CN106754555B - 一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 - Google Patents
一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法，涉及细菌，该菌株是葡聚糖蔗糖酶、D‑乳酸脱氢酶和乙醛脱氢酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株，为肠膜明串珠菌Δdtsl∆D‑ldh∆aldh（LeuconostocmesenteroidesΔdtsl∆D‑ldh∆aldh）菌株,其在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏日期是2016年11月14日，保藏号是CCTCC M2016638。将该菌株以重量百分比1%转接到MRS培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，甘露醇浓度可以达到9.35克/升，蔗糖中果糖部分的转化率93.5%。
Description
技术领域
本发明的技术方案涉及细菌，具体地说是一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法。
背景技术
甘露醇(Mannitol)是一种己六醇，在医药领域、食品领域和塑料领域均得到广泛的应用。
目前，世界上工业生产甘露醇主要有二种工艺。第一种是海藻提取法：提取1吨甘露醇约需13～15吨干海带，在生产海藻酸盐的同时，将提碘后的海带浸泡液，经多次提取浓缩、除去杂质、离子交换、蒸发浓缩、冷却结晶而得；生产过程产生大量废水，能耗高，污染严重，收率低。第二种是催化加氢法：以蔗糖或葡萄糖为原料，通过水解、差向异构与酶异构，然后加氢而得；原料来源稳定，生产期限不受限制，成本低，但是其产率较低，且有山梨醇伴生。
实验室生产甘露醇的方法还有二种。一是酶转化法，酶法氢化须要在体系中加入价格昂贵的辅酶，不经济。二是微生物发酵法，自然界中能合成甘露醇的微生物种类较多，细菌、酵母和霉菌中都有一些菌株具有产甘露醇的能力。在乳酸细菌转化甘露醇的过程中，甘露醇为主要产物，同时产乳酸、乙酸、乙醇和二氧化碳，而不产生其它多元醇等副产物，因而易于纯化分离及精制，并且条件温和、转化率较高。
很多菌株以果糖为底物发酵产生甘露醇，而明串珠菌将果糖和蔗糖都可以作为底物产生甘露醇。廉价的蔗糖进入明串珠菌胞内后，分解成1-磷酸葡萄糖和果糖，果糖再转化为甘露醇，反应步骤相对少；而同型乳酸发酵的乳杆菌中葡萄糖经6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖和1-磷酸甘露醇等中间产物最终转化为甘露醇，反应步骤相对多；明串珠菌的染色体基因组只有2M左右，故发酵周期只有20小时左右；明串珠菌是耐氧的，故发酵过程中不需要提供氧气；因此明串珠菌实现大规模工业化生产甘露醇的潜力比较大。
CN201410065372.2公开了一株明串珠菌突变菌株及其构建方法和应用方法，该明串珠菌突变菌株是葡聚糖蔗糖酶基因敲除的明串珠菌突变菌株，虽然比原始菌株提高了产量，但还是比较低，不足以应用于生产中。
总之，现有的明串珠菌发酵技术中，以蔗糖为底物产甘露醇的产率仍不够高，还需进一步提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法，该肠膜明串珠菌突变菌株是以现有的保藏号是CCTCCM2013724的肠膜明串珠菌Δdtsl(Leuconostoc mesenteroidesΔdtsl)为出发菌，采用分子生物学技术敲除消耗NADH的D-乳酸脱氢酶编码基因和乙醛脱氢酶编码基因，构建为葡聚糖蔗糖酶、D-乳酸脱氢酶和乙醛脱氢酶基因敲除的的肠膜明串珠菌突变菌株，即保藏号是CCTCC No：M2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株，克服了现有的明串珠菌发酵技术中以蔗糖为底物产甘露醇的产率仍不够高的缺陷。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株，是葡聚糖蔗糖酶、D-乳酸脱氢酶和乙醛脱氢酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株，为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)ΔdtslΔD-ldhΔaldh菌株,其在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2016年11月14日，保藏号是CCTCC M2016638。
一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的应用方法，在250毫升三角瓶中，将在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2016年11月14日，保藏号是CCTCCM2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株以重量百分比1％转接到MRS培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，甘露醇浓度可以达到9.35克/升，蔗糖中果糖部分的转化率93.5％。
上述一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的应用方法，所述MRS培养基的配制方法是：将酵母浸粉2克、蔗糖20克、柠檬酸铵2克、乙酸钠5克、K2HPO4 2克、MnSO4·H2O0.039克和水1000毫升用乙酸调pH到6.2，在121℃温度下，灭菌20分钟配制得到MRS培养基。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明具有如下突出的实质性特点和显著进步：
(1)本发明采用分子生物学技术敲除现有的保藏号是CCTCCM2013724的肠膜明串珠菌Δdtsl(Leuconostoc mesenteroidesΔdtsl)中的消耗NADH的D-乳酸脱氢酶编码基因和乙醛脱氢酶编码基因，构建为葡聚糖蔗糖酶、D-乳酸脱氢酶和乙醛脱氢酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株，即保藏号是CCTCC No：M2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株，克服了现有的明串珠菌发酵技术中以蔗糖为底物产甘露醇的产率仍不够高的缺陷。
(2)将在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2016年11月14日，保藏号是CCTCC M2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(LeuconostocmesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株以重量百分比1％转接到MRS培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，检测代谢产物，通过对比试验证明，该明串珠菌突变菌株的甘露醇产率比原始的保藏号是CCTCCM2013724的肠膜明串珠菌Δdtsl(Leuconostoc mesenteroidesΔdtsl)提高了7.2％，蔗糖中果糖部分的转化率提高了6.3％。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为本发明保藏号是CCTCC No：M2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株的构建D-乳酸脱氢酶基因同源重组载体中同源右臂的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为本发明保藏号是CCTCC No：M2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株的构建D-乳酸脱氢酶基因同源重组载体中同源左臂的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为本发明保藏号是CCTCC No：M2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株的通过PCR验证D-乳酸脱氢酶基因敲除突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。
图4为本发明保藏号是CCTCC No：M2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株的构建乙醛脱氢酶基因同源重组载体中同源左臂的琼脂糖凝胶电泳图。
图5本发明保藏号是CCTCC No：M2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株的构建乙醛脱氢酶基因同源重组载体中同源右臂的琼脂糖凝胶电泳图。
图6为本发明保藏号是CCTCC No：M2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株的通过PCR验证乙醛脱氢酶基因敲除突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
图1为本发明保藏号是CCTCC No：M2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株的构建D-乳酸脱氢酶基因同源重组载体中同源右臂的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示重组载体酶切产生的两条条带：1.Ldh-R PCR产物，2.重组载体双酶切，3.pMD20*-Tet单酶切产物。
图2为本发明保藏号是CCTCC No：M2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株的构建D-乳酸脱氢酶基因同源重组载体中同源左臂的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示重组载体酶切产生的两条条带：1.ldh-L PCR产物，2.重组载体双酶切产物，3.pMD20*-Tet-ldh(R)单酶切产物。
图3为本发明保藏号是CCTCC No：M2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株的通过PCR验证D-乳酸脱氢酶基因敲除突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示：1.以第一次重组菌株(基因失活)做模板，2.Marker，3.以第二次重组菌株(基因敲除)做模板。
图4为本发明保藏号是CCTCC No：M2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株的构建乙醛脱氢酶基因同源重组载体中同源左臂的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示重组载体酶切产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双酶切条带。
图5本发明保藏号是CCTCC No：M2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株的构建乙醛脱氢酶基因同源重组载体中同源右臂的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示重组载体酶切产生的两条条带：1.Marker，2.重组载体双酶切条带。
图6为本发明保藏号是CCTCC No：M2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株的通过PCR验证乙醛脱氢酶基因敲除突变菌株的琼脂糖凝胶电泳图。图中显示：1.Marker，2.以原始菌株为模板，3.以四环素抗性标记的基因失活菌株为模板，4.以不携带四环素抗性标记的基因敲除菌株为模板。
实施例1
构建葡聚糖蔗糖酶、D-乳酸脱氢酶和乙醛脱氢酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株，具体步骤如下：
第一步，以肠膜明串珠菌Δdtsl(CCTCC M2013724)为出发菌，构建葡聚糖蔗糖酶和D-乳酸脱氢酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株：
(1.1)肠膜明串珠菌D-乳酸脱氢酶基因部分序列的克隆：
以染色体DNA为模板，克隆编码序列长度为996bp的肠膜明串珠菌(肠膜明串珠菌Δdtsl(Leuconostoc mesenteroidesΔdtsl)菌株，保藏日期是2013年12月29日，其在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M2013724)的D-乳酸脱氢酶基因部分连续序列，具体操作步骤是：
(1.1.1)保藏号是CCTCCM2013724的肠膜明串珠菌Δdtsl(LeuconostocmesenteroidesΔdtsl)的肠膜明串珠菌总DNA的提取：
将在-80℃冻存的保藏号是CCTCCM2013724的肠膜明串珠菌Δdtsl(LeuconostocmesenteroidesΔdtsl)的肠膜明串珠菌划线于MRS固体平板上，于30℃过夜培养；从固体平板上挑取一个单菌落接种到5毫升MRS液体培养基中，于30℃，转速为120转/分钟的摇床培养过夜；取2毫升的上述培养的菌液以转速为10000转/分钟离心2分钟，收集菌体；用1毫升双蒸水洗涤菌体两次；将菌体溶于100微升的双蒸水中，吹打混匀；加入100微升的浓度为100毫克/毫升的溶菌酶，37℃水浴1h；加入500微升提取液，轻轻混匀；于80℃孵育10分钟后，以14000转/分钟离心10分钟，弃上清；加100微升悬浮液，使DNA溶解；加入等体积即100微升的酚-氯仿，轻轻摇匀，放入4℃冰箱中静置15分钟，然后4℃，12500转/分钟离心15分钟，把上清液抽提到新的离心管中；再重复一次酚-氯仿抽提操作；加入2倍体积即200微升的预冷无水乙醇，于4℃冰箱中静置2h；12000转/分钟离心20分钟，倒掉上清液；用体积百分比为70％的乙醇清洗1次，12000转/分钟离心10分钟，倒掉上清液，晾干；将沉淀溶于20微升的TE(Tris-HCl 100毫摩尔/升、EDTA 10毫摩尔/升，pH 8.0)中；
上述MRS培养基的组成：酵母浸粉3克、蛋白胨10克、牛肉浸粉8克、葡萄糖20克、柠檬酸铵2克、乙酸钠5克、K2HPO4 2克、MgSO4·7H2O 2克、MnSO4·H2O 0.039克、吐温80 1.6毫升和水1000毫升，用乙酸调pH到6.2；121℃灭菌20min。固体培养基加1.5％的琼脂；
上述提取液的组成：240毫摩尔/升NaOH、2.7毫摩尔/升EDTA、74％乙醇；
上述悬浮液的组成：0.1毫摩尔/升EDTA、50毫摩尔/升Tris-HCl，1％TritonX-100(pH8.0)，0.5％吐温20；
上述酚-氯仿溶液为用酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1配制成的溶液；
上述TE溶液为用Tris-HCl 100毫摩尔/升和EDTA 10毫摩尔/升配制，pH为8.0；
(1.1.2)PCR扩增D-乳酸脱氢酶基因：
设计一对引物ldhl：5'-CTCGACAAATAGGGTACAA-3'和ldhr：5'-TAAACACTGAATCTGGGAA-3'，以保藏编号为CCTCC M2013724的肠膜明串珠菌总DNA为模板，PCR扩增得到为996bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pTA2上，重组质粒命名为pTA2-ldh；
(1.1.3)感受态大肠杆菌DH5α的制备和DNA转化：
将在-80℃冻存的大肠杆菌DH5α菌株划线于LB固体平板上，37℃过夜培养；从固体平板上挑取一个单菌落接种到5毫升LB液体培养基中，于37℃以转速为150转/分钟摇床过夜培养；取0.2毫升上述培养得到的菌液转接到10毫升液体培养基中，于37℃以转速为150转/分钟振荡培养2～3h至菌液的OD600为0.6；取上述OD600为0.6的菌液1.0毫升加入到1.5毫升离心管中，冰浴10分钟；于4℃以转速为10000转/分钟离心30秒，弃上清液；加入1毫升冰冷的0.1摩尔/升CaCl2溶液悬浮细胞，冰浴30分钟；于4℃以转速为10000转/分钟离心30秒，弃上清液；加入100微升冰冷的0.1摩尔/升CaCl2溶液悬浮细胞，即为感受态细胞，也即感受态大肠杆菌DH5α；
将重组质粒10微升加入到在上述感受态细胞中，冰浴30分钟；于42℃准确热激90秒；立即在冰上放置3分钟；加入400微升LB液体培养基，于37℃振荡培养45分钟；将转化的感受态细胞均匀涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上；将平板放置于37℃温箱30分钟，至液体被吸收；倒置平板，于37℃培养12～16h；
挑去单菌落，在含氨苄青霉素的LB培养基中培养，提取质粒，经过琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。
上述LB液体培养基：酵母浸粉5克，蛋白胨10克，NaCl 10克，蒸馏水1000毫升，pH7.0，121℃灭菌20分钟。固体培养基加1.5％的琼脂；
(1.2)D-乳酸脱氢酶基因同源重组载体的构建：
(1.2.1)人工合成一段核苷酸序列连接到pMD20-T载体上，得到特征是两端为loxP序列、中间为ApaI-MluI-TaqI-XhoI-NcoI-XspI等限制性内切酶的识别序列，该序列为Ataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgggcccacgcgttcgactcgagccatggctagataacttcgtatagcatacattatacgaagttata，将这一重组质粒命名为pMD20*；
(1.2.2)四环素抗性基因表达盒的克隆：设计一对引物tetl：5'-TTAGGGCCCTTGACAGCTTATCATCG-3'和tetr：5'-ATAATGGGCCCTTGGAGTGGTGAATC-3'，以pBR322为模板，PCR扩增得到为1400bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pMD20*的ApaI酶切位点上，该重组质粒命名为pMD20*-Tet；
(1.2.3)右同源臂的克隆：设计一对引物ldhrh：5'-TGCGGATCCGACCTGTACCAATAACAC-3'和ldhrq：5'-CCGTGAATTCCGGCATTCGTGATGATG-3'，以pTA2-ldh为模板，PCR扩增得到为500bp的右同源臂片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pMD20*-Tet的BamHI和EcoRI酶切位点上，重组质粒命名为pMD20*-Tet-ldh(R)；
(1.2.4)左同源臂的克隆：设计一对引物ldhlh：5'-TGCAAGCTTTGTGTGGCGTAACCAATAC-3'和ldhlq：5'-CCGGGTCTAGATTATTGCTTATGACAAG-3'，以pTA2-ldh为模板，PCR扩增得到为400bp的左同源臂片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pMD20*-Tet-ldh(R)的HindIII和XbaI酶切位点上，重组质粒命名为pMD20*-Tet-ldh(RL)，即构建为同源重组载体；
(1.3)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因失活的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：
将在-80℃冻存的保藏号是CCTCCM2013724的肠膜明串珠菌Δdtsl(LeuconostocmesenteroidesΔdtsl)菌株划线于MRS固体平板上，于30℃过夜培养；从固体平板上挑取一个单菌落接种到5毫升MRS液体培养基中，于30℃以转速为120转/分钟摇床培养过夜；以1％转接到MRS含0.48微克/毫升氨苄青霉素的培养基中继续培养，初始OD600为0.048的保藏编号为CCTCC M2013724的肠膜明串珠菌菌液的OD600达到0.5时收集菌体，用含溶菌酶浓度为100U/毫升的LiAc-DTT溶液重新悬浮菌体，于30℃孵育20分钟，用冰冷的PBS溶液洗涤两次，再用50微升冰冷的PBS溶液悬浮菌体，加入5微升上述的同源重组载体质粒[pMD20*-Tet-ldh(RL)]，冰浴10分钟后进行电转化，所用电转化仪为Bio-Rad Gene Pulser XCellTM，电击参数为电击杯间距0.1cm、1400V、25μF、300Ω、电击时间为4毫秒，然后加入1毫升MRS培养基，复苏3h后，涂布于含MRS固体平板，培养36～48h后挑取单菌落验证，以证明从平板上筛选得到葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因失活的肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌TetΔdtslΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroides TetΔdtslΔD-ldh)菌株；
设计一对引物ldhyq：5'-CCGTGAATTCCGGCATTCGTGATGATG-3'和ldhyh：5'-TGCAAGCTTTGTGTGGCGTAACCAATAC-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，上述肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌TetΔdtslΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroides TetΔdtslΔD-ldh)菌株得到长度为2400bp的扩增产物，而原始肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides，保藏编号为CCTCC M2013724)得到长度为900bp的扩增产物；
上述LiAc-DTT溶液为用100毫摩尔/升LiAc、10毫摩尔/升DTT、0.6摩尔/升蔗糖、10毫摩尔/升Tris-HCl(pH7.5)的溶液；
上述PBS溶液为K2HPO4-KH2PO4 1毫摩尔/升、MgCl2 1毫摩尔/升和蔗糖0.5摩尔/升配制的溶液，pH为6.9；
(1.4)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：
(1.4.1)无抗生素抗性标记的D-乳酸脱氢酶基因同源重组载体的构建：将D-乳酸脱氢酶基因同源重组载体[pMD20*-Tet-ldh(RL)]用ApaI酶切而去除四环素抗性基因表达盒，获得无抗生素抗性标记的D-乳酸脱氢酶基因同源重组载体，命名为pMD20*-ldh(RL)。
(1.4.2)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：以电转化法将pMD20*-ldh(RL)导入到上述(1.3)步得到的肠膜明串珠菌TetΔdtslΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroides TetΔdtslΔD-ldh)菌株中，筛选获得葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌ΔdtslΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldh)菌株。
设计一对引物ldhrq：5'-CCGTGAATTCCGGCATTCGTGATGATG-3'和ldhlh：5'-TGCAAGCTTTGTGTGGCGTAACCAATAC-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，上述肠膜明串珠菌突变菌株(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldh)得到长度为1000bp的扩增产物，而肠膜明串珠菌TetΔdtslΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroides TetΔdtslΔD-ldh)菌株得到长度为2400bp的扩增产物。
上述LiAc-DTT溶液为100毫摩尔/升LiAc、10毫摩尔/升DTT、0.6摩尔/升蔗糖、10毫摩尔/升Tris-HCl(pH7.5)的溶液。
上述PBS溶液为K2HPO4-KH2PO4 1毫摩尔/升、MgCl2 1毫摩尔/升和蔗糖0.5摩尔/升配制的溶液，pH为6.9；
第二步，从肠膜明串珠菌ΔdtslΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldh)菌株构建葡聚糖蔗糖酶、D-乳酸脱氢酶和乙醛脱氢酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株，具体步骤如下：
(2.1)肠膜明串珠菌乙醛脱氢酶基因部分序列的克隆：
设计一对引物aldhq：5'-ACTTTGCGAATGAATAATG-3'和aldhh：5'-TCGTGTAACCAATGATAAC-3'，以肠膜明串珠菌ΔdtslΔD-ldh的染色体为模板，PCR扩增得到为1500bp的右同源臂片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pTA2上，重组质粒命名为pTA2-aldh；
(2.2)乙醛脱氢酶基因同源重组载体的构建
(2.2.1)四环素抗性基因表达盒的克隆：设计一对引物tetrl：5'-TTTGACAGCTTATCATCGA-3'和tetrr：5'-ATTCTTGGAGTGGTGAATC-3'，以pBR322为模板，PCR扩增得到为1300bp的片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pTA2上，重组质粒命名为pTA2-Tet；
(2.2.2)左同源臂的克隆：设计一对引物aldhlq：5'-AGTGGTACCCCGAAGGTCATGCACTG-3'和ldhlh：5'-ATTCTCGAGCCAGCACGTTCTGAACC-3'，以pTA2-aldh为模板，PCR扩增得到为544bp的左同源臂片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pTA2-Tet的KpnI和XhoI酶切位点上，重组质粒命名为pTA2-Tet-aldh(L)；
(2.2.3)右同源臂的克隆：设计一对引物aldhrq：5'-TATCTGCAGGGACAGGTATGTACTTC-3'和aldhrh：5'-GCCTCTAGATTGTTCACAAAGGTTTC-3'，以pTA2-aldh为模板，PCR扩增得到为569bp的右同源臂片段，并用T4连接酶将PCR产物连接到pTA2-Tet-aldh(L)的PstI和XbaI酶切位点上，重组质粒命名为pTA2-Tet-aldh(LR)，即构建为同源重组载体；
(2.3)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、乙醛脱氢酶基因失活的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：
以电击转化法将第二步得到的同源重组载体导入到肠膜明串珠菌ΔdtslΔD-ldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldh)菌株中，筛选获得葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、乙醛脱氢酶基因失活的肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌TetΔdtslΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroides TetΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株；
设计一对引物aldhyq：5'-CCGAAGGTCATGCACTGT-3'和aldhyh：5'-CTTGTTCACAAAGGTTTCG-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，上述肠膜明串珠菌突变菌株，即肠膜明串珠菌TetΔdtslΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc Mesenteroides TetΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株得到长度为2400bp的扩增产物，而肠膜明串珠菌ΔdtslΔD-ldh得到长度为1300bp的扩增产物；
(2.4)葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除、乙醛脱氢酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：
(2.4.1)无抗生素抗性标记的乙醛脱氢酶基因同源重组载体的构建：将乙醛脱氢酶基因同源重组载体[pTA-Tet-aldh(LR)]用EcoRI酶切而去除四环素抗性基因表达盒，获得无抗生素抗性标记的乙醛脱氢酶基因同源重组载体，命名为pTA-aldh(LR)；
(2.4.2)葡聚糖蔗糖酶、D-乳酸脱氢酶和乙醛脱氢酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株的构建：以电转化法将pTA-aldh(LR)导入到上述第三步得到的肠膜明串珠菌TetΔdtslΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroides TetΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株中，筛选获得葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除和乙醛脱氢酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株，即为肠膜明串珠菌ΔdtslΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株,其在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2016年11月14日，保藏号是CCTCC M2016638)，即本发明的一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株；
设计一对引物ldhrq：5'-CCGTGAATTCCGGCATTCGTGATGATG-3'和ldhlh：5'-TGCAAGCTTTGTGTGGCGTAACCAATAC-3'，提取总DNA，以染色体DNA为模板进行PCR，上述肠膜明串珠菌突变菌株(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)得到长度为1100bp的扩增产物，而肠膜明串珠菌TetΔdtslΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroides TetΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株得到长度为2400bp的扩增产物。
实施例2
肠膜明串珠菌ΔdtslΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株,其在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2016年11月14日，保藏号是CCTCC M2016638)，即本发明的一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株的发酵应用，具体步骤如下：
在250毫升三角瓶中，将在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2016年11月14日，保藏号是CCTCC M2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株以重量百分比1％转接到MRS培养基中，于30℃下，以转速为120转/分钟的摇床培养20小时，甘露醇浓度可以达到9.35克/升，蔗糖中果糖部分的转化率93.5％。
上述MRS培养基的配制方法是：将酵母浸粉2克、蔗糖20克、柠檬酸铵2克、乙酸钠5克、K2HPO4 2克、MnSO4·H2O 0.039克和水1000毫升用乙酸调pH到6.2，在121℃温度下，灭菌20分钟配制得到MRS培养基。
表1列出了各种明串珠菌发酵产甘露醇的产量，可见本发明的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2016年11月14日，保藏号是CCTCC M2016638的肠膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株的甘露醇产率比原始的保藏号是CCTCCM2013724的肠膜明串珠菌Δdtsl(LeuconostocmesenteroidesΔdtsl)提高了7.2％，蔗糖中果糖部分的转化率提高了6.3％。
表1.肠膜明串珠菌发酵产甘露醇的产量(g/L)
| 原始菌 | Δdtsl | ΔdtslΔldh | ΔdtslΔldhΔaldh | |
| 甘露醇产量 | 7.91 | 8.72 | 8.88 | 9.35 |
| 蔗糖中果糖部分的转化率 | 79.1％ | 87.2％ | 88.8％ | 93.5％ |
表1中，原始菌为被改造的原始肠膜明串珠菌，Δdtsl为葡聚糖蔗糖酶基因敲除的肠膜明串珠菌，ΔdtslΔldh为葡聚糖蔗糖酶基因敲除和D-乳酸脱氢酶基因敲除的肠膜明串珠菌，ΔdtslΔldhΔaldh为葡聚糖蔗糖酶基因敲除、D-乳酸脱氢酶基因敲除和乙醛脱氢酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株，即为肠膜明串珠菌ΔdtslΔD-ldhΔaldh(Leuconostoc mesenteroidesΔdtslΔD-ldhΔaldh)菌株,其在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2016年11月14日，保藏号是CCTCC M2016638)，即本发明的一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株。
上述实施例中未注明的具体实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验手册》中所述的方法或厂商提供的方案进行。
序列表
D-乳酸脱氢酶基因序列
<110> 河北工业大学
<120> 一株肠膜明串珠菌突变菌株及其应用方法
<160> 1085
<210> 1
<211> 1085
<212> DNA
<213> 肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)
〈400〉1
atgaagattt ttgcttacgg cattcgtgat gatgaaaagc catcacttga agaatggaaa 60
gcggctaacc cagagattga agtggactac acacaagaat tattgacacc tgaaacagct 120
aagttggctg agggatcaga ttcagctgtt gtttatcaac aattggacta tacacgtgaa 180
acattgacag ctttagctaa cgttggtgtt actaacttgt cattgcgtaa cgttggtaca 240
gataacattg attttgatgc agcacgtgaa tttaacttta acatttcaaa tgttcctgtt 300
tattcaccaa atgctattgc agaacactca atgattcaat tatctcgttt gctacgtcgc 360
acgaaagcat tggatgccaa aattgctaag cacgacttgc gttgggcacc aacaattgga 420
cgtgaaatgc gtatgcaaac agttggtgtt attggtacag gtcggatccg atttaacttc 480
gtatagcata cattatacga agttatgggc ccacgcgttc gactcgagcc atggctagat 540
aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt ataatccata tgactagtag atcctctaga 600
ttattgctta tgacaagtac ccaaatgctg aattacaagc agaaggtttg tacgttgaca 660
cattagacga attatatgca caagctgatg caatttcatt gtatgttcct ggtgtacctg 720
aaaaccatca tctaatcaat gcagatgcta ttgctaagat gaaggatggt gtggttatca 780
tgaacgctgc gcgtggtaat ttgatggaca ttgacgctat tattgatggt ttgaattctg 840
gtaagatttc agacttcggt atggacgttt atgaaaatga agttggcttg ttcaatgaag 900
attggtctgg taaagaattc ccagatgcta agattgctga cttgattgca cgcgaaaatg 960
tattggttac gccacacacg gctttctata caactaaagc tgttctagaa atggttcacc 1020
aatcatttga tgcagcagtt gctttcgcca agggtgagaa gccagctatt gctgttgaat 1080
attaa
乙醛脱氢酶基因
<110> 河北工业大学
<120>一株肠膜明串珠菌突变菌株及其构建和应用方法
<160> 1310
<210> 1
<211> 1310
<212> DNA
<213> 肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)
〈400〉1
atgagctatc aaacaattaa tccctttaac gacgaagtta ttcaaacatt tgacaatcat 60
gatgacgctt atgttgagaa ggccattgcc gaaggtcatg cactgtataa aaagtggcgc 120
aatgacccgg ctagtagtcg cgcagagata ttaaacaaaa ttgctgactt gatggaagaa 180
gatgctgatc atttagctaa ggtacttact attgaaatgg gtaagcgatt tgtcgaggct 240
caaggtgaag tagcattaag tgtttcaatt gctcgttact acgccaaaaa tggtgcagat 300
tttcttaagc cagaaccaat caaatcctcg atgggggatg cgcaagtaat ttcgcgcccc 360
actggggtat tgatgatggt tgaaccatgg aattttcctt actatcaaat tattcgtgta 420
tttgcaccaa attatatagc tggaaaccca atgcttttga agcacgcaag caatacgcca 480
atggctgcat cagaatttga aaaaattgtt gaacgggctg gtgcacctac tggtgcgttt 540
gctaatttat tcattgatta cgatcaagtg aataaaatta ttgctgacga tcgtgtacag 600
ggagtggcgt taactggttc agaacgtgct ggctcgaggt cgacggtatc gataagcttg 660
atatcgaatt cctgcaggga caggtatgta cttcgtctaa acggtttatt gtaaccgaaa 720
aaaattatga tgcggtactt acaatgttaa aagatgcctt tgctgaagca aaactaggcg 780
acccattgtt ggaagatacg acattagcac cattaagtac cagcaaggct aagaaaaact 840
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tccaagataa accagctgca ctgtttgatc ccgttatttt aactggtatt acaaaagaca 960
acccagctta ttatcaagag ttcttcggtc cagttggaca agtctacaaa gtgaaagatg 1020
aagaagaggc aattacacta gctaatgatt ctaattatgg cttatcgggc gtggtatttg 1080
gtggttcacc tgagcatgcg acggaagttg cttctcgtat tgagacggga gcggtttatg 1140
tgaatagttt tggtggaaca ttacctgagt taccatttgg tggtgttaaa aattctggct 1200
atggacgtga gctaggacgc tttggtatcg aaacctttgt gaacaaggaa cttattgtta 1260
ctaaaaagga accaattgat ttagataatg cttttggtgg atttgtttaa
Claims (1)
1.一株产甘露醇的肠膜明串珠菌突变菌株，其特征在于：是葡聚糖蔗糖酶、D-乳酸脱氢酶和乙醛脱氢酶基因敲除的肠膜明串珠菌突变菌株，为肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)Δdtsl ΔD-ldh Δaldh菌株,其在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2016年11月14日，保藏号是CCTCC M2016638。
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