CN108118043B

CN108118043B - 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体

Info

Publication number: CN108118043B
Application number: CN201611057003.4A
Authority: CN
Inventors: 闫云君; 李冠霖; 苏枫; 陈苑; 方兴容; 徐莉
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2016-11-26
Filing date: 2016-11-26
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2036-11-26
Also published as: CN108118043A

Abstract

本发明提供了一种褶皱假丝酵母脂肪酶突变体，采用定点突变技术对褶皱假丝酵母(ATCC NO:14830)脂肪酶LIP1(CRL1)进行热稳定性改造以优化其在工业高温环境下的实用性。本发明以CRL1基因为模板，利用蛋白质理性设计技术，通过将CRL1脂肪酶基因序列编码氨基酸第457位的氨基酸由Asp替换成Phe，而获得热稳定性提高的脂肪酶突变体，提高了该酶的应用范围与催化效率。运用分子生物学方法对CRL1进行定点突变，获得脂肪酶突变体，脂肪酶突变体的Tm值提高9.4℃，最适温度提高10℃，T_1/2(50℃)是亲本脂肪酶的6.5倍。

Description

一种热稳定性提高的脂肪酶突变体

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地，涉及一种热稳定性提高的脂肪酶突变体以及脂肪酶基因。

背景技术

酶作为一种天然的生物催化剂，具有反应条件温和、催化效率高、底物选择特异性高等传统催化方法所不可比拟的优点，在工业生产中具有巨大的应用潜力和良好的发展前景，但工业生产中常常需要较高的反应温度，一方面，高温条件下进行反应能够显著地降低反应物被微生物污染的概率，同时还可以增加底物的溶解性，使底物与酶更易接触；另一方面，一般而言，反应温度每增加10℃，反应速率就会提高两倍。因此，如果酶在高温下能够保持稳定的催化活力，就能随着反应速率的增加，缩短相应的转化时间，继而减少在反应过程中的需酶量，从而降低生产成本。大多数的酶蛋白分离于常温菌，这些酶蛋白经过长期的自然选择，已充分适应了生物体的催化要求，通常只能在较为温和的环境下发挥作用，这使得酶在其热稳定性上具有一定的局限性，过高的温度会影响蛋白质的稳定性，甚至导致其完全变性而丧失活力，使酶不能在工业条件下最大程度的发挥其作用，这严重制约了它们在工业生产中的应用。因此，建立一套高效的改良方法来提高酶的热稳定性是一件刻不容缓的事情。

褶皱假丝酵母(ATCC NO:14830)脂肪酶LIP1(Candida Rugosa Lipase 1，CRL1)与其他七种同工酶相比有着更高的表达量和水解、转酯、酯化活力，同时，由于其独特的催化性质(如立体选择性等)现已被广泛地应用于生物医药(手性拆分)、食品、生物柴油等多个领域中。但CRL1作为一种常温酶，具有较差的热稳定性，这一不足严重制约了其工业化应用。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，由亲本褶皱假丝酵母(ATCC NO:14830)脂肪酶LIP1(Candida Rugosa Lipase 1,CRL1)进行定点突变，获得热稳定性提高的脂肪酶突变体，亲本CRL1氨基酸序列在氨基酸取代位置发生突变，采用“原始氨基酸/位置/替换氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸，所述脂肪酶突变体为Asp457Phe，以解决现有技术的褶皱假丝酵母脂肪酶LIP1(CRL1)热稳定性差的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，所述脂肪酶突变体为亲本褶皱假丝酵母脂肪酶LIP1的氨基酸序列在氨基酸取代位置发生突变的突变体，采用“原始氨基酸/位置/替换氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸，所述脂肪酶突变体为Asp457Phe。

优选地，所述脂肪酶突变体的序列为：

(1)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(2)与序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

优选地，用于表达所述脂肪酶突变体的表达载体为pPIC9K，pPIC3.5K，pPICZα或pPICZ。

优选地，用于所述表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母。

按照本发明的另一个方面，提供了一种脂肪酶突变体基因，其为用于编码权利要求1所述的脂肪酶突变体的基因。

优选地，所述脂肪酶突变体基因的序列为

(1)由SEQ ID No.2所示的基因序列；或

(2)与序列SEQ ID No.2限定的基因序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的基因序列；或

(3)SEQ ID No.2所示的基因序列经增加、缺失或替换一个或多个密码子具有同等活性的由(1)衍生的基因。

按照本发明的另一个方面，提供了一种用于扩增所述的亲本脂肪酶全基因的引物对，其包括核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示的上游引物，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的下游引物。

按照本发明的另一个方面，提供了一种用于构建所述的脂肪酶突变体的引物对，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示的上游引物，以及核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示的下游引物。

本研究采用定点突变技术对CRL1进行热稳定性改造以优化其在工业高温环境下的实用性。本发明以褶皱假丝酵母脂肪酶LIP1基因为模板，利用蛋白质理性设计技术获得了热稳定性提高的脂肪酶突变体，提高了该酶的应用范围与催化效率。运用分子生物学方法对褶皱假丝酵母脂肪酶LIP1进行定点突变，获得脂肪酶突变体，脂肪酶突变体的Tm值提高9.4℃，最适温度提高10℃，T_1/2(50℃)是亲本脂肪酶的6.5倍。

附图说明

图1是本发明中CRL1与Asp457Phe熔融温度Tm值的测定结果；

图2是本发明中CRL1与Asp457Phe蛋白质最适温度的测定结果；

图3是本发明中CRL1与Asp457Phe蛋白质T_1/2(50℃)的测定结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

发明人在前期研究中使用密码子优化技术，将CRL1的密码子同义替换为在巴斯德毕赤酵母表达系统(Pichia Pastoris)偏好的密码子，成功提高了CRL1在毕赤酵母中的表达量(Xu Li,et al.2016.Enzyme and Microbial technology,82,115-124)。本发明以经密码子优化后的CRL1基因(如SEQ ID NO. 3所示)为模板，利用定点突变技术获得热稳定性提高的脂肪酶突变体。

酶的热稳定性是指酶分子在高温条件下保持结构与功能完整性的一种特征，是酶得以实际应用的必要条件。从能量和结构上产生因素的不同可以将“热稳定性”分为热力学稳定(Thermodynamicstability)和动力学稳定性(Kineticstability)。

热动力学稳定性通常是来描述蛋白质解折叠的一种趋势，指酶的结构处于能量上相对稳定的状态，在此状态下，任何结构上的改变都不能自发的进行。一般用蛋白质的解折叠自由能(ΔG_u)、蛋白质解折叠平衡常数(K_u)和解折叠温度(Tm)来表示。

动力学稳定性是指蛋白质在经历不可逆变性时，维持其部分活性所需要的时间或温度，一般用热半失活时间(T_1/2，半衰期)、热半失活温度(T₅₀)、最适反应温度(T_opt)以及代谢产物转换数(turnover number,TN)等指标来反映。

T_1/2是指在一定温度下，酶活力降到原来一半时所需要的时间，即残余50％酶活性所需时间；T₅₀是指在不同温度下放置一定时间后，残余50％酶活力时的温度，常用T₅₀t表示在放置t(min)时间后，残余50％酶活性的温度；Tm值则是指酶的结构有一半发生解折叠时的温度。T_1/2和T₅₀的计算可用表观残余酶活力的测定来完成。而Tm值的检测方法有多种，可以通过圆二色谱仪(Circular Dichroism Spectroscopy)、荧光定量PCR仪(Real-timeqPCR)、以及差示扫描量热仪(Differential Scanning Calorimetry)等对其进行测定。T₅₀和Tm值虽然在概念上不同，但由于酶蛋白分子在解折叠的同时也伴随着酶活力的丧失，因此这两个数据可以互相借鉴。

酶的最适温度可以通过将酶在相同的标准条件下测定催化活力来测定，酶催化活力最高时的反应温度即为该酶的最适温度。

酶的Tm值为酶解链一半时的温度，可通过荧光定量PCR测定熔解曲线而得到。

酶的热稳定性测定的方法为在某一温度下保持不同时间后，测定残余活力。

定义：

氨基酸和DNA核酸序列的命名法

氨基酸使用公认的IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认的IUPAC命名法。

脂肪酶突变体的标识

采用“原始氨基酸/位置/突变氨基酸”的格式来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸。如Asp457Phe，表示第457位的氨基酸由亲本脂肪酶的Asp替换成Phe。

本发明由亲本褶皱假丝酵母脂肪酶LIP1(Candida Rugosa Lipase 1,CRL1)进行定点突变，获得热稳定性提高的脂肪酶突变体，亲本CRL1氨基酸序列在氨基酸取代位置发生突变，采用“原始氨基酸/位置/替换氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸，所述脂肪酶突变体为Asp457Phe。

CRL1突变体的氨基酸序列为 SEQ ID NO.1，基因序列为 SEQ ID NO.2，突变位点使用底色标记显示。

可用于表达所述CRL1突变体的表达载体为：pPIC9K，pPIC3.5K， pPICZα或pPICZ；优选为pPICZα。

可用于所述的表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母。

与亲本CRL1相比，所述脂肪酶突变体的热稳定性获得了提高：以半解链温度Tm值来表示时，突变体脂肪酶比亲本脂肪酶提高9.4℃；以脂肪酶最适温度T_opt来表示时，突变体脂肪酶比亲本脂肪酶提高10℃；以50℃时的半衰期T_1/2(50℃)来表示时，突变体脂肪酶是亲本脂肪酶的6.5倍。

氨基酸突变体的选择依据：主要通过提高α螺旋的稳定性来提高脂肪酶的热稳定性，该突变点Asp457Phe位于α螺旋上，由于疏水作用对于α螺旋的稳定很关键，所以亲水性氨基酸Asp替换为疏水性氨基酸Phe后，很可能增强了α螺旋内部疏水侧链的相互作用。在此螺旋中，发现当457号位点的Asp替换成Phe后，位于α螺旋尾部的铰链区变成了该α螺旋的一部分，使得原先的柔性结构变成了相对稳定的结构，且相邻的原本不在此螺旋上的疏水性氨基酸Tyr458也加入到该螺旋结构中，这进一步提高了α螺旋内部的疏水相互作用力，使得α螺旋变得更加稳定，酶的热稳定性也相应的得到了提高。

实施例中涉及到的培养基及试剂配方如下：

50×Glucose：将50.0g Glucose溶于100mL去离子中，高压蒸汽灭菌后于4℃保存。

10×YNB：将13.4g YNB即酵母氮碱溶于100mL去离子水中，过滤除菌后放置在4℃保存。

500×生物素：20.0mg生物素溶于100mL去离子水中，定容后过滤除菌，于4℃避光保存。

LB液体培养基(100mL)：蛋白胨1.0g，酵母提取物0.5g，氯化钠1.0g。

YPD培养基(100mL)：蛋白胨2.0g，酵母提取物1.0g，经高压蒸汽灭菌后加入50×Glucose 4mL(若配制固体培养基则需在此基础上加入Agar 1.5-2.0g；需要筛选博来霉素抗性时，加入博来霉素至终浓度为50μg/mL)。

BMGY生长培养基(50mL)：蛋白胨1.0g，酵母提取物0.5g，甘油0.5g，特定pH的1M磷酸钾缓冲液5mL，加去离子水至45mL，经高压蒸汽灭菌后加入10×YNB 5mL、500×生物素200μL。

BMMY发酵培养基(50mL)：蛋白胨1.0g，酵母提取物0.5g，甲醇0.25mL，特定pH的1M磷酸钾缓冲液5mL，加去离子水至45mL，经高压蒸汽灭菌后加入10×YNB 5mL、500×生物素200μL。

罗丹明B-BMMY酶活检测固体培养基(100mL)：80mL去离子水中加入蛋白胨2.0g，酵母提取物0.5g，特定pH的1M磷酸钾缓冲液10mL，橄榄油乳化液2mL和罗丹明B 400μL，Agar1.5-2.0g，经高压蒸汽灭菌后，待其冷却至60℃左右，再加入10×YNB 10mL与500×生物素200μL。

实施例1

(1)以亲本基因为模板，采用全质粒PCR方法克隆出编码脂肪酶突变体的基因。

本发明人是以褶皱假丝酵母脂肪酶LIP1(CRL1)的基因序列为模板设计突变引物，通过PCR得到脂肪酶突变基因。

设计引物：

引物1：

F链：(SEQ ID NO.4)

5’-CCGCTCGAGCATCATCACCATCACCACGCCCCTACTGCTACTCTT-3’

R链：(SEQ ID NO.5)

5’-TTGCGGCCGCTTAGACAAAGAAAGAAGGTGGGTTACTAAAAAGAGCG-3’

使用上述引物，以SEQ ID:NO 3所示的亲本脂肪酶基因为模板扩增CRL1全基因，并同时在两端分别引入EcoR I和Not I酶切位点，PCR扩增体系如下：

PCR反应程序为：98℃预变性5min；98℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸5min；15℃保温。PCR产物用0.8％(w/v)的琼脂糖凝胶进行电泳检测，按照Omega公司的Gel Extraction Kit试剂盒操作指南胶回收结果正确的PCR产物。

使用EcoR I和Not I分别对原始基因和pPICZα载体进行酶切连接，获得含有亲本基因的表达质粒pPICZα-CRL1。

设计引物：

引物2：

F链：(SEQ ID NO.6)

5’-GATCAAAGAACCACTTCCAAGCAAGTAAAACTGGAAAACAATATCGTTTGAGTGAAA-3’

R链：(SEQ ID NO.7)

5’-TTTCACTCAAACGATATTGTTTTCCAGTTTTACTTGCTTGGAAGTGGTTCTTTGATC-3’

突变位点使用底色标记显示。

通过上述引物上分别引入Asp457Phe突变，使用PrimeSTAR^TM HS DNA

Polymerase Premix对全质粒进行扩增，反应体系如下：

PCR反应程序为：98℃预变性5min；98℃变性30s，根据各引物的Tm值设置具体退火温度并退火30s，72℃延伸 5min30s，30个循环；72℃延伸5min。

突变质粒分别转入DH5α，涂布LB平板，转接到含有博来霉素的LB液体培养基中；过夜培养，提取质粒，测序确定引入相关突变,得到表达质粒pPICZα-Asp457Phe。

(2)携带突变体基因的质粒转化毕赤酵母GS115得到基因工程菌的方法。

将表达质粒pPICZα-Asp457Phe经限制性内切酶Sac I线性化后，电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞，将其均匀地涂布在含有博来霉素抗性的YPDS平板上，28℃恒温静置培养至有单菌落产生，将YPDS平板上长出的酵母单菌落用灭过菌的牙签挑至含有罗丹明B的BMMY酶活检测平板中，并倒置于28℃恒温培养箱中静置培养24h后，每隔24h向培养皿盖上加入250μL无水甲醇，诱导3-4d，观察并记录重组菌株在检测平板上水解圈出现的时间与大小，最终获得能分泌出具有活性的目的蛋白的各突变体菌株。

(3)发酵基因工程菌，得到纯化后的突变体脂肪酶活性组分

将PCR验证正确的重组工程菌接种于5mL YPD液体培养基中，28℃、200rpm震荡培养20h，以此达到活化菌株的目的。以4.0％(v/v)的接种量接到装有50mL BMGY生长培养基(初始pH为7.5)的锥形瓶中，28℃、200rpm恒温震荡培养20h至OD₆₀₀为2-6，离心收集菌体，用BMMY发酵培养基稀释至OD₆₀₀为1，每隔24h加入1.0％(v/v)无水甲醇，诱导96h后收集发酵上清液。

将发酵上清液经过10KD超滤膜浓缩，通过Ni-NTA方法梯度洗脱，在NTA-500洗脱液中可以得到较纯净的目的蛋白。将此溶液通过超滤管浓缩提高蛋白浓度，再置入0.05M PB缓冲液进行透析去除咪唑并置换缓冲液，最终得到测定Tm值所需蛋白溶液样品。

(4)验证所述脂肪酶突变体的热稳定性，得到热稳定性提高的褶皱假丝酵母脂肪酶突变体。

将20μL蛋白溶液与5μL合适浓度的

Orange染料进行混合，使用StepOnePlus^TM荧光定量PCR仪测定Melt curve曲线，将荧光强度对温度求导数，导数最大值所对应的温度即为蛋白的Tm值。通过测定，突变体蛋白的Tm值比原始蛋白提高9.4℃(如图1所示)。

脂肪酶活力的测定方法为pNPP法(Pencreach G et al.Enzyme and MicrobialTechnol.1996,18:417-422.)。酶活的定义为标准反应条件下每分钟产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个脂肪酶水解酶活国际单位。将0.25U酶液分别于30℃-60℃测定酶活力，以最高酶活为100％，其他折算成相对酶活百分比。酶活最高所对应的温度即为酶的最适温度，亲本脂肪酶与突变脂肪酶最适温度测定结果如图2。

将原始菌和突变菌的蛋白溶液分别在50℃下保存不同时间后，测定其残余酶活(如图3所示)。在50℃下，原始菌在5min左右酶活下降一半，而突变菌在温浴26min后，仍保留有52％的酶活力，当温浴30min后，酶活力下降得更为缓慢，温浴60min后依旧保留有40％的酶活力。通过比较50℃下野生型重组CRL1T_1/2的测定曲线，得出热稳定性突变体Asp457Phe的T_1/2是原始菌株的6.5倍。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中科技大学

<120> 一种褶皱假丝酵母脂肪酶以及脂肪酶基因

<130> 无

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 534

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Pro Thr Ala Thr Leu Ala Asn Gly Asp Thr Ile Thr Gly Leu Asn

1 5 10 15

Ala Ile Ile Asn Glu Ala Phe Leu Gly Ile Pro Phe Ala Glu Pro Pro

20 25 30

Val Gly Asn Leu Arg Phe Lys Asp Pro Val Pro Tyr Ser Gly Ser Leu

35 40 45

Asp Gly Gln Lys Phe Thr Ser Tyr Gly Pro Ser Cys Met Gln Gln Asn

50 55 60

Pro Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Asn Leu Pro Lys Ala Ala Leu Asp Leu

65 70 75 80

Val Met Gln Ser Lys Val Phe Glu Ala Val Ser Pro Ser Ser Glu Asp

85 90 95

Cys Leu Thr Ile Asn Val Val Arg Pro Pro Gly Thr Lys Ala Gly Ala

100 105 110

Asn Leu Pro Val Met Leu Trp Ile Phe Gly Gly Gly Phe Glu Val Gly

115 120 125

Gly Thr Ser Thr Phe Pro Pro Ala Gln Met Ile Thr Lys Ser Ile Ala

130 135 140

Met Gly Lys Pro Ile Ile His Val Ser Val Asn Tyr Arg Val Ser Ser

145 150 155 160

Trp Gly Phe Leu Ala Gly Asp Glu Ile Lys Ala Glu Gly Ser Ala Asn

165 170 175

Ala Gly Leu Lys Asp Gln Arg Leu Gly Met Gln Trp Val Ala Asp Asn

180 185 190

Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Thr Lys Val Thr Ile Phe Gly Glu

195 200 205

Ser Ala Gly Ser Met Ser Val Met Cys His Ile Leu Trp Asn Asp Gly

210 215 220

Asp Asn Thr Tyr Lys Gly Lys Pro Leu Phe Arg Ala Gly Ile Met Gln

225 230 235 240

Ser Gly Ala Met Val Pro Ser Asp Ala Val Asp Gly Ile Tyr Gly Asn

245 250 255

Glu Ile Phe Asp Leu Leu Ala Ser Asn Ala Gly Cys Gly Ser Ala Ser

260 265 270

Asp Lys Leu Ala Cys Leu Arg Gly Val Ser Ser Asp Thr Leu Glu Asp

275 280 285

Ala Thr Asn Asn Thr Pro Gly Phe Leu Ala Tyr Ser Ser Leu Arg Leu

290 295 300

Ser Tyr Leu Pro Arg Pro Asp Gly Val Asn Ile Thr Asp Asp Met Tyr

305 310 315 320

Ala Leu Val Arg Glu Gly Lys Tyr Ala Asn Ile Pro Val Ile Ile Gly

325 330 335

Asp Gln Asn Asp Glu Gly Thr Phe Phe Gly Thr Ser Ser Leu Asn Val

340 345 350

Thr Thr Asp Ala Gln Ala Arg Glu Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Val His

355 360 365

Ala Ser Asp Ala Glu Ile Asp Thr Leu Met Thr Ala Tyr Pro Gly Asp

370 375 380

Ile Thr Gln Gly Ser Pro Phe Asp Thr Gly Ile Leu Asn Ala Leu Thr

385 390 395 400

Pro Gln Phe Lys Arg Ile Ser Ala Val Leu Gly Asp Leu Gly Phe Thr

405 410 415

Leu Ala Arg Arg Tyr Phe Leu Asn His Tyr Thr Gly Gly Thr Lys Tyr

420 425 430

Ser Phe Leu Ser Lys Gln Leu Ser Gly Leu Pro Val Leu Gly Thr Phe

435 440 445

His Ser Asn Asp Ile Val Phe Gln Phe Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Ser

450 455 460

Leu Ile Tyr Asn Asn Ala Phe Ile Ala Phe Ala Thr Asp Leu Asp Pro

465 470 475 480

Asn Thr Ala Gly Leu Leu Val Lys Trp Pro Glu Tyr Thr Ser Ser Ser

485 490 495

Gln Ser Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Asn Ala Leu Gly Leu Tyr Thr

500 505 510

Gly Lys Asp Asn Phe Arg Thr Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Phe Ser Asn

515 520 525

Pro Pro Ser Phe Phe Val

530

<210> 2

<211> 1602

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcccctactg ctactcttgc taacggtgac actatcacag gtcttaacgc tattatcaac 60

gaagcctttt tgggtattcc ttttgccgaa ccacctgttg gtaatcttag attcaaggat 120

ccagtccctt actccggatc attggacggt caaaaattca cttcttatgg accatcttgt 180

atgcaacaga accctgaggg tacatacgaa gagaatttgc caaaggctgc cttggatctt 240

gttatgcagt ccaaagtttt tgaagctgtc tctccttctt ccgaggattg cttgacaatt 300

aacgttgtca gaccacctgg aaccaaggcc ggtgcaaatc ttccagtcat gttgtggatc 360

tttggtggag gtttcgaagt tggaggtacc tctacttttc cacctgccca aatgattact 420

aagtccatcg caatgggtaa acctattatc catgtttcag tcaactatag agtttcaagt 480

tggggattct tggctggaga tgaaattaag gccgagggat ctgctaacgc cggtcttaaa 540

gaccaaagat tgggtatgca gtgggttgct gataatattg cagcttttgg aggtgaccca 600

acaaaggtca ccatcttcgg agagtctgct ggtagtatgt ctgttatgtg tcacattttg 660

tggaacgatg gagacaatac ttacaagggt aaaccattgt ttagagctgg aatcatgcaa 720

tctggtgcaa tggttccttc tgatgctgtt gatggaatct acggtaacga aatcttcgat 780

ttgcttgctt ctaatgccgg atgtggttcc gcctcagaca aattggcatg ccttagagga 840

gtttcttccg atacattgga ggacgcaact aacaatacac caggttttct tgcttactca 900

agtttgagac tttcttattt gccaagacct gatggtgtta atattactga tgacatgtac 960

gctttggtca gagagggaaa gtatgccaac atccctgtta ttatcggaga tcagaatgac 1020

gagggaactt tctttggtac atcttctttg aacgtcacta cagatgcaca agctagagaa 1080

tactttaaac agtctttcgt tcatgcatca gatgctgaga ttgacacctt gatgactgct 1140

tatccaggag atattacaca aggttctcct tttgacaccg gtatcttgaa cgcccttact 1200

ccacagttca aaagaatttc tgcagttttg ggagatcttg gttttactct tgctagaaga 1260

tacttcttga accattacac aggaggtacc aagtactcct tcttgtctaa acaattgtct 1320

ggacttcctg tcttgggtac ttttcactca aacgatattg ttttccagtt ttacttgctt 1380

ggaagtggtt ctttgatcta caacaatgcc tttatcgcct tcgcaaccga tttggaccca 1440

aacactgctg gattgcttgt taagtggcct gaatacacct caagttctca atctggtaac 1500

aatttgatga tgatcaacgc tttgggactt tatactggta aagataactt tagaactgct 1560

ggatacgacg ctctttttag taacccacct tctttctttg tc 1602

<210> 3

<211> 1602

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcccctactg ctactcttgc taacggtgac actatcacag gtcttaacgc tattatcaac 60

gaagcctttt tgggtattcc ttttgccgaa ccacctgttg gtaatcttag attcaaggat 120

ccagtccctt actccggatc attggacggt caaaaattca cttcttatgg accatcttgt 180

atgcaacaga accctgaggg tacatacgaa gagaatttgc caaaggctgc cttggatctt 240

gttatgcagt ccaaagtttt tgaagctgtc tctccttctt ccgaggattg cttgacaatt 300

aacgttgtca gaccacctgg aaccaaggcc ggtgcaaatc ttccagtcat gttgtggatc 360

tttggtggag gtttcgaagt tggaggtacc tctacttttc cacctgccca aatgattact 420

aagtccatcg caatgggtaa acctattatc catgtttcag tcaactatag agtttcaagt 480

tggggattct tggctggaga tgaaattaag gccgagggat ctgctaacgc cggtcttaaa 540

gaccaaagat tgggtatgca gtgggttgct gataatattg cagcttttgg aggtgaccca 600

acaaaggtca ccatcttcgg agagtctgct ggtagtatgt ctgttatgtg tcacattttg 660

tggaacgatg gagacaatac ttacaagggt aaaccattgt ttagagctgg aatcatgcaa 720

tctggtgcaa tggttccttc tgatgctgtt gatggaatct acggtaacga aatcttcgat 780

ttgcttgctt ctaatgccgg atgtggttcc gcctcagaca aattggcatg ccttagagga 840

gtttcttccg atacattgga ggacgcaact aacaatacac caggttttct tgcttactca 900

agtttgagac tttcttattt gccaagacct gatggtgtta atattactga tgacatgtac 960

gctttggtca gagagggaaa gtatgccaac atccctgtta ttatcggaga tcagaatgac 1020

gagggaactt tctttggtac atcttctttg aacgtcacta cagatgcaca agctagagaa 1080

tactttaaac agtctttcgt tcatgcatca gatgctgaga ttgacacctt gatgactgct 1140

tatccaggag atattacaca aggttctcct tttgacaccg gtatcttgaa cgcccttact 1200

ccacagttca aaagaatttc tgcagttttg ggagatcttg gttttactct tgctagaaga 1260

tacttcttga accattacac aggaggtacc aagtactcct tcttgtctaa acaattgtct 1320

ggacttcctg tcttgggtac ttttcactca aacgatattg ttttccagga ctacttgctt 1380

ggaagtggtt ctttgatcta caacaatgcc tttatcgcct tcgcaaccga tttggaccca 1440

aacactgctg gattgcttgt taagtggcct gaatacacct caagttctca atctggtaac 1500

aatttgatga tgatcaacgc tttgggactt tatactggta aagataactt tagaactgct 1560

ggatacgacg ctctttttag taacccacct tctttctttg tc 1602

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgctcgagc atcatcacca tcaccacgcc cctactgcta ctctt 45

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttgcggccgc ttagacaaag aaagaaggtg ggttactaaa aagagcg 47

<210> 6

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gatcaaagaa ccacttccaa gcaagtaaaa ctggaaaaca atatcgtttg agtgaaa 57

<210> 7

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tttcactcaa acgatattgt tttccagttt tacttgcttg gaagtggttc tttgatc 57

Claims

1.一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，其特征在于，所述脂肪酶突变体为亲本褶皱假丝酵母脂肪酶LIP1的氨基酸序列在氨基酸取代位置发生突变的突变体，采用“原始氨基酸/位置/替换氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸，所述脂肪酶突变体为Asp457Phe；

所述脂肪酶突变体的序列为由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2.一种脂肪酶突变体基因，其特征在于，其为用于编码权利要求1所述的脂肪酶突变体的基因。

3.如权利要求2所述的脂肪酶突变体基因，其特征在于，所述脂肪酶突变体基因的序列为由SEQ ID No.2所示的基因序列。

4.一种用于构建如权利要求1所述的脂肪酶突变体的引物对，其特征在于，其包括核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的上游引物，以及核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的下游引物。