呈浅黄色，圆形，边缘整齐，光滑湿润；菌体为杆菌，0.8～1.0×1.6～3.2mm，专性好氧，生长的最适温度为30℃～35℃。其生理生化特性表现在：不出现反硝化反应、明胶反应结果为阳性，氧化酶阳性，可分解脂肪，可利用D-核糖、D-阿拉伯糖、海藻糖等，不可利用麦芽糖。
菌株RQ-3的菌种鉴定：经BIOLOG自动细菌鉴定仪鉴定，Sim值为0.535（24h培养），鉴定结果显示该菌属于Burkholderia属；后经16S rDNA序列分析，表明该菌株与数据库中多株Burkholderia cepacia菌的同源性为99%。综合BIOLOG和16S rDNA分析结果，该菌株鉴定为Burkholderia cepacia，命名为Burkholderia cepacia RQ-3。
Burkholderia cepacia RQ-3产酶条件研究：采用单因素替换法研究发酵培养基的碳源（葡萄糖、蔗糖、玉米粉、甘油、糊精）、氮源（蛋白胨、酵母膏、大豆粉、尿素、硝酸钠、硫酸铵）、诱导剂（花生油、橄榄油、大豆油、玉米油）、表面活性剂（Tween 80、SDS、Triton X-100、阿拉伯树胶）、初始pH，接种量，发酵温度，装液量等对Burkholderia cepacia RQ-3产脂肪酶的影响，得出优化后的培养基组分为：蔗糖5 g/L，大豆粉10 g/L，MgSO4·7H2O 0.7g/L，K2HPO4·3H2O 1.8 g/L，Tween 80 5 mL/L，橄榄油7.5 mL/L，发酵初始pH 8.0；优化后的培养条件为：接种量2%（V/V），发酵温度30 ??C，摇床转速180 rpm，装液量40 mL/250 mL。在此优化条件下，发酵36 h后，酶活力达到71 U/mL，与初始培养基及培养条件下酶活21.9U/mL相比，提高了2.2倍。
实施例三
本实验说明耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的纯化程序。
将Burkholderia cepacia RQ-3在产酶培养基中培养36 h后，发酵液在8,000 rpm，4℃离心10 min，取上清为粗酶液；将以上处理得到的酶液，采用Phenyl-Sepharose FF层析柱进行纯化，以0.02 M PBS(pH 8.0)+20%乙醇和0.02 M PBS(pH 8.0)+50%乙醇溶液进行洗脱，收集脂肪酶活力峰。通过SDS-PAGE电泳图（图1），发现一步纯化后的耐有机溶剂脂肪酶（命名为脂肪酶RQ-3）已达电泳纯，该脂肪酶亚基分子量约为33 kDa。纯化倍数为15.5倍，回收率为50%，纯化后的脂肪酶比活达到4142.3 U/mg，汇总见表1。
表1 耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的纯化步骤及结果
| 总活力(U) | 总蛋白(mg) | 比活力(U/mg) | 回收率(%) | 纯化倍数 | |
| 粗酶液 | 7100.0 | 26.6 | 266.9 | 100 | 1 |
| Phenyl-SepharoseFF | 3557.1 | 0.86 | 4142.3 | 50.1 | 15.5 |
注：蛋白质浓度采用考马斯亮兰法测定
实施例四
本实验说明耐有机溶剂脂肪酶RQ-3编码基因的分离克隆程序。
将纯化的耐有机溶剂脂肪酶RQ-3（委托国家生物医学分析中心，NBCA) 进行LC-MS/MS分析测定其氨基酸片段，结果表明该酶与Burkholderia cepacia中多株菌的脂肪酶序列相近，找到该脂肪酶保守序列，在此酶CDS两端外各约150 bp处设计引物，扩增耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的CDS编码序列。将含有CDS编码序列的PCR片段电泳回收后克隆到pMD18-T载体，进行序列分析。设计的引物为：
LU1（SEQ ID:3）: GAGTCGTGATTCACTCCCGCATT
LD1（SEQ ID:4）: AGCCCCACGACACCATAGACCA
PCR反应参数为：94℃预变性2 min；94℃变性30 sec；65℃退火30 sec，72℃延伸1 min 30 sec；循环30轮后，72℃保温10 min。根据该反应条件，扩增到了1.3 kb的PCR片段。将此片段连接到pMD18-T载体，进行序列测定。结果表明，此片段有一个全长为1095 bp的阅读框。与Burkholderia sp. MC16-3脂肪酶基因同源性为99.2%，氨基酸序列同源性为99.2%（差异的氨基酸为A10V；V13 A；A200 T）。
实施例五
本实验说明耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的酶学性质。
耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的有机溶剂耐受性：向耐有机溶剂脂肪酶RQ-3酶液中分别加入15种有机溶剂（按照实施三制备），其混合比例为3：1（V/V），对照中不添加有机溶剂。30℃，150 rpm振荡每隔24h取样，以对硝基苯酚棕榈酸酯为底物检测脂肪酶活力。耐有机溶剂脂肪酶RQ-3具有良好的有机溶剂耐受性，其在25%（v/v）的正十六烷、正十四烷、正十二烷、正己烷、异丙醇、乙醇、DMF等有机溶剂中半衰期有明显的延长。
表2 有机溶剂对脂肪酶RQ-3的影响
| Organicsolvents | LogPO/W | Half-life（d） | Organicsolvents | LogPO/W | Half-life（d） |
| Control | - | 3 | n-Hexane | 3.5 | 6 |
| n-Hexadecane | 8.8 | >10 | n-Octanol | 2.9 | >10 |
| n-Tetradecane | 7.6 | >10 | Heptitol | 2.4 | 10 |
| n-Dodecane | 6.6 | >10 | Hexanol | 1.8 | 9 |
| n-Decane | 5.6 | 9 | Isopropanol | 0.05 | >10 |
| n-Nonane | 5.1 | 9 | ethanol | -0.24 | >10 |
| n-Octane | 4.5 | 7 | DMF | -1 | 7 |
| n-Heptane | 4 | 7 | DMSO | -1.35 | 6 |
耐有机溶剂脂肪酶RQ-3最适反应pH和pH稳定性的检测：以不同pH缓冲液溶解的对硝基苯酚棕榈酸酯为底物， pH 9.0条件下的脂肪酶活力为对照（100％），不同pH体系中的酶活如图2所示。耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的最适反应pH为9.0，为碱性脂肪酶。以原始酶液的脂肪酶活力为对照，检测该酶的pH稳定性（图3）。将耐有机溶剂脂肪酶RQ-3在不同pH的缓冲溶液中30℃保温1 h后测残余酶活，实验表明该脂肪酶在pH 6.0～10.0的范围内具有较高的稳定性，在pH 11.0的溶液中保温1 h后，仍然保留最高活力的60%。
耐有机溶剂脂肪酶RQ-3最适反应温度和热稳定性的检测：最适反应温度的测定在0.05 M Na2HPO4??12H2O-NaH2PO4??2H2O缓冲体系（pH 7.0）中进行，在不同的温度下以对硝基苯酚棕榈酸酯为底物进行酶促反应。结果显示该酶的最适反应温度为40℃(图4)，在50℃条件下反应仍然具有最佳情况下63%的酶活力。热稳定性测定：耐有机溶剂脂肪酶RQ-3在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下处理1 h以后，测定残留酶活。由图5可以看出该脂肪酶具有较好的热稳定性，在50℃处理1 h后仍然保留最高活力的87%。
耐有机溶剂脂肪酶RQ-3底物特异性的检测：参照以对硝基苯酚棕榈酸酯为底物的脂肪酶活力测定方法来检测底物特异性，底物分别为对硝基苯酚乙酸酯（C2）,对硝基苯酚丁酸酯（C4），对硝基苯酚辛酸酯（C8），对硝基苯酚癸酸酯（C10），对硝基苯酚豆蔻酸酯（C14），硝基苯酚棕榈酸酯（C16），对硝基苯酚硬脂酸酯（C18）。结果如图6，耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的最适人工底物为对硝基苯酚豆蔻酸酯（C14）。
实施例七
本实验说明耐有机溶剂脂肪酶RQ-3在有机相中拆分手性醇的应用
以0.3 mmol的1-苯乙醇和1.8 mmol的乙酸乙烯酯作为反应底物；以环己烷、正己烷、异辛烷、十二烷和十四烷作为溶剂，溶剂的加入量为1mL；加入20mg耐有机溶剂脂肪酶RQ-3酶粉（丙酮沉淀所得），在30℃，转速180rpm条件下反应，定时取样，采用HPLC进行检测。结果表明，正己烷为最佳溶剂，反应16 h后，转化率达到45%~50%，eep> 99%。
结果表明脂肪酶RQ-3具有良好的对映体选择性，在手性醇拆分中具有良好的应用前景。
<110> 南京工业大学
<120> 一种耐有机溶剂高活性脂肪酶产生菌及其所产脂肪酶的基因和应用
<160> 2
<210> 1
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<400> 1
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gcgccgttcg cggggacgac cgcggtgatg acgctcgcga cgacgcacgc ggcaatggcg 120
gccaccgcgc ccgccgctgg ctacgcggcg acgcgttacc cgatcatcct cgtgcacggg 180
ctctcgggta ccgacaagta cgccggcgtg ctcgagtatt ggtacggcat ccaggaggac 240
ctgcaacaga acggtgcgac cgtctacgtc gcgaacctgt cgggtttcca gagcgacgac 300
ggcccgaacg ggcgcggcga acagttgctc gcttacgtga agacggtgct cgcggcgacg 360
ggggcgacca aggtcaatct cgtcggtcac agccagggcg gcctctcgtc gcgctatgtt 420
gctgccgtcg cgcccgatct cgttgcgtcg gtgacgacga tcggcacgcc gcatcgcggc 480
tccgaattcg ccgacttcgt gcaggacgtg ctcgcgtacg atccgaccgg gctttcgtca 540
tcggtgatcg ccgcgttcgt caatgtgttc gggatcctga cgagcagcag ccacaacgcc 600
aaccaggacg cgctcgccgc actgcagacg ctgaccaccg cacgggccgc cacctacaac 660
cagaactatc cgagcgcggg cctgggtgcg ccgggcagtt gccagaccgg tgcgccgacc 720
gaaaccgtcg gcggcaacac gcacctgctg tattcgtggg ccggcacggc gatccagccg 780
acgctctccg tgttcggcgt cacgggcgcg acggacacga gcacccttcc gctcgtcgat 840
ccggcgaacg tgctcgacct gtcgacgctt gcgctgttcg gcaccggcac ggtgatgatc 900
aaccgcggct ccgggcagaa cgacgggctc gtgtcgaaat gcagtgcgct gttcggcaag 960
gtgctgagca cgaactacaa gtggaaccac ctcgacgaga tcaaccagct gctcggcgtg 1020
cgcggcgcgt atgcggaaga tccggtcgcg gtgatccgca cgcatgcgaa ccggctgaag 1080
ctggcgggcg tgtaa 1095
<210> 2
<211> 364
<212> PRT
<213> Burkholderia cepacia RQ-3
<400> 2
Met Ala Arg Thr Met Arg Ser Arg Val Ala Ala Gly Val Val Ala Cys
1 6 11 16
Ala Met Ser Ile Ala Pro Phe Ala Gly Thr Thr Ala Val Met Thr Leu
21 26 31
Ala Thr Thr His Ala Ala Met Ala Ala Thr Ala Pro Ala Ala Gly Tyr
36 41 46
Ala Ala Thr Arg Tyr Pro Ile Ile Leu Val His Gly Leu Ser Gly Thr
51 56 61
Asp Lys Tyr Ala Gly Val Leu Glu Tyr Trp Tyr Gly Ile Gln Glu Asp
66 71 76
Leu Gln Gln Asn Gly Ala Thr Val Tyr Val Ala Asn Leu Ser Gly Phe
81 86 91 96
Gln Ser Asp Asp Gly Pro Asn Gly Arg Gly Glu Gln Leu Leu Ala Tyr
101 106 111
Val Lys Thr Val Leu Ala Ala Thr Gly Ala Thr Lys Val Asn Leu Val
116 121 126
Gly His Ser Gln Gly Gly Leu Ser Ser Arg Tyr Val Ala Ala Val Ala
131 136 141
Pro Asp Leu Val Ala Ser Val Thr Thr Ile Gly Thr Pro His Arg Gly
146 151 156
Ser Glu Phe Ala Asp Phe Val Gln Asp Val Leu Ala Tyr Asp Pro Thr
161 166 171 176
Gly Leu Ser Ser Ser Val Ile Ala Ala Phe Val Asn Val Phe Gly Ile
181 186 191
Leu Thr Ser Ser Ser His Asn Ala Asn Gln Asp Ala Leu Ala Ala Leu
196 201 206
Gln Thr Leu Thr Thr Ala Arg Ala Ala Thr Tyr Asn Gln Asn Tyr Pro
211 216 221
Ser Ala Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ser Cys Gln Thr Gly Ala Pro Thr
226 231 236
Glu Thr Val Gly Gly Asn Thr His Leu Leu Tyr Ser Trp Ala Gly Thr
241 246 251 256
Ala Ile Gln Pro Thr Leu Ser Val Phe Gly Val Thr Gly Ala Thr Asp
261 266 271
Thr Ser Thr Leu Pro Leu Val Asp Pro Ala Asn Val Leu Asp Leu Ser
276 281 286
Thr Leu Ala Leu Phe Gly Thr Gly Thr Val Met Ile Asn Arg Gly Ser
291 296 301
Gly Gln Asn Asp Gly Leu Val Ser Lys Cys Ser Ala Leu Phe Gly Lys
306 311 316
Val Leu Ser Thr Asn Tyr Lys Trp Asn His Leu Asp Glu Ile Asn Gln
321 326 331 336
Leu Leu Gly Val Arg Gly Ala Tyr Ala Glu Asp Pro Val Ala Val Ile
341 346 351
Arg Thr His Ala Asn Arg Leu Lys Leu Ala Gly Val
356 361
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> LU1
<400> 3
gagtcgtgat tcactcccgc att
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> LD1
<400> 4
agccccacga caccatagac ca
Claims (5)
1.一种耐有机溶剂脂肪酶产生菌，其特征在于该菌为洋葱伯克霍尔德氏菌，命名为Burkholderia cepacia RQ-3，保藏日期为2010年12月5日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏登记号为CCTCC NO：M 2010330。
2.根据权利要求1所述的耐有机溶剂脂肪酶产生菌，其特征在于：所产耐有机溶剂脂肪酶RQ-3的编码基因，其核苷酸序列为：SEQ ID NO: 1。
3.根据权利要求1所述的耐有机溶剂产生菌，其特征在于所产耐有机溶剂脂肪酶RQ-3氨基酸序列为：SEQ ID NO: 2，其由SEQ ID NO: 1中所述的核苷酸序列编码。
4.根据权利要求1所述的耐有机溶剂脂肪酶产生菌产生的耐有机溶剂脂肪酶RQ-3在手性醇拆分体系中的应用。
5.根据权利要求5所述的耐有机溶剂脂肪酶产生菌产生的耐有机溶剂脂肪酶RQ-3在手性醇拆分体系中的应用，其特征在于所述耐有机溶剂脂肪酶在有机溶剂体系中，可完成手性醇苯乙醇的手性拆分。
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Citations (1)
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| CN101735967A (zh) * | 2009-11-11 | 2010-06-16 | 南京工业大学 | 一种耐有机溶剂脂肪酶、其应用及其产生菌株 |
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- 2011-01-14 CN CN2011100073494A patent/CN102174432B/zh not_active Expired - Fee Related
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| CN116622677B (zh) * | 2023-06-27 | 2024-05-14 | 福建师范大学 | 一种伯克霍尔德氏菌脂肪酶突变体及其在全细胞生物催化合成甾醇酯中的应用 |
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