CN107881140B - 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 - Google Patents
一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107881140B CN107881140B CN201711169481.9A CN201711169481A CN107881140B CN 107881140 B CN107881140 B CN 107881140B CN 201711169481 A CN201711169481 A CN 201711169481A CN 107881140 B CN107881140 B CN 107881140B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- delta
- mdh
- leuconostoc mesenteroides
- ldh
- dts1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 title claims abstract description 258
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 title claims abstract description 39
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 title claims abstract description 39
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 27
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 64
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims abstract description 22
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 79
- 108020000290 Mannitol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 55
- 101710199605 Endoribonuclease Proteins 0.000 claims description 43
- 101710113029 Serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 claims description 43
- 238000003198 gene knock in Methods 0.000 claims description 30
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 27
- 108010001539 D-lactate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 26
- 102100023319 Dihydrolipoyl dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 25
- 102100030011 Endoribonuclease Human genes 0.000 claims description 24
- 108010042194 dextransucrase Proteins 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 claims description 13
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 12
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 abstract description 14
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 abstract description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 12
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 abstract description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 42
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 42
- 239000000047 product Substances 0.000 description 42
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 31
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 108090000156 Fructokinases Proteins 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 18
- 101100490769 Rattus norvegicus Aldh1a1 gene Proteins 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 14
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 14
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 14
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 14
- 108010048202 alternansucrase Proteins 0.000 description 13
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102100023230 Serine/threonine-protein kinase MAK Human genes 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 10
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 9
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N acetyl dihydrogen phosphate Chemical compound CC(=O)OP(O)(O)=O LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 8
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 8
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 108010054377 Mannosidases Proteins 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000512259 Ascophyllum nodosum Species 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 241000186713 Lactobacillus amylovorus Species 0.000 description 3
- 102000001696 Mannosidases Human genes 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N fructose group Chemical group OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 3
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 108700041286 delta Proteins 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N D-F6P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- GACTWZZMVMUKNG-KVTDHHQDSA-N D-mannitol 1-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O GACTWZZMVMUKNG-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101150102768 Dhodh gene Proteins 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 229910009891 LiAc Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710184309 Probable sucrose-6-phosphate hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102400000472 Sucrase Human genes 0.000 description 1
- 101710112652 Sucrose-6-phosphate hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 108010081577 aldehyde dehydrogenase (NAD(P)+) Proteins 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N alpha-D-glucose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N beta-D-fructofuranose 6-phosphate Chemical compound OC[C@@]1(O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009903 catalytic hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 238000006345 epimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229950010772 glucose-1-phosphate Drugs 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-UHFFFAOYSA-N hexane-1,2,3,4,5,6-hexol Chemical compound OCC(O)C(O)C(O)C(O)CO FBPFZTCFMRRESA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01028—D-Lactate dehydrogenase (1.1.1.28)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01255—Mannitol dehydrogenase (1.1.1.255)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01005—Dextransucrase (2.4.1.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
- C12Y207/01004—Fructokinase (2.7.1.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
- C12Y207/11001—Non-specific serine/threonine protein kinase (2.7.11.1), i.e. casein kinase or checkpoint kinase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法，涉及细菌，该菌株是肠膜明串珠菌Δdts1∆D‑ldh∆stpk‑mdh ∆fk‑mdh ∆pat‑mdh（LeuconostocmesenteroidesΔdts1∆D‑ldh∆stpk‑mdh ∆fk‑mdh ∆pat‑mdh）菌株,其在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏日期是2017年10月25日，保藏号是CCTCC No：M2017578。将该菌株以重量百分比1%转接到MRS培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，甘露醇浓度可以达到9.73克/升，蔗糖中果糖部分的转化率97.3%。
Description
技术领域
本发明的技术方案涉及细菌，具体地说是一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及 其应用方法。
背景技术
甘露醇(Mannitol)是一种己六醇，在医药领域、食品领域和塑料领域均得到广泛的应 用。
目前，世界上工业生产甘露醇主要有二种工艺。第一种是海藻提取法：提取1吨甘露 醇约需13～15吨干海带，在生产海藻酸盐的同时，将提碘后的海带浸泡液，经多次提取浓 缩、除去杂质、离子交换、蒸发浓缩、冷却结晶而得；生产过程产生大量废水，能耗高， 污染严重，收率低。第二种是催化加氢法：以蔗糖或葡萄糖为原料，通过水解、差向异构 与酶异构，然后加氢而得；原料来源稳定，生产期限不受限制，成本低，但是其产率较低， 且有山梨醇伴生。
实验室生产甘露醇的方法还有二种。一是酶转化法，酶法氢化须要在体系中加入价格 昂贵的辅酶，不经济。二是微生物发酵法，自然界中能合成甘露醇的微生物种类较多，细 菌、酵母和霉菌中都有一些菌株具有产甘露醇的能力。在乳酸细菌转化甘露醇的过程中， 甘露醇为主要产物，同时产乳酸、乙酸、乙醇和二氧化碳，而不产生其它多元醇等副产物， 因而易于纯化分离及精制，并且条件温和、转化率较高。
很多菌株以果糖为底物发酵产生甘露醇，而明串珠菌将果糖和蔗糖都可以作为底物产 生甘露醇。廉价的蔗糖进入明串珠菌胞内后，分解成1-磷酸葡萄糖和果糖，果糖再转化为 甘露醇，反应步骤相对少；而同型乳酸发酵的乳杆菌中葡萄糖经6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果 糖和1-磷酸甘露醇等中间产物最终转化为甘露醇，反应步骤相对多；明串珠菌的染色体基 因组只有2M左右，故发酵周期只有20小时左右；明串珠菌是耐氧的，故发酵过程中不需 要提供氧气；因此明串珠菌实现大规模工业化生产甘露醇的潜力比较大。
CN201710051539.3公开了一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法，该明串 珠菌突变菌株是葡聚糖蔗糖酶、D-乳酸脱氢酶和乙醛脱氢酶基因敲除的明串珠菌突变菌株， 虽然比原始菌株提高了产量，但还是比较低，不足以应用于生产中。
总之，现有的明串珠菌发酵技术中，以蔗糖为底物产甘露醇的产率仍不够高，还需进一 步提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应 用方法，该肠膜明串珠菌突变菌株是以现有的保藏号是CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体––肠膜明串珠 菌Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)为出发菌，采用分子生物学技术 敲除丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶编码基因、果糖激酶编码基因和乙酰磷酸转移酶编码基因并敲 入甘露醇脱氢酶编码基因，构建为葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨 酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶 基因敲入和乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株， 即保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh (Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株，克服了现有 的明串珠菌发酵技术中以蔗糖为底物产甘露醇的产率仍不够高的缺陷。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌 株，是葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除 并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和乙酰磷酸转移酶 基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株，为肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh Δstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh Δpat-mdh)菌株,其在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017年10月 25日，保藏号是CCTCC No：M2017578，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学。
一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的应用方法，在250毫升三角瓶中，将在中 国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017年10月25日，保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株以重量百分比1％转接到MRS 培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，甘露醇浓度可以达到9.73 克/升，蔗糖中果糖部分的转化率97.3％。
上述一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的应用方法，所述MRS培养基的配制方 法是：将酵母浸粉2克、蔗糖20克、柠檬酸铵2克、乙酸钠5克、K2HPO4 2克、MnSO4·H2O0.039克和水1000毫升用乙酸调pH到6.2，在121℃温度下，灭菌20分钟配制得到MRS培 养基。
上述一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的应用方法，所涉及的原料、试剂和仪 器均由商购获得，所涉及的操作工艺是本领域技术人员能够掌握的。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明具有如下突出的实质性特点和显著进 步：
(1)本发明采用分子生物学技术敲除现有的保藏号是CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体––肠膜明串珠 菌Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1lΔD-ldh)中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶编 码基因、果糖激酶编码基因和乙酰磷酸转移酶编码基因并敲入甘露醇脱氢酶编码基因，构 建为葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并 甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、乙酰磷酸转移酶基 因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株，即保藏号是CCTCC No：M2017578 的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat--mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1 ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株，克服了现有的明串珠菌发酵技术中以蔗糖为底 物产甘露醇的产率仍不够高的缺陷。
(2)将在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017年10月25日， 保藏号是CCTCC M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株以重量百分比1％转接到MRS培养基 中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，检测代谢产物，通过对比试验 证明，该明串珠菌突变菌株的甘露醇产率比原始的保藏号是CCTCCM2016638的肠膜明串珠 菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明 串珠菌Δdts1ΔD-ldh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)提高了9.6％，蔗糖中果糖部 分的转化率提高了8.5％。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体中左右同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有α-淀粉酶标记的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体的琼脂糖凝 胶电泳图。
图4为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体 的琼脂糖凝胶电泳图。
图5为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的通过PCR验证丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。
图6为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建果糖激酶基因同源重组载体中左右同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。
图7为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建果糖激酶基因同源重组载体同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。
图8为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有α-淀粉酶标记的果糖激酶基因同源重组载体的琼脂糖凝胶电泳图。
图9为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的果糖激酶基因同源重组载体的琼脂糖凝胶电 泳图。
图10为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的通过PCR验证果糖激酶基因敲除突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。
图11为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体中左右同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。
图12为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。
图13为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有α-淀粉酶标记的乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体的琼脂糖凝胶电泳 图。
图14为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体的琼脂糖 凝胶电泳图。
图15为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的通过PCR验证乙酰磷酸转移酶基因敲除突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
图1为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体中左右同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。图 中显示左右同源臂：1.左同源臂，2.Marker，3.右同源臂。
图2为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示 重组载体酶切产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双酶切条带。
图3为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有α-淀粉酶标记的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体的琼脂糖凝 胶电泳图。图中显示重组载体酶切产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双酶切条带。
图4为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体 的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示重组载体酶切产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双 酶切条带。
图5为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的通过PCR验证丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。图中显 示：1.以肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh菌株为模板，2.肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-amy 为模板，3.Marker，4.肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh菌株为模板。
图6为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建果糖激酶基因同源重组载体中左右同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示左右同 源臂：1.左同源臂，2.Marker，3.右同源臂。
图7为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建果糖激酶基因同源重组载体同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示重组载体酶切 产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双酶切条带。
图8为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有α-淀粉酶标记的果糖激酶基因同源重组载体的琼脂糖凝胶电泳图。图中 显示重组载体酶切产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双酶切条带。
图9为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的果糖激酶基因同源重组载体的琼脂糖凝胶电 泳图。图中显示重组载体酶切产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双酶切条带。
图10为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的通过PCR验证果糖激酶基因敲除突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示：1.以肠膜 明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh菌株为模板，2.肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-amy为模板，3.Marker，4.肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh菌株为模板。
图11为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体中左右同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示 左右同源臂：1.左同源臂，2.Marker，3.右同源臂。
图12为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体同源臂的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示重组载 体酶切产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双酶切条带。
图13为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有α-淀粉酶标记的乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体的琼脂糖凝胶电泳 图。图中显示重组载体酶切产生的两条条带：1.重组载体双酶切条带，2.Marker。
图14为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的构建中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体的琼脂糖 凝胶电泳图。图中显示重组载体酶切产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双酶切条带。
图15为本发明保藏号是CCTCC No：M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌 株的通过PCR验证乙酰磷酸转移酶基因敲除突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示：1. 以肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh菌株为模板，2.肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh Δstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-amy为模板，3.Marker，4.肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-mdh菌株为模板。
实施例1
构建葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲 除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和乙酰磷酸转移 酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株，具体步骤如下：
第一步，以现有的保藏号是CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh (Leuconostoc mesenteroidesΔdt1ΔD-ldh)为出发菌，构建葡聚糖蔗糖酶、D-乳酸脱氢酶和 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株：
(1.1)肠膜明串珠菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因部分序列的克隆：
以染色体DNA为模板，克隆编码序列长度为1751bp的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh[保藏日期是2016年11月14日，其在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏 编号为CCTCC M2016638](Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠 膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)的丝氨酸/苏氨酸蛋白激 酶基因部分连续序列，具体操作步骤是：
(1.1.1)保藏号是CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明串珠菌ΔdtsΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)的肠膜明串珠菌总DNA的提取：
将在-80℃冻存的保藏号为CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ld1ΔD-ldh (Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)菌株划线于MRS固体平板上，于30℃过夜培养； 从固体平板上挑取一个单菌落接种到5毫升MRS液体培养基中，于30℃，转速为120转/ 分钟的摇床培养过夜；取2毫升的上述培养的菌液以转速为10000转/分钟离心2分钟，收 集菌体；用1毫升双蒸水洗涤菌体两次；将菌体溶于100微升的双蒸水中，吹打混匀；加入100微升的浓度为100毫克/毫升的溶菌酶，37℃水浴1h；加入500微升提取液，轻轻混 匀；于80℃孵育10分钟后，以14000转/分钟离心10分钟，弃上清；加100微升悬浮液， 使DNA溶解；加入等体积即100微升的酚-氯仿，轻轻摇匀，放入4℃冰箱中静置15分钟， 然后4℃，12500转/分钟离心15分钟，把上清液抽提到新的离心管中；再重复一次酚-氯 仿抽提操作；加入2倍体积即200微升的预冷无水乙醇，于4℃冰箱中静置2h；12000转/ 分钟离心20分钟，倒掉上清液；用体积百分比为70％的乙醇清洗1次，12000转/分钟离心 10分钟，倒掉上清液，晾干；将沉淀溶于20微升的TE(Tris-HCl 100毫摩尔/升、EDTA 10 毫摩尔/升，pH 8.0)中。
上述MRS培养基的组成：酵母浸粉3克、蛋白胨10克、牛肉浸粉8克、葡萄糖20克、 柠檬酸铵2克、乙酸钠5克、K2HPO4 2克、MgSO4·7H2O 2克、MnSO4·H2O 0.039克、吐温 80 1.6毫升和水1000毫升，用乙酸调pH到6.2；121℃灭菌20min。固体培养基加1.5％ 的琼脂。
上述提取液的组成：240毫摩尔/升NaOH、2.7毫摩尔/升EDTA、74％乙醇。
上述悬浮液的组成：0.1毫摩尔/升EDTA、50毫摩尔/升Tris-HCl，1％ TritonX-100(pH8.0)，0.5％吐温20。
上述酚-氯仿溶液为用酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1配制成的溶液。
上述TE溶液为用Tris-HCl 100毫摩尔/升和EDTA 10毫摩尔/升配制，pH为8.0。
(1.1.2)PCR扩增丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因：
设计一对引物stpkl：5'-ACGGAATTCTCCTCACTACTTGTTG-3'和stpkr： 5'-ACGGAATTCATGATGCGTCTTGATA-3'，以保藏编号为CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1 ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)的肠膜明串珠菌总DNA为模板，PCR 扩增得到为1751bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pUC19的EcoRI位点上，重 组质粒命名为pUC19-stpk。
(1.1.3)感受态大肠杆菌DH5α的制备和DNA转化：
将在-80℃冻存的大肠杆菌DH5α菌株划线于LB固体平板上，37℃过夜培养；从固体平板上挑取一个单菌落接种到5毫升LB液体培养基中，于37℃以转速为150转/分钟摇床 过夜培养；取0.2毫升上述培养得到的菌液转接到10毫升液体培养基中，于37℃以转速为 150转/分钟振荡培养2～3h至菌液的OD600为0.6；取上述OD600为0.6的菌液1.0毫升加入 到1.5毫升离心管中，冰浴10分钟；于4℃以转速为10000转/分钟离心30秒，弃上清液； 加入1毫升冰冷的0.1摩尔/升CaCl2溶液悬浮细胞，冰浴30分钟；于4℃以转速为10000 转/分钟离心30秒，弃上清液；加入100微升冰冷的0.1摩尔/升CaCl2溶液悬浮细胞，即 为感受态细胞，也即感受态大肠杆菌DH5α。
将重组质粒10微升加入到在上述感受态细胞中，冰浴30分钟；于42℃准确热激90秒； 立即在冰上放置3分钟；加入400微升LB液体培养基，于37℃振荡培养45分钟；将转化的感受态细胞均匀涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上；将平板放置于37℃温箱30分钟，至液体被吸收；倒置平板，于37℃培养12～16h。
挑去单菌落，在含氨苄青霉素的LB培养基中培养，提取质粒，经过琼脂糖凝胶电泳和 测序鉴定。
上述LB液体培养基：酵母浸粉5克，蛋白胨10克，NaCl 10克，蒸馏水1000毫升， pH7.0，121℃灭菌20分钟。固体培养基加1.5％的琼脂。
(1.2)中间带有α-淀粉酶标记的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体的构建：
(1.2.1)设计一对引物stpkl1：5'-CAGGAATTCTGTTGAACTGCTTGAGG-3'和stpkl2：5'-GTCGGATCCGGTACCAGCGTCAGATAGTGTA-3'(与stpkr1互补配对)，以pUC19-stpk为模板，PCR扩增得到为384bp的片段。
(1.2.2)设计一对引物stpkr1：5'-GCTGGTACCGGATCCGACCCAACATAATCTC-3'和stpkr2： 5'-CGCAAGCTTTGTTGACCGGACACCTA-3'，以pUC19-stpk为模板，PCR扩增得到为384bp的片 段。
(1.2.3)将上述(1.2.1)(1.2.2)中得到的2个PCR产物经纯化后混匀，以PCR产 物混合物为模板，通过8轮PCR循环使2个基因片段重叠延伸，然后利用一对引物stpkl1： 5'-CAGGAATTCTGTTGAACTGCTTGAGG-3'和stpkr2：5'-CGCAAGCTTTGTTGACCGGACACCTA-3'再进 行PCR，扩增得到为753bp的片段。
(1.2.4)将上述(1.2.3)中得到的重叠延伸PCR产物和pUC19用EcoRI和HindⅢ进行双酶切后，两者在T4-DNA连接酶的作用下连接，再将连接的产物转化大肠杆菌DH5α感 受态细胞，筛选重组质粒pUC19-stpkqh，即构建为同源重组载体。
(1.2.5)设计一对引物amyl：5'-TTGGTACCTTTGGCGTGATTATCAG-3'和amyr： 5'-TTGGTACCCGAAGGTGAAGTTATAG-3'，以保藏编号为CGMCC1.3395的食淀粉乳杆菌总DNA为 模板，PCR扩增得到为1963bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到同源重组载体 pUC19-stpkqh同源臂中间的KpnI位点上，重组质粒命名为pUC19-stpkqh-amy，即构建为 中间带有α-淀粉酶标记的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体。
(1.3)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基 因失活的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：
将在-80℃冻存的保藏号为CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh (Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)菌株划线于MRS固体平板上，于30℃过夜培养； 从固体平板上挑取一个单菌落接种到5毫升MRS液体培养基中，于30℃以转速为120转/ 分钟摇床培养过夜；以1％转接到MRS含0.48微克/毫升氨苄青霉素的培养基中继续培养， 初始OD600为0.048的保藏编号为CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh (Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh (Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)菌液的OD600达到0.5时收集菌体，用含溶菌酶浓 度为100U/毫升的LiAc-DTT溶液重新悬浮菌体，于30℃孵育20分钟，用冰冷的PBS溶液 洗涤两次，再用50微升冰冷的PBS溶液悬浮菌体，加入5微升上述的同源重组载体质粒 (pUC19-stpkqh-amy)，冰浴10分钟后进行电转化，所用电转化仪为Bio-Rad GenePulser XCellTM，电击参数为电击杯间距0.1cm、1400V、25μF、300Ω、电击时间为4毫秒，然后加入1毫升MRS培养基，复苏3h后，涂布于含MRS固体平板，培养120h后挑取单菌落验 证，以证明从平板上筛选得到葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏 氨酸蛋白激酶基因失活的肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-amy(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-amy)菌株。
设计一对引物stpkyq：5'-GAACTGCTTGAGGAACTAC-3'和stpkyh： 5'-GACCGGACACCTAATTATG-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，上述肠膜明串 珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-amy(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-amy)菌株得到长度为2731bp的扩增产物，而肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh (Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh，保藏编号为CCTCCM2016638)的中间体— —肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)得到长度为831bp 的扩增产物。
上述LiAc-DTT溶液为用100毫摩尔/升LiAc、10毫摩尔/升DTT、0.6摩尔/升蔗糖、10毫摩尔/升Tris-HCl(pH7.5)的溶液；
上述PBS溶液为K2HPO4-KH2PO4 1毫摩尔/升、MgCl2 1毫摩尔/升和蔗糖0.5摩尔/升配 制的溶液，pH为6.9。
(1.4)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基 因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：
(1.4.1)中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组 载体的构建：设计一对引物mdhl：5'-ATGGTACCATTATGCCTCTTCGCCG-3'和mdhr： 5'-ATGGTACCCACGTGATACTGTTGTC-3'，以保藏号为CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1 ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1lΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)总DNA为模板，PCR扩增得到为1236 bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到同源重组载体pUC19-stpkqh同源臂中间的KpnI 位点上，重组质粒命名为pUC19-stpkqh-mdh，即构建为中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒 的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源重组载体。
(1.4.2)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：以电转化法将pUC19-stpkqh-mdh导入到上述(1.3)中得到的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-amy(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-amy)菌株中，筛选获得葡聚糖蔗糖酶基因 敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入 的肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh)菌株。
设计一对引物stpkyq：5'-GAACTGCTTGAGGAACTAC-3'和stpkyh： 5'-GACCGGACACCTAATTATG-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，上述肠膜明串 珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh)菌株得到长度为2004bp的扩增产物，而肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh (Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh，保藏编号为CCTCCM2016638)的中间体— —肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)得到长度为831bp 的扩增产物。
第二步，从肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1 ΔD-ldhΔstpk-mdh)菌株构建葡聚糖蔗糖酶、D-乳酸脱氢酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因 敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠 菌突变菌株，具体步骤如下：
(2.1)肠膜明串珠菌果糖激酶基因部分序列的克隆：
设计一对引物fkq：5'-ACGAAGCTTGAAGCAGGTGGAACGA-3'和fkh： 5'-TGTGAATTCTAGCAACGGGTACGAT-3'，以肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh的染色体为模板，PCR扩增得到为782bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pUC19的HindIII 和EcoRI位点上，重组质粒命名为pUC19-fk。
(2.2)中间带有α-淀粉酶标记的果糖激酶基因同源重组载体的构建
(2.2.1)左同源臂的克隆：设计一对引物fklq：5'-CGGAATTCTTGCGGATCAC-3'和fklh： 5'-TTGGTACCGCGCCATTAACGTCAGT-3'(与fkrq互补配对)，以pUC19-fk为模板，PCR扩增得 到为277bp的片段。
(2.2.2)右同源臂的克隆：设计一对引物fkrq：5'-AATGGCGCGGTACCAAAAGCATCCT-3' 和fkrh：5'-GCAAGCTTCAGCAAAACTT-3'，以pUC19-fk为模板，PCR扩增得到为273bp的片段。
(2.2.3)将上述(2.2.1)(2.2.2)中得到的2个PCR产物经纯化后混匀，以PCR产 物混合物为模板，通过8轮PCR循环使2个基因片段重叠延伸，然后利用一对引物fklq： 5'-CGGAATTCTTGCGGATCAC-3'和fkrh：5'-GCAAGCTTCAGCAAAACTT-3'再进行PCR，扩增得到 为536bp的片段。
(2.2.4)将上述(2.2.3)中得到的重叠延伸PCR产物和pUC19用EcoRI和HindⅢ进行双酶切后，两者在T4-DNA连接酶的作用下连接，再将连接的产物转化大肠杆菌DH5α感 受态细胞，筛选重组质粒pUC19-fkqh，即构建为同源重组载体。
(2.2.5)设计一对引物amyl：5'-TTGGTACCTTTGGCGTGATTATCAG-3'和amyr： 5'-TTGGTACCCGAAGGTGAAGTTATAG-3'，以保藏编号为CGMCC1.3395的食淀粉乳杆菌总DNA为 模板，PCR扩增得到为1963bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到同源重组载体 pUC19-fkqh同源臂中间的KpnI位点上，重组质粒命名为pUC19-fkqh-amy，即构建为中间 带有α-淀粉酶标记的果糖激酶基因同源重组载体。
(2.3)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基 因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因失活的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：
以电击转化法将(2.2.5)中得到的中间带有α-淀粉酶标记的果糖激酶基因同源重组 载体导入到肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh Δstpk-mdh)菌株中，筛选获得葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因失活的肠膜明串珠菌突 变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-amy(LeuconostocmesenteroidesΔdts1 ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-amy)菌株。
设计一对引物fkyq：5'-ACTCAGTAGAGCAAGTCAT-3'和fkyh： 5'-TATCAGGGCGTAAAATCAT-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，上述肠膜明串 珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-amy(Leuconostocmesenteroides Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-amy)菌株得到长度为2513bp的扩增产物，而肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh)菌株得到长度 为743bp的扩增产物。
(2.4)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基 因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串 珠菌突变菌株的构建：
(2.4.1)中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的果糖激酶基因同源重组载体的构建：设 计一对引物mdhl：5'-ATGGTACCATTATGCCTCTTCGCCG-3'和mdhr： 5'-ATGGTACCCACGTGATACTGTTGTC-3'，以保藏号为CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1 ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)总DNA为模板，PCR扩增得到为1236 bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到同源重组载体pUC19-fkqh同源臂中间的KpnI 位点上，重组质粒命名为pUC19-fkqh-mdh，即构建为中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的 果糖激酶基因同源重组载体。
(2.4.2)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明 串珠菌突变菌株的构建建：以电转化法将pUC19-fkqh-mdh导入到上述(2.3)中得到的肠 膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-amy(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh Δstpk-mdhΔfk-amy)菌株中，筛选获得葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝 氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢 酶基因敲入的的肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh (Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh)菌株。
设计一对引物fkyq：5'-ACTCAGTAGAGCAAGTCAT-3'和fkyh： 5'-TATCAGGGCGTAAAATCAT-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，上述肠膜明串 珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh(Leuconostocmesenteroides Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh)菌株得到长度为1786bp的扩增产物，而肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh)菌株得到长度 为743bp的扩增产物。
第三步，从肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh(Leuconostocmesenteroides Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh)菌株构建葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱 氢酶基因敲入、乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌 株，具体步骤如下：
(3.1)肠膜明串珠菌乙酰磷酸转移酶基因部分序列的克隆：
设计一对引物patq：5'-TGTGAATTCTTTTGCTAAGCCTTGT-3'和path： 5'-TGTGAATTCGTGAAGATCCCCGTAT-3'，以肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh的染 色体为模板，PCR扩增得到为995bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pUC19的HindIII和EcoRI位点上，重组质粒命名为pUC19-pat。
(3.2)中间带有α-淀粉酶标记的乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体的构建
(3.2.1)左同源臂的克隆：设计一对引物patlq：5'-CGGAATTCTCGACTTATAATGCTTG-3' 和patlh：5'-TAGGATCCTAGGTACCAAGCGAAGAGCGTTATGT-3'(与patrq互补配对)，以pUC19-pat 为模板，PCR扩增得到为511bp的片段。
(3.2.2)右同源臂的克隆：设计一对引物patrq： 5'-TTGGTACCTAGGATCCTACTTCGCCTTTTTGCAT-3'和patrh： 5'-CGAAGCTTAGGCATTTATGGAACTT-3'，以pUC19-pat为模板，PCR扩增得到为490bp的片段。
(3.2.3)将上述(3.2.1)(3.2.2)中得到的2个PCR产物经纯化后混匀，以PCR产 物混合物为模板，通过8轮PCR循环使2个基因片段重叠延伸，然后利用一对引物patlq： 5'-CGGAATTCTTGCGGATCAC-3'和patrh：5'-GCAAGCTTCAGCAAAACTT-3'再进行PCR，扩增得到 为983bp的片段。
(3.2.4)将上述(3.2.3)中得到的重叠延伸PCR产物和pUC19用EcoRI和HindⅢ进行双酶切后，两者在T4-DNA连接酶的作用下连接，再将连接的产物转化大肠杆菌DH5α感 受态细胞，筛选重组质粒pUC19-patqh，即构建为同源重组载体。
(3.2.5)设计一对引物amyl：5'-TTGGTACCTTTGGCGTGATTATCAG-3'和amyr： 5'-TTGGTACCCGAAGGTGAAGTTATAG-3'，以保藏编号为CGMCC1.3395的食淀粉乳杆菌总DNA为 模板，PCR扩增得到为1963bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到同源重组载体 pUC19-fkqh同源臂中间的KpnI位点上，重组质粒命名为pUC19-patqh-amy，即构建为中间 带有α-淀粉酶标记的乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体。
(3.3)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基 因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、乙酰磷酸 转移酶基因失活的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：
以电击转化法将(3.2.5)中得到的中间带有α-淀粉酶标记的乙酰磷酸转移酶基因同 源重组载体导入到肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh(Leuconostocmesenteroides Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh)菌株中，筛选获得葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶 基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除 并甘露醇脱氢酶基因敲入、乙酰磷酸转移酶基因失活的肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明 串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-amy(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh Δstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-amy)菌株。
设计一对引物patyq：5'-ACATTCTCTTCATTGGCTC-3'和patyh： 5'-GACTTTATGGAACTTTTTG-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，上述肠膜明串 珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-amy(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-amy)菌株得到长度为2964bp的扩增产 物，而肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1 ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh)菌株得到长度为995bp的扩增产物。
(3.4)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基 因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、乙酰磷酸 转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：
(3.4.1)中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体的构 建：设计一对引物mdhl：5'-ATGGTACCATTATGCCTCTTCGCCG-3'和mdhr： 5'-ATGGTACCCACGTGATACTGTTGTC-3'，以保藏号为CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1 ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体——肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdt1ΔD-ldh)总DNA为模板，PCR扩增得到为1236 bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到同源重组载体pUC19-fkqh同源臂中间的KpnI 位点上，重组质粒命名为pUC19-patqh-mdh，即构建为中间带有甘露醇脱氢酶基因表达盒的 乙酰磷酸转移酶基因同源重组载体。
(3.4.2)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、乙酰磷 酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株的构建建：以电转化 法将pUC19-patqh-mdh导入到上述(3.3)中得到的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdh Δfk-mdhΔpat-amy(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-amy)菌 株中，筛选获得葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、乙酰磷 酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的的肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌 Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldh Δstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株。
设计一对引物patyq：5'-ACATTCTCTTCATTGGCTC-3'和patyh： 5'-GACTTTATGGAACTTTTTG-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，上述肠膜明串 珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株得到长度为2237bp的扩增产 物，而肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh(LeuconostocmesenteroidesΔdts1 ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh)菌株得到长度为995bp的扩增产物。
实施例2
肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostocmesenteroides ΔdtslΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株,其在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保 藏，保藏日期是2017年10月25日，保藏号是CCTCC M2017578)，即本发明的一株高产甘 露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的发酵应用，具体步骤如下：
在250毫升三角瓶中，将在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017 年10月25日，保藏号是CCTCC M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdh Δpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株以重量 百分比1％转接到MRS培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，甘 露醇浓度可以达到9.73克/升，蔗糖中果糖部分的转化率97.3％。
上述MRS培养基的配制方法是：将酵母浸粉2克、蔗糖20克、柠檬酸铵2克、乙酸钠 5克、K2HPO4 2克、MnSO4·H2O 0.039克和水1000毫升用乙酸调pH到6.2，在121℃温度下， 灭菌20分钟配制得到MRS培养基。
表1列出了各种明串珠菌发酵产甘露醇的产量，可见本发明的中国典型培养物保藏中 心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017年10月25日，保藏号是CCTCC M2017578的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh Δstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株的甘露醇产率比原始的保藏号是CCTCCM2016638的肠膜 明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔaldh)的中间体—— 肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldh)提高了9.6％，蔗糖中 果糖部分的转化率提高了8.5％。
表1.肠膜明串珠菌发酵产甘露醇的产量(g/L)
表1中，原始菌为未被改造的原始肠膜明串珠菌，Δdts1为葡聚糖蔗糖酶基因敲除的肠 膜明串珠菌，Δdts1Δldh为葡聚糖蔗糖酶基因敲除和D-乳酸脱氢酶基因敲除的肠膜明串珠 菌，Δdts1ΔldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh为葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因 敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘 露醇脱氢酶基因敲入、乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌 突变菌株，即为肠膜明串珠菌Δdts1ΔldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株,其在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)保藏，保藏日期是2017年10月25日，保藏号是CCTCCM2017578)，即本发明的 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株。
上述实施例中，所涉及的原料、试剂和仪器均由商购获得，所涉及的操作工艺是本领 域技术人员能够掌握的，未注明的具体实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验手册》中所述的方法或厂商提供的的方案进行。
序列表
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因中部分序列缺失并在此插入甘露醇脱氢酶基因表达盒的核苷酸序列
<110> 河北工业大学
<120> 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法
<160> 3119
<210> 1
<211> 3119
<212> DNA
<213> 肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)
<400> 1
ttattgactc gaagagctct cagatgtgga actgtccgat gatgtagtac tagaatcctc 60
actacttgtt gaactgcttg aggaactact gctagaacta gaagacgatg aactactact 120
acttgagctc gattgttctg gtccctgtga aatcgtaatt aataaggtgt tatcttttgt 180
aatctttgat ccgccacgga ttgattgact aataacatgg tccttcttaa cagaattgga 240
gtaagtcgta ttaaaattaa cagtgacatc attttgtgat gcccaatttt gaacatcgct 300
ttgtgtgcta cttttagtga agtcagggac agtaatctta accggtcctg ttgagacagt 360
gaaagtcacc tttgtggctg tagggtctac cttcccattg gcattaatag attgagctat 420
aattatgcct gcagctacac tatctgacgc tggtaccgga tccgacatta tgcctcttcg 480
ccgccaacct tcacaacagc cttagatacg acacctaact taccgttaac aaagtcgtca 540
acagtcttat agtctaattc gtgtgacatc aatgcttcaa cattcaactt accagatgat 600
agcagagcca gtgaatcttc aaaggcgtta gggttgataa atgaaccttg aatagttaac 660
tgcttttgga atacttcata agtgttcatt tggaacttgg cgtcaggacc accaacacca 720
aacatcaata cttgagcgcc acgagctgat gcttcaatag cagcttcttg tgtttgtggt 780
agaccaacgg cttcaataat gacatcatat tcaccttcag ggatcttgtc acccttcatt 840
gtgttgtacg tgttctttac gccaaacttt tctttgttca ttgccaactt ttcgtcaaca 900
ataccagcta agtcaacttg gtgaatacca tatgcttgca agatttgaac gaataattcg 960
cccatgaatc catcaccaat taccaaagcc ttttggtaag gggtaacctt caacaattga 1020
ataccgtgaa cggcacatga aattggttca acaacagcag ctgactttaa tgaaacgtta 1080
tcaggaattg gataaacaac agatgcaggt gcagtgaaga attcttcaaa gccaccatca 1140
cgtgtcacac caacagctga caagttttcg cataattcag ggcgtgcagt acggcagtac 1200
ttgcattgtc cacaataaat gttagggtca acagttacgc ggtcaccaac tttaacgtta 1260
gtaacagcag aaccgatttc tgcaacaaca cctgagttct catgaccaag aacgattgga 1320
ggaacagcat cagctgaacc tggcaaacca gcgtatagtg cgtgatcagt tccacaaata 1380
ccagcaaacg ctgtgtgaat caaaacttca tttggcaaaa cctttggacg gtcaatgtcc 1440
tttacttcta atttcttagt tccggttaga acaagtgctt ccatgattaa ttctcctttt 1500
ttgtgacaaa agtaacttac ggtgactatg ctaaaccttt ggcattataa agtcaagtct 1560
caggccaaat taattttcga ttataaggct gttggtgtga taaaataata taagactatg 1620
gaggtatgta atggttgcaa aattaagtga tgtcgcagcg ctagctggtg tttctgtgac 1680
aacagtatca cggctggtac cggatccgac ccaacataat ctccaaaacg cacttttgcc 1740
ttaccagagg aaataaccaa gttgatactg tccccttttt ttacgtcagt tccttcttta 1800
ggcgttgaac gcacaacact gccctttttg atggttgtcg aagttgtcga agtcacacta 1860
ccaacattca atccagcttc ttgtattttc ttttcagcct tggctcttgt taagttggat 1920
aagctcggca cagtgatttg actagcctga atatgaataa acgcaaaaat agcaataata 1980
gcaacaataa aaagcactgc aaaagccaaa attttaggta atttattttc acgatacttg 2040
atgccattgc cccgaagcac acttctaaca taattaggtg tccggtcaac aatttttgcg 2100
atacttttaa cagcgtaacc ttttttacca tactcaatga tcagatcttt tactgatggt 2160
tcctcaggaa cttcctccgg taaaacatta acagaggaaa caccattctt gagctggtct 2220
tgaatttgtt ccatcggaat aatgcgcgtt tcgttttcaa tatccgcagt tggcgcaaat 2280
cgttgttcat ttgaacgacg tggcgataga actgttttta aatcttcagc cataactgag 2340
acatctaaat aacgatcctg tgggttctta gctgtggctt ttaaaataac attttctagt 2400
gcttggggaa ttcttggatc aaaatcacgt actgaaggca tatcagcagt tgcatgtttt 2460
agtgctactg cgaccggcgt atctccttca tacggcactt gcttcgttag catttcatat 2520
agcataacac caagtgcata gatatcagac tttgctgatg ccatgcctcc acgggtttgt 2580
tctggtgaca aataatgaac tgaaccaatc acggtatgtg tctgcgtcaa atcttgctct 2640
gatttagcaa ttgcaatacc gaaatcggta atcttcactt gatcatttct gtcaattaaa 2700
atattttgtg gctttaaatc acgatgaata atacctgcat tatgtgcagc ctgcactgcg 2760
tttaatattt gcatcataat atcaacaact tgttgatatg caattggaaa atgttcacca 2820
atatatgatt taagatttgt accatcaaca tattccatga caatatattg tgaaccttgg 2880
tactcaccaa cgtcgtatac ttggacaata ttgtcattaa tcagttctgt tactgataag 2940
gcctcacgtt gaaagcgttt tgccaaatct acatcatttt tcatatcaag acgcatcatt 3000
ttaaacgtta catcacgatt aagaaattca tcatgcgcca aataaacatt ggccataccg 3060
ccatcgccaa gcgattttat aatacggtat cgattgtcaa ctagtgtatc tggtaacat
果糖激酶基因中部分序列缺失并在此插入甘露醇脱氢酶基因表达盒的核苷酸序列
<110> 河北工业大学
<120>一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法
<160> 1966
<210> 1
<211> 1966
<212> DNA
<213> 肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)
<400> 1
atgggtttat taggagcaat tgaagcaggt ggaacgaagt ttgtggtcgc tgttgcggat 60
cacgattata atattgttga gagaacatca ttccctacac ttgatggtca aaaaacagta 120
gagcaagtca tcgctttttt tgataagttt gacgacatcg acgcaattgg tattgcagct 180
tttggaccaa ttgacattgt agagggatca acaacatatg gtcacgttct agatacacca 240
aaacgcgggt ggtcaggata tgattttctg ggtgcaatga aagactggcg tgatattcct 300
tactattgga ctactgacgt taatggcgcg gtaccaaatt atgcctcttc gccgccaacc 360
ttcacaacag ccttagatac gacacctaac ttaccgttaa caaagtcgtc aacagtctta 420
tagtctaatt cgtgtgacat caatgcttca acattcaact taccagatga tagcagagcc 480
agtgaatctt caaaggcgtt agggttgata aatgaacctt gaatagttaa ctgcttttgg 540
aatacttcat aagtgttcat ttggaacttg gcgtcaggac caccaacacc aaacatcaat 600
acttgagcgc cacgagctga tgcttcaata gcagcttctt gtgtttgtgg tagaccaacg 660
gcttcaataa tgacatcata ttcaccttca gggatcttgt cacccttcat tgtgttgtac 720
gtgttcttta cgccaaactt ttctttgttc attgccaact tttcgtcaac aataccagct 780
aagtcaactt ggtgaatacc atatgcttgc aagatttgaa cgaataattc gcccatgaat 840
ccatcaccaa ttaccaaagc cttttggtaa ggggtaacct tcaacaattg aataccgtga 900
acggcacatg aaattggttc aacaacagca gctgacttta atgaaacgtt atcaggaatt 960
ggataaacaa cagatgcagg tgcagtgaag aattcttcaa agccaccatc acgtgtcaca 1020
ccaacagctg acaagttttc gcataattca gggcgtgcag tacggcagta cttgcattgt 1080
ccacaataaa tgttagggtc aacagttacg cggtcaccaa ctttaacgtt agtaacagca 1140
gaaccgattt ctgcaacaac acctgagttc tcatgaccaa gaacgattgg aggaacagca 1200
tcagctgaac ctggcaaacc agcgtatagt gcgtgatcag ttccacaaat accagcaaac 1260
gctgtgtgaa tcaaaacttc atttggcaaa acctttggac ggtcaatgtc ctttacttct 1320
aatttcttag ttccggttag aacaagtgct tccatgatta attctccttt tttgtgacaa 1380
aagtaactta cggtgactat gctaaacctt tggcattata aagtcaagtc tcaggccaaa 1440
ttaattttcg attataaggc tgttggtgtg ataaaataat ataagactat ggaggtatgt 1500
aatggttgca aaattaagtg atgtcgcagc gctagctggt gtttctgtga caacagtatc 1560
acgaatggcg cggtaccaaa agcatcctct tgataaatat gaaggtcatt gcccattcca 1620
tggcgataat tgtttggaag gcttagctgc tggtccagca attgaagagc gttggggacg 1680
tagtgcgaag gaaattccag atgatgatgt tgcctggaag attgaagcct tctatcttgc 1740
gcaagcagcc cttgattata caatgatttt acgccctgaa aaaattgttt ttggtggcgg 1800
tgtacctcat cgtgaaatct tattcccatt aattcgcgaa agttttgctg agcaaatgag 1860
tgattattta gcagttcctg atttggatga atacatcgta cccgttgcta atggcgataa 1920
tgccggcatc ttgggttgct tctatttggc aaaaacatta ctttaa
乙酰磷酸转移酶基因中部分序列缺失并在此插入甘露醇脱氢酶基因表达盒的核苷酸序列
<110> 河北工业大学
<120> 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法
<160> 2251
<210> 1
<211> 2251
<212> DNA
<213> 肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)
<400> 1
ttataatgct tgcgcagcag taataatagc tactttataa acatcctctt cattggctcc 60
tcgcgataaa tcagaaacag gttttgctaa gccttgtaaa ataggtccaa tcgcttcaaa 120
cccacccaag cgttgtgcaa ttttatagcc aatattacct gcttctagac ttgggaaaat 180
aaatgtgttc gctttacctg cgacttttga atcaggcgcc tttgcggcag caacagattc 240
aacaaacgca gcatcaaact gtaactctcc atcaattgag tccgccagtt caggtgctaa 300
cttcttagcc aatgcagtgg cagttgccac cttatcgacc aagggtgatt tcgcggagcc 360
cttagttgaa aatgaaagca tcgcaacttt tggttcaata tcaaacactt gagctgtgtg 420
ggctgattgt attgcaattt cagccatcgt gtccgaatca atgtcaatgt taatggcagc 480
gtccgcaaat acataacgct cttcgcttgg tacctaggat cctaatatta tgcctcttcg 540
ccgccaacct tcacaacagc cttagatacg acacctaact taccgttaac aaagtcgtca 600
acagtcttat agtctaattc gtgtgacatc aatgcttcaa cattcaactt accagatgat 660
agcagagcca gtgaatcttc aaaggcgtta gggttgataa atgaaccttg aatagttaac 720
tgcttttgga atacttcata agtgttcatt tggaacttgg cgtcaggacc accaacacca 780
aacatcaata cttgagcgcc acgagctgat gcttcaatag cagcttcttg tgtttgtggt 840
agaccaacgg cttcaataat gacatcatat tcaccttcag ggatcttgtc acccttcatt 900
gtgttgtacg tgttctttac gccaaacttt tctttgttca ttgccaactt ttcgtcaaca 960
ataccagcta agtcaacttg gtgaatacca tatgcttgca agatttgaac gaataattcg 1020
cccatgaatc catcaccaat taccaaagcc ttttggtaag gggtaacctt caacaattga 1080
ataccgtgaa cggcacatga aattggttca acaacagcag ctgactttaa tgaaacgtta 1140
tcaggaattg gataaacaac agatgcaggt gcagtgaaga attcttcaaa gccaccatca 1200
cgtgtcacac caacagctga caagttttcg cataattcag ggcgtgcagt acggcagtac 1260
ttgcattgtc cacaataaat gttagggtca acagttacgc ggtcaccaac tttaacgtta 1320
gtaacagcag aaccgatttc tgcaacaaca cctgagttct catgaccaag aacgattgga 1380
ggaacagcat cagctgaacc tggcaaacca gcgtatagtg cgtgatcagt tccacaaata 1440
ccagcaaacg ctgtgtgaat caaaacttca tttggcaaaa cctttggacg gtcaatgtcc 1500
tttacttcta atttcttagt tccggttaga acaagtgctt ccatgattaa ttctcctttt 1560
ttgtgacaaa agtaacttac ggtgactatg ctaaaccttt ggcattataa agtcaagtct 1620
caggccaaat taattttcga ttataaggct gttggtgtga taaaataata taagactatg 1680
gaggtatgta atggttgcaa aattaagtga tgtcgcagcg ctagctggtg tttctgtgac 1740
aacagtatca cgttggtacc taggatccta cttcgccttt ttgcataatg aatgcaccag 1800
aaatacgtga tgagccaggc gccgttttaa tgatctgcaa cgcaggacga actgtatcac 1860
cagttggatg tactgcgcct gacaccatac cgtcagcttt gccagtataa accagcattg 1920
tcccaaaata gttaacattt tgtagccatt tggcagctgt ctcagcgtct gttttccctt 1980
tgcgcctttc gacaagtgtc gcatttaatt ttgccaattc attctcatca tatgaagcag 2040
gatcaatcgt ctctatgttc gataaatcaa agttatgggc ttgggcagtt tttgaaattt 2100
cctgtgcatc ccccaacaat attggctcga tcaaattatc agctgctaat ctgatagctg 2160
cgccctggat acggggatct tcaccttccg gaaatacaat tgtcttattt tgaccggtaa 2220
ttttattttt taattgctca aaaagttcca t
Claims (1)
1.一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株，其特征在于：是葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入、果糖激酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入和乙酰磷酸转移酶基因敲除并甘露醇脱氢酶基因敲入的肠膜明串珠菌突变菌株，为肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh(Leuconostoc mesenteroidesΔdts1ΔD-ldhΔstpk-mdhΔfk-mdhΔpat-mdh)菌株,其在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017年10月25日，保藏号是CCTCC No：M2017578。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711169481.9A CN107881140B (zh) | 2017-11-22 | 2017-11-22 | 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711169481.9A CN107881140B (zh) | 2017-11-22 | 2017-11-22 | 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107881140A CN107881140A (zh) | 2018-04-06 |
| CN107881140B true CN107881140B (zh) | 2020-03-27 |
Family
ID=61778411
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711169481.9A Expired - Fee Related CN107881140B (zh) | 2017-11-22 | 2017-11-22 | 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107881140B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109593696B (zh) * | 2018-12-17 | 2022-07-05 | 天津博瑞威生物医药科技有限公司 | 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 |
| CN109593699B (zh) * | 2018-12-20 | 2022-05-17 | 河北工业大学 | 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 |
| CN111057673B (zh) * | 2019-12-23 | 2021-07-27 | 河北工业大学 | 一株能利用菊粉的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 |
| CN112852696B (zh) * | 2020-12-14 | 2022-08-30 | 河北工业大学 | 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103315058A (zh) * | 2013-03-12 | 2013-09-25 | 东莞市农业科学研究中心 | 一株肠膜明串珠菌菌株的应用 |
| CN103667367A (zh) * | 2013-11-01 | 2014-03-26 | 天津志卓生物科技有限公司 | 以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法 |
| CN103865863A (zh) * | 2014-02-26 | 2014-06-18 | 河北工业大学 | 一株明串珠菌突变菌株及其构建方法和应用方法 |
| CN106754555A (zh) * | 2017-01-21 | 2017-05-31 | 河北工业大学 | 一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 |
-
2017
- 2017-11-22 CN CN201711169481.9A patent/CN107881140B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103315058A (zh) * | 2013-03-12 | 2013-09-25 | 东莞市农业科学研究中心 | 一株肠膜明串珠菌菌株的应用 |
| CN103667367A (zh) * | 2013-11-01 | 2014-03-26 | 天津志卓生物科技有限公司 | 以红糖为碳源明串珠菌发酵产甘露醇的方法 |
| CN103865863A (zh) * | 2014-02-26 | 2014-06-18 | 河北工业大学 | 一株明串珠菌突变菌株及其构建方法和应用方法 |
| CN106754555A (zh) * | 2017-01-21 | 2017-05-31 | 河北工业大学 | 一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Biotechnological production of mannitol and its applications;Badal C. Saha & F. Michael Racine;《Appl Microbiol Biotechnol》;20101110;879-891 * |
| The Effect of Dextransucrase Gene Inactivation on Mannitol Production by Leuconostoc mesenteroides;Zhou Zhang et al.;《Indian J Microbiol》;20141025;35-40 * |
| 利用代谢工程构建D-甘露醇生产菌株;王小芳 等;《生物工程学报》;20130923;第29卷(第10期);1450-1462 * |
| 化学诱变快速筛选高产甘露醇柠檬明串珠菌株的研究;郑琳 等;《河南农业大学学报》;20160831;第50卷(第4期);516-520 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107881140A (zh) | 2018-04-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107881140B (zh) | 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 | |
| CN110157654B (zh) | 一种纳豆芽孢杆菌重组菌及其构建方法与应用 | |
| US11130973B1 (en) | Recombinant strain for producing L-lactic acid | |
| US11118202B2 (en) | Method for purifying and obtaining 3,6-anhydro-L-galactose using microorganisms | |
| CN113430127B (zh) | 一种产l-乳酸的重组菌及其应用 | |
| CN109022476B (zh) | 一种地衣芽孢杆菌CRISPR-Cas9基因编辑系统及其应用 | |
| CN109593699B (zh) | 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 | |
| WO2015003629A1 (zh) | 生产d-乳酸的重组大肠杆菌及其应用 | |
| CN108913737B (zh) | 使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法 | |
| CN109593696B (zh) | 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 | |
| CN106754555B (zh) | 一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 | |
| CN111057673B (zh) | 一株能利用菊粉的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 | |
| CN114058561B (zh) | 一种n-乙酰氨基葡萄糖生产菌株及其应用 | |
| CN112852696B (zh) | 一株高产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 | |
| CN112175981B (zh) | 一种基于无水乙醇或十二烷基磺酸钠刺激的哈维弧菌定点基因敲除的方法 | |
| CN108251447B (zh) | 一种能高效表达脂肪酶的质粒、其构建方法及其应用 | |
| CN112646831A (zh) | 一种穿梭质粒及构建方法及其在集胞藻转化外源基因中的应用 | |
| CN113667686B (zh) | 一种高效利用葡萄糖合成肌醇的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用 | |
| CN116042562B (zh) | 重组酵母菌及其应用 | |
| CN111826372A (zh) | 利用木糖生产丁醇的工程菌株及其构建方法和应用 | |
| CN117867054B (zh) | 合成hmo的方法 | |
| CN118497230B (zh) | 肠杆菌素合酶编码基因在发酵生产丝氨酸中的应用 | |
| CN111334445B (zh) | 长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用 | |
| CN117106836B (zh) | 磷脂酰甘油磷酸酶编码基因在发酵生产胞苷中的应用 | |
| CN114807267B (zh) | 一种同时制备新科斯糖和1f-低聚果糖的方法及其专用工程菌株 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20200327 |