CN111826363A

CN111826363A - 一种右旋糖酐蔗糖酶突变体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN111826363A
Application number: CN202010730704.XA
Authority: CN
Inventors: 马江锋; 姜岷; 李进; 王义娅; 吴昊
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2020-07-27
Filing date: 2020-07-27
Publication date: 2020-10-27

Abstract

本发明公开了一种右旋糖酐蔗糖酶突变体及其制备方法与应用。突变体TB‑7右旋糖酐蔗糖酶序列如SEQ ID NO：1所示，其最适催化pH为5.5，温度为30℃。与野生酶相比，突变的右旋糖酐蔗糖酶可催化单一分子量区间的微分子量右旋糖酐直接获得目标产物，克服了现有技术的缺陷，具有操作简单，能耗低，效率高的特点，是一种工艺简单，适合工业化的批量生产简便，经济，高效的方法。

Description

一种右旋糖酐蔗糖酶突变体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种催化生产微分子量右旋糖酐的右旋糖酐蔗糖酶突变体及其制备方法与应用。

背景技术

右旋糖酐(dextran,dex)又叫α右旋糖酐，是葡萄糖单元经脱水后所构成的高分子多糖化合物。右旋糖酐结构疏松柔软，具有较好的水溶性及持水性，因此被当作保湿剂、增稠剂等应用于食品工业和其它化工行业。右旋糖酐在医药上的应用也很普遍，其中微分子右旋糖酐能改善微循环，消除血管内红细胞聚集，防止血栓形成及渗透利尿的作用，可用于治疗急性失血性休克、心肌梗塞、脑血栓、脑供不足、周围血管病及防止弥散性血管内凝血和肾功能衰竭等功效。

目前微分子量右旋糖酐主要以双酶法或多酶法催化为主要获得手段。其中大多数方法为先以右旋糖酐蔗糖酶催化获得较大分子量的右旋糖酐，在使用酸水解法或者酶水解法分解大分子右旋糖酐，从而获得微分子量右旋糖酐。但酸水解法引入了氯离子而酶水解法也引入了新的蛋白杂质，同时水解大分子右旋糖酐使得产物的分子量难以控制，其中混杂的较大分子量右旋糖酐不仅是对原料的浪费，同时也对产品的纯化造成了困难。因此，通过改造右旋糖酐蔗糖酶，开发以一步直接酶催化蔗糖生产微分子量右旋糖酐的右旋糖酐蔗糖酶突变体势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种催化生产微分子量右旋糖酐的右旋糖酐蔗糖酶突变体TB-7，其特征在于，所述突变体TB-7右旋糖酐蔗糖酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述突变体最适pH为5.5，最适温度为30℃，催化时间为4h。

本发明的第二目的在于提供一种右旋糖酐蔗糖酶突变体TB-7的编码基因TB-7，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三目的在于提供一种包含右旋糖酐蔗糖酶突变体TB-7编码基因TB-7的重组载体。

本发明的第四目的在于提供一种包含右旋糖酐蔗糖酶突变体TB-7编码基因TB-7的重组菌

本发明的第五目的在于提供催化生产微分子量右旋糖酐的右旋糖酐蔗糖酶突变体TB-7的应用

本发明还提供一种催化生产微分子量右旋糖酐的右旋糖酐蔗糖酶突变体TB-7的制备方法，按以下步骤进行：

1)将TB-7编码基因和表达载体pET28a(+)相连接，并将连接产物转化至大肠杆菌BL21，获得包含TB-7的重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组突变内右旋糖酐蔗糖酶的表达；

3)高压匀浆破碎含重组菌株的菌液，离心获得含右旋糖酐蔗糖酶TB-7的酶液；

4)对酶进行活性测定。

本发明的有益技术效果是：与一般右旋糖酐蔗糖酶相比，右旋糖酐蔗糖酶突变体TB-7可以直接一步酶催化生产分子量在5000～10000之间的右旋糖酐，且催化较为稳定，分子量分布较为集中，免去了先催化生成高分子量右旋糖酐再水解生产微分子量右旋糖酐的步骤。本发明的突变右旋糖酐蔗糖酶TB-7可应用于药物行业等生物技术领域。

附图说明

图1为酶催化反应体系内右旋糖酐分子量随时间变化结果图。

图2为酶催化反应体系内蔗糖果糖含量随时间变化结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行完整的描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例。基于本发明的实施例，本领域的普通技术人员再没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

实验试剂和材料

1.菌株及载体：大肠杆菌E.coli BL21(DE3)和表达载体pET28a由南京工业大学提供。该材料也可通过商业途径购买。

2.酶类及其他生化试剂：DNA聚合酶及dNTP购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，其他都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司买到)

3.培养基：LB培养基：Peptone 10g/L，Yeast extract 5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水溶解。固体培养基在此基础上加2％(w/v)琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)一书中所列具体方法实行，或按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：右旋糖酐蔗糖酶突变体的构建

以来源于柑橘明串珠菌NRRL B-1299的基因组为模板，设计突变体引物，利用PCR扩增得到含突变基因的质粒。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验测定后，设计合适的酶切体系，加入DpnI去除带甲基化的原始模板。酶切4h后，酶切产物进行PCR产物纯化，纯化产物经核酸电泳检验确认。将所得纯化产物与大肠杆菌DH5α感受态混合，置于冰上30min，于42℃下热击90s，迅速置于冰上5min。将上步所得的感受态细胞加入至1mL LB培养基中，在37℃180rpm下活化50min，活化后感受态细胞取100uL均匀涂布于LB固体培养基平板上，37℃培养箱静置过夜，挑取平板上的单菌落接种于5mL LB培养基中，于37℃180rpm条件下过夜培养，经基因测序确定扩增结果后提取质粒备用。

PCR引物序列如下：

TB-7F:5’-aaggctttagcggctaaggatagtgc-3’

TB-7R:5’-ctatccttagccggtaaagcctta-3’

实施例2：右旋糖酐蔗糖酶突变体的表达

右旋糖酐蔗糖酶突变体TB-7的质粒经DNA限制性内切酶EcorI于37℃进行酶切线性化，酶切5h后对酶切产物进行核酸电泳检测确认。随后将PCR产物进行纯化，使用无菌水进行最终洗脱，将纯化产物化转至大肠杆菌BL21(DE3)中，转化液涂布于LB平板中37℃培养12h，长出的单菌落为表达菌株。挑取单菌落接种至5mL LB培养基中37℃200rpm下培养12h，再进一步接种到200mL LB培养基中扩大培养，当菌液OD600长至0.6～0.8时，加入0.1mMIPTG诱导培养24h。

实施例3：右旋糖酐蔗糖酶突变体表达酶活性的测定

超声破碎含右旋糖酐蔗糖酶突变体TB-7的菌液，破碎后离心收集上清液，取1mL和测量酶活用的酶活反应体系2.5mL混合反应30min，反应后加入定量DNS试剂，煮沸5min，使用分光光度计在540nm波长下测量，代入果糖标准曲线计算反应后果糖含量，判断酶活。

酶活反应体系为：乙酸钠1.46g/L，氯化钙0.05g/L，蔗糖120g/L，用20％盐酸调节pH至5.5。

酶活力的定义：在一定条件下，每分钟催化1umol蔗糖反应生成果糖所需要的酶量为1个酶活单位，用1U表示。

实施例4：不同时间酶催化产物分子量变化的测定

将破碎后的酶液以1：4的体积比与蔗糖反应体系混合，蔗糖反应体系配制方法为：蔗糖240g/L，乙酸钠0.73g/L，氯化钙0.025g/L，体系pH为5.5。在30℃下反应4h，反应中每隔1h取样，反应结束后将样品稀释200倍使用凝胶渗透色谱法(GPC)测量溶液中右旋糖酐的平均分子量。测得反应进行1h后反应体系中右旋糖酐平均分子量达到8100，反应进行2h后体系中右旋糖酐平均分子量达到8500，反应进行3h后体系中右旋糖酐平均分子量达到8700，反应进行4h体系中右旋糖酐平均分子量达到8900，从分子量检测结果来看，反应时间4h对于控制右旋糖酐分子量的效果较好。

实施例5：酶催化反应体系蔗糖果糖含量随时间变化的测定

取催化反应的样品1mL，以1g/L蔗糖和1g/L果糖标准溶液为对照，用铅柱色谱柱对样品蔗糖及果糖浓度进行检测，测得反应0h体系内蔗糖浓度为235.5g/L，果糖浓度为0；反应进行1h体系中蔗糖浓度为142.5g/L，果糖浓度为42.5g/L；反应进行2h体系中蔗糖浓度为84.1g/L，果糖浓度为73.8g/L；反应进行3h体系中蔗糖浓度为49.3g/L，果糖浓度为93.6g/L；反应进行4h体系中蔗糖浓度为24.7g/L，果糖浓度为102.1g/L。在反应进行4h之后89.5％蔗糖被消耗，蔗糖转化为右旋糖酐的反应转化率达到了96.7％。从蔗糖消耗率来看，提高酶液添加量至反应总体系酶活为4U/mL，蔗糖的残留较少，利用率较高。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种右旋糖酐蔗糖酶突变体及其制备方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1270

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

Phe Glu Lys Ala Pro Asp Ser Val Pro Glu Thr Ile Thr Gly Gly Arg

1 5 10 15

Tyr Ser Leu Lys Asp Gly Tyr Tyr Val Tyr Leu Asp Lys Gln Gly Lys

20 25 30

Gln Val Val Gly Pro Lys Asn Ile Asp Asn His Leu Gln Tyr Phe Asp

35 40 45

Glu Thr Thr Gly Lys Gln Val Lys Gly Asp Phe Arg Ser Val Asn Gly

50 55 60

Lys Arg Ile Tyr Phe Asn Ala Asn Leu Gly Tyr Ala Asp Asp Tyr Thr

65 70 75 80

Thr Asp Val Ala Gly Lys Leu Val Gly Tyr Asp Ser Asn Gly Asn Gln

85 90 95

Val Lys Ala Gly Tyr Val Thr Asn Ser Gln Gly Lys Thr Tyr Tyr Phe

100 105 110

Asn Asn Gln Gly Glu Ala Ile Ile Gly Leu Lys Thr Asp Asn Asn Lys

115 120 125

Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Asp Gly Ala Gln Val Lys Gly Ala Phe Gln

130 135 140

Gln Val Asn Gly Lys Asn Ile Tyr Phe Asp Ala Gln Thr Gly Tyr Ala

145 150 155 160

Arg Gln Asn Val Gly Phe Leu Asp Gly Thr Ala Lys Gly Phe Asp Glu

165 170 175

Gln Gly Asn Gln Ile Lys Ser Gly Ile Ala Thr Asp Leu Ser Gly Asn

180 185 190

Val Tyr Tyr Phe Asp Ala Ser Gly Lys Met Leu Thr Gly Val Gln Asn

195 200 205

Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Gln Gly His Arg Arg Arg

210 215 220

Asn Tyr Ala Gly Val Phe Asn Asn Glu Phe Ile Tyr Phe Gly Leu Asp

225 230 235 240

Gly Val Gly Gln Ser Ala Ile Glu Tyr Gln Phe Glu Lys Gly Leu Thr

245 250 255

Ser Gln Asn Ser Val Ala Thr Ser His Asn Ala Ala Lys Ser Tyr Asp

260 265 270

Thr Lys Ser Phe Thr Asn Val Asp Gly Phe Leu Thr Ala Asn Ser Trp

275 280 285

Tyr Arg Pro Thr Asp Ile Leu Arg Asn Gly Thr Lys Trp Glu Pro Ser

290 295 300

Thr Glu Thr Asp Phe Arg Pro Leu Leu Met Thr Trp Trp Pro Asp Lys

305 310 315 320

Glu Val Gln Ala Asn Tyr Leu Asn Tyr Met Ser Ala Leu Gly Leu Gly

325 330 335

Asp Gln Lys Ile Tyr Thr Gly Ala Ser Ser Gln Leu Asp Leu Asn Asn

340 345 350

Ala Ala Leu Ile Val Gln Glu Ala Ile Glu Lys Lys Ile Ser Leu Glu

355 360 365

Lys Ser Thr Lys Trp Leu Asp Asp Ser Ile Lys Ser Phe Ile Lys Ser

370 375 380

Lys Arg Lys Asp Ile Gln Gly Asn Leu Val Asp Thr Asn Pro Gly Trp

385 390 395 400

Thr Ile Asp Ser Glu Thr Gly Ser Thr Asn His Leu Gln Asn Gly Ala

405 410 415

Phe Ile Phe Thr Asn Ser Pro Leu Val Pro Glu Ala Asn Ala Ala Glu

420 425 430

Gly Asn Arg Leu Ile Asn Arg Thr Pro Ser Gln Gln Thr Gly Asn His

435 440 445

Ile Ser Tyr Ala Ser Gln Pro Tyr Ser Gly Asp Asp Trp Gly Tyr Glu

450 455 460

Leu Leu Leu Gly Asn Asp Val Asp Asn Ser Asn Pro Ile Val Gln Ala

465 470 475 480

Glu Gln Leu Asn Trp Ile His Tyr Leu Met Asn Phe Gly Thr Ile Thr

485 490 495

Ala Pro Gln Asp Pro Asp Ala His Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ile Arg

500 505 510

Ile Asp Ala Val Asp Asn Val Asp Ala Asp Leu Leu Gln Ile Ala Gly

515 520 525

Asp Tyr Phe Lys Ala Ala Tyr Gln Val Gly Glu Asn Asp Lys Asn Ala

530 535 540

Asn Gln His Ile His Ile Leu Glu Asp Trp Ser Pro Asn Asp Val Trp

545 550 555 560

Tyr Asn Gln Gln Val Asn Gly Asn Ser Gln Leu Thr Met Asp Ala Thr

565 570 575

Met Gln Asn Gln Leu Leu Ala Ser Leu Thr Arg Pro Ile Thr Ser Arg

580 585 590

Asp Ser Met Lys Ser Phe Thr Lys Asp Ala Leu Leu Val His Arg Thr

595 600 605

Ala Asp Asn Ser Tyr Asn Gln Ala Val Pro Asn Tyr Ser Phe Ile Arg

610 615 620

Ala His Asp Ser Glu Val Gln Thr Ile Ile Ala Lys Ile Ile Ser Asp

625 630 635 640

Lys His Pro Asp Leu Tyr Pro Thr Val Asp Lys Ala Leu Leu Ala Lys

645 650 655

Asp Ser Ala Leu Tyr Asp Glu Ala Phe Thr Glu Tyr Asn Ala Asp Met

660 665 670

Gln Lys Ile Ser Ser Gln Lys Gln Tyr Thr His Asn Asn Met Pro Ser

675 680 685

Ala Tyr Ala Ile Leu Leu Thr Asn Lys Asp Thr Val Pro Arg Val Tyr

690 695 700

Tyr Gly Asp Leu Phe Thr Asp Asn Gly Glu Tyr Met Ala Asn Lys Thr

705 710 715 720

Pro Tyr Tyr Asp Ala Ile Thr Ser Leu Leu Thr Ala Arg Thr Lys Phe

725 730 735

Val Ser Gly Gly Gln Ser Leu Ser Val Asp Lys Asn Asp Val Leu Thr

740 745 750

Ser Val Arg Tyr Gly Lys Gly Ala Leu Ser Ala Thr Asp Asn Gly Ser

755 760 765

Ser Asp Thr Arg Asn Gln Gly Ile Gly Val Ile Val Ser Asn Asn Pro

770 775 780

Asn Leu Asp Leu Asn Asn Asp Lys Val Thr Leu Ser Met Gly Ile Ser

785 790 795 800

His Ala His Gln Ala Tyr Arg Pro Leu Leu Leu Thr Asn Ser Gln Gly

805 810 815

Ile Val Ala Tyr Ala Thr Asp Ser Glu Val Pro Gln Asn Leu Tyr Lys

820 825 830

Thr Thr Asn Asp Lys Gly Glu Leu Thr Phe Asp Ala Ser Glu Ile Lys

835 840 845

Gly Tyr Asp Thr Val Gln Thr Ser Gly Tyr Leu Ala Val Trp Val Pro

850 855 860

Val Gly Ala Ser Asp Glu Gln Asp Ala Arg Thr Ile Ala Ser Thr Glu

865 870 875 880

Lys Asn Asn Gly Asn Ser Val Tyr His Ser Asn Ala Ala Leu Asp Ser

885 890 895

Gln Leu Ile Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Phe Gln Thr Val Pro Ser Lys

900 905 910

Asn Ala Ser Ala Asp Glu Tyr Ala Asn Val Ile Ile Ala Lys His Ala

915 920 925

Ala Asp Phe Asn Lys Trp Gly Val Thr Ser Phe Gln Met Ala Pro Gln

930 935 940

Tyr Arg Ser Ser Thr Asp Gly Ser Phe Leu Asp Ala Val Asp Thr Val

945 950 955 960

Gln Asn Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Arg Tyr Asp Leu Gly Phe Asn Ala

965 970 975

Ala Asp Gly Ser Lys Asn Pro Thr Lys Tyr Gly Thr Asp Glu Asp Leu

980 985 990

Arg Asn Ala Ile Lys Ser Leu His Ala Gln Lys Thr Tyr Asp Gly Ser

995 1000 1005

Ser Ile Gln Val Met Ala Asp Phe Val Pro Asp Gln Leu Tyr Asn Met

1010 1015 1020

Pro Leu Glu Gln Ala Val Ser Val Ile Arg Thr Asp Lys Tyr Gly Val

1025 1030 1035 1040

Asn Ser Glu Asn Pro Asp Ile Gln Asn Ile Ile Tyr Ala Ala Asn Ile

1045 1050 1055

Lys Ser Ser Gly Thr Asp Tyr Gln Ser Ile Tyr Gly Gly Lys Tyr Leu

1060 1065 1070

Ala Glu Leu Gln Lys Asn Pro Leu Phe Lys Ser Leu Phe Asp Arg Ile

1075 1080 1085

Gln Ile Ser Thr Lys Lys Thr Ile Asp Pro Asn Thr Arg Ile Thr Gln

1090 1095 1100

Trp Ser Ala Lys Tyr Phe Asn Gly Ser Asn Ile Gln Gly Lys Gly Ile

1105 1110 1115 1120

Asn Tyr Val Leu Lys Asp Trp Ala Ser Asn Lys Tyr Phe Asn Val Ser

1125 1130 1135

Ser Asn Asp Asp Met Tyr Ser Arg Leu Pro Lys Gln Leu Met Asn Gln

1140 1145 1150

Glu Ser Asn Thr Gly Phe Ile Val Asp Asp Ile Gly Val Lys Tyr Tyr

1155 1160 1165

Ser Ile Ser Gly Tyr Gln Ala Lys Asn Thr Phe Val Glu Asp Gly Asn

1170 1175 1180

Gly Glu Trp Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Gly Tyr Met Val Lys Ser Thr

1185 1190 1195 1200

Glu Glu Ser Gly Pro Leu Arg Thr Val Asn Ala Ser Ser Lys Lys Tyr

1205 1210 1215

Tyr Ile Leu Pro Asn Gly Val Glu Ile Arg Asn Ser Phe Gly Gln Asp

1220 1225 1230

Ile Gln Gly Asn Thr Tyr Tyr Phe Asp Ala Arg Gly Glu Met Val Thr

1235 1240 1245

Ser Gln Tyr Ile Ser Asp Asp Thr Gln Asn Ile Tyr Tyr Phe Asn Asn

1250 1255 1260

Asp Gly Thr Met Ala Lys

1265 1270

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<211> 3810

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

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agacaaaatg taggattttt ggatggtaca gcaaaagggt ttgatgagca aggaaatcag 540

attaaaagtg gtatagccac tgatttgtca ggtaatgttt actattttga tgctagtgga 600

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catcgtagaa gaaattatgc tggtgtattt aataatgaat ttatttactt tggattagat 720

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attgaaaaaa agattagtct tgaaaaaagc acaaaatggt tagacgattc cattaaaagt 1140

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cctagtcaac agacgggaaa tcatatatca tatgcaagcc aaccgtacag cggagacgat 1380

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agctttattc gagctcatga tagtgaggtt cagacaataa ttgccaaaat tatttctgat 1920

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tacgacgaag cttttacaga gtataatgct gacatgcaaa agatttcttc acaaaagcag 2040

tatacgcata ataatatgcc cagtgcttat gcaattttgt taactaataa agatactgtg 2100

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agtaataatc ctaatttgga tttaaataac gataaagtga ctttgagcat ggggattagt 2400

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aaaaataatg gtaattctgt ttatcattct aatgctgcat tggattctca acttatctat 2700

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aaaaatccta caaaatacgg aacagatgag gacttaagaa atgccattaa atctcttcat 3000

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tttaaatcat tgtttgatcg aatacaaatt tctactaaaa aaacgattga tccgaatact 3300

agaattacac aatggtccgc taaatatttt aatggttcta acattcaggg aaaaggaatc 3360

aactacgtct taaaagactg ggcatctaat aagtatttta atgtttctag caacgatgat 3420

atgtattctc gtctgcccaa gcagcttatg aatcaagagt caaatactgg gtttattgtt 3480

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aatggtgttg aaataaggaa cagtttcggt caagatattc agggaaatac ctactatttc 3720

gatgcacgtg gtgaaatggt aaccagtcag tatatttcag atgatacaca aaatatttac 3780

tattttaata acgatggtac gatggcaaaa 3810

Claims

1.一种催化生产微分子量右旋糖酐的右旋糖酐蔗糖酶突变体TB-7，其特征在于，所述突变体TB-7右旋糖酐蔗糖酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述右旋糖酐蔗糖酶突变体TB-7，其特征在于，所述突变体最适pH为5.5，最适温度为30℃，催化时间为4h。

3.一种编码权利要求1所述右旋糖酐蔗糖酶突变体TB-7的编码基因TB-7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求3所述的包含右旋糖酐蔗糖酶突变体TB-7编码基因TB-7的重组载体。

5.根据权利要求3所述的包含右旋糖酐蔗糖酶突变体TB-7编码基因TB-7的重组菌。

6.一种制备权利要求1所述右旋糖酐蔗糖酶突变体TB-7的方法，其特征在于，按以下步骤进行：

1)将TB-7的编码基因和表达载体pET28a(+)相连接，并将连接产物转化至大肠杆菌BL21，获得包含TB-7的重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组突变内右旋糖酐蔗糖酶的表达；

4)对酶进行活性测定。

7.根据权利要求1～6任意一项所述催化生产微分子量右旋糖酐的右旋糖酐蔗糖酶突变体TB-7的应用。