CN112175982B - 一种γ-PGA聚合酶基因重组菌株及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种γ‑PGA聚合酶基因重组菌株及其构建方法与应用,是一种从糖质原料一步法发酵合成γ–聚谷氨酸的生产工艺,属于合成生物学和发酵工程领域。本发明将天然生产菌地衣芽孢杆菌的γ‑聚谷氨酸合成酶的基因簇capBCA克隆至一株高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌F343中进行外源表达,在此基础上,利用不同强度的RBS调控元件调控合成酶基因簇各基因的表达水平获得的重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A所生产的γ‑PGA分子量为295.47~28018kDa。本发明成功地构建了聚谷氨酸的外源合成途径,实现理性控制γ‑PGA分子量的目的,节省了原料和过程控制成本,提高了经济效益,拓展了聚谷氨酸的应用范围,具有很好的工业应用价值和前景。
Description
技术领域
本发明涉及应用合成生物学技术,具体是一种γ-PGA聚合酶基因重组菌株及其构建方法与应用技术,通过调节γ-聚谷氨酸合成酶调节其分子量,属于合成生物学和发酵工程领域。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种由L-谷氨酸和D-谷氨酸单体聚合成的生物聚合物,具有水溶性高、良好的生物降解特性、较强的增稠能力等性质,对重金属离子具有优异的吸收性和结合能力。近年来,γ-PGA广泛应用于食品、化妆品、生物医学、环境保护等领域。聚谷氨酸分子量是限制其应用的一个重要因素,例如用于水处理领域的聚谷氨酸分子量需要在150-200kDa左右,而化妆品领域需要80-120kDa左右的聚谷氨酸,医药载体领域则需要低分子量聚谷氨酸,例如,分子量30-60kDa的聚谷氨酸可以用于合成水溶性γ-PGA-紫杉醇偶联物抗肿瘤,11kDa大小的γ-PGA可以促进钙吸收。目前,主要有物理、化学、酶法降解等方法控制其分子量。物理法操作过程简单,但效率较低,产品稳定性较差,化学法引入化学试剂,造成污染,反应条件复杂,产生大量工业废水,而酶解法利用γ-PGA降解酶酶解,步骤繁琐,也不是控制γ-PGA分子量大小的高效方法。
为解决上述问题,相关研究以B.subtilis 168为底盘微生物,异源表达不同来源的γ-PGA合成酶基因,通过微生物发酵法直接合成得到了一定分子量范围的聚谷氨酸。但是其仍然不能达到精确控制γ-PGA分子量,以满足不同应用需求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是在谷氨酸棒杆菌中合成不同分子量的γ-聚谷氨酸。本发明选用高产L-谷氨酸的工业菌株----谷氨酸棒杆菌F343菌株为底盘微生物,应用合成生物学技术,对地衣芽孢杆菌的γ-聚谷氨酸合成酶基因capBCA表达水平单独调控并串联,在Corynebacterium glutamicum F343菌株中成功表达,成功构建了重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A,获得不同产量且不同分子量的γ-聚谷氨酸。
本发明的第一个目的是γ-聚谷氨酸合成酶基因capBCA表达水平单独调控并串联,先提取地衣芽孢杆菌基因组,通过PCR分别扩增出γ-聚谷氨酸合成酶基因capB、capC、capA,选取2种强度的基因调控元件,分别单独调控聚合酶基因capB、capC、capA,再通过同尾酶技术得到串联表达重组质粒,转化到感受态细胞C.glutamicum F343中,最终构建了单独调控聚合酶基因重组菌株。
进一步的,所述γ-聚谷氨酸合成酶基因,在本发明的一种实施方式中,来自于地衣芽孢杆菌,从ATCC购买,菌株号为ATCC 9945a。
进一步的,所述的基因调控元件,在本发明的一种实施方式中,是双顺反子结构标准化的RBS,即BCD-RBS。
进一步的,所述的2种强度,在本发明的一种实施方式中,是低强度BCD-RBS1和高强度BCD-RBS10。
进一步的,所述同尾酶连接技术,在本发明的一种实施方式中,是一种直接用于路径的新型模块化合成生物学工具ePathBrick。
进一步的,所述的串联表达重组质粒,在本发明的一种实施方式中,是pZMI(Ptac)-BCD-R1/R10-capBcapCA、pZMI(Ptac)-capB-BCD-R1/R10-capC-capA、pZMI(Ptac)-capBC-BCD-R1/R10-capA。
本发明的另一个目的是提供一种单独调控聚合酶基因重组菌株,在本发明的一种实施方式中,是Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A。
本发明的另一个目的是提供一种利用表达所述基因工程菌发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。
进一步的,所述方法,在本发明的一种实施方式中,是用于生产不同分子量的γ-聚谷氨酸。
进一步的,所述方法,在本发明的一种实施方式中,是将Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A从保菌冻存管中吸取2-5μL菌液,在LB-Glu(含卡那霉素25mg/L)平板中划线,培养24h(30℃)。挑单菌落到种子培养基中,32℃,120rpm往复培养12h,按5%的接种量接入发酵培养基中,32℃、120rpm培养2h,加入IPTG诱导1h后温度调为37℃培养96h。
本发明的另一个目的是提供所述方法得到的聚谷氨酸。
进一步的,所述聚谷氨酸,在本发明的一种实施方式中,分子量为295.47~28018kDa。
本发明的另一个目的是提供本发明得到的聚谷氨酸在食品、化妆品、生物医学、环境保护领域的应用。
本发明的有益效果:(1)构建的重组菌株能够合成不同产量的γ-PGA,为进一步提高γ-PGA产量提供有效方法;(2)通过单独调控聚谷氨酸合成酶基因,可以合成不同分子量大小的γ-PGA,分子量为295.47~28018kDa。本研究通过高产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌为底盘微生物,外源表达来源于地衣芽孢杆菌中γ-聚谷氨酸合成酶基因簇capBCA,并且通过双顺反子标准化后的核糖体结合位点RBS分别单独调控聚合酶基因capBCA,实现γ-PGA的分子量的精准调控。因此,本发明所提供的方案,对于利用谷氨酸棒杆菌高产不同分子量的γ-聚谷氨酸的研究具有普遍的意义。
附图说明
图1:重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A的菌落PCR验证;
图2:重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A发酵评价之重组菌生长情况;
图3:重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A发酵评价之γ-PGA产量;
图4:利用葡聚糖标准品分子量与峰停留时间绘制的保准曲线图;
图5:重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A所产γ-PGA分子量变化。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例
根据下述实施例,可以更好的理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
下面实施例涉及的测定方法或培养方法如下:
聚谷氨酸产量测定方法:
样品处理:将发酵液12000rpm离心15min,取上清,稀释适当倍数,用0.45μm过滤膜过滤,取500μL于2mL进样瓶中,待测。使用凝胶渗透色谱柱:TSKgel super Aw 4000、TSKgelsuper Aw 5000。柱温:40℃,进样量50μL。流动相为0.2M Na2SO4,用冰醋酸调节流动相pH为4.0左右。检测器为:waters液相RID示差检测器。
生物量的测定方法(紫外可见光光度计):将各个取样点的样品稀释合适倍数,至OD600值为0.2-0.8,量取200μL,在波长600nm处测取吸光度。
种子培养基:玉米浆35g·L-1,葡萄糖25g·L-1,K2HPO4 1.5g·L-1,MgSO4 0.6g·L-1,FeSO4·7H2O 0.005g·L-1,MnCl2·4H2O 0.005g·L-1,尿素2.5g·L-1(分消灭菌),pH6.8-7.0,每250mL三角瓶中装液25mL,121℃灭菌20min。
发酵培养基:玉米浆10g·L-1,葡萄糖120g·L-1,K2HPO4 1.0g·L-1,MgSO4 0.6g·L-1,FeSO4·7H2O 0.002g·L-1,MnCl2·4H2O 0.002g·L-1,尿素7.0g·L-1(分消灭菌),pH6.8-7.0,每500mL三角瓶装液50mL,121℃灭菌20min。
重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A的构建方法:以构建重组菌Cg1BCA为例,以B.licheniformis ATCC9945a基因组为模板,扩增出capB、capC和capA基因片段,长度分别为1179bp、447bp和1167bp,将PCR产物和诱导型载体进行Nde I和BamH I双酶切、连接,得到重组质粒pZM(Ptac)-capB、pZM(Ptac)-capC和pZM(Ptac)-capA。利用引物BCD-R1-F/R扩增出BCD-R1片段,利用Xba I和Nde I进行双酶切,连接到同样用Xba I和NdeI双酶切处理后的pZM(Ptac)-capB质粒上,构建重组质粒pZMI-BCD-R1-capB。对其进行NheI和Sal I双酶切,对pZM(Ptac)-capC进行Avr II和Sal I双酶切,利用Nhe I和Avr II是一对同尾酶,酶切后具有相同的粘性末端,T4连接两段酶切后的片段,连接处的Nhe I和AvrII两酶切位点消失,得到重组片段pZMI-BCD-R1-capB-capC。再利用Nhe I和Sal I双酶切pZMI-BCD-R1-capB-capC,Avr II和Sal I双酶切pZM(Ptac)-capA,T4连接两段酶切产物,得到重组质粒pZMI-BCD-R1-capB-capC-capA(1BCA),重复此方法,构建重组质粒pZMI-BCD-R10-capB-capC-capA(10BCA)、pZMI-capB-BCD-R1/10-capC-capA(B1CA/B10CA)和pZMI-capB-capC-BCD-R1/10-capA(BC1A/BC10A)。转化到C.glutamicum F343中,重复此方法,构建重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A。
谷氨酸棒杆菌转化方法(质粒):(1)取单菌落接种至种子培养基中,32℃,120rpm培养过夜;将适量的种子培养物接种于感受态培养基中,使初始OD600=0.3;30℃,120rpm培养使OD600=0.7-0.8,4h左右;将培养基置于冰上10min,将菌液分装到离心管中,离心10min,4000rpm,获得菌株;用25ml冰浴10%甘油洗涤4遍;用1.5mL-2mL10%甘油悬浮,用冰浴后的1.5mL Ep管分装,得到感受态细胞。(2)电击杯提前放置超净台吹洗,放置冰箱;
(3)取感受态细胞置于冰上融化,加入3-5μL DNA混合,加入电击杯中,1.8kV,5mS电转,电转后立即加入1mL BHIS至电极杯中悬浮;(4)悬浮后转至1.5mL EP管中,46℃,温育6min;(5)温育后于30℃,培养2h,使细胞复苏及表达抗性;(6)温育好后,12000rpm,离心1min,涂布至含有50μg/mL Kan+抗性的LBHIS平板1-2d。
实施例1:单独调控聚合酶基因的重组菌株的构建
利用NCBI查找来自B.licheniformis菌株的γ-PGA聚合酶基因capB、capC、capA,设计包含Nde I和BamH I酶切位点的扩增引物(如表1,序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.6所示),按照上述重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A的构建方法,PCR扩增、双酶切、连接、转化和验证构建重组质粒pZMI(Ptac)-capB、pZMI(Ptac)-capC和pZMI(Ptac)-capA。然后利用同尾酶Avr II和Nhe I,对要串联的两个基因片段分别进行Nhe I和Sal I、Avr II和Sal I进行双酶切、连接、转化构建基因串联表达重组质粒,转化到C.glutamicum F343,在含有25μg/L的Kan培养基中进行筛选,挑取转化子进行菌落PCR,验证正确(如图1),重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A构建成功。图1中,M:DNAMarker;1:重组菌Cg 1BCA;2:重组菌Cg 10BCA;3:重组菌Cg B1CA;4:重组菌Cg B10CA;5:重组菌Cg BC1A;6:重组菌Cg BC10A,在3000bp左右有明显条带,这与各重组质粒中多片段总长长度相一致,表明在C.glutamicum F343中利用双顺反子结构改造后的不同强度RBS单独调控γ-PGA聚合酶基因表达的重组菌株构建成功。
表1本研究中用得到的引物
实施例2:重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A摇瓶发酵性能检测
将重组菌株Cg 1BCA和Cg 10BCA、Cg B1CA和Cg B10CA、Cg BC1A和Cg BCA10A按照上述谷氨酸棒杆菌转化方法(质粒)方法进行摇瓶发酵,评价其发酵特性,以没有RBS调控的重组菌C.glutamicum pZMI-capBCA(Cg BCA)作为对照菌株。每隔4h对发酵液进行取样用于菌体生长、γ-PGA产量及生物量的测定,结果如图2、3所示。
(1)重组菌生物量比较
根据BCD-RBS的强度来比较各重组菌生长情况,由图2可以发现,重组菌Cg BC1A生长最佳,在24h其生物量达到了12.36,1BCA菌体生物量次之与之相近(OD600 11.88),第三为BC10A(OD600 9.33)。
首先,从整体上比较BCD-R1调节组和BCD-R10调节组的生物量,可以看出,利用BCD-R1调节各聚合酶强度后的重组菌1BCA、B1CA和BC1A生长状况都优于BCD-R10调节后的各重组菌10BCA、B10CA和BC10A,其中1BCA和10BCA菌体生物量差异最大;这可能是因为BCD-R10元件强度较高,各聚合酶的高强度表达水平给菌体生长带来负担。
其次,进一步的,单从BCD-R1对capB、capC和capA不同基因片段的调节效果进行比较,调节效果依次为:BC1A(OD600 12.36)>1BCA(OD600 11.88)>B1CA(OD600 7.63),其中,BC1A和1BCA的促进作用明显,而最低的B1CA(OD600 7.63)则低于对照菌株BCA生物量(OD6008.71),生长最佳的BC1A菌体生物量较对照菌株BCA生物量(OD600 8.71)提高42%,较B1CA(OD600 7.63)提高了62%。另一方面,从BCD-R10对capB、capC和capA不同基因片段的调节效果进行比较,也是BC10A(OD600 9.33)>10BCA(OD600 7.27)>B10CA(OD600 7.24)的变化趋势,也符合上述分析。
最后,进一步分析capB、capA、capC经BCD-R1、BCD-R10调节后的结果可以看出,不同于capB、capA用BCD-R1、BCD-R10调节后生物量差异明显,尤其是用BCD-R1调节后有明显的促进效果;capC无论是经BCD-R1或BCD-R10调节后,重组菌Cg B1CA和Cg B10CA的生长状况都较弱,24h菌体生物量OD600都只有7左右,低于对照菌株BCA的生物量。
可以看出,γ-PGA聚合酶capB、capC和capA表达强度的调控对γ-PGA的合成具有不同的影响,这可能是与γ-PGA各聚合酶的主要结构和功能有关。研究发现pgsBCA(与capBCA同源)具有跨膜结构,Ashiuchi等人认为pgsB(与capB同源)存在酰胺连接酶结构,其与高度疏水性细胞膜蛋白pgsC紧密联系,具有谷氨酸依赖的ATP酶活性,共同构成复合酶的催化活性位点,而pgsA属于A1型锚定蛋白,位于细胞膜外侧,pgsBCA复合酶通过其定地锚定在细胞膜中,pgsA可以有效地从酶的活性位点上移除γ-PGA延长链以助于单体谷氨酸的聚合,负责γ-PGA的延伸以及转运。
综上,从重组菌生物量比较结果可以得出,将capB、capA使用BCD-R1调节后得到的重组菌株能获得相对更佳的生物量结果。
(2)重组菌γ-PGA产量比较
各重组菌γ-PGA产量的结果如图3所示,生长状况最好的重组菌Cg BC1A产量明显高于其他重组菌,36h产量达到最大4.03g/L,这较对照菌株Cg BCA(1.04g/L)提高了近4倍。重组菌Cg BC10A的γ-PGA产量次之,36h能达到1.68g/L。由此说明,与对照菌株相比,改变capA前基因调控元件中的RBS,不管是调高了其表达水平,亦或是调低,对于γ-PGA的产量都有促进作用。这与上面第(1)点中Cg BC1A和Cg BC10A生物量都较高、菌株生长较佳是对应的。
与capA现象相反的是,通过更换不同强度的RBS,调控capC的表达水平对于其产量有较强的抑制作用,重组菌Cg B1CA和Cg B10CA的γ-PGA最高产量各只有0.14g/L和0.78g/L,这也与上面第(1)点中重组菌Cg B1CA和Cg B10CA的生物量低、菌株生长较弱有关。
而生长状况较好的重组菌Cg 1BCA的γ-PGA产量并不如预期结果,其最高产量只有0.89g/L,低于对照菌株Cg BCA产量14%;而重组菌Cg 10BCA的γ-PGA产量则更低,仅有0.54g/L。与capC相似,聚合酶capB表达水平的调控对γ-PGA积累也存在抑制作用,24h Cg1BCA和Cg 10BCA产量分别为0.89g·L-1和0.54g·L-1,这较对照菌株Cg BCA产量下降14.42%和48.07%。
综合以上对重组菌株摇瓶发酵性能检测结果的分析,可以得出,capBCA对重组菌生长和发酵合成γ-PGA有显著影响,其中,对重组菌生长具有促进作用的重组菌株优选为Cg BC1A和Cg BC10A,进一步优选方式为Cg BC1A。
实施例3:重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A所产γ-PGA分子量变化通过GPC继续对各重组菌重组菌株Cg 1BCA和Cg 10BCA、Cg B1CA和Cg B10CA、Cg BC1A和CgBCA10A发酵合成的γ-PGA分子量进行检测。首先利用葡聚糖标准品分子量与峰停留时间绘制保准曲线,如图4得到函数关系y=-0.739363x+17.3566(R2=0.997567),然后根据重组菌的γ-PGA样品的出峰时间计算其分子量大小。如图5,与对照菌株Cg BCA最大分子量(36h,3.5×103kDa)相比,重组菌株Cg BC1A的分子量有大幅度提高,在48h时能够达到最大分子量约2.8×104kDa;同时,重组菌株Cg B10CA的分子量也有明显提高,在36h达到最大分子量1.4×104kDa。
此外,从图5可以看出,经过不同基因调控后得到的重组菌株Cg 1/10BCA、Cg B1/10CA和Cg BC1/10A所生产的γ-PGA分子量为295.47~28018kDa,包含了低分子量到高分子量的各个范围,适用于不同领域,可根据目标γ-PGA分子量的需求选择不同的基因调控元件,以实现对不同分子量的调控。
综上,本发明提供了一种从糖质原料一步法发酵合成γ–聚谷氨酸的生产工艺,将天然生产菌地衣芽孢杆菌的γ-聚谷氨酸合成酶的基因簇capBCA克隆至一株高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌F343中进行外源表达,所生产的γ-PGA分子量为295.47~28018kDa,有效实现了理性控制γ-PGA分子量的效果,以满足不同应用需求。本发明成功地构建了聚谷氨酸的外源合成途径,节省了原料和过程控制成本,提高了经济效益,拓展了聚谷氨酸的应用范围,具有很好的工业应用价值和前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种获得不同分子量γ-PGA的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
aaaactgcag catatgtggg taatgctatt agcctg 36
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
cgcggatccc tagctaacga gctgcttaat cttg 34
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
tatacatatg tttggatcag atttatatat cgc 33
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
cgcggatcct tagattagat agtaagcata cataatgacg 40
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tatacatatg aaaaaacaac tgaactttca gc 32
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
cgcggatcct catttgttca ccactccgt 29
Claims (4)
1.一种聚合酶基因重组菌株构建方法,其特征在于,在谷氨酸棒杆菌C. glutamicum中串联表达聚谷氨酸合成酶基因簇capBCA的基础上,利用基因表达调控元件单独调控capB、capC、capA基因中任意一个的表达水平,构建单独调控聚合酶基因重组菌株,所述聚谷氨酸合成酶基因簇capBCA选自地衣芽孢杆菌;
所述基因调控元件为双顺反子标准化的RBS,所述双顺反子标准化的RBS为低强度BCD-RBS1或高强度BCD-RBS10。
2.根据权利要求1所述的聚合酶基因重组菌株构建方法,其特征在于,以C. glutamicum F343为感受态细胞。
3.根据权利要求1-2任一所述方法构建的单独调控聚合酶基因重组菌株。
4.一种利用权利要求3所述菌株合成聚谷氨酸的方法,其特征在于,该方法为:将产聚谷氨酸的单独调控聚合酶基因重组菌株的种子液,接种至发酵培养基,先于32℃培养,再添加IPTG低温诱导,最后于37℃培养;所述发酵培养基中含有7 g/L尿素。
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