CN116445440B - 黏性聚羟基脂肪酸酯及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种黏性聚羟基脂肪酸酯及其制备和应用。相对于传统技术，本申请具有如下有益效果：本申请提供具有PHA聚合酶PhaC61‑3的突变体的假单胞菌，发酵该假单胞菌能够生产新型的黏性聚羟基脂肪酸酯，为可降解制品的制备提供新材料。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种黏性聚羟基脂肪酸酯及其制备和应用。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯（PHA）是由很多微生物合成的一种胞内聚酯，在生物体内主要是作为碳源和能源的贮藏性物质而存在，它具有类似与合成塑料的物化特性及合成塑料所不具备的生物可降解性、生物相容性、光学活性、压电性、气体相隔性等许多优秀性能。聚羟基脂肪酸酯在生物可降解的包装材料、组织工程材料、缓释材料、电学材料以及医疗材料方面有广阔的应用前景。
传统的聚羟基脂肪酸酯，例如CN114480317A、CN114480318A等记载的聚羟基脂肪酸酯的制备方法。然而，传统的聚羟基脂肪酸酯种类有限，还未有黏性聚羟基脂肪酸酯的报道。
有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本申请的目的之一包括提供一种具有PHA聚合酶PhaC61-3的突变体的假单胞菌，发酵该假单胞菌能够生产新型的黏性聚羟基脂肪酸酯。
在本申请的第一方面，提供一种PHA聚合酶PhaC61-3的突变体，所述突变体具有如下氨基酸突变位点：E115T，A261E，R360S，和K457Q。
在本申请的第二方面，提供一种核酸片段，所述核酸编码所述的突变体。
在本申请的第三方面，提供一种重组载体，所述载体包含所述的核酸片段。
在本申请的第四方面，提供一种基因工程化的细菌，所述细菌为大肠杆菌，所述大肠杆菌包含所述的重组载体，或者，所述细菌为假单胞菌，所述假单胞菌的基因组中整合有所述的核酸片段。
在本申请的一些实施例中，所述大肠杆菌为S17-1菌株。
在本申请的一些实施例中，所述假单胞菌为PE1668菌株。
在本申请的第五方面，提供一种黏性聚羟基脂肪酸酯，具有如下所示的结构式：
。
在本申请的第六方面，提供所述的黏性聚羟基脂肪酸酯在制备可降解制品中的应用。
在本申请的第七方面，提供一种可降解制品，包含所述的黏性聚羟基脂肪酸酯。
在本申请的第八方面，提供所述的突变体、所述的核酸片段、所述的重组载体、所述的大肠杆菌在制备所述的黏性聚羟基脂肪酸酯中的应用。
在本申请的第九方面，提供所述的黏性聚羟基脂肪酸酯的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
将所述的假单胞菌接种于发酵培养基中进行发酵培养，收集菌体，提取黏性聚羟基脂肪酸酯。
在本申请的一些实施例中，所述发酵培养基包含0g/L-40g/L葡萄糖、0.1g/L-5g/L10-十一烯酸以及LB培养基。
在本申请的一些实施例中，所述发酵培养基包含10g/L-40g/L葡萄糖、1g/L-3.5g/L 10-十一烯酸以及LB培养基。
在本申请的一些实施例中，发酵培养的条件包括：温度为28℃-42℃，时间为12h-72h，转速为150rpm-300rpm。
相对于传统技术，本申请具有如下有益效果：
本申请提供具有PHA聚合酶PhaC61-3的突变体的假单胞菌，发酵该假单胞菌能够生产新型的黏性聚羟基脂肪酸酯，为可降解制品的制备提供新材料。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同菌株的PHA聚合酶蛋白序列比对；
图2为15-25% 3HU10D单体比例的P（3HB-co-3HU10D）；
图3为30-40% 3HU10D单体比例的P（3HB-co-3HU10D）；
图4为45-50% 3HU10D单体比例的P（3HB-co-3HU10D）；
图5为P（3HB-co-3HU10D）材料的黏性展示；
图6为30-40%3HU10D单体比例的P（3HB-co-3HU10D）材料黏性测试。
实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本申请的第一方面
本申请提供一种PHA聚合酶PhaC61-3的突变体，所述突变体具有如下氨基酸突变位点：E115T，A261E，R360S，和K457Q。
本申请的第二方面
本申请提供一种核酸片段，所述核酸编码所述的突变体。
本申请的第三方面
本申请提供一种重组载体，所述载体包含所述的核酸片段。
本申请的第四方面
本申请提供一种基因工程化的细菌，所述细菌为大肠杆菌，所述大肠杆菌包含所述的重组载体，或者，所述细菌为假单胞菌，所述假单胞菌的基因组中整合有所述的核酸片段。
在本申请的一些实施例中，所述大肠杆菌为S17-1菌株。
在本申请的一些实施例中，所述假单胞菌为PE1668菌株。
本申请的第五方面
本申请提供一种黏性聚羟基脂肪酸酯，具有如下所示的结构式：
。
本申请的第六方面
本申请提供所述的黏性聚羟基脂肪酸酯在制备可降解制品中的应用。
本申请的第七方面
本申请提供一种可降解制品，包含所述的黏性聚羟基脂肪酸酯。
可降解制品例如为包装材料、组织工程材料、缓释材料、电学材料以及医疗材料等。
本申请的第八方面
本申请提供所述的突变体、所述的核酸片段、所述的重组载体、所述的大肠杆菌在制备所述的黏性聚羟基脂肪酸酯中的应用。
本申请的第九方面
本申请提供所述的黏性聚羟基脂肪酸酯的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
将所述的假单胞菌接种于发酵培养基中进行发酵培养，收集菌体，提取黏性聚羟基脂肪酸酯。
在一些实施例中，所述发酵培养基包含0g/L-40g/L葡萄糖、0.1g/L-5g/L 10-十一烯酸以及LB培养基。所述发酵培养基可以包含葡萄糖或者不含有葡萄糖，葡萄糖的浓度（g/L）例如为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40，10-十一烯酸的浓度（g/L）例如为0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5。
在一些实施例中，所述发酵培养基包含10g/L-40g/L葡萄糖、1g/L-3.5g/L 10-十一烯酸以及LB培养基。
在一些实施例中，发酵培养的条件包括：温度为28℃-42℃，时间为12h-72h，转速为150rpm-300rpm。发酵培养的温度（℃）例如为28、30、32、34、36、38、40、42，时间（h）例如为12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72，转速（rpm）例如为150、175、200、225、250、275、300。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
（1）比对不同假单胞菌来源的PHA聚合酶氨基酸序列
将重组假单胞菌PE1668（Li M, Ma Y, Zhang X, Zhang L, Chen X, Ye JW,Chen GQ. Tailor-Made Polyhydroxyalkanoates by Reconstructing PseudomonasEntomophila. Adv Mater. 2021 Oct;33(41):e2102766. doi: 10.1002/adma.202102766. Epub 2021 Jul 28. PMID: 34322928）中的PHA聚合酶（PhaC61-3，来自Pseudomonas sp. 61-3）的蛋白序列导入NCBI Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中进行分析，筛选出同源性高、结构相近、功能相同的菌株：Pseudomonas sp.Irchel 3E20，Pseudomonas sp.H3，Pseudomonas sp. GM17，Pseudomonas sp. SK3，和Pseudomonas sp. SWRI18。使用MEGA 6.0软件及网站https://espript.ibcp.fr对将上述菌株的氨基酸序列及PhaC61-3氨基酸序列在进行比对，具体比对结果如图1所示。
（2）利用定点突变对PHA聚合酶PhaC61-3进行突变
PHA聚合酶PhaC61-3（PE1668菌株）与PhaC61-3（来自菌株Pseudomonas sp. 61-3）原生序列对比只有325和481处存在氨基酸差异，与其他菌株相比，存在较多的差异。针对不同差异，现进行4处氨基酸位点的突变，分别为E115T，A261E，R360S，K457Q。以下将对这4处依次进行引物设计突变，得到所需的基因片段后，并采用T4连接酶将其连接。
①对于E115T突变，利用Snapgene软件设计引物，引物序列如下：
115-F（SEQ ID No.1） ACACAGGACATCAATCGCGCTCACTTCGT
115-R（SEQ ID No.2） GGACAGTTTGCTGTTGCCGATCCAGTC
反应总体积为 50 µL，在 0.2 mL PCR 管中依次加入下列成分：
表1、Q5高保真DNA聚合酶的PCR体系添加表
混匀后瞬时离心，反应参数为：98 ℃变性30 sec； 98 ℃变性10 sec，72 ℃退火30 sec，72 ℃延伸5.5 min，35个循环后72 ℃终延伸2 min。
使用通用性DNA纯化试剂盒（购自天根生化科技有限公司）回收上述基因片段，具体操作根据产品说明书提供的步骤进行。
通过 T4 DNA Ligase（购自New England Biolabs）进行连接，反应总体积为10 µL，在 0.2 mL PCR 管中依次加入下列成分：
表2、T4连接酶的PCR体系添加表
混匀后，瞬时离心，16 ℃过夜连接，获得连接产物1。
②对于A261E突变，将步骤①获得的连接产物1进行如下操作：
Snapgene软件的引物序列及Q5体系的反应参数如下：
261-F（SEQ ID No.3） GAACAGCGTGAGTGGGGTCTGTCGA
261-R（SEQ ID No.4） CTTGGTCGGGTTGCGCCAGCTGA
反应参数：98℃变性30sec；98℃变性10sec，72℃退火30sec，72℃延伸5.5min，35个循环后72℃终延伸2min。
将所得的基因片段采用T4连接酶进行连接，方法同步骤①，最终得到连接产物2。
③对于R360S突变，将步骤②中所得的连接产物2进行如下操作：
Snapgene软件的引物序列及Q5体系的反应参数如下：
360-F（SEQ ID No.5） AGCGACATGGCCAAAGTCTTCGCCTGGA
360-R（SEQ ID No.6） GCCTTCCAGCACGCCGGCCTGATA
反应参数：98℃变性30sec；98℃变性10sec，72℃退火30sec，72℃延伸5.5min，35个循环后72℃终延伸2min。
将所得的基因片段采用T4连接酶进行连接，方法同步骤①，最终得到连接产物3。
④对于K457Q突变，将步骤③中得到的连接产物3进行如下操作：
Snapgene软件的引物序列及Q5体系的反应参数如下：
457-F（SEQ ID No.7） CAGTCTTGCTACAAGTCGGCGCAACTGTTCGG
457-R（SEQ ID No.8） CCAGGGCGTGATGTGATCGTTGGTGCC
反应参数：98℃变性30sec； 98℃变性10sec，72℃退火30sec，72℃延伸5.5min，35个循环后72℃终延伸2min。
将所得的基因片段采用T4连接酶进行连接，方法同步骤①，最终得到连接产物4。
（3）大肠杆菌S17-1感受态细胞的制备
①使用LB平板培养基，用接种环挑取大肠杆菌S17-1（-80℃甘油保藏菌株），在平板上划线，于37℃培养20-24 h；
②从LB平板上挑取的大肠杆菌S17-1单菌落，接种于摇菌管（5mL LB液体培养基）中，37℃振荡培养12h；
③将上述培养物以1%（v/v）的比例接种于150mL锥形瓶（LB液体培养基）中，37℃振荡培养至OD600=0.4-0.5，放置冰上停止培养；
④取上述菌液1mL转入1.5mL离心管中，4000rpm，4℃离心10min，弃去上清；之后按Competent Cell Preparation Kit（Takara公司制备大肠感受态的试剂盒）说明书进行；
⑤冰上将感受态细胞分装成50μL/管，-80℃保存，获得大肠杆菌S17-1感受态细胞；
（4）连接产物转入大肠杆菌S17-1
①取50 μL大肠杆菌S17-1感受态细胞于冰上融化，加入5 μL步骤（2）中四处氨基酸均突变后的最终连接产物4，轻轻混匀，并在冰上放置30分钟；
②将混合产物42℃水浴热激60s，然后迅速将管转移到冰浴中2分钟；
③向混合体系内加入500 μL的灭菌LB液体培养基（不含抗生素），混合后于37℃，220rpm培养1h；
④取200 μL步骤③中的菌液涂布于含有Kan抗性的LB平板，37℃培养16h；
⑤挑取阳性单菌落接种到的含LB液体培养基（5 mL+1‰ Kan）的摇菌管中，37℃，220rpm 过夜培养，通过菌液PCR验证阳性单菌落和送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析后进行序列比对表明重组质粒构建成功。
（5）大肠杆菌S17-1与假单胞菌接合
①取大肠杆菌S17-1和假单胞菌（Pseudomonas entomophila LAC32）菌液各50 μL，将菌液滴在LB的平板上，30℃培养10 h；
②在平板菌苔处用三横三竖进行划线，然后用此枪头在LB平板（含Kan+Cm）涂抹，并在此平板上加入200μL的LB液体培养基，涂布棒涂布后置于30℃培养48 h；
③将平板上长出的阳性单克隆进行划线（LB+Kan平板），30℃培养24 h；
④挑取单菌落接种到含有Kan抗性的摇菌管（5 mL LB液体培养基）中，30℃，220rpm培养12h，重组的假单胞菌命名为PE1668-1，并用50%甘油进行保菌储存于-80℃冰箱。
实施例2：新型、黏性PHA（P（3HB-co-3HU10D））的发酵生产
采用带有质粒的重组假单胞菌PE1668-1进行该新型材料的发酵生产，得到含PHA（P（3HB-co-3HU10D））的湿菌体。
（1）种子液的制备
单克隆：取接种环在超净工作台上将上述重组PE1668-1菌株划线至LB平板（Kan）上，30 ℃活化24 h，待其长出单克隆；
②一级种子液：挑选上述步骤①中单克隆接种于装有5 mL种子培养基（LB+1‰Kan）的摇菌管中，30 ℃，200 rpm培养12 h；
③二级种子液：取上述步骤②中200μL（1%接种，v/v）菌液，接种于装有20 mL种子培养基（LB+1‰ Kan）的 150mL锥形瓶中，30 ℃，200 rpm培养12 h。
（2）发酵液的准备
LB培养基：酵母粉5g/L；胰蛋白胨10 g/L；氯化钠10g/L；
碳源：葡萄糖17-30g/L；10-十一烯酸 1-3.2g/L；
抗生素：卡那霉素（Kan）；
（3）发酵培养
将种子液按5%（v/v）接种于含400mL LB培养基的 2L大摇瓶内；加入顺序依次为1‰ Kan抗生素，不同含量的碳源，种子液。将上述培养体系置于30℃，200 rpm培养48h。
（4）细胞干重及PHA（P（3HB-co-3HU10D））含量的测定
细胞干重（CDW）：将25mL发酵后菌液置于50mL离心管中，8000rpm室温下离心6min，去上清液；去离子水水洗两次；置于-80℃冰箱冻存1h；真空冷冻干燥机冷冻干燥18h；称重，并除以开始的菌液体积得出CDW（g/L）。
PHA（P（3HB-co-3HU10D））含量测定：取称重后的冻干细胞40mg中加入2mL酯化液（包含甲醇、3% (v/v)浓硫酸(98%，w/w)和1g/L苯甲酸）及2mL氯仿，100℃下酯化约4h。PHA标品称25mg采用同样处理为参照。随后使用GC-2014气相色谱仪(日本岛津)测定PHA含量。测试方法是：初始温度维持在80℃，1.5min；第一阶段，温度以30℃/min的速度增加到140℃；第二阶段，以40℃/min的速度增加到240℃，此过程耗时2min；总的分析时间是8min；注射温度为240℃和检测器温度为250℃。
（5）发酵结果
对于不同含量的10-十一烯酸及葡萄糖浓度所产生的发酵结果及PHA（P（3HB-co-3HU10D））含量存在一定的差异，如表3（在表中所有数据均是均值±方差）所示：
表3、不同含量下的10-十一烯酸及葡萄糖的发酵结果
实施例3：新型、黏性PHA（P（3HB-co-3HU10D））的提取及纯化
（1）新型、黏性PHA（P（3HB-co-3HU10D））的提取
①湿菌体的获得：
分别收集实施例2中步骤（3）发酵之后的假单胞菌菌液，将其倒入到50mL离心管内；室温离心6分钟，转速为8000rpm，倒掉上清，尽量不要损失沉淀；随后加入去离子水重悬，然后室温离心6分钟，转速为8000rpm（此过程重复2次）。
假单胞菌细胞的破碎、PHA（P（3HB-co-3HU10D））提取
本过程中破碎细胞壁采用的是水相分离法。即将装有处理好的菌液的烧杯，进行加热。当温度达到50℃后，加入1 mg/mL表面活性剂并用5M的NaOH保持pH在9左右，此过程时间维持15分钟，过程期间不断进行搅拌。
待冷却至室温之后，将混合溶液放入多个50ml离心管内，室温离心6分钟，转速为8000rpm；倒掉上清液（并尽可能的减少沉淀的损失）；加入去离子水30mL，重悬（保证沉淀完全消失），室温离心6分钟，转速为8000rpm，倒掉上清，（此过程重复2次）；将PHA（P（3HB-co-3HU10D））粗产品放入-80℃冰箱冻存0.5h；真空冷冻干燥机冷冻干燥10h；称重。
（2）新型、黏性PHA（P（3HB-co-3HU10D））的纯化
参考文献（ Follonier, S., Riesen, R., & Zinn, M. (2015). Pilot-scaleProduction of Functionalized mcl-PHA from Grape Pomace Supplemented withFatty Acids. Chemical and Biochemical Engineering Quarterly, 29, 113-121.）的方法对得到的PHA材料进行提取和纯化。提取纯化方法为：PHA粗产品先采用二氯甲烷进行萃取，后采用冷甲醇进行沉淀提纯。具体操作为：将称重之后的PHA粗产品按着1g/17ml二氯甲烷比例进行添加二氯甲烷，不断搅拌，之后静置存放3小时；抽滤，滤去滤渣，保留含PHA材料的滤液存于合适体积的烧杯内，在不断搅拌下滴入冰甲醇（甲醇体积/含PHA的二氯甲烷体积比为5:1），可观察到材料析出，静置1小时，抽滤，滤去滤液，保留PHA材料；采用二氯甲烷重新溶解PHA材料，并在真空干燥器内24h，最终得到PHA材料。
（3）新型、黏性PHA（P（3HB-co-3HU10D））含量、质量的测定
①PHA（P（3HB-co-3HU10D））含量的测定：采用气相色谱测定，同实施例2。
②PHA（P（3HB-co-3HU10D））质量的测定：考虑到材料的黏性，在进行纯化时，将材料放置在玻璃皿或者烧杯上进行挥发，材料的质量可以通过质量变化量△m求得。即△m=m总-m0；其中m总：材料和玻璃皿或者烧杯的总质量，m0：玻璃皿或者烧杯的质量。
（4）纯化后的新型、黏性PHA（P（3HB-co-3HU10D））产品量
提纯后的PHA产品量如表4所示。实验序号分别对应于表3中发酵结果（例如表4中的2-1对应表3中的1-1），且表中数据采用均值加方差形式。
表4、提取纯化后的新型、黏性PHA（P（3HB-co-3HU10D））产品量
实施例4：新型、黏性PHA（P（3HB-co-3HU10D））的核磁分析及黏性检测
（1）核磁分析
将实施例3中提取纯化后的PHA（P（3HB-co-3HU10D））材料进行核磁分析，确定各单体的比例。由于不同的原料比对应不同的P（3HB-co-3HU10D）材料比例：
当葡萄糖含量为30-34g/L，10-十一烯酸含量为1-2g/L，此时3HU10D单体可达到15-25%，1HNMR 结果如图2所示。
当葡萄糖含量为20-25g/L，10-十一烯酸含量为2-2.5g/L，此时3HU10D单体可达到30-40%，1HNMR结果如图3所示。
当葡萄糖含量为10-17g/L，10-十一烯酸含量为2.5-3.2g/L，此时3HU10D单体可达到45-50%，1HNMR结果如图4所示。
（2）黏性分析
在实施例3中，纯化后的材料P（3HB-co-3HU10D）具有透明、黏性的特点，如图5 （与实验序号2-3对应）所示，可以清楚发现P（3HB-co-3HU10D）材料的黏性。
黏性检测：取20mg材料均匀涂在一个玻璃片A的一侧；然后用另一个干净玻璃片B将涂有材料的一侧压紧，并确保两玻璃片及中间的材料接触紧密；然后在玻璃片B的另一侧用夹子和橡皮筋悬挂上一个0.1g砝码；组装好后，将这两个玻璃片进行竖直放置，不断的更换砝码的质量，直到玻璃片A和玻璃片B之间出现松动，参见图6，与实验序号2-3对应。
将20mg不同含量3HU10D单体的P（3HB-co-3HU10D）材料进行黏度测试，能承受的最大砝码质量如下（表5）：
表5、不同3HU10D单体比例的P（3HB-co-3HU10D）材料最大耐受质量
数据表明，当3HU10D单体在PHA中的比例越高，其材料的黏性越大，能最大承受的砝码质量越大。当3HU10D单体比例在45%以上时，可最大承受1.67Kg的砝码。
（3）水下黏性分析
①不同载体水下黏度分析：
将实施例3中得到的不同3HU10D比例的PHA材料，进行水下黏度分析。
采用不同黏附载体进行水下黏度测试:取20mg材料均匀涂抹在相同尺寸的玻璃片、金属片、塑料片、胶原膜、PVA膜上；然后将其分别放在含去离子水（室温）的烧杯内，放置时间为0.5小时；然后采用（2）中黏性检测的方法。
将20mg不同含量3HU10D单体的P（3HB-co-3HU10D）材料进行水下黏度测试，能承受的最大砝码质量如下（表6）：
表6、不同3HU10D单体比例的P（3HB-co-3HU10D）材料最大耐受质量
数据表明，对于同一载体，3HU10D单体比例越低，能耐受的砝码重量越小；对于相同的3HU10D单体比例，胶原膜为载体，能承受的砝码重量最大，PVA膜次之，玻璃片的黏性也较大。
②不同温度下进行水下黏度测试：
取20mg材料均匀涂抹在相同尺寸的玻璃片、胶原膜、PVA膜上；然后将其分别放在含不同温度的去离子水的烧杯内，放置时间为0.5小时；然后采用（2）中黏性检测的方法。
不同条件下能承受的最大砝码质量如下（表7）：
表7、不同3HU10D单体比例的P（3HB-co-3HU10D）材料最大耐受质量
数据表明，对于同一载体，相同温度下，3HU10D单体比例越高，能耐受的砝码重量越大；对于相同的3HU10D单体比例，胶原膜为载体，温度为37℃时，能承受的砝码重量最大，PVA膜次之。
SEQ ID No.9：
MSNKNSDDLNRQASENTLGLNPVIGLRGKDLLTSARMVLTQAIKQPIHSVKHVAHFGIELKNVMFGKSKLQPESDDRRFNDPAWSQNPLYKRYLQTYLAWRKELHDWIGNSKLSEQDINRAHFVITLMTEAMAPTNSAANPAAVKRFFETGGKSLLDGLTHLAKDLVNNGGMPSQVDMGAFEVGKSLGTTEGAVVFRNDVLELIQYRPTTEQVHERPLLVVPPQINKFYVFDLSPDKSLARFCLSNNQQTFIVSWRNPTKAQREWGLSTYIDALKEAVDVVSAITGSKDINMLGACSGGITCTALLGHYAALGEKKVNALTLLVTVLDTTLDSQVALFVDEKTLEAAKRHSYQAGVLEGRDMAKVFAWMRPNDLIWNYWVNNYLLGNEPPVFDILFWNNDTTRLPAAFHGDLIEMFKNNPLVRANALEVSGTPIDLKQVTADIYSLAGTNDHITPWKSCYKSAQLFGGKVEFVLSSSGHIKSILNPPGNPKSRYMTSTDMPATANEWQENSTKHTDSWWLHWQAWQAERSGKLKKSPTSLGNKAYPSGEAAPGTYVHER。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (8)
1. PHA聚合酶PhaC61-3的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸突变位点为：E115T，A261E，R360S，和K457Q，所述PHA聚合酶PhaC61-3的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。
2.核酸片段，其特征在于，所述核酸片段编码权利要求1所述的突变体。
3.重组载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2所述的核酸片段。
4.基因工程化的细菌，其特征在于，
所述细菌为大肠杆菌，所述大肠杆菌包含权利要求3所述的重组载体，
或者，
所述细菌为假单胞菌，所述假单胞菌的基因组中整合有权利要求2所述的核酸片段。
5.根据权利要求4所述的基因工程化的细菌,其特征在于，所述大肠杆菌为S17-1菌株，或/和，所述假单胞菌为PE1668菌株。
6.权利要求1所述的突变体、权利要求2所述的核酸片段、权利要求3所述的重组载体、或者权利要求4或者5所述的大肠杆菌在制备黏性聚羟基脂肪酸酯中的应用，
黏性聚羟基脂肪酸酯的结构式如下：
。
7.黏性聚羟基脂肪酸酯的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
将权利要求4或者5所述的假单胞菌接种于发酵培养基中进行发酵培养，收集菌体，提取黏性聚羟基脂肪酸酯，
黏性聚羟基脂肪酸酯的结构式如下：
；
所述发酵培养基包含10g/L-40g/L葡萄糖、1g/L-3.5g/L 10-十一烯酸以及LB培养基。
8.根据权利要求7所述的黏性聚羟基脂肪酸酯的制备方法，其特征在于，发酵培养的条件包括：温度为28℃-42℃，时间为12h-72h，转速为150rpm-300rpm。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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