CN113234764A - 一种γ-聚谷氨酸的异源表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种γ‑聚谷氨酸的异源表达方法，是一种从糖质原料一步法发酵合成不同D/L单体比的γ–PGA的生产工艺，以一株高产L‑Glu的C.glutamicum F343为底盘表达来自于地衣芽孢杆菌的γ–PGA合成酶的基因簇capBCA，合成了以L‑Glu为主(98.06)的γ–PGA。再通过外源添加不同浓度的D‑Glu，合成了γ–D‑PGA占比为2％‑33％的γ–PGA。结果显示，在48h时γ‑PGA的产量达到最高为5.33g/L。此外本发明对产自F343重组菌的γ‑聚谷氨酸的分子量进行了测定，结果显示，其重均分子量是产自地衣芽孢杆菌的天然γ‑聚谷氨酸的重均分子量的1.16倍。本发明成功地构建了聚谷氨酸的外源合成途径，节省了原料和过程控制成本，提高了经济效益，具有很好的工业应用价值和前景。

Description

一种γ-聚谷氨酸的异源表达方法

技术领域

本发明涉及应用合成生物学技术，具体是一种γ-聚谷氨酸的异源表达方法，构建了一株生产γ-聚谷氨酸的谷氨酸棒杆菌，属于合成生物学和发酵工程领域。

背景技术

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体聚合成的生物聚合物，分为γ-L-PGA(仅由L-谷氨酸单体聚合而成)、γ-D-PGA(仅由D-谷氨酸单体聚合而成)、γ-LD-PGA(由D-谷氨酸、L-谷氨酸两种单体聚合而成)。γ-PGA具有水溶性高、良好的生物降解特性、较强的增稠能力等性质，对高金属离子具有优异的吸收性和结合能力。近年来，γ-PGA广泛应用于食品、化妆品、生物医学、环境保护等领域。

已报道的γ-PGA合成方法有化学合成法、肽合成、生物转化和微生物发酵法。与其他方法相比，微生物发酵法具有许多优点，包括廉价的原料、较小的环境污染、较高的天然产物纯度和温和的反应条件。在微生物发酵法中，目前应用到工业生产的主要生产菌株是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，但是两者均为谷氨酸依赖型菌株，在发酵过程中需外源添加谷氨酸作为前体物质。

为解决上述问题，研究人员尝试从自然界中筛选出非谷氨酸依赖型菌株，但均存在γ-聚谷氨酸产量不高、菌株遗传背景不清晰、不易进行基因操作等缺点。任何一种微生物发酵法生产γ-聚谷氨酸都面临两大问题：(1)如何获得稳定生产γ-聚谷氨酸的基因工程菌，(2)如何减少外源谷氨酸的添加量从而降低γ-聚谷氨酸的生产成本。

目前利用芽孢杆菌属发酵生产γ-PGA是其主要生产工艺，但通常获得的γ-PGA的单体以D-Glu为主，限制了其应用的开发。γ-L-PGA的生产菌株较少，一般为极端嗜盐、嗜碱的古细菌，但上述菌株均不易培养。

不同D-Glu/L-Glu单体比(以下简称为D/L单体比)的γ-PGA具有潜在新的应用价值。含有L-Glu单体比高的γ-PGA具有低免疫原性和更好的生物相容性、组织亲和性等性能特点，因此被广泛用作细胞支架材料、保湿剂、分散剂、药物输送剂、医用生物粘合剂等，同时γ-PGA降解形成的L-Glu可以促进细胞生长和组织修复且无毒副作用。含有D-Glu单体比高的γ-PGA因不易降解，更加稳定且可食无毒，广泛用作防冻剂、凝聚剂、增稠剂、金属吸附剂、生物可降解材料等。

通过高产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌为底盘微生物，外源表达来源于地衣芽孢杆菌中γ-聚谷氨酸合成酶基因簇capBCA，实现在不添加外源谷氨酸的条件下，微生物直接利用葡萄糖一步法生成γ-聚谷氨酸目前未见报道。因此，在γ-PGA生产过程中，如何直接获得以L-Glu为主(>90％)的γ-PGA产物，以及如何获得不同D/L单体比的γ-PGA产物，都是本领域急需解决的技术问题。

发明内容

本发明是利用一种非谷氨酸依赖型菌株，生产γ-聚谷氨酸，具体是一种γ-聚谷氨酸的异源表达方法，采用外源法合成不同D/L单体比的γ-聚谷氨酸的方法，以解决上述技术问题。

本发明的第一个目的是提供一种γ-聚谷氨酸的异源表达方法，选用谷氨酸棒杆菌F343(C.glutamicum F343)菌株为底盘微生物，应用合成生物学技术，将地衣芽孢杆菌的γ-聚谷氨酸合成酶基因capBCA在C.glutamicum F343菌株中成功表达，成功构建了产L-Glu菌株即C.glutamicum F343-pZM1-capBCA菌株。该菌株在不添加外源谷氨酸的培养基中可以大量合成以L-Glu为主的γ-聚谷氨酸。在所述C.glutamicum F343 pZM1-capBCA菌株发酵培养过程中外源添加不同浓度的D-Glu，用于合成不同D/L单体比的γ-聚谷氨酸。

所述产γ-聚谷氨酸的构建方法，具体是聚谷氨酸合成酶基因的克隆和异源表达，先提取地衣芽孢杆菌基因组，通过PCR分别扩增出γ-聚谷氨酸合成酶基因capB、capC、capA，再通过同尾酶连接技术得到具有γ-聚谷氨酸合成酶基因簇的重组质粒，转化到感受态细胞C.glutamicum F343中，最终构建了C.glutamicum F343-pZM1-capBCA。

所述γ-聚谷氨酸合成酶基因，在本发明的一种实施方式中，来自于地衣芽孢杆菌，菌株号为ATCC 9945a。

所述同尾酶连接技术，在本发明的一种实施方式中，是一种直接用于路径的新型模块化合成生物学工具ePathBrick。

在本发明的一种实施方式中，所述产L-Glu菌株用于合成以L-谷氨酸为主的γ-聚谷氨酸，其中L-谷氨酸的质量占比为85-98％；最终合成的所述γ-聚谷氨酸中，包括γ-L-PGA和γ-D-PGA，所述γ-D-PGA的含量为2％-33％。

在本发明的一种实施方式中，所述D-Glu的添加浓度为0～6g/L。

所述重组质粒，在本发明的一种实施方式中，是pZM1(Ptac)-capBCA。

所述C.glutamicum F343，即谷氨酸棒杆菌F343，在本发明的一种实施方式中，是一株高产L-谷氨酸的工业菌株，参照Zheng P.,Liu M.,Liu X.D.et al.Genome shufflingimproves thermotolerance and glutamic acid production of corynebacteriaglutamicum[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology,2012,28(3):p.1035-1043.的方法，由基因重组得到，γ-L-PGA的产量可达50g/L。

本发明的第三个目的是提供一种利用表达所述基因工程菌发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，具体是将C.glutamicum F343 pZM1(Ptac)-capBCA从保菌冻存管中吸取2-5μL菌液，在LB-Glu(含卡那霉素25mg/L)平板中划线，培养24h(30℃)。挑单菌落到种子培养基中，于32℃，120rpm往复培养12h，获得工程菌株的种子液。然后，按5％的接种量接入发酵培养基中，32±2℃、120rpm培养1～2h，加入1mM IPTG诱导1～2h后温度调为37±2℃培养96±5h。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，还包括在发酵培养过程中添加尿素。所述尿素添加量是7g/L。

本发明的第二个目的，是提供根据上述方法中构建的C.glutamicumF343 pZM1-capBCA菌株。

本发明的第三个目的，是提供根据上述方法生产得到的γ-聚谷氨酸。

本发明的第四个目的，是提供根据上述方法生产得到的γ-聚谷氨酸在食品(包括未来食品，如作为生物支架用于细胞培养肉)、化妆品、生物医学、环境保护等领域的应用。

本发明的有益效果：(1)构建的菌株不需要外源添加谷氨酸，能够在糖质原料的培养基中成功的合成γ-聚谷氨酸，节省了原料成本，提高了经济效益；(2)使用构建的菌株，能够在37℃的高温下高效合成γ-聚谷氨酸，节省了夏季发酵过程中冷凝水的用量，从而降低了生产成本；(3)通过在发酵过程中诱导表达聚谷氨酸合成酶基因，在发酵在48h时γ-PGA的产量达到最高为5.33g/L。

附图说明

图1为重组质粒pZM1(Ptac)-capBCA的构建过程示意图；

图2为重组质粒pZM1(Ptac)-capBCA的酶切验证示意图，图2(a)为地衣芽孢杆菌的γ-PGA合成酶基因capB/capC/capA的PCR扩增验证示意图，图2(b)为质粒pZM1(Ptac)-capBCA的双酶切的验证示意图；

图3为C.glutamicum F343-pZM1-capBCA发酵评价；

图4为产自C.glutamicum F343-pZM1-capBCA的γ-PGA立体构型；

图5为外源添加D-Glu对γ-PGA的D/L单体比的影响；

图6为γ-PGA的凝胶渗透色谱，图6(a)为Bacillus licheniformis ATCC 9945a所产γ-PGA的凝胶渗透色谱图，图6(b)为重组菌C.glutamicum F343-pZM1-capBCA所产γ-PGA的凝胶渗透色谱图；

图7为发酵过程中重组菌C.glutamicum F343-pZM1-capBCA产γ-PGA的单体比例及分子量的变化，图7(a)为单体比例示意图，图7(b)为分子量的变化示意图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

本发明实施例所使用的各测定分析方法分别如下：

γ-聚谷氨酸的鉴定方法：先将发酵液进行乙醇沉淀，取各个时间段的发酵液50mL，经12000rpm，15min离心，取上清液加入4倍体积的乙醇，4℃低温过夜后，12000rpm，15min离心，收集沉淀物，将此沉淀物37℃过夜干燥，得到黄色粉末状粗样品。再通过透析袋透析除盐，把提取得到的沉淀物加10mL水溶解，12000rpm，15min离心，取上清液，用10mL注射器注入截留分子量20K WD透析袋内，将透析袋放入2L超纯水中，每30分钟换水一次。之后，将透析袋中的样品吸出，冷冻干燥，得淡黄色样品。将纯化后的样品用1H-NMR VARIAN-300核磁共振仪测定，工作频率为299.95MHz，以D2O为溶剂，DSS(4.4-二甲基-4-硅代戊磺酸钠)为内标，在50℃测量，采样时间2s，延迟时间10s。

γ-聚谷氨酸产量测定方法：

样品处理：将发酵液12000rpm离心15min，取上清，稀释适当倍数，用0.45μm过滤膜过滤，取500μL于2mL进样瓶中，待测。使用凝胶渗透色谱柱：TSKgel super Aw 4000、TSKgelsuper Aw 5000。柱温：40℃，进样量50uL。流动相为0.2M Na₂SO₄，用冰醋酸调节流动相pH为4.0左右。检测器为：waters液相RID示差检测器。

残糖、L-Glu含量测定方法：

将在不同时间点所取得的发酵液在12000rpm下离心15min，取上清液稀释至合适倍数，使其葡萄糖和L-谷氨酸含量值在0-1.0g/L的范围内，用生物传感仪测定葡萄糖和L-谷氨酸含量。

生物量的测定方法(紫外可见光光度计)：将各个取样点的样品稀释合适倍数，至OD₆₀₀值为0.2-0.8，量取200μL，在波长600nm处测取吸光度。

种子培养基：玉米浆35，葡萄糖25，K₂HPO₄ 1.5，MgSO₄ 0.6，FeSO₄·7H₂O 0.005，MnCl₂·4H₂O 0.005，尿素2.5(分消灭菌)，pH 6.8-7.0每250mL三角瓶中装液25mL，121℃灭菌20min。

发酵培养基：玉米浆10，葡萄糖120，K₂HPO₄ 1.0，MgSO₄ 0.6，FeSO₄·7H₂O 0.002，MnCl₂·4H2O 0.002，尿素7.0(分消灭菌)，pH 6.8-7.0，每500mL三角瓶装液50mL，121℃灭菌20min。

重组质粒pZM1-capBCA的构建方法：以含有诱导型启动子Ptac的ePathBrick表达质粒pZM1(Ptac)，分别构建了诱导型表达载体pZM1(Ptac)-capB、pZM1(Ptac)-capC、pZM1(Ptac)-capA。随后用酶AvrⅡ、SalI酶切质粒pZM1(Ptac)-capC获得元件Ptac-lacO-RBS-capC-T7(如图1所示)，同时以酶NheI、SalI双酶切获得的线性质粒pZM1(Ptac)-capB为载体，由于NheI与AvrⅡ为一对同尾酶，故用T4 DNA连接酶将上述元件和载体16℃过夜连接，得到重组质粒pZM1(Ptac)-capBC。随后用酶NheI、SalI将质粒pZM1(Ptac)-capBC进行酶切，同时以酶AvrⅡ、SalI对载体pZM1(Ptac)-capA进行酶切得到元件Ptac-lacO-RBS-capA-T7，将线性载体pZM1(Ptac)-capBC与元件Ptac-lacO-RBS-capA-T7 16℃下进行过夜连接得到重组质粒pZM1(Ptac)-capBCA，将重组质粒转化到大肠杆菌JM109后，提取质粒作为模板，并用酶AvrⅡ和SalI进行双酶切验证。两条条带验证结果大小与capBCA理论大小相符(capBCA：3218bp，pZM1-Ptac：8221bp)，为正确重组质粒(如图1所示)。所得质粒经金唯智生物技术有限公司测序，结果正确。将重组质粒电转入C.glutamicum F343中，在含有25μg/L的Kan培养基中进行筛选，挑取转化子进行菌落PCR，验证正确(如图1)。

谷氨酸棒杆菌转化方法：

(1)取单菌落接种至种子培养基中，32℃，120rpm培养过夜；将适量的种子培养物接种于感受态培养基中，使初始OD₆₀₀＝0.3；30℃，120rpm培养使OD₆₀₀＝0.7-0.8，4h左右；将培养基置于冰上10min，将菌液分装到离心管中，离心10min，4000rpm，获得菌株；用25ml冰浴10％甘油洗涤4遍；用1.5ml-2ml 10％甘油悬浮，用冰浴后的1.5mlEp管分装，得到感受态细胞。

(2)电击杯提前放置超净台吹洗，放置冰箱；

(3)取感受态细胞置于冰上融化，加入3-5uLDNA混合，加入电击杯中，1.8kV，5mS电转，电转后立即加入1mL BHIS至电极杯中悬浮；

(4)悬浮后转至1.5mL EP管中，46℃，温育6min；

(5)温育后于30℃，培养2h，使细胞复苏及表达抗性；

(6)温育好后，12000rpm，离心1min，涂布至含有50ug/mL Kan+抗性的LBHIS平板1-2d。

实施例1：诱导型表达载体及工程菌株的构建

以B.licheniformis的基因组为模板，使用对应的引物，如表1中，capB-NdeI-F(SEQ ID NO.1)、capB-BamHI-R(SEQ ID NO.2)、capC-NdeI-F(SEQ ID NO.3)/capC-BamHI-R(SEQ ID NO.4)、capA-NdeI-F(SEQ ID NO.5)、capA-BamHI-R capA-NdeI-F(SEQ ID NO.6)，PCR扩增出带酶切位点的目的基因capB、capA、capC片段。将酶切的目的基因capB片段与双酶切(NdeI、BamHI)线性化的载体pZM1用T4连接酶进行过夜连接，并转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，在含有Kan抗性LB平板上进行筛选，获得的转化子经菌落PCR验证及酶切验证，得到正确的转化子，再用同样的方法将capA、capC分别连接到载体pZM1中。

表1本实施例中用得到的引物

随后用同尾酶技术，具体技术过程如图1所示，将元件Ptac-lacO-RBS-capB-T7、Ptac-lacO-RBS-capC-T7和Ptac-lacO-RBS-capA-T7依次连接到pZM1质粒上，最终得到重组质粒pZM1-(Ptac)-capBCA。

将重组质粒转化到大肠杆菌JM109后，提取质粒作为模板，并用酶AvrⅡ和SalI进行双酶切验证。两条条带大小与capBCA理论大小相符(3500bp)，pZM1-Ptac全长8304bp，如图2所示，条带验证结果与理论大小相符，为正确重组质粒。

将重组质粒电转入C.glutamicum F343中，在含有25μg/L的Kan培养基中进行筛选，挑取转化子进行菌落PCR验证，成功构建重组菌株C.glutamicum F343-pZM1-capBCA。

实施例2：C.glutamicum F343重组菌摇瓶发酵性能检测

将携带载体pZM1(Ptac)-capBCA的基因工程菌C.glutamicum F343(命名为FC0)在上述摇瓶发酵条件下进行发酵。由图3可知，重组菌FC0在24h进入稳定期，生物量OD₆₀₀在15.00左右；同时随着发酵进行，葡萄糖作为唯一碳源被迅速消耗，发酵36h，残糖量为由80g/L下降到28.20g/L，后期残糖稳定在28g/L；发酵液中L-Glu含量随着发酵进行逐渐上升，60h时达到最高，为11.60g/L；发酵过程中胞内的L-Glu被γ-PGA合成酶CapBCA催化生成γ-PGA并排出胞外，在48h时γ-PGA的产量达到最高为5.33g/L。

实施例3：谷氨酸棒杆菌工程菌生产的γ-聚谷氨酸的特性研究

为探究重组菌FC0的立体构型的性质，将纯化得到的γ-PGA经醇沉、冻干、酸水解后，用HPLC检测其L-谷氨酸单体组分，成功将γ-PGA中的L-谷氨酸和D-谷氨酸进行分离。如图4所示，L-Glu先出峰，保留时间在2.2min左右，D-Glu后出峰，保留时间为5.7min左右，两峰可以完全分开。由检测结果可知，由重组菌FC0发酵48h所得的γ-PGA以L型为主，L-谷氨酸单体比例为98.06％(±0.58)，如图7(a)所示。该比例下的γ-DL-PGA在化妆品及药物载体领域具有更为良好的应用效果，但目前生产此比例的生产菌株较少。

实施例4：外源添加D-Glu合成不同D/L单体比的γ-PGA

细胞外的谷氨酸浓度会影响细胞内的谷氨酸水平，从而影响γ-PGA的立体组成。因此在发酵时外源添加不同浓度的D-Glu，从而改变细胞内的D-Glu/L-Glu比例，进而合成不同D/L单体比的γ-PGA，结果如图5所示。随着外源添加D-Glu浓度的提高，合成的γ-PGA中的D-Glu占比也逐渐提高。当添加2、4g/L的D-Glu时，γ-PGA中的D-Glu占比分别为15.71％和28.55％，较对照有明显提高。当D-Glu的浓度大于4g/L时，γ-PGA中的D-Glu占比稳定在30.37-33.52％，提高幅度较小。一方面可能是因为D-Glu对菌体生长具有抑制作用，所以当D-Glu浓度过高时，菌体代谢活力减弱，无法将更多的D-Glu聚合成γ-PGA。另一方面可能是因为γ-PGA合成酶CapBCA在谷氨酸棒杆菌中表达时对L-Glu亲和力较高，对D-Glu的亲和力较弱，所以合成的γ-PGA中L-Glu占比较高。

实施例5：谷氨酸棒杆菌工程菌生产的γ-聚谷氨酸的分子量特性研究

为了探究重组菌FC0的分子量的性质，发酵液需要通过乙醇沉淀、透析袋透析除盐、低温冷冻干燥才能获得γ-PGA冻干品，再采用凝胶渗透色谱法(GPC)分别测定了来自地衣芽孢杆菌和重组菌FC0的γ-PGA的分子量。从图6(a)可知，对照菌株地衣芽孢杆菌生产的γ-PGA，其GPC谱图的出峰时间在11.5min左右，从图6(b)可知，产自重组菌株FC0的γ-PGA的GPC图的出峰时间在10.5min左右，根据凝胶渗透色谱的分子筛原理，分子量大的物质先出峰，因此产自重组菌株FC0的γ-PGA的分子量与对照菌株相比较大。从表2中得知，产自重组菌株FC0的γ-PGA的重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)分别为2.88×106±2.326％Da、1.536×106±8.404％Da，较对照菌株(Bacillus licheniformis)的Mw(1.33×106±1.989％Da)和Mn(1.256×106±2.403％Da)相比分别提高了1.16倍和22.29％，与图6的分析结果一致。除此之外，图6(a)的峰顶对应的出峰时间较图6(b)晚，峰顶处的分子量的大小由Mp表征，结合表2中的数据，分析可知，产自重组菌FC0的γ-PGA的Mp(2.787×106±1.140％Da)较对照菌株的Mp(1.333×106±0.613％Da)提高了1.09倍，与图6(a)、图6(b)的分析结果一致。由FC0生产的γ-PGA的分子量表现出较对照菌株(Bacilluslicheniformis)大，可能因为在芽孢杆菌中存在相关的γ-PGA降解酶基因pgdS，而在谷氨酸棒杆菌中还未被发现。

表2产自B.licheniformis和FC0的γ-PGA分子量

图7(b)为发酵过程中重组菌C.glutamicum F343-pZM1-capBCA产γ-PGA的分子量的变化，从图中可以看出分子量在发酵过程中表现出不同的变化趋势。其变化过程分为三个阶段，第一阶段在8-40h之间，其分子量缓慢降低，由2993kDa下降到1926kDa，第二阶段在48-80h之间，分子量变化相对恒定，维持在3250kDa和4170kDa之间，第三阶段在发酵后期(88-96h)，分子量分别下降到2095kDa、1405kDa。不同时间点上表现出的分子量的变化可能与发酵过程中的溶氧及微生物生长有关，由于γ-PGA是高分子聚合物，因此发酵液较粘稠，粘稠的发酵液影响发酵过程中氧气的扩散和传递，导致菌体的供氧不足，不利于菌体的生长，可能会影响其产γ-PGA的特性，使其在不同时间点上表现出的不同的分子量大小。

综上所述，本发明构建的菌株不需要外源添加谷氨酸，能够在糖质原料的培养基中成功的合成γ-聚谷氨酸，节省了原料成本，提高了经济效益。本发明生产得到的γ-聚谷氨酸可以在食品(包括未来食品，如作为生物支架用于细胞培养肉)、化妆品、生物医学、环境保护等领域进行应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种γ-聚谷氨酸的异源表达方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

aaaactgcag catatgtggg taatgctatt agcctg 36

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

cgcggatccc tagctaacga gctgcttaat cttg 34

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

tatacatatg tttggatcag atttatatat cgc 33

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

cgcggatcct tagattagat agtaagcata cataatgacg 40

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 5

tatacatatg aaaaaacaac tgaactttca gg 32

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 6

cgcggatcct catttgttca ccactccgt 29

Claims (10)

1.一种γ-聚谷氨酸的异源表达方法，其特征在于，将地衣芽孢杆菌的γ-聚谷氨酸合成酶基因capBCA在产L-Glu的菌株C.glutamicum F343中表达，构建工程菌株:C.glutamicum F343pZM1-capBCA菌株，用于合成γ-聚谷氨酸；在所述C.glutamicum F343pZM1-capBCA菌株发酵培养过程中外源添加不同浓度的D-Glu，用于合成不同D/L单体比的γ-聚谷氨酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述工程菌株用于合成以L-谷氨酸为主的γ-聚谷氨酸，其中L-谷氨酸γ–L-PGA的质量占比为85-98％；最终合成的所述γ-聚谷氨酸中，包括γ–L-PGA和γ–D-PGA，其中，所述γ–D-PGA的含量为2-33％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述D-Glu的添加浓度为0～6g/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述合成γ-聚谷氨酸的方法是：将构建的产L-谷氨酸菌株的种子液，接种至发酵培养基，先于32±2℃培养1～2h，再添加IPTG诱导1～2h，最后于37±2℃培养96±5h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述IPTG添加量为1mM，诱导γ-聚谷氨酸合成酶基因的外源表达。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在发酵初期，所述发酵培养基中添加7g/L尿素。

7.如权利要求1-6任一所述方法中构建的C.glutamicumF343 pZM1-capBCA菌株。

8.根据权利要求1-6任一所述方法得到的γ-聚谷氨酸。

9.根据权利要求8所述的γ-聚谷氨酸在食品、化妆品、生物医学、环境保护领域的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述食品包括未来食品，所述γ-聚谷氨酸在未来食品领域的应用包括，所述γ-聚谷氨酸作为细胞支架用于细胞培养肉。

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