KR101169265B1 - 단백질 - Google Patents

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KR101169265B1
KR101169265B1 KR1020067008846A KR20067008846A KR101169265B1 KR 101169265 B1 KR101169265 B1 KR 101169265B1 KR 1020067008846 A KR1020067008846 A KR 1020067008846A KR 20067008846 A KR20067008846 A KR 20067008846A KR 101169265 B1 KR101169265 B1 KR 101169265B1
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리케 훼그 로렌첸
요른 보르흐 쉐
요른 달가아드 미켈슨
아르노 데 크레이
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대니스코 에이/에스
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Abstract

본 발명은 (a) 아미노산 서열 모티프 GDSX를 포함하고, X는 하나 이상의 하기 아미노산 잔기 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S임을 특징으로 하는 당지질 아실트랜스퍼라제 효소인 모효소를 선택하는 단계; (b) 변이 당지질 아실트랜스퍼라제를 생성하기 위해 하나 이상의 아미노산을 변형시키는 단계; (c) 갈락토리피드 기질 및 선택적으로는 인지질 기질 및/또는 선택적으로는 트리글리세리드 기질 상에서의 트랜스퍼라제 활성, 선택적으로는 가수분해 활성에 대해 변이 당지질 아실트랜스퍼라제를 시험하는 단계; (d) 모효소와 비교시 갈락토리피드에 대해 증가된 활성을 지닌 변이 효소를 선택하는 단계; 및 선택적으로는 (e) 다량의 변이 효소를 제조하는 단계를 포함한 변이 당지질 아실트랜스퍼라제의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 아미노산 서열 모티프 GDSX를 포함하고, X는 하나 또는 그 이상의 하기 아미노산 잔기 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S임을 특징으로 하고, 세트 2, 세트 4, 세트 6 또는 세트 7에서 한정된 어떠한 하나 이상의 아미노산 잔기에서 모서열과 비교시 하나 이상의 아미노산 변형을 포함함을 특징으로 하는 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소에 관한 것이다.
Figure 112006031978468-pct00026
변이 당지질 아실트랜스퍼라제, 활성, 아미노산, 서열, 잔기

Description

단백질{Proteins}
관련 출원 참조
하기 관련 출원을 참고함: 1999년 7월 20일 출원된 미국 특허출원 제09/750,990호; 2003년 7월 23일 출원된 미국 특허출원 제10/409,391호; 미국 특허출원 제60/489,441호; 2003년 12월 24일 출원된 영국 특허출원 GB 0330016.7호 및 2004년 1월 15일 출원된 국제출원 PCT/IB2004/000655호. 이들 각각의 출원 및 각 출원에 인용된 문헌("출원 인용 문헌") 및 출원 인용 문헌에 참조되거나 인용된 각 문헌뿐만 아니라 심사동안 진행된 특허성을 지지하는 모든 의견서가 참고문헌으로 포함되어 있다. 또한 다양한 문헌이 본 텍스트("여기 인용된 문헌")에 인용된다. 여기 인용된 문헌 및 여기 인용된 문헌 내에서 인용되거나 참조된 문헌은 참고문헌으로 포함된다.
본 발명은 변이 효소의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 신규한 변이 효소 및 이들 신규한 변이 효소의 이용에 관한 것이다.
지질:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 효소는 오랫동안 알려져 왔다(Buckley - Biochemistry 1983, 22, 5490-5493 참조). 특히 식물 및/또는 포유류 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LACATs)와 같은 글리세로인지질:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(GCATs)는 포스파티딜콜린과 콜레스테롤 사이의 지방산 전이를 촉매할 것으로 발견되었다.
Upton and Buckley(TIBS 20, May 1995, p178-179) 및 Brumlik and Buchkey(J. of Bacteriology Apr. 1996, p2060-2064)는 수성 배지 내에서 알코올 수용체로의 아실 전이를 수행할 수 있는 능력을 지닌 아에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)로부터의 리파제/아실트랜스퍼라제를 보고한다.
본 효소에 대해 아에로모나스 하이드로필라 아실트랜스퍼라제의 추정 기질 결합 도메인 및 활성 사이트가 확인되었다(Thornton et al 1988 Biochem. et Biophys. Acta. 959, 153-159 and Hilton & Buckley 1991, J. Biol. Chem. 266, 997-1000 참조).
Buckley et al(J. Bacteriol 1996, 178(7)2060-4)는 Ser16, Asp116 및 His291가 유지되는 효소 활성에 대해 보유되어야 하는 필수적 아미노산임을 보고하였다.
Robertson et al(J. Bio. Chem. 1994, 269, 2146-50)은 본 발명에 포함되지 않은 아에로모나스 하이드로필라 아실트랜스퍼라제의 일부 특이적 돌연변이 즉, Y226F, Y230F, Y30F, F13S, S18G, S18V를 보고하였다.
발명의 요약 관점
본 발명은 모효소와 비교시 증가된 트랜스퍼라제 활성을 지닌, 지질 아실트랜스퍼라제 효소를 포함한 GDSx의 특이적 변이체의 발견을 나타낸다. 특히 본 발명에 따른 변이체는 모효소와 비교시 아실 공여체로서 갈락토리피드를 이용하는 증가된 트랜스퍼라제 활성을 지닌다. 이들 지질 아실트랜스퍼라제는 여기서 당지질 아실트랜스퍼라제로 표기된다. 본 발명에 따른 변이체는 인지질 트랜스퍼라제 활성(GL:PL 비율)과 비교시 아실 공여체로서 갈락토리피드를 이용하는 트랜스퍼라제 활성의 증가된 비율 및/또는 갈락토리피드 가수분해 활성(GLt:GLh 비율)과 비교시 아실 공여체로서 갈락토리피드를 이용하는 트랜스퍼라제 활성의 증가된 비율을 추가적으로 지닌다.
첫 번째 관점에 따라 본 발명은 본 발명은 (a) 아미노산 서열 모티프 GDSX를 포함하고, X는 하나 이상의 하기 아미노산 잔기 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S임을 특징으로 하는 지질 아실트랜스퍼라제 효소인 모효소를 선택하는 단계; (b) 변이 지질 아실트랜스퍼라제를 생성하기 위해 하나 이상의 아미노산을 변형시키는 단계; (c) 갈락토리피드 기질 및 선택적으로는 인지질 기질 및/또는 선택적으로는 트리글리세리드 기질 상에서의 활성에 대해 변이 지질 아실트랜스퍼라제를 시험하는 단계; (d) 모효소와 비교시 갈락토리피드에 대해 증가된 활성을 지닌 변이 효소를 선택하는 단계; 및 선택적으로는 (e) 다량의 변이 효소를 제조하는 단계를 포함한 변이 당지질 아실트랜스퍼라제의 제조 방법을 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 아미노산 서열 모티프 GDSX를 포함하고, X는 하나 또는 그 이상의 하기 아미노산 잔기 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S임을 특징으로 하고, 세트 2, 세트 4, 세트 6 또는 세트 7에서 한정된(하기 한정됨) 어떠한 하나 이상의 아미노산 잔기에서 모서열과 비교시 하나 이상의 아미노산 변형을 포함함을 특징으로 하는 변이 당지질 아실트랜스퍼라제 효소를 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 아미노산 서열 모티프 GDSX를 포함하고, X는 하나 또는 그 이상의 하기 아미노산 잔기 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S임을 특징으로 하고, 여기에 설명된 바와 같이 상기 모서열이 바람직하게는 1IVN.PDB 및/또는 1DEO.PDB와의 P10480 결정 구조 배위의 구조적 정렬에 의해 수득된 여기에 한정된 P10480의 구조적 모델과 구조적으로 정렬됨으로서 확인된 세트 2 또는 세트 4 또는 세트 6 또는 세트 7에서 상세하게 설명된(하기 한정됨) 어떠한 하나 이상의 아미노산 잔기에서 모서열과 비교시 하나 이상의 아미노산 변형을 포함함을 특징으로 하는 변이 당지질 아실트랜스퍼라제 효소를 제공한다.
또한 본 발명은 아미노산 서열 모티프 GDSX를 포함하고, X는 하나 또는 그 이상의 하기 아미노산 잔기 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S임을 특징으로 하고, 설명된 바와 같이 최상의 일치 중복을 보증하기 위해 상기 모서열이 pfam 공통 서열(consensus sequence)(서열번호: 1)에 정렬되고 P10480의 구조적 모델에 따라 변형될 때 확인된 세트 2에서 지침된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 모서열과 비교시 하나 이상의 아미노산 변형을 포함함을 특징으로 하는 변이 당지질 아실트랜스퍼라제 효소를 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 서열번호 2와의 서열 정렬에 의해 확인된 세트 2 또는 세트 4 또는 세트 6 또는 세트 7(하기 한정됨)에서 한정된 어떠한 하나 이상의 아미노산 잔기에서 하나 이상의 아미노산 변형을 제외하고 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 45에 나타난 서열을 포함함을 특징으로 하는 변이 당지질 아실트랜스퍼라제를 제공한다.
또다른 관점에따라 본 발명은 여기에 설명된 바와 같이 상기 모서열이 바람직하게는 1IVN.PDB 및/또는 1DEO.PDB와의 P10480 결정 구조 배위의 구조적 정렬에 의해 수득된 여기에 한정된 P10480의 구조적 모델과 구조적으로 정렬됨으로서 확인된 세트 2 또는 세트 4 또는 세트 6 또는 세트 7에서 한정된 어떠한 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 제외하고 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 45에 나타난 서열을 포함함을 특징으로 하는 변이 당지질 아실트랜스퍼라제를 제공한다.
또다른 관점에 따라 본 발명은 설명된 바와 같이 최상의 일치 중복(도 55 참조)을 보증하기 위해 상기 모서열이 pfam 공통 서열(서열번호: 1)에 정렬되고 P10480의 구조적 모델에 따라 변형될 때 확인된 세트 2에서 지침된 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 제외하고 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 45에 나타난 서열을 포함함을 특징으로 하는 변이 당지질 아실트랜스퍼라제를 제공한다.
또한 본 발명은 부분적 가수분해 생성물 즉, 리소-당지질(lyso-glycolipid)을 생성하기 위해 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소로 당지질(즉, 디갈락토실 디글리세리드(DGDG) 또는 모노갈락토실 디글리세리드(MGDG))을 처리함으로서 디갈락토실 모노글리세리드(DGMG) 또는 모노갈락토실 모노글리세리드(MGMG)와 같은 리소-당지질을 제조하기 위해 기질(바람직하게는 식료품)의 제조시 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 당지질분해효소의 이용을 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 부분적 가수분해 생성물 즉, 리소-인지질(lyso-phospholipid)을 생성하기 위해 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소로 인지질(즉, 레시틴)을 처리함으로서 리소레시틴과 같은 리소-인지질을 제조하기 위해 기질(바람직하게는 식료품)의 제조시 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소의 이용을 제공한다.
하나의 관점에서 본 발명은 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소를 하나 이상의 식료품 성분에 첨가하는 것을 포함한 식료품의 제조 방법에 관한 것이다.
또다른 관점에서 본 발명은 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소를 반죽에 첨가하는 것을 포함한, 반죽으로부터의 베이크된 제품의 제조 방법에 관한 것이다.
또다른 관점에서 본 발명은 리소인지질을 제조하기 위한 계란-주성분 제품의 제조시 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소의 이용을 제공한다.
또다른 관점에서 리소인지질을 제조하기 위해 계란 또는 계란-주성분 제품에 본 발명에 따른 변이 지질분해효소를 첨가하는 것을 포함한 계란 또는 계란-주성분 제품의 시험 방법이 제공된다.
본 발명의 변이체는 WO02/065854호와 유사한 인스턴트 국수와 같은 스낵 음식의 제조 방법에 이용된다.
본 발명은 바람직한 기술적 효과 또는 예를 들어 식료품('기술적 효과'에 기입된 바와 같은) 내에서의 기술적 효과의 결합을 유발하기 위해 본 발명에 따른 변이 지질 아실트랜스퍼라제의 이용에 관한 것이다.
또다른 관점에서 본 발명은 극성 지질(즉, 인지질 및/또는 당지질)의 주요 부분을 가수분해하기 위해 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소로 식용유 또는 식물유를 처리하는 것을 포함한, 식물유 또는 식용유의 효소적 탈검(degumming) 방법을 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소와 상기 인지질을 혼합시키는 것을 포함한, 지방 아실 그룹을 가수분해하기 위해 인지질을 처리하는 것을 포함한 방법을 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 인지질의 주요 부분을 가수분해하기 위해 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소로 기름을 처리하는 단계 및 기름으로부터 가수분해된 인지질을 함유한 수성상을 분리하는 단계를 포함한 식용유 내의 인지질 함량을 감소시키는 방법을 제공한다.
또한 지질분해효소의 폴리펩타이드를 코드하는 뉴클레오타이드 서열을 발현하는 것이 가능한 숙주 세포를 상기 변이 지질분해효소를 코드하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한 재조합 핵산으로 형질전환시키는 단계 및 핵산이 발현되는 조건하에서 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 변이 지질분해효소를 채취하는 단계를 포함한 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소의 제조 방법이 제공된다.
또다른 관점에서 본 발명은 탄수화물 에스테르 및/또는 단백질 에스테르 및/또는 단백질 서브유니트 에스테르 및/또는 히드록시산(hydroxy acid) 에스테르와 같은 고가 생성물을 제조하기 위해 극성 지질(바람직하게는 당지질)의 생물변환(bioconversion)시 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소의 이용에 관한 것이다.
극성 지질을 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소와 혼합시키는 것을 포함한 극성 지질(바람직하게는 당지질)을 고가 생성물로 생물변환시키는 방법.
또한 본 발명은 본 발명에 따르거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 고정된 변이 지질분해효소에 관한 것이다.
본 발명의 관점은 청구범위 및 하기 설명에 나타나 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 서열에 관한 또다른 관점은 하기를 포함한다: 본 발명의 서열을 포함한 컨스트럭트; 본 발명에서 사용된 서열을 포함한 벡터; 본 발명에서 사용되기 위한 서열을 포함한 플라스미드; 본 발명에서 사용되기 위한 서열을 포함한 형질전환된 세포; 본 발명에서 사용되기 위한 서열을 포함한 형질전환된 조직; 본 발명에서 사용되기 위한 서열을 포함한 형질전환된 기관; 본 발명에서 사용되기 위한 서열을 포함한 형질전환된 숙주; 본 발명에서 사용되기 위한 서열을 포함한 형질전환된 생물체. 또한 본 발명은 숙주 세포 내에서의 발현과 같이 본 발명에서 사용되기 위한 서열을 이용하여 이를 발현시키는 방법을 포함한다; 이를 이전시키는 방법을 포함. 또한 본 발명은 숙주 세포로부터의 분리와 같이 뉴클레오타이드 서열을 분리하는 방법을 포함한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 아미노산 서열에 관한 또다른 관점은 하기를 포함한다: 본 발명에 사용되기 위한 아미노산 서열을 인코드하는 컨스트럭트; 본 발명에서 사용되기 위한 아미노산 서열을 인코드하는 벡터; 본 발명에서 사용되기 위한 아미노산 서열을 인코드하는 플라스미드; 본 발명에서 사용되기 위한 아미노산 서열을 발현하는 형질전환된 세포; 본 발명에서 사용되기 위한 아미노산 서열을 발현하는 형질전환된 조직; 본 발명에서 사용되기 위한 아미노산 서열을 발현하는 기관; 본 발명에서 사용되기 위한 아미노산 서열을 발현하는 형질전환된 숙주; 본 발명에서 사용되기 위한 아미노산 서열을 발현하는 형질전환된 생물체. 또한 본 발명은 숙주 세포 내에서의 발현과 같이 본 발명에서 사용되기 위한 서열을 이용하여 이를 정제하는 방법을 포함한다; 이를 이전시킨 후 상기 서열을 정제하는 방법을 포함.
참고를 용이하게 하기 위해 본 발명의 이들 및 또다른 관점이 적당한 섹션 표제로 논의된다. 그러나 각 섹션 하의 지침은 특정한 섹션에 항상 한정적인 것은 아니다.
세트의 한정
아미노산 세트:
아미노산 세트 1(이들은 1IVN 내의 아미노산임을 주지 - 도 57 및 도 58)
Figure 112006031978468-pct00001
GDSx 및 촉매 잔기와 같은 매우 보존된 모티프가 세트 1로부터 해제되었다. 의심의 여지를 회피하기 위해 세트 1은 1IVN 모델의 활성 사이트 내의 글리세롤의 중심 탄소 원자의 10Å 내의 아미노산 잔기를 한정한다.
아미노산 세트 2:
아미노산 세트 2(아미노산의 번호는 P10480 성숙 서열 내의 아미노산 서열을 나타냄을 주지)
Figure 112006031978468-pct00002
세트 2와 비교시 세트 1 내의 선택된 아미노산 잔기의 표
IVN 모델
IVN A.hyd 상동체		 P10480
성숙 서열 잔기
번호
PFAM 구조
Gly8 Gly32
Asp9 Asp33
Ser10 Ser34
Leu11 Leu35 Leu17
Ser12 Ser36 Ser18
Lys22
Met23
Tyr15 Gly58 Gly40
Gly44 Asn98 Asn80
Asp45 Pro99 Pro81
Thr46 Lys100 Lys82
Asn87
Asn88
Glu69 Trp129 Trp111
Leu70 Val130 Val112
Gly71 Gly131
Gly72 Ala132 Ala114
Asn73 Ans133
Asp74 Asp134
Gly75 Tyr135 Tyr117
Leu76 Leu136 Leu118
Gln106 Pro174 Pro156
Ile107 Gly177 Gly159
Arg108 Gln178 Gln160
Leu109 Asn179 Asn162
Pro110 180 to 190 Pro162
Tyr113 Ser163
Ala164
Arg165
Ser166
Gln167
Lys168
Val169
Val170
Glu171
Ala172
Phe121 His198 Tyr197 Tyr179
His198 His180
Asn199 Asn181
Phe139 Met227 Met209
Phe140 Leu228 Leu210
Met141 Arg229 Arg211
Tyr145 Asn233 Asn215
Lys284
Met151 Met303 Met285
Asp154 Asp306
Gly155 Gln307 Gln289
Ile156 Val308 Val290
His157 His309
Pro158 Pro310
아미노산 세트 3:
아미노산 세트 3은 세트 2와 동일하나 아에로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida)(서열번호: 28) 코딩 서열을 나타낸다 즉, 시그날 서열(서열번호: 28)을 포함한 단백질과 비교시 성숙 단백질(서열번호: 2)의 아미노산 번호 사이의 차이를 나타내는 바와 같이 세트 아미노산 잔기 번호는 세트 3에서 18이 더 높다.
아에로모나스 살모니시다 GDSX(서열번호: 28) 및 아에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)의 성숙 단백질은 5개 아미노산이 다르다. 이들은 Thr3Ser, Gln182Lys, Glu309Ala, Ser310Asn, Gly318-이고, 살모니시다 잔기는 첫 번째에 기입되어 있고, 하이드로필라 잔기는 마지막에 기입되어 있다(도 59). 하이드로필라 단백질은 단지 317개 아미노산 길이이고 318 위치에 잔기가 부재한다. 아에로모나스 살모니시다 GDSX는 아에로모나스 하이드로필라보다 갈락토리피드 기질과 같은 극성 지질에 매우 높은 활성을 지닌다. 사이트 스캐닝이 모든 5개 아미노산 위치 상에서 수행되었다.
아미노산 세트 4:
아미노산 세트 4는 S3, Q182, E309, S310 및 -318이다.
아미노산 세트 5:
F13S, D15N, S18G, S18V, Y30F, D116N, D116E, D157N, Y226F, D228N Y230F
아미노산 세트 6:
아미노산 세트 6은 Ser3, Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164, Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Gln182, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309, Ser310, -318이다.
세트 6 내의 아미노산 번호는 P10480 내의 아미노산 잔기를 나타낸다(서열번호: 2) - 다른 서열 백본 내의 상응하는 아미노산은 P10480 및/또는 1IVN에 대한 상동성 정렬 및/또는 구조적 정렬에 의해 결정될 수 있다.
아미노산 세트 7:
아미노산 세트 7은 Ser3, Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164, Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Gln182, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309, Ser310, -318, Y30X(X는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W로부터 선택됨), Y226X(X는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W로부터 선택됨), S18X(X는 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로부터 선택됨), D157X(X는 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로부터 선택됨)이다.
세트 7 내의 아미노산 번호는 P10480 내의 아미노산 잔기를 나타낸다(서열번호: 2) - 다른 서열 백본 내의 상응하는 아미노산은 P10480 및/또는 1IVN에 대한 상동성 정렬 및/또는 구조적 정렬에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 상세한 관점
바람직하게는, 모(parent) 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 하기 아미노산 서열의 어느 하나를 포함한다: 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 45 또는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 45에 나타난 서열의 어느 하나와 75% 이상의 동일성을 지닌 아미노산 서열.
적당하게는, 모 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 하기 아미노산 서열의 어느 하나를 포함한다: 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 35, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44 또는 서열번호 46 또는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 35, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44 또는 서열번호 46에 나타난 서열의 어느 하나와 75% 이상의 동일성을 지닌 아미노산 서열.
적당하게는, 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 35, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44 또는 서열번호 46에 나타난 서열의 어느 하나와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 지닌다.
바람직하게는 모효소는 참고 서열(서열번호 2)과의 정렬되거나 pfam 공통 서열에 정렬되고 P1040의 구조적 모델에 따라 변형될 때 세트 2 또는 세트 4 또는 세트 6 또는 세트 7 내에서 한정된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 변형된다.
적당하게는 변이 효소는 모효소와 비교할 때 인지질 및/또는 트리글리세리드 상에서의 활성과 비교시 갈락토리피드 상의 활성의 증가된 비율을 지닌다.
적당하게는 본 발명에 따른 방법은:
(ⅰ) 갈락토리피드 기질로부터의 트랜스퍼라제 활성, 및
(ⅱ) 인지질 기질로부터의 트랜스퍼라제 활성에 대해
변이 지질 아실트랜스퍼라제를 시험하는 단계; 및
모효소와 비교시 인지질 대비 갈락토리피드로부터의 트랜스퍼라제 활성의 증가된 비율을 지닌 변이 효소를 선택하는 단계를 포함한다.
적당하게는 본 발명에 따른 변이 효소의 인지질과 비교시 갈락토리피드로부터의 트랜스퍼라제 활성의 비율은 적어도 1 이상, 적어도 2 이상, 적어도 3 이상, 적어도 4 이상 또는 적어도 5 이상이다.
적당하게는 본 발명에 따른 방법은
(a) 갈락토리피드 기질로부터의 트랜스퍼라제 활성, 및
(b) 갈락토리피드 기질로 상의 가수분해 활성에 대해
변이 지질 아실트랜스퍼라제를 시험하는 단계; 및
모효소와 비교시 당지질 상의 가수분해 활성 대비 갈락토리피드로부터의 트랜스퍼라제 활성의 증가된 비율을 지닌 변이 효소를 선택하는 단계를 포함한다.
적당하게는 갈락토리피드 상의 가수분해 활성과 비교시 갈락토리피드 상의 트랜스퍼라제 활성의 비율은 1 이상, 적어도 1.5 이상, 적어도 2 이상, 적어도 4 이상 또는 적어도 5 이상이다.
갈락토리피드 및/또는 인지질로부터의 트랜스퍼라제 및 가수분해 활성을 측정하기 위한 분석은 실시예 8에 나타나 있다.
"갈락토리피드에 대해 증가된 활성"이라는 용어는 모효소와 비교시 지질 아실 공여체가 갈락토리피드일 때 증가된(즉, 높은) 트랜스퍼라제 활성을 지니거나(갈락토리피드 트랜스퍼라제 활성) 모효소와 비교시 인지질 트랜스퍼라제 활성 대비 증가된 비율의 갈락토리피드 트랜스퍼라제 활성을 지니거나(GLt:PLt 비율) 모효소과 비교시와 비교시 갈락토리피드 가수분해 활성 대비 증가된 비율의 갈락토리피드 트랜스퍼라제 활성을 지님(GLt:GLh 비율)을 의미한다.
적당하게는 모효소 대비 변이 효소는 증가된 갈락토리피드 트랜스퍼라제 활성 및 동일하거나 더 적은 갈락토리피드 가수분해 활성을 지닌다. 즉, 적당하게는 변이 효소는 모효소와 비교시 그의 갈락토리피드 가수분해 활성 대비 더 높은 갈락토리피드 트랜스퍼라제 활성을 지닌다. 적당하게는 변이 효소는 갈락토리피드를 단순히 가수분해하기보다는 갈락토리피드로부터 아실 수용체로 아실기를 우선적으로 전이시킨다.
하나의 실시태양에서 본 발명에 따른 효소는 모효소와 비교시 인지질에 대해 증가된 트랜스퍼라제 활성(즉, 증가된 인지질 트랜스퍼라제 활성)을 지닌다. 이러한 증가된 인지질 트랜스퍼라제 활성은 갈락토리피드에 대해 증가된 활성과는 무관하다. 그러나 적당하게는 변이 효소는 증가된 갈락토리피드 트랜스퍼라제 활성 및 증가된 인지질 트랜스퍼라제 활성을 지닌다.
하나의 실시태양에서 본 발명은 아미노산 서열 모티프 GDSX를 포함하고, X는 하나 또는 그 이상의 하기 아미노산 잔기 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S임을 특징으로 하고, 모효소와 비교시 인지질에 대한 증가된 활성, 바람직하게는 증가된 인지질 트랜스퍼라제 활성을 지니고, 세트 2 또는 세트 4 또는 세트 6 또는 세트 7에서 한정된 어떠한 하나 이상의 아미노산 잔기에서 모서열과 비교시 하나 이상의 아미노산 변형을 포함함을 특징으로 하는 변이 당지질 아실트랜스퍼라제 효소를 제공한다.
여기서 사용된 "변형"이라는 용어는 첨가, 치환 및/또는 삭제를 의미한다. 바람직하게는 "변형"이라는 용어는 "치환"을 의미한다.
의심의 여지를 회피하기 위해 아미노산이 모효소에서 치환될 때 바람직하게는 모효소 내의 위치에서 본래 발견되는 것과 다른 아미노산으로 치환되어 변이 효소를 생성시킨다. 즉, "치환"이라는 용어는 동일한 아미노산으로의 아미노산 대체를 포함시키지 않는다.
바람직하게는 모효소는 서열번호 2 및/또는 서열번호 28에 나타난 아미노산 서열을 포함한 효소이다.
바람직하게는 변이 효소는 세트 2 또는 세트 4 또는 세트 6 또는 세트 7에서 한정된 어떠한 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 제외하고 서열번호 2에 나타난 아미노산 서열을 포함한 효소이다.
하나의 실시태양에서 바람직하게는 변이 효소는 세트 4에서 한정된 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기에서 모서열과 비교시 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다.
적당하게는 변이 효소는 모효소와 비교시 하나 이상의 하기 아미노산 변형을 포함한다:
S3E, A, G, K, M, Y, R, P, N, T 또는 G
E309Q, R 또는 A, 바람직하게는 Q 또는 R
-318Y, H, S 또는 Y, 바람직하게는 Y
바람직하게는 GDSX 모티프의 X는 L이다. 따라서 바람직하게는 모효소는 아미노산 모티프 GDSL을 포함한다.
바람직하게는 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소의 제조 방법은 하나 이상의 하기 단계를 더욱 포함한다:
1) 구조적 상동성 맵핑 또는
2) 서열 상동성 정렬
적당하게는 구조적 상동성 맵핑은 하나 이상의 하기 단계를 포함한다:
ⅰ) 모서열을 도 52에 나타난 구조적 모델(1IVN.PDB)과 정렬시키는 단계;
ⅱ) 활성 사이트(도 53 참조) 내의 글리세롤 분자의 중심 탄소 원자의 중심에 놓인 10Å 구면 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 선택하는 단계(세트 1 또는 세트 2에서 한정된 하나 이상의 아미노산 잔기와 같은); 및
ⅲ) 상기 모서열 내에서 단계 (ⅱ)에 따라 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시키는 단계
하나의 실시태양에서 선택된 아미노산 잔기는 활성 사이트(도 53 참조) 내의 글리세롤 분자의 중심 탄소 원자의 중심에 놓인 9Å, 바람직하게는 8Å, 7Å, 6Å, 5Å, 4Å, 또는 3Å 구면 내의 잔기이다.
적당하게는 구조적 상동성 맵핑은 하나 이상의 하기 단계를 포함한다:
ⅰ) 모서열을 도 52에 나타난 구조적 모델 (1IVN.PDB)과 정렬시키는 단계;
ⅱ) 활성 사이트(도 53 참조) 내의 글리세롤 분자의 중심 탄소 원자의 중심에 놓인 10Å 구면 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 선택하는 단계(세트 1 또는 세트 2에서 한정된 하나 이상의 아미노산 잔기와 같은); 및
ⅲ) 단계 (ⅱ)에 따라 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 크게 보존적인지(특히 활성 사이트 잔기인지 또는 GDSx 모티프의 일부인지 또는 GANDY 모티프의 일부인지) 여부를 측정하는 단계; 및
ⅳ) 상기 모서열에서 단계 (ⅲ)에 따라 확인된 보존된 구역을 제외하고 단계 (ⅱ)에 따라 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시키는 단계
하나의 실시태양에서 선택된 아미노산 잔기는 활성 사이트(도 53 참조) 내의 글리세롤 분자의 중심 탄소 원자의 중심에 놓인 9Å, 바람직하게는 8Å, 7Å, 6Å, 5Å, 4Å, 또는 3Å 구면 내의 잔기이다.
상기 기술된 구조적 상동성 맵핑의 대안으로, 또는 이와 결합하여 구조적 상동성 맵핑은 P10480 모델 및 1IVN과 중복된 pfam 정렬(정렬 2, 도 56)로부터 유래된 특이적 루프 구역(LRs) 또는 중개 구역(IVRs)을 선택함으로서 수행될 수 있다. 루프 구역(LRs) 또는 중개 구역(IVRs)는 하기 표에서 한정된다:
Figure 112006031978468-pct00003
본 발명의 일부 실시태양에서 변이 아실트랜스퍼라제 효소는 세트 1-4 및 6-7의 어느 하나에서 한정된 하나 이상의 아미노산에서의 아미노산 변형을 포함할 뿐만 아니라 상기 한정된 하나 이상의 중개 구역(IVR1-6) 내(바람직하게는 하나 이상의 IVRs 3, 5 및 6 내, 더욱 바람직하게는 IVR 5 또는 IVR 6 내) 및/또는 상기-한정된 하나 이상의 루프 구역(LR1-5) 내(바람직하게는 하나 이상의 LR1, LR2 또는 LR5 내, 더욱 바람직하게는 LR5 내) 적어도 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다.
하나의 실시태양에서 본 발명에 따르거나 본 발명에 의해 수득된 변이 아실트랜스퍼라제는 하나 이상의 세트 2, 4, 6 및 7에 의해 한정될 뿐만 아니라 하나 이상의 IVRs 1-6 내(바람직하게는 IVR 3, 5 내 또는 6, 더욱 바람직하게는 IVR 5 또는 IVR 6 내) 또는 하나 이상의 LR1-5 내(바람직하게는 LR1, LR2 또는 LR5 내, 더욱 바람직하게는 LR5 내)에도 있는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다.
적당하게는 본 발명에 따르거나 본 발명에 의해 수득된 변이 아실트랜스퍼라제는 세트 1 또는 2 내에 있을 뿐만 아니라 IVR 5 내에도 있는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다.
적당하게는 본 발명에 따르거나 본 발명에 의해 수득된 변이 아실트랜스퍼라제는 세트 1 또는 2 내에 있을 뿐만 아니라 IVR 6 내에도 있는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다.
적당하게는 본 발명에 따르거나 본 발명에 의해 수득된 변이 아실트랜스퍼라제는 세트 1 또는 2 내에 있을 뿐만 아니라 LR1 내에도 있는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다.
적당하게는 본 발명에 따르거나 본 발명에 의해 수득된 변이 아실트랜스퍼라제는 세트 1 또는 2 내에 있을 뿐만 아니라 LR2 내에도 있는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다.
유사하게는 본 발명의 일부 실시태양에서 변이 아실트랜스퍼라제 효소는 활성 사이트(도 53 참조) 내의 글리세롤 분자의 중심 탄소 원자의 중심에 놓인 10Å, 바람직하게는 9Å, 8Å, 7Å, 6Å, 5Å, 4Å, 또는 3Å 구면 내의 잔기인 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 아미노산 변형을 포함할 뿐만 아니라 상기 한정된 하나 이상의 중개 구역(IVR1-6) 내(바람직하게는 하나 이상의 IVRs 3, 5 및 6 내, 더욱 바람직하게는 IVR 5 또는 IVR 6 내) 및/또는 상기-한정된 하나 이상의 루프 구역(LR1-5) 내(바람직하게는 하나 이상의 LR1, LR2 또는 LR5 내, 더욱 바람직하게는 LR5 내) 적어도 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다.
하나의 실시태양에서 바람직하게는 아미노산 변형은 10Å 구면 내에 있고 LR5 내에도 있는 잔기인 하나 이상의 아미노산 잔기이다.
따라서 구조적 상동성 맵핑은 하나 이상의 하기의 단계를 포함한다:
ⅰ) 모서열을 도 52에 나타난 구조적 모델(1IVN.PDB)과 정렬시키는 단계;
ⅱ) 활성 사이트(도 53 참조) 내의 글리세롤 분자의 중심 탄소 원자의 중심에 놓인 10Å 구면 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 선택하는 단계(세트 1 또는 세트 2에서 한정된 하나 이상의 아미노산 잔기와 같은) 및/또는 IVR1-6 내에서(바람직하게는 IVR 3, 5 또는 6 내, 더욱 바람직하게는 IVR 5 또는 IVR 6 내) 하나 이상의 아미노산 잔기를 선택하는 단계 및/또는 LR1-5 내에서(바람직하게는 LR1, LR2 또는 LR5 내, 더욱 바람직하게는 LR5 내) 하나 이상의 아미노산 잔기를 선택하는 단계; 및
ⅲ) 상기 모서열 내에서 단계 (ⅱ)에 따라 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시키는 단계
하나의 실시태양에서 선택된 아미노산 잔기는 활성 사이트(도 53 참조) 내의 글리세롤 분자의 중심 탄소 원자의 중심에 놓인 9Å, 바람직하게는 8Å, 7Å, 6Å, 5Å, 4Å, 또는 3Å 구면 내의 잔기이다.
적당하게는 구조적 상동성 맵핑은 하나 이상의 하기 단계를 포함한다:
ⅰ) 모서열을 도 52에 나타난 구조적 모델(1IVN.PDB)과 정렬시키는 단계;
ⅱ) 활성 사이트(도 53 참조) 내의 글리세롤 분자의 중심 탄소 원자의 중심에 놓인 10Å 구면 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 선택하는 단계(세트 1 또는 세트 2에서 한정된 하나 이상의 아미노산 잔기와 같은) 및/또는 IVR1-6 내에서(바람직하게는 IVR 3, 5 또는 6 내, 더욱 바람직하게는 IVR 5 또는 IVR 6 내) 하나 이상의 아미노산 잔기를 선택하는 단계 및/또는 LR1-5 내에서(바람직하게는 LR1, LR2 또는 LR5 내, 더욱 바람직하게는 LR5 내) 하나 이상의 아미노산 잔기를 선택하는 단계; 및
ⅲ) 단계 (ⅱ)에 따라 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 크게 보존적인지(특히 활성 사이트 잔기인지 또는 GDSx 모티프의 일부인지 또는 GANDY 모티프의 일부인지) 여부를 측정하는 단계; 및
ⅳ) 상기 모서열에서 단계 (ⅲ)에 따라 확인된 보존된 구역을 제외하고 단계 (ⅱ)에 따라 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시키는 단계
적당하게는 상기 상술된 방법에서 선택된 하나 이상의 아미노산은 활성 사이트(도 53 참조) 내의 글리세롤 분자의 중심 탄소 원자의 중심에 놓인 10Å 구면 내에 존재할 뿐만 아니라 IVR1-6 내(바람직하게는 IVR 3, 5 또는 6 내, 더욱 바람직하게는 IVR 5 또는 IVR 6 내) 또는 LR1-5 내(바람직하게는 LR1, LR2 또는 LR5 내, 더욱 바람직하게는 LR5 내)에도 존재한다.
하나의 실시태양에서 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 변형은 LR5 내에 존재한다. 변형(들)이 LR5 내에 존재하는 경우 변형은 세트 5에서 한정된 것이 아니다. 적당하게는 하나 이상의 아미노산 변형은 LR5에 의해 한정된 구역 내에 포함될 뿐만 아니라 하나 이상의 세트 2, 세트 4, 세트 6 또는 세트 7 내의 아미노산을 구성한다.
적당하게는 서열 상동성 정렬은 하나 이상의 하기 단계를 포함한다:
ⅰ) 첫 번째 모 지질 아실트랜스퍼라제를 선택하는 단계;
ⅱ) 바람직한 활성을 지닌 두 번째 관련 지질 아실트랜스퍼라제를 확인하는 단계;
ⅲ) 상기 첫 번째 모 지질 아실트랜스퍼라제와 두 번째 관련 지질 아실트랜스퍼라제를 정렬시키는 단계;
ⅳ) 두 서열 사이에서 차이를 보이는 아미노산 잔기를 확인하는 단계; 및
ⅴ) 상기 모 지질 아실트랜스퍼라제 내에서 단계 (ⅳ)에 따라 확인된 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시키는 단계
적당하게는 서열 상동성 정렬은 하나 이상의 하기 단계를 포함한다:
ⅰ) 첫 번째 모 지질 아실트랜스퍼라제를 선택하는 단계;
ⅱ) 바람직한 활성을 지닌 두 번째 관련 지질 아실트랜스퍼라제를 확인하는 단계;
ⅲ) 상기 첫 번째 모 지질 아실트랜스퍼라제와 두 번째 관련 지질 아실트랜스퍼라제를 정렬시키는 단계;
ⅳ) 두 서열 사이에서 차이를 보이는 아미노산 잔기를 확인하는 단계; 및
ⅴ) 단계 (ⅳ)에 따라 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 크게 보존적인지(특히 활성 사이트 잔기인지 또는 GDSx 모티프의 일부인지 또는 GANDY 모티프의 일부인지) 여부를 측정하는 단계; 및
ⅵ) 상기 모 지질 아실트랜스퍼라제 내에서 단계 (ⅴ)에 따라 확인된 보존 구역을 제외하고 단계 (ⅳ)에 따라 확인된 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시키는 단계
적당하게는 상기 첫 번째 모 지질 아실트랜스퍼라제는 하나 이상의 하기 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 45
적당하게는 상기 두 번째 관련 지질 아실트랜스퍼라제는 하나 이상의 하기 아미노산 서열을 포함한다: 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 45
변이 효소는 모효소와 비교시 적어도 하나 이상의 아미노산 변형을 포함해야 한다. 일부 실시태양에서 변이 효소는 모효소와 비교시 적어도 2 이상, 바람직하게는 적어도 3 이상, 바람직하게는 적어도 4 이상, 바람직하게는 적어도 5 이상, 바람직하게는 적어도 6 이상, 바람직하게는 적어도 7 이상, 바람직하게는 적어도 8 이상, 바람직하게는 적어도 9 이상, 바람직하게는 적어도 10 이상의 아미노산 변형을 포함한다.
적당하게는 본 발명에 따른 방법은 효소 조성물 및/또는 빵 개선 조성물과 같은 식료품 조성물 내로 변이 효소를 포뮬레이트시키는 단계를 더욱 포함한다.
GDSx 폴리펩타이드 서열(모서열)을 서열번호 2와 정렬시키기 위해 이원(pairwise) 정렬과 같은 서열 정렬이 이용될 수 있다(http://www.ebi.ac.uk/emboss /align/index.html). 따라서 서열번호 2에 대해 세트 2 또는 세트 4 또는 세트 6 또는 세트 7에서 한정된 하나 이상의 아미노산에 상응하는 대안적 모(parental) GDSx 폴리펩타이드 내의 동등한 아미노산이 측정되고 변형될 수 있다. 당업자가 용이하게 이해할 수 있기 때문에 엠보스(emboss) 이원 정렬를 이용시 일반적으로 표준 셋팅이면 충분하다. 상응하는 잔기는 두 서열의 전체 길이를 포함하는 정렬을 수행하기 위해 "바늘"을 이용하여 확인될 수 있다. 그러나 "물"을 이용하여 두 서열 사이의 유사성의 최상의 구역을 발견하는 것도 가능하다.
대안으로, 특히 모 GDSx 폴리펩타이드가 서열번호 2와 낮은 상동성을 공유하는 경우 서열번호 2에 대해 세트 2 또는 세트 4 또는 세트 6 또는 세트 7에서 한정된 하나 이상의 아미노산에 상응하는 대안적 모 GDSx 폴리펩타이드 내의 상응하는 아미노산은 '딥 뷰 스위스-PDB 뷰어(Deep View Swiss-PDB viewer)'(www.expasy.org /spdbv/로부터 수득된)를 이용하여 P10480 유래 구조적 모델과 1IVN.PDB 및 1DEO.PDB의 구조적 배위를 비교함으로서 수득된 P10480의 구조적 모델에 대한 구조적 정렬에 의해 측정될 수 있다(도 53 및 실시예 1). 동등한 잔기는 세트 1 및 세트 2를 비교하는 표에서 나타난 바와 같이(상기 "세트의 정의"의 표제의 섹션 참조) 수득된 P10480의 구조적 모델 내의 잔기에 중복되는 것 또는 가장 가까운 근접성을 지닌 것으로 확인된다. 이러한 방식으로 다른 GDSX 폴리펩타이드는 1IVN.PDB 결정 배위 및 측정된 세트 1에 대해 동등한 잔기에 대해 비교될 수 있다.
대안으로, 특히 모 GDSx 폴리펩타이드가 서열번호 2와 낮은 상동성을 공유하는 경우 서열번호 2에 대해 세트 2 또는 세트 4 또는 세트 6 또는 세트 7에서 한정된 하나 이상의 아미노산에 상응하는 대안적 모 GDSx 폴리펩타이드 내의 상응하는 아미노산은 정렬 1(도 55)에 나타난 구조적 정렬에 기반하여 변형된 PFAM 데이터베이스(PFAM 공통(consensus))로부터 수득된 정렬로부터 측정될 수 있다. 최상의 일치 중복을 보증하기 위해 구조적 모델에 기반한 변형은 정렬을 약간 이동시킬 필요가 있다. 정렬 1(도 55)은 이에 대한 안내를 제공한다.
본 발명에 따른 효소는 바람직하게는 세트 5에서 한정된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하지 않는다.
적당하게는 변이 효소는 자리 지정 돌연변이를 이용하여 제조된다.
대안으로, 예를 들어 Stratagene사의 GeneMorph PCR mutagenesis kit 또는 Clontech사의 Diversify PCR random mutagenesis kit와 같은 상품화 키트를 이용하여 무직위로 돌연변이를 도입시킬 수 있다. EP 0 583 265는 PCR 기반 돌연변이의 최적화 방법을 나타내고, 이는 EP 0 866 796에 기술된 바와 같은 돌연변이원 DNA 아날로그의 이용과 결합될 수 있다. 오류 빈발 PCR 기술이 바람직한 특성을 지닌 지질 아실트랜스퍼라제의 변이체의 제조에 적당하다. WO0206457호는 리파제의 분자 진화를 나타낸다.
신규한 서열을 수득하는 세 번째 방법은 많은 제한효소 또는 Dnase I과 같은 효소를 이용하거나 기능적 단백질을 코드하는 전체 뉴클레오타이드 서열을 재집합함으로서(이하 "셔플링(shuffling)"으로 표기) 비-동일 뉴클레오타이드 서열을 분해하는 것이다. 대안으로 전체 뉴클레오타이드 서열의 재집합 동안 하나 또는 다수의 비-동일 뉴클레오타이드 서열을 이용하고 돌연변이를 도입시킬 수 있다. DNA 셔플링 및 패밀리 셔플링 기술은 바람직한 특성을 지닌 지질 아실트랜스퍼라제의 변이체의 제조에 적당하다. '셔플링'을 수행하는데 적당한 방법은 EP0 752 008, EP1 138 763, EP1 103 606에서 발견될 수 있다. 또한 셔플링은 미국특허 제6,180,406호 및 WO 01/34835호에 기술된 DNA 돌연변이의 다른 형태와 결합될 수 있다.
따라서 생체 내 또는 시험관 내에서 뉴클레오타이드 서열 내로의 많은 자리 지정 또는 무작위 돌연변이를 생성한 후 다양한 수단에 의해 인코드된 변이체 폴리펩타이드의 개선된 기능성에 대해 선별하는 것이 가능하다.
더욱이 비-제한적 예로서 새로운 변이체를 제조하기 위해 폴리뉴클레오타이드 서열의 돌연변이 또는 자연 변이체가 야생형 또는 다른 돌연변이 또는 자연 변이체와 재조합될 수 있다. 또한 이러한 새로운 변이체는 인코드된 폴리펩타이드의 개선된 기능성에 대해 선별될 수 있다.
하기 구역은 바람직하게는 집중화된 무작위 돌연변이 및/또는 셔플링에 대해 선별된다: IVR3, IVR5, IVR6, LR1, LR2 및/또는 LR5, 가장 바람직하게는 LR5.
변이체 라이브러리의 제조를 위해 미생물 진핵성 또는 원핵성 발현 숙주가 이용된다. 변이체 라이브러리 내의 균일한 발현을 보증하기 위해 낮은 카피수, 바람직하게는 단일 이벤트 염색체 발현 시스템이 바람직하다. 높은 형질전환 빈도를 지닌 발현 시스템이 특히 무작위 돌연변이 및/또는 셔플링 기술을 이용하여 제조된 것과 같은 큰 변이체 라이브러리(>1000 콜로니)의 발현의 경우 바람직하다.
효소의 제조시 진핵성 발현 숙주 즉, 효모의 이용에 적당한 방법은 EP1131416에 기술되어 있다. 효모와 같은 미생물 진핵성 발현 숙주는 진핵성 아실트랜스퍼라제 모유전자를 이용하여 제조된 변이 라이브러리의 발현이 바람직하다.
효소의 제조시 발현 숙주로서 바실러스(Bacillus) 즉, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)를 이용하는 적당한 방법은 WO02/14490에 기술되어 있다. 바실러스와 같은 미생물 진핵성 발현 숙주가 원핵성 아실트랜스퍼라제 모유전자 예를 들어 P10480 참고 서열(서열번호: 2)를 이용하여 제조된 변이 라이브러리의 발현이 바람직하다.
적당하게는 본 발명에 따른 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 모효소와 적어도 70% 이상, 바람직하게는 적어도 80% 이상, 바람직하게는 적어도 90% 이상, 바람직하게는 적어도 95% 이상, 바람직하게는 적어도 97% 이상, 바람직하게는 적어도 99% 이상의 상동성을 보유한다.
적당한 모효소는 에스테라제 또는 리파제 활성을 지닌 효소를 포함한다.
적당하게는 모효소는 pfam00657 공통 서열과 정렬된다.
바람직한 실시태양에서 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 GDSx, GANDY 및 HPT 블록에서 발견되는 적어도 하나 이상의 pfam00657 공통 서열 아미노산 잔기를 보유하거나 포함한다.
수성 환경에서 지질 아실트랜스퍼라제 활성을 지니지 않거나 적게 지니는 리파제와 같은 효소는 트랜스퍼라제 활성을 도입시키거나 증가시키도록 분자적 진화 도구를 이용하여 돌연변이되어 본 발명의 조성물 및 방법에 이용하기에 적당한 유의적인 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소를 제조한다.
적당하게는 본 발명에서 이용하기 위한 지질 아실트랜스퍼라제는 모효소와 비교시 극성 지질, 바람직하게는 당지질 상에 증가된 효소 활성을 지닌 변이체이다. 또한 바람직하게는 이러한 변이체는 리소 극성 지질 상에 낮은 활성을 지니거나 활성을 지니지 않는다. 극성 지질, 바람직하게는 당지질 상에 증가된 효소 활성은 가수분해 및/또는 트랜스퍼라제 활성 또는 이 둘의 결합의 결과이다.
본 발명에 이용하기 위한 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 모효소와 비교시 트리글리세리드 및/또는 모노글리세리드 및/또는 디글리세리드 상의 감소된 활성을 지닌다.
적당하게는 변이 효소는 트리글리세리드 및/또는 모노글리세리드 및/또는 디글리세리드 상에 어떠한 활성도 지니지 않는다. 트리글리세르디 상의 낮은 활성은 계란 또는 계란-주성분 제품 및/또는 탈검 기름의 처리를 위해 베이커리 적용에 이용되는 변이 효소에 바람직하다.
하나의 실시태양에서 적당하게는 변이 효소는 디글리세리드 상에 높은 활성을 지니고 트리글리세리드 상에 활성을 지니지 않거나 낮은 활성을 지닌다.
특이적 아미노산 잔기의 표기시 번호는 변이 서열과 서열번호 2에 나타난 참고 서열과의 정렬로부터 수득된 것이다.
하나의 관점에서 바람직하게는 변이 효소는 하나 이상의 하기 아미노산 치환을 포함한다:
Figure 112006031978468-pct00004
Figure 112006031978468-pct00005
Figure 112006031978468-pct00006
더욱이 또는 대안으로 하나 이상의 C-말단 연장이 있다. 바람직하게는 부가적인 C-말단 연장은 하나 이상의 지방성 아미노산, 바람직하게는 비-극성 아미노산, 더욱 바람직하게는 I, L, V 또는 G로 구성된다. 따라서 본 발명은 하나 이상의 하기 C-말단 연장을 포함한 변이 효소를 더욱 제공한다: 318I, 318L, 318V, 318G.
P10480 및/또는 1IVN에 대한 상동성 정렬 및/또는 구조적 정렬에 의한 측정시 모(parent) 백본 내의 잔기가 P10480(서열번호: 2)에서와 다른 경우 P10480(서열번호: 2) 내의 어떠한 하나의 하기 아미노산 잔기에 정렬된 잔기를 각각 P10480에서 발견된 잔기와 교체하는 것이 바람직하다: Ser3, Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164, Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Gln182, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309, Ser310.
P10480의 하기 야생형 잔기는 갈락토리피드로부터의 양질의 활성, 특히 양질의 트랜스퍼라제 활성을 보유하기 위해 바람직한 것으로 발견되었다: L17, W111, R221, S3, G40, N88, K22, Y117, L118, N181, M209, M285, E309, M23. 따라서 바람직하게는 변이 효소는 하나 이상의 이들 사이트에서 P10480 내에 발견된 아미노산 잔기를 포함한다.
또한 극성 지질에 대한 증가된 가수분해 활성을 지닌 변이 효소는 극성 지질로부터의 증가된 트랜스퍼라제 활성을 지닌다.
또한 포스파티딜콜린(PC)과 같은 인지질에 대한 증가된 가수분해 활성을 지닌 변이 효소는 인지질로부터의 증가된 트랜스퍼라제 활성을 지닌다.
또한 DGDG와 같은 갈락토리피드에 대한 증가된 가수분해 활성을 지닌 변이 효소는 갈락토리피드로부터의 증가된 트랜스퍼라제 활성을 지닌다.
또한 포스파티딜콜린(PC)과 같은 인지질에 대한 증가된 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이 효소는 인지질로부터의 증가된 가수분해 활성을 지닌다.
또한 DGDG와 같은 갈락토리피드에 대한 증가된 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이 효소는 갈락토리피드로부터의 증가된 가수분해 활성을 지닌다.
또한 극성 지질로부터 증가된 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이 효소는 극성 지질에 대한 증가된 가수분해 활성을 지닌다.
적당하게는 하나 이상의 하기 사이트는 기질 결합에 관련된다:
Leu17; Ala114; Tyr179; His180; Asn181; Met209; Leu210; Arg211; Asn215; Lys284; Met285; Gln289; Val290.
본 발명에 따른 변이 효소는 모효소와 비교시 하나 이상의 하기 기능성을 지닌다:
1) %TDG/TPC로 계산된 PC 대비 갈락토리피드(DG)에 대한 증가된 상대 트랜스퍼라제 활성(실시예 8에 나타난 바와 같이)
2) 갈락토리피드(DG)에 대한 증가된 절대 트랜스퍼라제 활성(실시예 8에 나타난 바와 같이)
3) 갈락토리피드(DG)상의 가수분해 활성 HDG에 대한 공여체(TDG)로서 갈락토리피드를 이용한 증가된 트랜스퍼라제 활성(실시예 8에 나타난 바와 같이)
4) PC에 대한 증가된 절대 트랜스퍼라제 활성(실시예 8에 나타난 바와 같이)
DG는 갈락토리피드이고(즉, DGDG)(GL로서도 표기됨), PC는 인지질(즉, 레시틴)임. 갈락토리피드에 대해 증가된 활성을 지닌 변이체는 상기 카테고리 1), 2) 및 3) 내의 변이체를 포함한다. 갈락토리피드 상의 증가된 활성을 지닌 변이체는 인지질 내의 증가된 활성을 지닌다(상기 카테고리 4).
1. 하나 이상의 하기 잔기로의 변형은 %T DG /T PC 로 계산된 PC 대비 DG에 대한 증가된 상대 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이 효소를 유발한다:
-318, N215, L210, S310, E309, H180, N80, V112, Y30X(X는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W로부터 선택됨), V290, Q289, K22, G40, Y179, M209, L211, K22, P81, N87, Y117, N181, Y230X(X는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W로부터 선택됨), Q182.
일반적 하나 이상의 하기 치환이 바람직하다:
S3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 M, R, N, G, T, Q, P, Y, S, L, E, W, 가장 바람직하게는 Q
K22A, E, C, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 A, C, E 또는 R
Y30A, C, D, H, K, M, N, P, Q, R, T, V, W, G, I, L, S, M, A, R 또는 E, 바람직하게는 H, T, W, N, D, C, Q, G, I, L, S, M, A, R 또는 E
G40L, N, T, V 또는 A
N80N, R, D, A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 H, I, Y, C, Q, M, S, W, L, N, R, D 또는 F
P81A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 I, M, F, G, V, Y, D, C 또는 A
K82A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 H, K, S 또는 R
N87A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 I, Y, M, T, Q, S, W, F, V 또는 P
N88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 C, V, A 또는 F
V112C
Y117A, C, D, E, F, H, T, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V 또는 W, 바람직하게는 A, N, E, H, T, I, F, C, P 또는 S
L118A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 F
V112A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W 또는 Y, 바람직하게는 I, M, F, Y, N, E, T, Q, H 또는 P
Y179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W, 바람직하게는 F, C, H, I, L, M, P, V 또는 W
H180K, Q, A, C, D, E, F, G, I, L, M, P, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 M, F, C, K 또는 Q
N181A 또는 V
Q182A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 K
M209L, K, M, A, C, D, E, F, G, H, I, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 I, F, T, D, C, H, L, K, M 또는 P
L210G, I, H, E, M, S, W, V, A, R, N, D, Q, T, C, F, K, P 또는 Y, 바람직하게는 G, I, H, E, M, S, W, V, A, R, N, D, Q, T, Y 또는 F
R211G, Q, K, D, A, C, E, F, H, I, L, M, N, P, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 G, Q, K, D, H, I, M, F, P, S, Y, N, C, L 또는 W
N215A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 I, F, P, T, W, H 또는 A
Y230A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 I, T, G, D, R, E, V, M 또는 S, 가장 바람직하게는 I, D, R 또는 E
Q289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 F, W, H, I, Y, L, D, C, K, V, E, G, R, N 또는 P, 더욱 바람직하게는 R, T, D, K, N 또는 P
V290A, C, D, E, H, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W 또는 Y;
E309S, Q, R, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 F, W, N, H, I, M, S, Q, R, A 또는 Y
S310A, P, T, H, M, K, G, C, D, E, F, I, L, N, Q, R, V, W 또는 Y, 바람직하게는 F, Y, C, L, K, A, P, T, H, M, K 또는 G
-318A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, Y, H 또는 S.
바람직하게는 하나 이상의 하기 변형은 %TDG/TPC로 계산된 PC 대비 DG에 대한 증가된 상대 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이 효소를 유발한다.
S3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 M, R, N, G, T, Q, P, Y, S, L, E, W, 가장 바람직하게는 Q
G40L, N, T, V 또는 A
K82A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 H, K, S 또는 R
N88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 C, V, A 또는 F
Y230A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 I, T, G, D, R, E, V, M 또는 S, 가장 바람직하게는 D, R 또는 E
Q289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 F, W, H, I, Y, L, D, C, K, V, E, G 또는 P, 더욱 바람직하게는 R, T, D, K 또는 P
하나 이상의 하기 변형은 %TDG/TPC로 계산된 PC 대비 DG에 대한 증가된 상대 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이 효소를 유발한다:
-318 Y, H 또는 S
N215H
L210G, I, H, E, M, S, W, V, A, R, N, D, Q 또는 T
S310A, P, T, H, M, K 또는 G
E309S, Q, A 또는 R
H180K, T 또는 Q
N80N, R 또는 D
V112C
Y30G, I, L, S, M, A, R 또는 E, 더욱 바람직하게는 Y30M, A 또는 R
V290R, E, H 또는 A
Q289R, T, D 또는 N
K22E
G40L
Y179V 또는 R
M209L, K 또는 M
L211G, Q, K 또는 D
Y230V
G40Q, L 또는 V
N88W
N87R 또는 D
또한 일부 실시태양의 경우 하기 치환이 적당하다:
K22A 또는 C
P81G
N87M
Y117A, N, E, H 또는 T
N181A 또는 V
Y230I
V290H
N87R, D, E 또는 M
Q182T
바람직하게는 인지질 트랜스퍼라제 활성 대비 갈락토리피드 트랜스퍼라제의 비율을 증가시키기 위해 변형된 잔기는 하나 이상의 하기이다: -318, N215, L210, E309, H180, N80.
일반적으로 하나 이상의 하기 치환이 바람직하다:
-318 Y, H 또는 S, 가장 바람직하게는 Y
N215H
L210D, Q 또는 T
E309Q 또는 R
H180K 또는 Q
N80N, R 또는 D
2. 하나 이상의 하기 잔기로의 변형은 DG에 대해 증가된 절대 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이체를 유발한다:
-318, N215, L210, S310, E309, H180, N80, V112, Y30X(X는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W로부터 선택됨), V290, Q289, K22, G40, Y179, M209, L211, K22, P81, N87, Y117, N181, Y230X(X는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W로부터 선택됨), V290, N87, Q182, S3, S310, K82, A309.
특히 하나 이상의 하기 변형은 DG에 대한 증가된 절대 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이체를 유발한다:
-318Y, H, S, A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V 또는 W, 바람직하게는 Y, H, S 또는 I
N215A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 H, I, F, P, T, W 또는 A, 가장 바람직하게는 H, S, L, R, Y
L210G, I, H, E, M, S, W, V, A, R, N, D, Q, T, C, F, K, P 또는 Y, 바람직하게는 D, Q, T, Y 또는 F
S310A, P, T, H, M, K, G, C, D, E, F, I, L, N, Q, R, V, W 또는 Y, 바람직하게는 F, Y, C, L, K 또는 P
E309S, Q, R, A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 S, Q, R,, F, W, N, H, I, M 또는 Y, 가장 바람직하게는 S, Q, R, N, P 또는 A
H180A, C, D, F, G, I, K, Q, L, M, P, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 K, Q, M, F 또는 C, 가장 바람직하게는 T, K 또는 Q
N181A 또는 V
N80N, R, D, A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 H, I, Y, C, Q, M, S, W, L, N, R, D 또는 F, 가장 바람직하게는 N, R, D, P, V, A 또는 G
V112A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W 또는 Y, 바람직하게는 I, M, F, Y, N, E, T, Q, H 또는 P
Y30G, I, L, S, A, E, C, D, H, K, M, P, Q, R, T, V 또는 W, 바람직하게는 H, T, W, N, D, C 또는 Q
V290A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W 또는 Y;
Q289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 R, E, G, P, N 또는 R
K22A, C, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 C
Y179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W; 바람직하게는 F, C, H, I, L, M, P 또는 W, 더욱 바람직하게는 E, R, N, V, K, S
M209A, C, D, E, F, G, H, I, L, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 R, N, Y, E 또는 V
R211A, C, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, K, D, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 H, I, M, F, P, S, Y, N, C, L 또는 W, 가장 바람직하게는 R
S310C, D, E, F, I, L, N, Q, R, V, W 또는 Y, 바람직하게는 F, Y, C, L, K 또는 P
S3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 M, R, N, A, G, T, Q, P, Y 또는 S, 가장 바람직하게는 Q 또는 N
K82A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 H, K, S, E 또는 R
P81A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 I, M, F, V, Y, D, C 또는 A
N87A, C, F, G, H, I, K, L, P, Q, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 I, Y, T, Q, S, W, F, V 또는 P
Q182A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 D 또는 K
Y230A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 W, H, Q, L, P 또는 C, 가장 바람직하게는 T 또는 G
D157A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 C
G40L
Y226I
일반적으로 하나 이상의 하기 치환이 바람직하다:
-318 Y, H 또는 S
N215H
L210G, I, H, E, M, S, W, V, A, R, N, D, Q 또는 T
S310A, P, T, H, M, K 또는 G
E309S, Q 또는 R
H180K 또는 Q
N80N, R 또는 D
V112C
Y30G, I, L, S, M, A, R 또는 E, 더욱 바람직하게는 Y30M, A 또는 R
V290R, E, H 또는 A
Q289R 또는 N
K22E
G40L
Y179V
M209L, K 또는 M
L211G, Q, K 또는 D
또한 하기 일부 실시태양의 경우 하기 치환이 적당하다:
K22A 또는 C
P81G
N87M
Y117A, N, E, H 또는 T
N181A 또는 V
Y230I
V290H
N87R, D, E 또는 M
Q182T
바람직하게는 갈락토리피드 기질(DGDG)로부터의 트랜스퍼라제 활성을 증가시키기 위해 변형된 잔기는 하나 이상의 하기이다: -318, N215, L210, E309, H180, N80.
일반적으로 하나 이상의 하기 치환이 바람직하다:
-318 Y, H 또는 S, 가장 바람직하게는 Y
N215H
L210D, Q 또는 T
E309Q 또는 R
H180K 또는 Q
N80N, R 또는 D
3. 하나 이상의 하기 잔기에서의 변형은 DG 상의 가수분해 활성 H DG 에 대한 증가된 트랜스퍼라제 활성 T DG 를 지닌 변이 효소를 유발한다:
Y230, S310, H180, Q289, G40, N88, Y179, N215, L210, N80, Y30X(X는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W로부터 선택됨), N87, M209, R211, S18X(X는 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로부터 선택됨).
바람직하게는 하나 이상의 하기 변형은 DG 상의 가수분해 활성 HDG에 대한 증가된 트랜스퍼라제 활성 TDG를 지닌 변이 효소를 유발한다:
Y230A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T 또는 W, 바람직하게는 W, H, Q, L, P 또는 C
S310A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W 또는 Y, 바람직하게는 F, Y, C, L, K 또는 P
Y179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W; 바람직하게는 F, C, H, I, L, M, P 또는 W
H180A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, V, W 또는 Y, 바람직하게는 M, F 또는 C
Q289A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, V, W 또는 Y; 바람직하게는 F, W, H, I, Y, L, D, C, K, V, E, G 또는 P
G40A, C, D, E, F, H, I, K, M, N, P, R, S, T, W 또는 Y; 바람직하게는 I, P, W 또는 Y
N88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V 또는 Y, 바람직하게는 I 또는 H
N87A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 I, Y, T, Q, S, W, F, V 또는 P
일반적으로 하나 이상의 하기 치환이 바람직하다(이러한 변이 효소는 감소된 가수분해 활성(갈락토리피드 및/또는 인지질) 및/또는 갈락토리피드로부터의 증가된 트랜스퍼라제 활성을 지닌다):
Y179E, R, N 또는 Q
N215G
L210D, H, R, E, A, Q, P, N, K, G, R, T, W, I, V 또는 S
N80G
Y30L
N87G
일반적으로 하나 이상의 하기 치환은 바람직하다(이러한 변이 효소는 감소된 가수분해 활성(갈락토리피드 및/또는 인지질) 및/또는 갈락토리피드로부터의 증가된 트랜스퍼라제 활성을 지닌다):
Y179E, R, N, Q
N215G
L210D, H, R, E, A, Q, P, N, K, G, R, T, W, I, V 및 S
N80G
Y30L
N87G
H180I, T
M209Y
R211D, T 및 G
S18G, M 및 T
G40R 및 M
N88W
N87C, D, R, E 및 G
4. 하나 이상의 하기 잔기의 변형은 인지질에 대한 증가된 절대 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이 효소를 유발한다:
S3, D157, S310, E309, Y179, N215, K22, Q289, M23, H180, M209, L210, R211, P81, V112, N80, L82, N88; N87
인지질로부터의 증가된 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이 효소를 제공하는 특이적 변형은 하나 이상의 하기로부터 선택된다:
S3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 N, E, K, R, A, P 또는 M, 가장 바람직하게는 S3A
D157A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 D157S, R, E, N, G, T, V, Q, K 또는 C
S310A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 S310T, -318E
E309A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 E309R, E, L, R 또는 A
Y179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W; 바람직하게는 Y179D, T, E, R, N, V, K, Q 또는 S, 더욱 바람직하게는 E, R, N, V, K 또는 Q
N215A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 N215S, L, R 또는 Y
K22A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 K22E, R, C 또는 A
Q289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 Q289R, E, G, P 또는 N
M23A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 M23K, Q, L, G, T 또는 S
H180A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 H180Q, R 또는 K
M209A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 M209Q, S, R, A, N, Y, E, V 또는 L
L210A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 L210R, A, V, S, T, I, W 또는 M
R211A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 R211T
P81A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 P81G
V112A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W 또는 Y; 바람직하게는 V112C
N80A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 N80R, G, N, D, P, T, E, V, A 또는 G
L82A, C, D, E, F, G, H, I, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 L82N, S 또는 E
N88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V 또는 Y; 바람직하게는 N88C
N87A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 N87M 또는 G
하나 이상의 하기 잔기의 변형은 인지질에 대한 증가된 절대 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이 효소를 유발한다:
S3N, R, A, G
M23K, Q, L, G, T, S
H180R
L82G
Y179E, R, N, V, K 또는 Q
E309R, S, L 또는 A
5. 갈락토리피드 기질(DGDG)로부터 증가된 트랜스퍼라제 활성 및 인지질 트랜스퍼라제 활성 대비 갈락토리피드 트랜스퍼라제 비율의 증가를 유발하는 잔기 변형은 하기의 하나 이상을 포함한다: -318, N215, L210, S310, E309, H180, N80, V112, Y30X(X는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W로부터 선택됨), V290, Q289, K22, G40, Y179, M209, L211, K22, P81, N87, Y117, N181, Y230X(X는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W로부터 선택됨), Q182.
일반적으로 하나 이상의 하기 치환이 바람직하다:
-318Y, H 또는 S
N215H
L210G, I, H, E, M, S, W, V, A, R, N, D, Q 또는 T
S310A, P, T, H, M, K 또는 G
E309S, A, Q 또는 R
H180K 또는 Q
N80N, R 또는 D
V112C
Y30G, I, L, S, M, A, R 또는 E, 더욱 바람직하게는 Y30M, A 또는 R
V290R, E, H 또는 A
Q289R 또는 A
K22E
G40L
Y179V
M209L, K 또는 M
L211G, Q, K 또는 D
또한 일부 실시태양의 경우 하기 치환이 적당하다:
K22A 또는 C
P81G
N87M
Y117A, N, E, H 또는 T
N181A 또는 V
Y230I
V290H
N87R, E, E 또는 M
Q182T
바람직하게는 갈락토리피드 기질(DGDG)로부터의 트랜스퍼라제 활성을 증가시키고 또는 인지질 트랜스퍼라제 활성 대비 갈락토리피드 트랜스퍼라제의 비율을 증가시키기 위해 변형되는 잔기는 하나 이상의 하기이다: -318, N215, L210, E309, H180, N80.
일반적으로 하나 이상의 하기 치환이 바람직하다:
-318Y, H 또는 S, 가장 바람직하게는 Y
N215H
L210D, Q 또는 T
E309Q 또는 R
H180K 또는 Q
N80N R 또는 D
6. P10480의 하기 야생형 잔기는 양질의 활성 특히 갈락토리피드로부터의 양질의 트랜스퍼라제 활성을 보유하는데 바람직한 것으로 나타났다:
W111, R211, N181, S3, L17, G40, N88, Y117, L118, N181, K22, M209, M285, M23
바람직하게는 이들 잔기는 변이 효소 내에서 유지된다.
갈락토리피드 기질로부터의 증가된 트랜스퍼라제 활성을 위한 변이 GDSx 아실트랜스퍼라제의 제조시 모효소가 P10480에서 발견되는 잔기 외에 W111, R211, N181, S3, L17, G40, N88, Y117, L118, N181, K22, M209, M285, M23 위치에서 P10480 서열의 잔기에 상응하는 잔기를 지니는 반면 변이체는 바람직하게는 P10480 서열 내에서 발견되는 아미노산 잔기를 포함하는 상응하는 위치에서 치환을 포함한다.
L17은 바람직하게는 소수성 아미노산 잔기이다.
7. 하기 결합은 갈락토리피드 기질(DGDG)로부터의 증가된 트랜스퍼라제 활성 및/또는 인지질 트랜스퍼라제 활성 대비 갈락토리피드 트랜스퍼라제 활성 비율의 증가를 지닌다.
N215H & -318Y
N215H & L210D, Q 또는 T
-318Y & L210D, Q 또는 T
N215H & -318Y & L210D, Q 또는 T
또한 상기 결합은 선택적으로는 -318Y, H 또는 S, 바람직하게는 -318Y와 같은 C-말단 아미노산 첨가를 포함한다.
또한 상기 결합은 선택적으로는 하기 변형을 포함한다:
적당하게는 하나 이상의 하기 결합은 갈락토리피드 기질(DGDG)로부터의 증가된 트랜스퍼라제 활성 및/또는 인지질 트랜스퍼라제 활성 대비 갈락토리피드 트랜스퍼라제 활성 비율의 증가를 지닌다:
E309A, Q 또는 R
N215H & -318Y, H 또는 S, 바람직하게는 Y
L210D, Q 또는 T & -318Y, H 또는 S, 바람직하게는 Y
N215H & E309A, Q 또는 R
L210D, Q 또는 T & E309A, Q 또는 R
-318Y & E309A, Q 또는 R
또한 상기 결합은 선택적으로는 Q182 위치에서의 치환, 바람직하게는 Q182K 를 포함한다.
하기 결합은 갈락토리피드 기질(DGDG)로부터의 증가된 트랜스퍼라제 활성 및/또는 인지질 트랜스퍼라제 활성 대비 갈락토리피드 트랜스퍼라제 활성 비율의 증가 및/또는 가수분해 활성 대비 갈락토리피드 트랜스퍼라제 비율의 증가를 지닌다:
N215H & N80G
-318Y & N80G
L210D 또는 Q & N80G
N215H & N88N
-318Y & N88N
L210D 또는 Q & N88N
N215H & Y30L
-318Y & Y30L
L210D 또는 Q & Y30L
N215H & N87G
-318Y & N87G
L210D 또는 Q & N87G
N215H & Y179E, R, N 또는 Q
-318Y & Y179E, R, N 또는 Q
L210D 또는 Q & Y179E, R, N 또는 Q
상기 주지된 바와 같이 특정 아미노산 잔기의 표기시 번호는 변이 서열을 서열번호 2에 나타난 참고 서열과의 정렬시킴으로서 수득된다.
의심의 여지를 회피하기 위해 예를 들어 L118과 같이 특정 아미노산이 특정 사이트에서 지침될 때 이는 서열번호 2 내의 특정 아미노산 번호 118을 나타낸다. 그러나 모효소와 다른 사이트 118에서의 아미노산 잔기는 류신과 다르다.
따라서 아미노산 잔기 118을 치환시킬 때 참고가 L118로 이루어지나 당업자는 모효소가 서열번호 2에 나타난 것 이외인 경우 치환되는 아미노산이 류신이 아님을 쉽게 이해할 것이다. 따라서 서열번호 2에 나타난 아미노산 서열을 지닌 효소가 아닌 모효소 내에서 아미노산 서열을 치환할 경우 새로운(치환) 아미노산은 서열번호 2에 나타난 것과 동일한 것이 가능하다. 이는 예를 들어 상기 잔기 118에서의 아미노산이 류신이 아니고 따라서 서열번호 2 내의 잔기 118에서의 아미노산과 다른 경우가 된다. 즉, 예를 들어 잔기 118에서 모효소가 류신 이외의 아미노산 위치를 지니는 경우 이러한 아미노산은 본 발명에 따라 류신으로 치환된다.
여기서 사용된 "지질 아실트랜스퍼라제"라는 용어는 아실트랜스퍼라제 활성(일반적으로 Enzyme Nomenclature Recommendations(1992) of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology에 따른 E.C. 2.3.1.x로 분류됨)을 지닌 효소 의미하여 본 효소는 지질로부터 하나 이상의 하기와 같은 하나 이상의 수용체 기질로 아실기를 전이시키는 것이 가능하다: 스테롤; 스타놀(stanol); 탄수화물; 단백질; 단백질 서브유니트; 글리세롤.
바람직하게는 지질 아실트랜스퍼라제는 지질로부터 적어도 스테롤 및/또는 스타놀, 예를 들어 콜레스테롤로 아실기를 전이시키는 것이 가능하다.
바람직하게는 본 발명에 따르고 또는 본 발명의 방법 및 또는 용도에 이용되는 지질 아실트랜스퍼라제 변이체는 지질(여기서 한정된)로부터 하나 이상의 하기 아실 수용체 기질로 아실기를 전이시키는 것이 가능하다: 스테롤, 스타놀, 탄수화물, 단백질 또는 그의 서브유니트 또는 글리세롤.
일부의 관점에 있어서 본 발명에 따른 "아실 수용체"는 예를 들어 글리세롤; 스테롤; 스타놀; 탄수화물을 포함한 다가 알코올; 과일산, 시트르산, 타르타르산, 젖산 및 아스코르브산을 포함한 히드록시산; 단백질 또는 아미노산, 단백질 가수분해물 및 펩타이드(부분적으로 가수분해된 단백질)와 같은 그의 서브유니트; 및 그의 혼합물 및 유도체와 같은 히드록시기(-OH)를 포함한 어떠한 화합물도 된다. 바람직하게는 본 발명에 따른 "아실 수용체"는 물이 아니다.
하나의 실시태양에서 아실 수용체는 바람직하게는 모노글리세리드 및/또는 디글리세리드가 아니다.
하나의 관점에서 바람직하게는 변이 효소는 지질로부터 스테롤 및/또는 스타놀로 아실기를 전이시키는 것이 가능하다.
하나의 관점에서 바람직하게는 변이 효소는 지질로부터 탄수화물로 아실기를 전이시키는 것이 가능하다.
하나의 관점에서 바람직하게는 변이 효소는 지질로부터 단백질 또는 그의 서브유니트로 아실기를 전이시키는 것이 가능하다. 적당하게는 단백질 서브유니트는 하나 이상의 하기이다: 아미노산, 단백질 가수분해물, 펩타이드, 디펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드.
적당하게는 단백질 또는 단백질 서브유니트 내에서 아실 수용체는 단백질 또는 단백질 서브유니트의 하나 이상의 하기 성분이다: 세린, 트레오닌, 티로신 또는 시스테인.
단백질 서브유니트가 아미노산인 경우 적당하게는 본 아미노산은 어떠한 적당한 아미노산도 된다. 적당하게는 아미노산은 하나 이상의 세린, 트레오닌, 티로신 또는 시스테인이다.
하나의 관점에서 바람직하게는 변이 효소는 지질로부터 글리세롤로 아실기를 전이시키는 것이 가능하다.
하나의 관점에서 바람직하게는 변이 효소는 지질로부터 히드록시산으로 아실기를 전이시키는 것이 가능하다.
하나의 관점에서 바람직하게는 변이 효소는 지질로부터 다가 알코올로 아실기를 전이시키는 것이 가능하다.
하나의 관점에서 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 지질로부터 스테롤 및/또는 스타놀로 아실기를 전이시킬 수 있을 뿐만 아니라 지질로부터 하나 이상의 하기로 아실기를 전이시킬 있다: 탄수화물, 단백질, 단백질 서브유니트, 글리세롤.
바람직하게는 본 발명에 따른 변이 지질 아실트랜스퍼라제가 작용하는 지질 기질은 하나 인상의 하기 지질이다: 레시틴과 같은 인지질 즉, 포스파티딜콜린, 트리아실글리세리드, 카디오리핀(cardiolipin), 디글리세디르 또는 디갈락토실디글리세리드(DGDG) 또는 모노갈락토실디글리세리드(MGDG)와 같은 당지질. 더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 변이 효소는 DGDG 및 MGDG 중의 하나 또는 둘 모두에 작용한다. 바람직하게는 본 발명에 따른 변이 효소는 디갈락토실디글리세리드(DGDG) 및 모노갈락토실디글리세리드(MGDG) 상에 활성을 지니지 않는다(또는 단지 제한된 활성을 지님). 따라서 바람직하게는 지질 기질은 DGDG 및 MGDG 중의 하나 또는 둘 모두가 아니다. 이러한 지질 기질은 여기서 "지질 아실 공여체"로서 표기된다. 여기서 사용되는 레시틴이라는 용어는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린 및 포스파티딜글리세롤을 포함한다.
여기서 사용된 "갈락토리피드"라는 용어는 하나 이상의 DGDG 또는 DGMG를 의미한다.
여기서 사용된 "인지질"이라는 용어는 포스파티딜콜린을 포함한 레시틴을 의미한다.
일부의 관점에 있어서 바람직하게는 변이 지질 아실트랜스퍼라제가 작용하는 지질 기질은 레시틴, 예를 들어 포스파티딜콜린과 같은 인지질이다.
일부의 관점에 있어서 바람직하게는 지질 기질은 식료품 지질 즉, 식료품의 지질 성분이다.
일부의 관점에 있어서 본 발명에 따른 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 트리글리세리드 및/또는 1-모노글리세리드 및/또는 2-모노글리세리드에 작용할 수 없거나 실질적으로 작용할 수 없다.
적당하게는 지질 기질 또는 지질 아실 공여체는 하나 이상의 하기 기실 내에 존재하는 하나 이상의 지질이다: 라드, 짐승기름 및 버터 지방을 포함한 지방; 야자유, 해바라기유, 대두유, 홍화유, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 올리브유, 코코넛유 및 평지씨유로부터 추출되거나 유래된 기름을 포함한 기름. 또한 대두, 평지씨 또는 계란 노른자위로부터의 레시틴이 적당한 지질 기질이다. 지질 기질은 귀리 지질 또는 갈락토리피드를 함유한 다른 식물 기반 물질이다.
하나의 관점에서 지질 아실 공여체는 바람직하게는 계란 노른자의 레시틴(포스파티딜콜린과 같은)이다.
본 발명의 일부 관점에 있어서, 지질은 8개 내지 22개 탄소의 지방산 사슬 길이를 지닌 지질로부터 선택된다.
본 발명의 일부 관점에 있어서, 지질은 16개 내지 22개 탄소, 더욱 바람직하게는 16개 내지 20개 탄소의 지방산 사슬 길이를 지닌 지질로부터 선택된다.
본 발명의 일부 관점에 있어서, 지질은 적어도 14개 이하의 탄소의 지방산 사슬 길이를 지닌 지질, 적당하게는 4개 내지 14개 탄소, 적당하게는 4개 내지 10개 탄소, 적당하게는 4개 내지 8개 탄소의 지방산 사슬 길이를 지닌 지질로부터 선택된다.
적당하게는 본 발명에 따른 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 하나 이상의 하기리파제 활성을 나타낸다: 글리코리파제(glycolipase) 활성(E.C.3.1.1.26), 트리아실글리세롤 리파제 활성(E.C.3.1.1.3), 포스포리파제 A2 활성(E.C.3.1.1.4) 또는 포스포리파제 A1 활성(E.C.3.1.1.32). 여기서 사용된 "글리코리파제 활성"이라는 용어는 "갈락토리파제 활성"을 포함한다.
적당하게는 본 발명에 따른 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 적어도 하나 이상의 하기 활성을 지닌다: 글리코리파제 활성(E.C.3.1.1.26) 및/또는 포스포리파제 A1 활성(E.C.3.1.1.32) 및/또는 포스포리파제 A2 활성(E.C.3.1.1.4).
일부의 관점에 있어서, 본 발명에 따른 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 적어도 글리코리파제 활성(E.C.3.1.1.26)을 지닌다.
적당하게는 일부의 관점에 있어서 본 발명에 따른 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 당지질 및/또는 인지질로부터 하나 이상의 하기 수용체 기질로 아실기를 전이시키는 것이 가능하다: 스테롤, 스타놀, 탄수화물, 단백질, 글리세롤.
일부의 관점에 있어서, 바람직하게는 본 발명에 따른 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 당지질 및/또는 인지질로부터 탄수화물로 아실기를 전이시켜 적어도 탄수화물 에스테르를 형성하는 것이 가능하다.
일부의 관점에 있어서, 바람직하게는 본 발명에 따른 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 당지질 및/또는 인지질로부터 단백질로 아실기를 전이시켜 적어도 단백질 에스테르(또는 단백질 지방산 축합물)를 형성하는 것이 가능하다.
일부의 관점에 있어서, 바람직하게는 본 발명에 따른 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 당지질 및/또는 인지질로부터 글리세롤로 아실기를 전이시켜 적어도 디글리세리드 및/또는 모노글리세리드를 형성하는 것이 가능하다.
일부의 관점에 있어서, 바람직하게는 본 발명에 따른 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 트리아실글리세롤 리파제 활성(E.C.3.1.1.3)을 나타내지 않는다.
일부의 관점에서 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 지질로부터 스테롤 및/또는 스타놀로 아실기를 전이시키는 것이 가능하다. 따라서 하나의 실시태양에서 본 발명에 따른 "아실 수용체"는 스테롤 또는 스타놀 또는 스테롤과 스타놀의 결합이다.
하나의 실시태양에서 적당하게는 스테롤 및/또는 스타놀은 하나 이상의 하기 구조적 특징을 포함한다:
ⅰ) 3-베타 히드록시기 또는 3-알파 히드록시기; 및/또는
ⅱ) 시스 위치 내의 A:B 고리 또는 트랜스 위치 내의 A:B 고리 또는 C5-C6이 불포화됨.
적당한 스테롤 아실 수용체는 콜레스테롤 및 예를 들어 알파-시토스테롤, 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 5,6-디히드로스테롤, 브라시카스테롤, 알파-스피나스테롤, 베타-스피타스테롤, 감마-스피나스테롤, 델타스피나스테롤, 푸코스테롤, 디모스테롤, 아스코스테롤, 세레비스테롤, 에피스테롤, 아나스테롤, 히포스테롤, 콘드릴라스테롤, 데스모스테롤, 칼리노스테롤, 포리페라스테롤, 클리오나스테롤, 스테롤 글리코시드과 같은 식물스테롤 및 다른 천연 또는 합성 이성체 형태 및 유도체를 포함한다.
본 발명의 하나의 관점에서 적당하게는 하나 이상의 스테롤 및/또는 스타놀은 아실 수용체로서 작용하고, 적당하게는 둘 이상의 스테롤 및/또는 스타놀이 아실 수용체로서 작용한다. 즉, 본 발명의 하나의 관점에서 적당하게는 하나 이상의 스테롤 에스테르 및/또는 스타놀 에스테르가 생성된다. 적당하게는 콜레스테롤이 아실 수용체인 경우 하나 이상의 또다른 스테롤 또는 하나 이상의 스타놀이 아실 수용체로서 작용한다. 따라서 하나의 관점에서 본 발명은 콜레스테롤 에스테르와 적어도 하나 이상의 스테롤 또는 스타놀 에스테르의 원위치에서의 제조 방법을 제공한다. 즉, 본 발명의 일부 관점에 있어서 지질 아실트랜스퍼라제는 지질로부터 콜레스테롤과 적어도 하나 이상의 또다른 스테롤 및/또는 적어도 하나 이상의 스타놀 모두로 아실기를 전이시킨다.
하나의 관점에서 바람직하게는 스테롤 아실 수용체는 하나 이상의 하기이다: 알파-시토스테롤, 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤 및 캄페스테롤.
하나의 관점에서 바람직하게는 스테롤 아실 수용체는 콜레스테롤이다. 콜레스테롤이 변이 지질 아실트랜스퍼라제에 대한 아실 수용체인 경우 식료품 내의 자유 콜레스테롤의 양은 변이 지질 아실트랜스퍼라제로의 노출 전 식료품과 비교시 및/또는 변이 지질 아실트랜스퍼라제로 처리되지 않은 동일한 식료품과 비교시 감소된다.
적당한 스타놀 아실 수용체는 식물스테롤 예를 들어 베타-시토스타놀 또는 ss-시토스타놀을 포함한다.
하나의 관점에서 바람직하게는 스테롤 및/또는 스타놀 아실 수용체는 콜레스테롤 이외의 스테롤 및/또는 스타놀이다.
일부의 관점에서 본 발명에 따라 제조된 식료품은 혈청 콜레스테롤을 감소시키고 또는 저밀도 리포단백질을 감소시키는데 사용된다. 혈청 콜레스테롤 및 저밀도 리포단백질은 아테롬성 동맥경화증 및/또는 심장병과 같은 인간의 특정 질병과 관련된다. 따라서 본 발명에 따라 제조된 식료품은 이러한 질병의 위험을 감소시키는데 사용됨이 인식된다.
따라서 하나의 관점에서 본 발명은 아테롬성 동맥경화증 및/또는 심장병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 본 발명에 따른 식료품의 이용을 제공한다. 따라서 하나의 관점에서 식료품은 식약품으로 고려된다.
또다른 관점에서 본 발명은 본 발명에 따른 식료품을 포함한 약물을 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 본 발명에 따른 유효량의 식료품을 환자에게 투여하는 것으로 포함한, 인간 또는 동물 환자의 질병을 치료하고/또는 예방하는 방법을 제공한다.
적당하게는 스테롤 및/또는 스타놀 "아실 수용체"는 본래 식료품 내에서 발견된다. 대안으로, 스테롤 및/또는 스타놀이 식료품에 첨가된다. 스테롤 및/또는 스타놀이 식료품에 첨가되는 경우 스테롤 및/또는 스타놀은 본 발명에 따른 지질 아실트랜스퍼라제의 첨가 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 첨가된다. 적당하게는 본 발명은 본 발명에 따른 변이 효소의 첨가 이전에 또는 그와 동시에 식료품으로의 외생적 스테롤/스타놀 특히 식물스테롤/식물스타놀의 첨가를 포함한다.
일부의 관점에 있어서 식료품 내에 존재하는 하나 이상의 스테롤은 변이 지질 아실트랜스퍼라제가 본 발명에 따라 첨가되기 전 또는 그와 동시에 하나 이상의 스타놀로 전환된다. 스테롤을 스타놀로 전환시키는 적당한 방법이 이용된다. 예를 들어 전환은 예를 들어 화학적 수소첨가에 의해 수행된다. 전환은 본 발명에 따라 변이 지질 아실트랜스퍼라제의 첨가 전에 또는 본 발명에 따라 변이 지질 아실트랜스퍼라제의 첨가와 동시에 수행된다. 적당하게는 스테롤의 스타놀로의 전환을 위한 효소는 WO00/061771호에 나타나 있다.
적당하게는 본 발명은 식료품 내에 원위치에서 식물스타놀 에스테르를 제조하는데 이용된다. 식물스타놀 에스테르는 지질 멤브레인을 통한 용해성, 생물학적 이용가능성을 증가시키고 건강 이익을 증가시킨다(예를 들어 WO92/99640호 참조).
본 발명의 일부 실시태양에서 스타놀 에스테르 및/또는 스테롤 에스테르는 향미료 및/또는 텍스처라이저(texturizer)이다. 이러한 경우 본 발명은 향미료 및/또는 텍스처라이저의 원위치 제조를 포함한다.
하나의 실시태양에서 본 발명은 기름을 본 발명에 따른 변이 효소로 처리함으로서 자유 지방산의 형성 없이 식용유(예를 들어 대두유와 같은 식물유와 같은) 내에 식물 스테롤 에스테르 및/또는 스타놀 스테롤 및 리소레시틴을 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 경우 제조된 리소레시틴은 탈검 공정을 이용하여 제거된다. 하나 이상의 알려진 탈검 공정과 같은 어떠한 탈검 공정도 사용된다. 자유 지방산은 필요한 경우 탈취에 의해 제거될 수 있다. 특히 기름 내에서 제조된 스타놀/스테롤 에스테르는 탈취 공정에 의해 제거되지 않는다. 따라서 제조된 식용유는 혈액 콜레스테롤 수치 저하와 같은 유익한 영양 및/또는 식약 효과를 지닌 스테롤 에스테르 및/또는 스타놀 에스테르 포함한다.
이러한 방법이 수행될 수 있는 적당한 기름은 특히 레시틴 및 스테롤/스타놀을 포함한 것이다. 적당하게는 기름은 처리시 원유이다. 적당하게는 식용유는 하나 이상의 하기이다: 옥수수유, 면실유, 아마인유, 야자유, 땅콩유, 평지씨유, 참기름, 대두유, 해바라기유 및 맥아유.
본 발명의 일부 관점에 있어서 본 발명에 따른 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 아실 수용체로서 탄수화물을 이용한다. 탄수화물 아실 수용체는 하나 이상의 하기이다: 단당류, 이당류, 올리고당류 또는 다당류. 바람직하게는 탄수화물은 하나 이상의 하기이다: 포도당, 과당, 무수과당(anhydrofructose), 맥아당, 젖당, 자당, 갈락토스, 자일로스, 자일로올리고당, 아라비노스, 말토올리고당, 타가토스, 마이크로테신, 아스코파이론(ascopyrone) P, 아스코파이론 T, 코르탈세론(cortalcerone).
적당하게는 탄수화물 "아실 수용체"는 식료품 내에 본래 발견된다. 대안으로 탄수화물은 식료품에 첨가된다. 탄수화물이 식료품에 첨가되는 경우 탄수화물은 본 발명에 따라 변이 지질 아실트랜스퍼라제의 첨가 전에, 그와 동시에 또는 그 후에 첨가된다.
탄수화물 에스테르는 식료품 내에 유용한 유화제로서 기능할 수 있다. 따라서 효소가 아실기를 당에 전이시키는 기능을 하는 경우 본 발명은 식료품 내의 두 번째 원위치 유화제의 제조를 포함한다.
일부 실시태양에서 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 아실 수용체로서 스테롤 및/또는 스타롤과 탄수화물 모두를 이용한다.
스테롤 및/또는 스타놀뿐만 아니라 탄수화물에도 아실기를 전이시킬 수 있는 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 계란을 포함한 식료품에 특히 유리하다. 특히 계란 및 계란 제품 내에 당 특히 포도당의 존재는 불리한 것으로 보인다. 계란 노른자는 1%까지의 포도당을 포함한다. 일반적으로 계란 또는 계란-주성분 제품은 이러한 포도당의 일부 또는 모두를 제거하기 위해 포도당 산화효소로 처리된다. 그러나 본 발명에 따라 이러한 원치 않는 당은 당을 "에스테르화"하여 당 에스테르를 형성함으로서 용이하게 제거될 수 있다.
본 발명의 일부 관점에 있어서, 본 발명에 따른 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 아실 수용체로서 단백질을 이용한다. 적당하게는 단백질은 식품 예를 들어 유제품 및/또는 육류 제품 내에서 발견되는 하나 이상의 단백질이다. 예로서 적당한 단백질은 락토글로불린과 같은 응유 또는 유장 내에서 발견되는 것이다. 다른 적당한 단백질은 계란으로부터의 난알부민, 글리아딘, 퓨로인돌린, 곡물로부터의 지질 전이 단백질 및 육류로부터의 미오신을 포함한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 모 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 하기 기준을 이용하여 특성화된다:
(ⅰ) 효소는 에스테르 전이 활성으로서 한정되어 지질 아실 공여체의 본래 에스테르 결합의 아실 부분이 아실 수용체로 전이되어 새로운 에스테르를 형성하는 아실트랜스퍼라제 활성을 보유하고
(ⅱ) 효소는 아미노산 서열 모티프 GDSX를 포함하고, X는 하나 이상의 하기 아미노산 잔기, L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S이다.
바람직하게는 GDSX 모티프의 X는 L이다. 따라서 바람직하게는 본 발명에 따른 효소는 아미노산 서열 GDSL을 포함한다.
GDSX 모티프는 4개의 전환된 아미노산으로 구성된다. 바람직하게는 모티프 내의 세린은 지질 아실트랜스퍼라제 효소의 촉매성 세린이다. 적당하게는 GDSX 모티프의 세린은 Brumlik & Buckley(Journal of Bacteriology Apr. 996, Vol. 178, No.7, p2060-2064) 내에 나타난 아에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) 내의 Ser-16에 상응하는 위치 내에 존재한다.
단백질이 본 발명에 따른 GDSX 모티프를 지니는지 여부를 측정하기 위해 서열은 바람직하게는 pfam 데이터베이스의 hidden markov model protile(HMM profile)과 비교된다.
Pfam은 단백질 도메인 패밀리의 데이터베이스이다. Pfam은 새로운 서열 내의 이들 도메인을 확인하기 위해 hidden markov model protile(profile HMM)뿐만 아니라 각 패밀리에 대한 쿠레이트된(curated) 다수 서열을 포함한다. Pfam으로의 도입은 Bateman A et al.(2002) Nucleic Acids Res. 30;276-280에서 발견될 수 있다. Hidden Markov model은 단백질 분류시 많은 데이터베이스에 사용된다(Bateman A and Haft DH(2002) Brief Bioinform 3;236-245 참조).
Figure 112006031978468-pct00007
hidden Markov model의 상세한 설명 및 어떻게 이들이 Pfam 데이터베이스에 적용되는지를 알기 위해 Durbin R, Eddy S, and Krogh A(1998) Biological sequence analysis; probalilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge Univerisity Press, ISBN 0-521-62041-4 참조. Hammer 소프트웨어 팩키지는 미국 세인트루이스 워싱턴대학으로부터 입수될 수 있다.
대안으로, GDSX 모티프는 Hammer 소프트웨어 팩키지를 이용하여 확인될 수 있고, 지침은 Durbin R, Eddy S, and Krogh A(1998) Biological sequence analysis; probalilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge Univerisity Press, ISBN 0-521-62041-4 및 그의 참고문헌 및 본 명세서에 제공된 HMMER2 프로파일 내에 제공된다.
PFAM 데이터베이스는 예를 들어 하기 웹사이트에서 현재 위치하는 일부 서버를 통해 접근될 수 있다.
Figure 112006031978468-pct00008
데이터베이스는 단백질 서열을 기재할 수 있는 검색 시설을 제공한다. 데이터베이스의 디폴트 파라미터를 이용하여 단백질 서열이 Pfam 도메인의 존재에 대해 분석될 것이다. GDSX 도메인은 데이터베이스 내의 수립된 도메인이고 의문의 서열 내의 이러한 존재가 인식될 것이다. 데이터베이스는 Pfam00657 공통 서열의 의문의 서열로의 정렬을 반환할 것이다.
아에로모나스 살모니시다 또는 아에로모나스 하이드로필라를 포함한 다수의 정렬은 하기에 의해 수득될 것이다:
a) 수동적
Pfam00657 공통 서열과 목적 단백질의 정렬을 수득하고 Pfam00657 공통 서열의 P10480과의 정렬을 수득후 상기 기술된 절차를 수행;
또는
b) 데이터베이스를 통해
Pfam00657 공통 서열의 확인 후 데이터베이스는 Pfam00657 공통 서열의 씨드(seed) 정렬로의 의문 서열의 정렬을 나타내는 선택을 제공한다. P10480은 씨드 정렬의 일부이고 GCAT_AERHY에 의해 표시된다. 의문의 서열과 P0480 모두는 동일한 창에 나타날 것이다.
아에로모나스 하이드로필라 참고 서열:
아에로모나스 하이드로필라 GDSX 리파제의 잔기는 NCBI 파일 P10480 내에서 번호가 매겨지고, 이러한 텍스트 내의 번호는 본 발명이 바람직한 실시태양에서 본 발명의 지질 아실트랜스퍼라제 효소 내에 존재하는 특정 아미노산 잔기를 측정하는데 사용하는 파일 내에 제공되는 번호를 나타낸다.
Pfam 정렬이 수행되었다(도 33 및 도 34):
하기 보존된 잔기가 인식될 수 있고 바람직한 실시태양에서 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되기 위한 변이 효소 내에 존재한다;
Figure 112006031978468-pct00009
'hid'는 Met, Ile, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp, Tyr, Phe로부터 선택된 소수성 잔기를 의미한다.
바람직하게는 본 발명의 조성물/방법에 사용되는 모 및/또는 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 Pfam00657 공통 서열을 이용하여 정렬될 수 있다.
바람직하게는 pfam00657 도메인 패밀리의 hidden markov model profile(HMM profile)과의 양성 매치는 본 발명에 따른 GDSL 또는 GDSX 도메인의 존재를 나타낸다.
바람직하게는 Pfam00657 공통 서열과의 정렬시 본 발명의 조성물/방법에 사용되기 위한 모 및/또는 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 적어도 하나 이상, 바람직하게는 적어도 2 이상의 하기, GDSx 블록, GANDY 블록, HPT 블록을 지닌다. 적당하게는 모 및/또는 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 GDSx 블록 및 GANDY 블록을 지닌다. 대안으로, 모 및/또는 변이 효소는 GDSx 블록 및 HPT 블록을 지닌다. 바람직하게는 모 및/또는 변이 효소는 적어도 GDSx 블록을 포함한다.
바람직하게는 Pfam00657 공통 서열과의 정렬시 본 발명의 조성물/방법에 사용되기 위한 모 및/또는 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 참고 아에로모나스 하이드로필라 폴리펩타이드 서열 즉, 서열번호 26과 비교시 하기 아미노산 잔기의 적어도 하나 이상, 바람직하게는 적어도 2 이상, 바람직하게는 적어도 3 이상, 바람직하게는 적어도 4 이상, 바람직하게는 적어도 5 이상, 바람직하게는 적어도 6 이상, 바람직하게는 적어도 7 이상, 바람직하게는 적어도 8 이상, 바람직하게는 적어도 9 이상, 바람직하게는 적어도 10 이상, 바람직하게는 적어도 11 이상, 바람직하게는 적어도 12 이상, 바람직하게는 적어도 13 이상, 바람직하게는 적어도 14 이상을 지닌다: 28hid, 29hid, 30hid, 31hid, 32gly, 33Asp, 34Ser, 35hid, 130hid, 131Gly, 132Hid, 133Asn, 134Asp, 135hid, 309His.
pfam00657 GDSX 도메인은 다른 효소로부터 이러한 도메인을 보유한 단백질을 구별하는 특정한 식별자이다.
pfam00657 공통 서열은 서열번호 1로서 도 1에 제공된다. 이는 여기서 pfam00657.6으로 표기되는 pfam 패밀리 00657, 데이터베이스 버전 6의 확인으로부터 유래된다.
공통 서열은 pfam 데이터베이스의 또다른 방출을 이용함으로서 업데이트된다.
예를 들어 도 33 및 34는 여기서 pfam00657.11로 표기되는 데이터베이스 버전 11로부터의 패밀리 00657의 pfam 정렬을 나타낸다.
GDSx, GANDY 및 HPT 블록의 존재는 데이터베이스의 방출로부터의 pfam 패밀리 00657 내에서 발견된다. pfam 데이터베이스의 또다른 방출은 pfam 패밀리 00657을 확인하는데 이용될 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 모 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 하기 기준을 이용하여 특성화된다:
(ⅰ) 효소는 에스테르 전이 활성으로서 한정되어 지질 아실 공여체의 본래 에스테르 결합의 아실 부분이 아실 수용체로 전이되어 새로운 에스테르를 형성하는 아실트랜스퍼라제 활성을 보유하고;
(ⅱ) 효소는 아미노산 서열 모티프 GDSX를 포함하고, X는 하나 이상의 하기 아미노산 잔기, L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S이고;
(ⅲ) 효소는 His-309를 포함하거나 도 2에 나타난 아에로모나스 하이드로필라 지질분해효소(서열번호: 2 또는 서열번호: 26) 내의 His-309에 상응하는 위치에서 히스티딘 잔기를 포함한다.
바람직하게는 GDSX 모티프의 아미노산 잔기는 L이다.
서열번호 26에서 첫 번째 18개 아미노산 잔기는 신호 서열을 형성한다. 전체 길이 서열의 His-309 즉, 신호 서열을 포함한 단백질은 단백질의 성숙 부분 즉, 신호 서열이 없는 서열의 His-291과 동등하다.
바람직하게는 본 발명에 따른 모 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 하기 촉매성 삼조체(triad)를 포함하고: Ser-16, Asp-116 및 His-291 또는 도 2에 나타난 아에로모나스 하이드로필라 지질분해효소(서열번호: 2) 내의 Ser-16, Asp-116 및 His-291에 상응하는 위치에서 또는 도 28에 나타난 전체 길이 서열(서열번호: 26)의 Ser-34, Asp-134 및 His-309에 상응하는 위치에서 각각 세린 잔기, 아스파르트산 잔기 및 히스티딘 잔기를 포함한다. 상기 기술된 바와 같이 서열번호 26에 나타난 서열 내에서 첫 번째 18개 아미노산 잔기는 신호 서열을 형성한다. 전체 길이 서열의 Ser-34, Asp-134 및 His-309 즉, 신호 서열을 포함한 단백질은 단백질의 성숙 부분의 Ser-16, Asp-116 및 His-291 즉, 신호 서열이 없는 서열과 동등하다. 도 1에 제공된 바와 같이(서열번호: 1) pfam00657 공통 서열에서 활성 사이트 잔기는 Ser-7, Asp-157 및 His-348에 상응한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 모 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 하기 기준을 이용하여 특성화된다:
(ⅰ) 효소는 에스테르 전이 활성으로서 한정되어 지질 아실 공여체의 본래 에스테르 결합의 아실 부분이 아실 수용체로 전이되어 새로운 에스테르를 형성하는 아실트랜스퍼라제 활성을 보유하고;
(ⅱ) 효소는 도 28(서열번호: 26) 내의 각각 Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 및 His-309 위치와 동등한 도 2(서열번호: 2) 내의 아에로모나스 하이드로필라 효소에 상응하는 위치에서 적어도 Gly-14, Asp-15, Ser-16, Asp-116 및 His-191을 포함한다.
적당하게는 본 발명에 따른 모 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 하나 이상의 하기 속으로부터의 생물체로부터 수득가능하고, 바람직하게는 수득된다: 아에로모나스(Aeromonas), 코리네박테리움(Corynebacterium), 노보스핑고비움(Novosphingobium), 테르모비피다(Termobifida), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 사카로마이세스(Saccharomyces), 락토코커스(Lactococcus), 마이코박테리움(Mycobacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 디술피토박테리움(Desulfitobacterium), 바실러스(Bacillus), 캄파일로박터(Campylobacter), 비브리오나세에(Vibrionaceae), 크실렐라(Xylella), 술폴로부스(Sulfolobus), 아스페르길러스(Aspergillus), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 리스테리아(Listeria), 네이세리아(Neisseria), 메소리조비움(Mesorhizobium), 랄스토니아(Ralstonia), 크산토모나스(Xanthomonas) 및 칸디다(Candida).
적당하게는 본 발명에 따른 모 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 하나 이상의 하기 생물체로부터 수득가능하고, 바람직하게는 수득된다: 아에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 아에로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida), 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 기로서스(Streptomyces rimosus), 마이코박테리움(Mycobacterium), 스트렙토코커스 파이오게네스(Streptococcus pyogenes), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus), 디술피토박테리움 디할로게난스(Desulfitobacterium dehalogenans), 바실러스(Bacillus sp), 캄파일로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 비브리오나세에(Vibrionaceae), 크실렐라 파스티디오사(Xylella fastidiosa), 술폴로부스 솔파타리커스(Sulfolobus solfataricus), 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 아스페르길러스 테레우스(Aspergillus terreus), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 메소리조비움 로티(Mesorhizobium loti), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum), 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 크산토모나스 악소노포디스(Xanthomonas axonopodis), 코리네박테리움 에피센스(Corynebacterium efficiens), 노보스핑고비움 아로마티시보란스(Novosphingobium aromaticivorans), 테르모비피다 푸스카(Termobifida fusca) 및 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis).
하나의 관점에서 바람직하게는 본 발명에 따른 모 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 하나 이상의 아에로모나스 하이드로필라 또는 아에로모나스 살모니시다로부터 수용가능하고, 바람직하게는 수득된다.
하나의 관점에서 본 발명에 따른 모 지질 아실트랜스퍼라제는 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT) 또는 그의 변이체(예를 들어 분자 진화에 의해 제조된 변이체)이다.
적당한 LCAT는 당분야에 알려져 있고 예를 들어 하나 이상의 하기 생물체로부터 수득가능하다: 포유류, 래트, 마우스, 닭, 초파리(Drosophila melanogaster), 애기장대(Arabidopsis) 및 쌀(Oryza sativa)을 포함한 식물, 선충, 진균 및 효모.
바람직하게는 본 발명에 따른 방법의 수행시 생성물(즉, 식료품)은 식료품 내 자유 지방산을 증가시키지 않거나 실질적으로 증가시키지 않는다.
여기서 사용된 "트랜스퍼라제"라는 용어는 "지질 아실트랜스퍼라제"라는 용어와 상호교환가능하다.
여기서 사용된 "갈락토리피드 트랜스퍼라제 활성"이라는 용어는 갈락토리피드 공여체로부터 예를 들어 글리세롤과 같은 수용체 분자(물 이외의)로의 아실기 전이를 촉매하는 효소의 능력을 의미한다.
유사하게는 여기서 사용된 "인지질 트랜스퍼라제 활성"이라는 용어는 인지질 공여체로부터 예를 들어 글리세롤과 같은 수용체 분자(물 이외의)로의 아실기 전이를 촉매하는 효소의 능력을 의미한다.
여기서 사용된 "인지질 트랜스퍼라제 활성 대비 갈락토리피드 트랜스퍼라제 활성의 증가 비율"이라는 용어는 모효소와 비교시 변이 효소가 인지질 트랜스퍼라제 대비 더 높은 비율로 갈락토리피드 트랜스퍼라제를 촉매할 수 있음을 의미한다. 이는 갈락토리피드 트랜스퍼라제 활성과 인지질 트랜스퍼라제 활성 모두 모효소와 비교시 증가됨을 의미하거나 모효소와 비교시 갈락토리피드 트랜스퍼라제 활성이 증가된 반면 인지질 트랜스퍼라제 활성은 감소됨을 의미한다. 이는 어떤 것이 중요한지의 두 활성 사이의 최종 관계이다.
적당하게는 여기서 한정된 지질 아실트랜스퍼라제는 하나 이상의 하기 반응을 촉매한다: 에스테르교환(interesterification), 전이에스테르화(transesterification), 알코올분해, 가수분해.
"에스테르교환"이라는 용어는 자유 아실기가 아닌 지질 공여체와 지질 수용체 사이의 효소 촉매된 아실기 전이를 나타낸다.
여기서 사용된 "전이에스테르화"라는 용어는 지질 공여체(자유 지방산 이외의)로부터 아실 수용체(물 이외의)로의 효소 촉매된 아실기 전이를 의미한다.
여기서 사용된 "알코올분해"라는 용어는 알코올 ROH와의 반응에 의한 산 유도체의 공유결합이 효소적으로 분열되어 생성물 중의 하나가 알코올의 H와 결합하고 다른 생성물이 알코올의 OR기와 결합함을 나타낸다.
여기서 사용된 "알코올"이라는 용어는 하이드록실기를 함유한 알킬 화합물을 나타낸다.
여기서 사용된 "가수분해"라는 용어는 지질로부터 물분자의 OH기로의 효소 촉매된 아실기 전이를 나타낸다. 가수분해를 유발하는 아실 전이는 물분자의 분리를 필요로 한다.
여기서 사용된 "갈락토리피드 가수분해 활성"이라는 용어는 갈락토리피드로부터 물분자의 OH기로 아실기를 전이시킴으로서 갈락토리피드의 가수분해를 촉매하는 효소의 능력을 의미한다.
적당하게는 여기서 사용된 "인지질 가수분해 활성"이라는 용어는 인지질로부터 물분자의 OH기로 아실기를 전이시킴으로서 인지질의 가수분해를 촉매하는 효소의 능력을 의미한다.
여기서 사용된 "갈락토리피드 가수분해 활성 대비 갈락토리피드 트랜스퍼라제 활성의 증가 비율"이라는 용어는 모효소와 비교시 변이 효소가 갈락토리피드 가수분해 대비 더 높은 비율로 갈락토리피드 트랜스퍼라제를 촉매할 수 있음을 의미한다. 이는 갈락토리피드 트랜스퍼라제 활성과 갈락토리피드 가수분해 활성 모두 모효소와 비교시 증가됨을 의미하거나 모효소와 비교시 갈락토리피드 트랜스퍼라제 활성이 증가된 반면 갈락토리피드 가수분해 활성이 감소됨을 의미한다. 이는 어떤 것이 중요한지의 두 활성 사이의 최종 관계이다.
여기서 사용된 "자유 지방산을 증가시키지 않거나 실질적으로 증가시키지 않는"이라는 용어는 바람직하게는 본 발명에 따른 지질 아실트랜스퍼라제가 100% 트랜스퍼라제 활서을 지님을 의미한다(즉, 가수분해 활성 없이 아실 공여체로부터 아실 수용체로 아실기를 100% 전이시킴); 그러나 효소는 지질 아실 공여체 내에 존재하는 아실기를 아실 수용체로 100% 이하의 아실기를 전이시키기도 한다. 이러한 경우 바람직하게는 아실트랜스퍼라제 활성은 적어도 5% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 10% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 20% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 30% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 40% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 50% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 60% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 70% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상의 총 효소 활성을 책임진다. % 트랜스퍼라제 활성(즉, 총 효소 활성의 백분율로서의 트랜스퍼라제 활성)은 하기 프로토콜에 의해 측정된다:
% 아실트랜스퍼라제 활성의 측정을 위한 프로토콜:
본 발명에 따른 지질 아실트랜스퍼라제가 첨가되는 식료품은 추출된 후 CHCl3:CH3OH 2:1로의 하기 효소 반응되고 지질 물질을 포함한 유기상이 분리되고 하기 상술된 절차에 따라 GLC에 의해 분석된다. GLC 분석(및 필요한 경우 HPLC 분석)으로부터 지방산 및 하나 이상의 스테롤/스타놀 에스테르; 탄수화물 에스테르, 단백질 에스테르; 디글리세리드; 또는 모노글리세리드의 양이 측정된다. 본 발명에 따른 효소가 첨가되지 않은 대조군 식료품도 동일한 방식을 분석된다.
계산:
GLC( 및 선택적으로 HPLC 분석)의 결과로부터 지방산 및 스테롤/스타놀 에스테르 및/또는 탄수화물 에스테르 및/또는 단백질 에스테르 및/또는 디글리세리드 및/또는 모노글리세리드의 증가가 계산될 수 있다:
Δ % 지방산 = % 지방산(효소) - % 지방산(대조군); Mv 지방산 = 지방산의 평균 분자량;
A = Δ % 스테롤 에스테르/Mv 스테롤 에스테르(Δ % 스테롤 에스테르 = % 스테롤/스타놀 에스테르(효소) - % 스테롤/스타놀 에스테르(대조군)이고, Mv 스테롤 에스테르 = 스테롤/스타놀 에스테르의 평균 분자량임) _ 아실 수용체가 스테롤 및/또는 스타놀인 경우 적용가능;
B = Δ % 탄수화물 에스테르/Mv 탄수화물 에스테르(Δ % 탄수화물 에스테르 = % 탄수화물 에스테르(효소) - % 탄수화물 에스테르(대조군)이고, Mv 탄수화물 에스테르 = 탄수화물 에스테르의 평균 분자량임) _ 아실 수용체가 탄수화물인 경우 적용가능;
C = Δ % 단백질 에스테르/Mv 단백질 에스테르(Δ % 단백질 에스테르 = % 단백질 에스테르(효소) - % 단백질 에스테르(대조군)이고, Mv 단백질 에스테르 = 단백질 에스테르의 평균 분자량임) _ 아실 수용체가 단백질인 경우 적용가능;
D = 디글리세리드 및/또는 모노글리세리드의 절대치/Mv 디/모노글리세르디 (Δ % 디글리세리드 및/또는 모노글리세리드 = % 디글리세리드 및/또는 모노글리세리드(효소) - % 디글리세리드 및/또는 모노글리세리드(대조군)이고, Mv 디/모노글리세르디 = 디글리세리드 및/또는 모노글리세리드의 평균 분자량임) _ 아실 수용체가 글리세롤인 경우 적용가능.
트랜스퍼라제 활성은 총 효소 활성의 백분율로서 계산됨:
Figure 112006031978468-pct00010
* - 적당히 삭제.
"비-극성", "극성 - 비하전", "극성 - 하전"이라는 용어에 포함되는 아미노산은 "지방성" 및 "방향성"이라는 용어에 포함되는 아미노산과 같이 하기 표에 나타나 있다. "극성"이라는 용어는 "극성 - 비하전", "극성 - 하전" 아미노산 모두를 나타낸다.



지방성

 비- 극성 G A P
I L V
극성 - 비하전 C S T M
N Q
극성 - 하전 D E
K R
방향성 H F W Y
GLC 분석
WCOT fused silica column 12.5 m x 0.25 mm ID x 0.1μ 필름 두께 5% 페닐-메틸-실리콘(Chrompack사의 CP Sil 8 CB)이 장착된 Perkin Elmer Autosystem 9000 Capillary Gas Chromatograph.
운반 기체: 헬륨
주입기. PSSI 냉각 분할 주입(초기 온도 50℃에서 385℃로 가열됨), 부피 1.0 ㎕
검출기 FID: 395℃
오븐 프로그램: 1 2 3
오븐 온도, ℃. 90 280 350
등온선, 시간, 분 1 0 10
온도 비율, ℃/분 15 4
표본 준비: 30 mg의 표본이 내부 표준 헵타데칸(heptadecane), 0.5 mg/ml을 함유한 9 ml 헵탄:피리딘, 2:1에 용해되었다. 300 ㎕ 표본 용액이 크림프 바이알(crimp vial)로 옮겨졌고, 300 ㎕ MSTFA(N-메틸-N-트리메틸실릴-트리플루오르아세아미드)가 첨가되었고 60℃에서 20분간 반응되었다.
계산: 모노-디-트리글리세리드에 대한 반응 인자 및 자유 지방산이 표준 2(모노-디-트리글리세리드)로부터 측정되었고, 콜레스테롤, 콜레스테릴 팔라미테이트(cholesteryl palamitate) 및 콜레스테릴 스테아레이트(cholesteryl stearate)의 경우 반응 인자가 정제 참고 물질로부터 측정되었다(정제 물질 10 mg에 대해 측량).
기술적 효과
본 발명은 계란 제품, 특히 마요네즈에서 하나 이상의 하기 예상 밖의 기술적 효과를 제공한다: 저온살균 동안의 개선된 열 안정성; 개선된 감각수용성, 개선된 일관성.
증가된 인지질 트랜스퍼라제 활성, 특히 인지질과 콜레스테롤과 같은 스테롤 및/또는 스타놀 사이의 증가된 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이 효소는 리소인지질의 제조방법 및/또는 식용유의 효소적 탈검방법 및/또는 개선된 유화 성질 및/또는 건강 이익을 지닌 계란 제품의 제조방법에 특히 유용하다.
효소적 탈검방법에 사용되기 위해 스테롤에 대한 증가된 절대 인지질 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이체가 바람직하다.
적당하게는 본 발명은 계란 또는 계란 제품에서의 하나 이상의 하기 예상 밖의 기술적 효과를 제공한다: 유화의 개선된 안정성; 유화의 열 안정성; 개선된 향미; 개선된 농화성, 개선된 일관성.
본 발명은 반죽 및/또는 베이크된 제품에서의 하나 이상의 하기 예상 밖의 기술적 효과를 제공한다: 반죽 또는 베이크된 제품(예를 들어 식빵 및/또는 케이크)의 개선된 특정 부피; 개선된 반죽 안정성; 개선된 껍질 점수(예를 들어 더 얇고/또는 더 바삭바삭한 식빵 껍질), 개선된 빵가루 점수(예를 들어 더 균일한 빵가루 분포 및/또는 더 미세한 빵가루 구조 및/또는 더 부드러운 빵가루); 개선된 외형(예를 들어 발포 또는 구멍이 없거나 실질적으로 없는 매끄러운 표면); 감소된 노화(staling); 증가된 부드러움; 개선된 향기; 개선된 미감.
적당하게는 본 발명은 식료품에서의 하나 이상의 하기 예상 밖의 기술적 효과를 제공한다: 개선된 외형, 개선된 질감, 개선된 안정성, 특히 개선된 열 안정성, 개선된 미감, 개선된 부드러움, 개선된 탄성, 개선된 유화.
적당하게는 본 발명은 아이스크림과 같은 유제품에서의 하나 이상의 하기 예상 밖의 기술적 효과를 제공한다: 개선된 질감(바람직하게는 더욱 크림같은 질감); 개선된 미감; 개선된 녹음(meltdown).
식료품의 제조시 여기서 한정된 지질 아실트랜스퍼라제의 이용과 관련된 특정한 기술적 효과는 하기 표에 기입되어 있다:
식료품 효과
1 식빵, 머핀 및 도넛 반죽을 강화시키고 기계적 저항성을 증가시키고/또는 베이커리 제품의 부피를 증가시키고 빵가루의 부드러움을 유지시키고/또는 식빵 표면상의 발포를 감소시킴
2 동결 반죽 냉장동안 부패를 방지함
3 스폰지 케이크 양질의 케이크 부피 및/또는 균일한 부드러운 질감이 됨
4 비스킷, 크래커 및 쿠키 지방의 안정한 유화를 유발하고/또는 기계로의 부착을 방지하고/또는 고지방제품의 불루밍(blooming)을 방지함
5 배터(batter) 및 브레딩(breading) 튀겨진 제품의 질감을 개선시킴
6 국수 반죽이 기계에 부착되는 것을 방지고/또는 수분 함량을 증가시키고/또는 쿠킹 손실을 감소시킴
7 인스턴트 국수 국수가 서로 부착되는 것을 방지함
8 파스타 반죽 조절제가 요리기구에 부착되는 것을 방지함
9 카스타드 크림 전분 페이스트가 매끄럽고 크리미한 질감이 되게 하고/또는 탈수를 방지함
10 커피 표백제 기름과 물의 분리를 방지함
11 휘핑 크림 안정한 유화를 제공함
12 쵸콜렛 불루밍을 방지하거나 감소시킴
13 캬라멜, 사탕 및 너겟 녹은 설탕 및 기름의 유화를 개선시키고/또는 기름의 분리를 방지함
14 가공된 육류, 소시지 소시지 및 압축된 햄의 물 보유 능력을 개선시키고/또는 페이스트 및 파테의 기름 상의 분리를 방지함
적당하게는 본 발명은 치즈에서의 하나 이상의 하기 예상 밖의 기술적 효과를 제공한다: 치즈의 오일링-오프(oiling-off) 효과의 감소; 치즈 생산량의 증가; 풍미의 개선; 감소된 악취; 감소된 "비누같은" 질감.
하나의 관점에서 본 발명은 식품 - 치즈와 같은 -의 생산량이 지질 아실트랜스퍼라제의 이용에 의해 증가되는 실현에 부분적으로 근거를 둔다. 더욱이 또는 대안으로, 식품의 풍미, 질감, 산화 안정성 및/또는 저장 수명이 개선된다. 더욱이 또는 대안으로, 식품은 감소된 콜레스테롤 수치 또는 식품스테롤/스타놀 에스테르의 증가된 함량을 지닌다.
하나의 관점에서 본 발명은 여기서 한정된 지질 아실트랜스퍼라제를 포함한 식품 첨가제 조성물을 제공한다.
또다른 관점에서 본 발명은 여기서 한정된 지질 아실트랜스퍼라제를 포함한 화장품 조성물을 제공한다.
더욱이 본 발명은 화장품 조성물을 제조하기 위해 여기서 한정된 아실트랜스퍼라제의 이용을 제공한다.
이점
본 발명의 변이 트랜스퍼라제는 모효소와 비교시 하나 이상의 하기 이점을 지닌다:
ⅰ) 극성 지질 상의 증가된 활성 및/또는 트리글리세리드 대비 극성 지질 상의 증가된 활성
ⅱ) 하나 이상의 디갈락토실 디글리세리드(DGDG) 및/또는 모노갈락토실 디글리세리드(MGDG)와 같은 갈락토리피드(당지질) 상의 증가된 활성
ⅲ) 인지질 및/또는 트리글리세리드 대비 갈락토리피드(당지질) 상의 증가된 활성 비율
바람직하게는 본 발명의 변이 트랜스퍼라제는 디갈락토실 디글리세리드(DGDG) 및/또는 모노갈락토실 디글리세리드(MGDG) 상에 증가된 활성을 지닌다.
바람직하게는 본 발명의 변이 트랜스퍼라제는 DGDG 및/또는 MGDG 상에 증가된 활성을 지니고 DGDG 및/또는 MGDG 상에 감소된 활성을 지닌다.
또한 본 발명의 변이 트랜스퍼라제는 트리글리세리드 상에 증가된 활성을 지닌다.
또한 본 발명의 변이 트랜스퍼라제는 포스파티딜콜린을 포함한 레시틴과 같은 인지질 상에 증가된 활성을 지닌다.
본 발명의 변이 트랜스퍼라제는 트리글리세리드 및/또는 모노글리세리드 및/또는 디글리세리드 상에 감소된 활성을 지닌다.
극성 지질이라는 용어는 일반적으로 반죽 내에서 발견되는 극성 지질 특히 갈락토리피드 및 인지질을 나타낸다.
반죽 또는 베이크된 제품의 제조에 사용시 본 발명의 변이 트랜스퍼라제는 반죽 또는 베이크된 제품에 하나 이상의 하기 예상 밖의 기술적 효과를 유발한다: 반죽 또는 베이크된 제품(예를 들어 식빵 및/또는 케이크)의 개선된 특정 부피; 개선된 반죽 안정성; 개선된 껍질 점수(예를 들어 더 얇고/또는 더 바삭바삭한 식빵 껍질), 개선된 빵가루 점수(예를 들어 더 균일한 빵가루 분포 및/또는 더 미세한 빵가루 구조 및/또는 더 부드러운 빵가루); 개선된 외형(예를 들어 발포 또는 구멍이 없거나 실질적으로 없는 매끄러운 표면); 감소된 노화; 증가된 부드러움; 개선된 향기; 개선된 미감.
분리된
하나의 관점에서 바람직하게는 본 발명에 사용되기 위한 폴리펩타이드 또는 단백질은 분리된 형태이다. "분리된"이라는 용어는 자연과 있는 그대로 관련되고 자연 내에서 발견되는 것과 같은 서열을 지닌 적어도 하나 이상의 다른 성분으로부터 서열이 실질적으로 유리되는 것을 의미한다.
정제된
하나의 관점에서 바람직하게는 본 발명에 사용되기 위한 폴리펩타이드 또는 단백질은 정제된 형태이다. "정제된"이라는 용어는 매우 순수한 상태 - 즉, 적어도 약 51% 이상의 순도 또는 적어도 약 75% 이상 또는 적어도 약 80% 이상 또는 적어도 약 0% 이상 또는 적어도 약 95% 이상 또는 적어도 약 98% 이상의 순도를 의미한다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열의 클로닝
여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드 또는 변형에 적당한 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열이 상기 폴리펩타이드를 생성하는 세포 또는 생물체로부터 분리된다. 다양한 방법이 뉴클레오타이드 서열의 분리를 위해 당분야에 잘 알려져 있다.
예를 들어 게놈 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리는 폴리펩타이드를 생성하는 생물체로부터의 염색체 DNA 또는 메신저 RNA를 이용하여 구축된다. 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 알려진 경우 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브가 합성되고 생물체로부터 제조된 게놈 라이브러리로부터 폴리펩타이드-인코딩 클론을 확인하는데 이용된다. 대안으로, 다른 알려진 폴리펩타이드 유전자에 상동적인 서열을 포함한 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브가 폴리펩타이드-인코딩 클론을 확인하는데 이용될 수 있다. 후자의 경우 낮은 스트린전시(stringency)의 하이브리디제이션 및 세척 조건이 이용된다.
대안으로, 폴리펩타이드-인코딩 클론은 플라스미드와 같은 발현 벡터 내로 게놈 DNA의 단편을 삽입시키고, 수득된 게놈 DNA 라이브러리로 효소-음성 박테리아를 형질전환시킨 후 형질전환된 박테리아를 폴리펩타이드에 의해 억제된 효소를 포함한 한천 상에 놓아서 폴리펩타이드를 발현하는 클론이 확인되도록 함으로서 확인될 수 있다.
또다른 대안으로, 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열은 수립된 표준 방법 즉, Beucage S.L. et al(1981) Tetrahedron Letters 22, p1859-1869에 의해 기술된 포스포로아미디트(phosphoroamidite) 방법 또는 Matthes et al(1984) EMBO J. 3, p801-805에 의해 기술된 방법에 의해 합성적으로 제조된다. 포스포로아미디트 방법에서 올리고뉴클레오타이드가 합성된다 즉, 자동 DNA 합성기에서 정제되고, 어닐되고, 라이게이트되고 적당한 벡터 내에서 클론된다.
뉴클레오타이드 서열은 표준 기술에 따라 합성, 게놈 또는 cDNA 기원(적당한)의 단편을 라이게이트함으로서 혼합된 게놈 및 합성 기원, 혼합된 합성 및 cDNA 기원 또는 혼합된 게놈 및 cDNA 기원이다. 각각의 라이게이트된 단편은 전체 뉴클레오타이드 서열의 다양한 부분에 상응한다. 또한 DNA 서열은 예를 들어 미국특허 제4,683,202호 또는 Saiki R K et al(Science(1988) 239, pp487-491)에 기술된 바와 같이 특정 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조된다.
뉴클레오타이드 서열
또한 본 발명은 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 여기서 사용된 "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 그의 변이체, 상동체, 단편 및 유도체이다(그의 일부와 같은). 뉴클레오타이드 서열은 센스 또는 안티센스 스트랜스를 나타내는 이중-스트랜드 또는 단일-스트랜드이다.
본 발명과 관련하여 "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 및 RNA를 포함한다. 바람직하게는 DNA, 더욱 바람직하게는 코딩 서열에 대한 cDNA를 의미한다.
바람직한 실시태양에서 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드를 그 자체로 인코드하는 뉴클레오타이드 서열은 자연 환경 내에 있는 자연적으로 관련된 서열(들)과 결합시 자연 환경 내의 고유의 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다. 용이한 참고를 위해 이러한 바람직한 실시태양을 "비-고유 뉴클레오타이드 서열"이라고 명명한다. 이러한 관점에서 "고유 뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 고유의 환경 내에 존재하고 자연적으로 관련된 전체 프로모터에 실시가능하게 결합시 프로모터도 그의 고유 환경 내에 존재하는 전체 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 따라서 본 발명의 폴리펩타이드는 고유의 생물체 내의 뉴클레오타이드 서열에 의해 발현될 수 있으나 뉴클레오타이드 서열은 생물체 내에서 자연적으로 관련된 프로모터의 조절 하에 있지 않다.
바람직하게는 폴리펩타이드는 고유 폴리펩타이드이다. 이러한 관점에서 "고유 폴리펩타이드"라는 용어는 고유 환경 내에 존재하고 고유 뉴클레오타이드 서열에 의해 발현되는 전체 폴리펩타이드를 나타낸다.
일반적으로 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열은 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된다(즉, 재조합 DNA). 그러나 본 발명의 대안적 실시태양에서 뉴클레오타이드 서열은 당분야에 잘 알려진 화학적 방법을 이용하여 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다(Caruthers MH et al(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 및 Horn T et al(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).
분자적 진화
효소-인코딩 뉴클레오타이드 서열이 분리되거나 추정 효소-인코딩 뉴클레오타이드 서열이 확인되면 선택된 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 것이 바람직하고, 예를 들어 본 발명에 따른 효소를 제조하기 위해 서열을 돌연변이시키는 것이 바람직하다.
돌연변이는 합성 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 도입된다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 원하는 돌연변이 사이트의 측면에 위치하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
적당한 방법은 Morinaga et al(Biotechnology(1984) 2, p646-649)에 개시되어 있다. 돌연변이를 효소-인코딩 뉴클레오타이드 서열 내로 도입시키는 또다른 방법은 Nelson and Long(Analytical Biochemistry(1989), 180, p147-151)에 기술되어 있다.
자리 지정 돌연변이 대신에 상기 기술된 바와 같이 Stratagene사의 GeneMorph PCR 돌연변이유발 키트 또는 Clontech사의 Diversify PCR 무작위 돌연변이유발 키트와 같은 상품화 키트를 이용하여 무작위로 돌연변이를 도입시킬 수 있다. EP 0 583 265는 PCR 기반 돌연변이유발을 최적화시키는 방법을 나타내고, 이는 또한 EP 0 866 796에 기술된 것과 같은 돌연변이유발성 DNA 아날로그의 이용과 결합될 수 있다. 오류 빈발 PCR 기술이 바람직한 특성을 지닌 지질 아실트랜스퍼라제의 변이체 제조에 적당하다. WO0206457은 리파제의 분자적 진화를 나타낸다.
신규한 서열을 수득하는 세 번째 방법은 많은 제한 효소 또는 Dnase I과 같은 효소를 이용하고, 기능적 단백질을 코드하는 전체 뉴클레오타이드 서열을 재집합시킴으로서 비-동일성 뉴클레오타이드 서열을 분해시키는 것이다. 대안으로, 하나 또는 다수의 비-동일성 뉴클레오타이드 서열을 이용하고 전체 뉴클레오타이드 서열의 재집합 동안 돌연변이를 도입시킬 수 있다. DNA 셔플링 및 패밀리 셔플링 기술은 바람직한 특성을 지닌 지질 아실트랜스퍼라제의 변이체 제조에 적당하다. '셔플링'을 수행하는 적당한 방법은 EP0 752 008, EP1 138 763, EP1 103 606에서 발견될 수 있다. 또한 셔플링은 미국특허 제6,180,406 및 WO 01/34835에서 기술된 DNA 돌연변이유발의 다른 형태와 결합될 수 있다.
따라서 생체 내 및 시험과 내에서 뉴클레오타이드 서열 내로 많은 자리 지정 및 무작위 돌연변이를 제조한 후 다양한 수단에 의해 인코드된 폴리펩타이드의 개선된 기능성에 대해 선별하는 것이 가능하다. 예를 들어 실리코(silico) 및 엑소 매개 재조합 방법을 이용하여(WO 00/58517, 미국특허 6,344,328, 미국특허 6,361,974) 제조된 변이체가 알려진 효소 또는 단백질에 대해 매우 낮은 상동성을 보유한 분자적 진화가 수행될 수 있다. 이렇게 수득된 변이체는 알려진 트랜스퍼라제 효소에 대해 유의적인 구조적 유사성을 지니나 매우 낮은 아미노산 서열 상동성을 지닌다.
더욱이 비-제한적 예로서 폴리뉴클레오타이드 서열의 돌연변이 또는 자연 변이체가 야생형 또는 다른 돌연변이 또는 자연 변이체에 재조합되어 새로운 변이체를 제조할 수 있다. 이러한 새로운 변이체는 인코드된 폴리펩타이드의 개선된 기능성에 대해서도 선별될 수 있다.
상기-논의된 것의 적용 및 유사한 분자적 진화 방법은 단백질 구조 또는 기능의 사전 지식 없이 바람직한 특성을 지닌 본 발명의 효소 변이체의 확인 및 선택을 가능하게 하고, 예측할 수 없으나 유익한 돌연변이 또는 변이체의 제조를 가능하게 한다. 효소 활성의 최적화 또는 변화에 대한 당분야의 분자적 진화 적용의 많은 예가 있고, 이러한 예는 하나 이상의 하기를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다: 숙주 세포 내 또는 시험관 내의 최적화된 발현 및/또는 활성, 증가된 효소적 활성, 변화된 기질 및/또는 생성물 특이성, 증가되거나 감소된 효소적 또는 구조적 안정성, 바람직한 환경 조건 즉, 온도, pH, 기질 내에서의 변화된 효소적 활성/특이성.
당업자에게 분명한 바와 같이 분자적 진화 도구를 이용하여 효소는 효소의 기능성을 개선시키도록 변화된다.
적당하게는 본 발명에서 사용되는 지질 아실트랜스퍼라제는 변이체이다 즉, 모효소와 비교시 적어도 하나 이상의 아미노산 치환, 삭제 또는 첨가를 포함한다. 변이 효소는 모효소에 대해 적어도 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 이상의 상동성을 보유한다. 적당한 모효소는 에스테라제 또는 리파제 활성을 지닌 효소를 지닌다. 바람직하게는 모효소는 pfam00657 공통 서열에 정렬된다.
바람직한 실시태양에서 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 GDSx, GANDY 및 HPT 블록에서 발견되는 적어도 하나 이상의 pfam00657 공통 서열 아미노산 잔기를 보유하거나 포함한다.
수성 환경에서 지질 아실트랜스퍼라제 활성이 없거나 낮은 활성을 지닌 리파제와 같은 효소는 트랜스퍼라제 활성을 도입시키거나 증가시키는 분자적 진화 도구를 이용하여 돌연변이되어 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용되기에 적당한 유의적인 트랜스퍼라제 활성을 지닌 지질 아실트랜스퍼라제 효소를 제조한다.
적당하게는 본 발명에 사용되기 위한 지질 아실트랜스퍼라제는 모효소와 비교시 극성 지질, 바람직하게는 인지질 및/또는 당지질 상에 증가된 효소 활성을 지닌 변이체이다. 또한 바람직하게는 이러한 변이체는 리소 극성 리질 상에 활성을 지니지 않거나 낮은 활성을 지닌다. 극성 지질, 인지질 및/또는 당지질 상의 증가된 활성은 가수분해 및/또는 트랜스퍼라제 활성 또는 둘의 결합의 결과이다.
본 발명에 사용되기 위한 변이 지질 아실트랜스퍼라제는 모효소와 비교시 트리글리세리드 및/또는 모노글리세리드 및/또는 디글리세리드 상에 감소된 활성을 지닌다.
적당하게는 변이 효소는 트리글리세리드 및/또는 모노글리세리드 및/또는 디글리세리드 상에 활성을 지니지 않는다.
대안으로, 본 발명에 사용되기 위한 변이 효소는 트리글리세리드 상에 증가된 활성을 지니고/또는 하나 이상의 하기에 증가된 활성을 지니다: 극성 지질, 인지질, 레시틴, 포스파티딜콜린, 당지질, 디갈락토실 모노글리세리드, 모노갈락토실 모노글리세리드.
지질 아실트랜스퍼라제의 변이체는 알려져 있고, 하나 이상의 이러한 변이체는 본 발명에 따른 방법 및 용도 및/또는 본 발명에 따른 효소 조성물에 사용되기에 적당하다. 예로서 하기 참고문헌에 기술된 지질 아실트랜스퍼라제의 변이체가 본 발명에 따라 이용된다: Hilton & Buckley J Biol. Chem. 1991 Jan 15:266(2):997-1000; Robertson et al J. Biol. Chem. 1994 Jan 21;269(3):2146-50; Brumlik et al J. Bacteriol 1996 Apr; 178(7):2060-4; Peelman et al Protein Sci. 1998 Mar;7(3):587-99.
아미노산 서열
또한 본 발명은 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함한다.
여기서 사용된 "아미노산 서열"이라는 용어는 "폴리펩타이드"라는 용어 및/또는 "단백질"이라는 용어와 동의어이다. 일부의 경우 "아미노산 서열"이라는 용어는 "펩타이드"라는 용어와 동의어이다.
아미노산 서열은 적당한 원료로부터 제조/분리되거나 합성적으로 제조되거나 재조합 DNA 기술의 이용에 제조된다.
적당하게는 아미노산 서열은 표준 기술에 의해 여기서 나타난 분리된 폴리펩타이드로부터 수득된다.
분리된 폴리펩타이드로부터 아미노산 서열을 측정하는 적당한 방법은 하기와 같다:
정제된 폴리펩타이드가 동결-건조되고 100 ㎍d의 동결-건조된 물질이 8 M 요소와 0.4 M의 탄산수소암모늄의 혼합물 50 ㎕, pH 8.4 내에 용해된다. 용해된 단백질은 변성되고 15분간 50℃에서 환원된 후 질소로 피복되고 45 mM 디티오트레이톨 5 ㎕이 첨가된다. 상온으로 냉각된 후 100 mM 요오드아세트아미드(iodoacetamide) 5 ㎕가 시스테인 잔기에 첨가되어 질소 조건 하의 상온 암실에서 15분간 유도된다.
5 ㎕의 물에 135 ㎕의 물 및 5 ㎍의 엔도프로테이나아제(endoproteinase) Lys-C가 상기 반응 혼합물에 첨가되고 24시간 동안 37℃에서 질소 조건 하에서 분해가 수행된다.
수득된 펩타이드는 용매 A: 물 내의 0.1% TFA 및 용매 B: 아세토니트릴 내의 0.1% TFA를 이용하여 VYDAC C18 컬럼(0.46x15 cm; 10 ㎛; The Separation Group, California, USA) 상의 역상 HPLC에 의해 분리된다. 선택된 펩타이드는 N-말단 시퀀싱 전에 동일한 용매 시스템을 이용하여 Develosil C18 컬럼 상에서 재-크로마토그래프된다. 시퀀싱은 제조사의 지침에 따라 pulsed fast cycle을 이용하여 Applied Biosystems 476A 시퀀서를 이용하여 수행된다(Applied Biosystems, California, USA).
서열 동일성 또는 서열 상동성
또한 본 발명은 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드의 아미노산 서열(들)과 서열 동일성 또는 서열 상동성을 지닌 서열 또는 이러한 폴리펩타이드를 인코드하는 어떠한 뉴클레오타이드 서열(이하 "상동적 서열(들)"로 표기)의 이용을 포함한다. 여기서 "상동체"라는 용어는 피험 아미노산 서열 및 피험 뉴클레오타이드 서열과 특정한 상동성을 지닌 실재를 의미한다. 여기서 "상동성"이라는 용어는 "동일성"과 동등하다.
상동적 아미노산 서열 및/또는 뉴클레오타이드 서열은 기능적 활성을 보유한 폴리펩타이드를 제공하고/또는 인코드하고/또는 효소의 활성을 증가시켜야 한다.
이러한 상황에서 상동적 서열은 피험 서열에 적어도 75, 85 또는 90% 이상, 바람직하게는 적어도 95 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하게 된다. 일반적으로 상동체는 피험 아미노산 서열과 동일한 활성 사이트를 포함할 것이다. 상동성이 유사성 측면에서 고려될 수 있으나(즉, 유사성 화학 성질/기능을 지닌 아미노산 잔기) 본 발명에서 서열 동일성 측면에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
이러한 상황에서 상동적 서열은 본 발명의 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(피험 서열)에 적어도 75, 85 또는 90% 이상, 바람직하게는 적어도 95 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하게 된다. 일반적으로 상동체는 피험 서열과 동일하게 활성 사이트 등을 코드하는 서열을 포함할 것이다. 상동성이 유사성 측면에서 고려될 수 있으나(즉, 유사성 화학 성질/기능을 지닌 아미노산 잔기) 본 발명에서 서열 동일성 측면에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
상동성 비교는 눈으로 또는 더욱 일반적으로는 용이하게 입수가능한 서열 비교 프로그램에 의해 수행될 수 있다. 이들 상품화된 컴퓨터 프로그램은 2 이상의 서열 사이의 % 상동성을 계산할 수 있다.
% 상동성은 인접 서열에 대해 계산된다 즉, 하나의 서열이 다른 서열과 정렬되고 하나의 서열 내의 각 아미노산은 한번에 하나의 잔기씩 다른 서열 내의 상응하는 아미노산과 비교된다. 이는 "언갭된(ungapped)" 정렬로 명명된다. 일반적으로 이러한 언갭된 정렬은 매우 적은 수의 잔기에만 수행된다.
이는 매우 간단하고 일관된 방법이나 예를 들어 서열의 동일한 쌍이 아닌 경우 하나의 삽입 또는 삭제는 이하 아미노산 잔기가 정렬로부터 제거되게 하여 전체적인 정려이 수행될 때 % 상동성 상에 큰 감소를 잠재적으로 유발함을 고려하지 못한다. 따라서 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 점수 부당하게 패널티를 과하지 않고 가능한 삽입 및 삭제를 고려하는 최적의 정렬을 생성하도록 고안된다. 이는 국부적 상동성을 최대화하도록 서열 정렬 내에 "갭"을 삽입함으로서 달성된다.
그러나 이들 더욱 복잡한 방법은 정렬 내 발생하는 각 갭에 "갭 패널티"를 할당하여 가능한 적은 갭을 지닌 동일한 수의 동일한 아미노산의 경우 서열 정렬은 - 2개의 비교 서열 사이의 더 큰 관련성을 반영 - 많은 갭을 지닌 것보다 더 높은 점수를 달성할 것이다. 갭의 존재에 대해 매우 높은 비용을 부과하고 갭 내의 부차적 잔기에 대해 더 작은 패널티를 부가하는데 일반적으로 "아핀(affine) 갭 비용"이 이용된다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 득점 시스템이다. 물론 높은 갭 패널티는 적은 갭을 지닌 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티가 변형되는 것을 가능하게 한다. 그러나 서열 비교시 이러하 소프트웨으를 사용할 때 디폴트 수치를 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 GCG Wisconsin Bestfit 팩키지 사용시 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 패널티는 갭의 경우 -12 및 각 연장의 경우 -4이다.
따라서 최대 % 상동성의 계산은 갭 패널티를 고려할 때 최적 정렬의 생성을 먼저 필요로 한다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적당한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 팩키지이다(Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387). 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 팩키지(Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18) FASTA(Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410) 및 GENEWORKS suite of comparision tool이나 이에 한정적인 것은 아니다. BLAST 및 FASTA 모두 오프라인 및 온라인 검색에 유용하다(Ausubel et al 1999, 7-58 내지 7-60 참조). 그러나 일부 적용에 있어서 GCG Bestfit 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 Sequence로 불리는 새로운 도구도 단백질 및 뉴클레오타이드 서열을 비교하기에 유용하다(FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 및 tatiana@ncbi.nlm.nih.gov 참조).
최종 % 상동성이 동일성의 측면에서 측정될 수 있더라도 정렬 과정 그 자체는 일반적으로 전부-또는-전부가 아닌(all-or-nothing) 쌍 비교에 기반하지 않는다. 대신에 일반적으로 눈금이 있는 유사성 득점 매트릭스가 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기반하여 각각의 이원비교(pairwise comparison)에 점수를 할당하는데 이용된다. 일반적으로 이용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스이다 - 프로그램 BLAST 한 벌에 대한 디폴트 매트릭스. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공개 디폴트 수치 또는 공급되는 경우 맞춤 기호 비교를 이용한다(추가 상세한 설명은 사용자 설명서 참조). 일부 적용을 위해 GCG 팩키지의 경우 공개 디폴트 수치를 이용하고, 다른 소프트웨어의 경우 BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 이용하는 것이 바람직하다.
대안으로, 백분율 상동성은 CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988), Gene 73(1), 237-244)와 유사한 알고리즘에 기반하여 DNASISTM(Hitachi Software) 내의 다수의 정렬 특징을 이용하여 계산된다.
소프트웨어가 최적 정렬을 생성하면 % 상동성, 바람직하게는 % 서열 동일성을 계산하는 것이 가능하다. 일반적으로 소프트웨어는 서열 비교의 일부로서 이를 수행하고 수적인 결과를 생성한다.
또한 서열은 침묵 변화를 생성하고 기능적으로 동등한 물질을 유발하는 아미노산 잔기의 삭제, 삽입 또는 치환을 지닌다. 계획적인 아미노산 치환은 물질의 2차 결합 활성이 보유되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 상의 유사성에 기반하여 이루어진다. 예를 들어 음성적으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루타민산을 포함하고; 양성적으로 하전된 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 수치를 지닌 비하전된 극성 헤드를 지닌 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다.
보존적 치환은 예를 들어 하기 표에 따라 이루어진다. 두 번째 컬럼 내의 동일한 블록, 바람직하게는 세 번째 컬럼 내의 동일한 줄의 아미노산이 서로 치환된다:



지방성

 비-극성 G A P
I L V
극성 - 비하전 C S T M
N Q
극성 - 하전 D E
K R
방향성 H F W Y
또한 본 발명은 발생하는 상동적 치환(치환 및 교체는 모두 여기서 현존하는 아미노산 잔기와 대안적 잔기의 상호교환을 의미하는데 사용됨) 즉, 염기성에 대해 염기성, 산성에 대해 산성, 극성에 대해 극성과 같은 유사-대-유사(like-for-like) 치환을 포함한다. 또한 한 분류의 잔기로부터 또다른 잔기 또는 오르니틴(이하 Z로 표기), 디아미노뷰티르산(diaminobutyric acid) 오르니틴(이하 B로 표기), 노르류신 오르니틴(이하 O로 표기), 피릴알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신과 같은 비자연적 아미노산의 함유물 관련 대안 잔기로 비-상동적 치환이 발생한다.
또한 교체는 비자연적 아미노산에 의해 이루어진다.
변이 아미노산 서열은 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 간격 외에 메틸기, 에틸기 또는 프로필기와 같은 알킬기를 포함한, 서열의 두 아미노산 잔기 사이에 삽입되는 적당한 간격(spacer) 그룹을 포함한다. 추가적인 변이의 형태는 펩토이드(peptoid) 형태로 하나 이상의 아미노산 잔기의 존재를 포함하고, 이는 당업자에 의해 잘 이해될 것이다. 의심의 여지를 회피하기 위해 α-탄소 치환기가 α-탄소 보다는 잔기의 질소 원자 상에 있는 변이 아미노산을 나타내는데 "펩토이드 형태"가 사용된다. 펩토이드 형태 내에 펩타이드를 제조하는 방법은 예를 들어 Simon RJ et al., PNAS(1992) 89(20), 9367-9371 및 Horwell DC, Trends Biotechnol.(1995) 13(4), 132-134와 같이 당분야에 알려져 있다.
본 발명에 사용되거나 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열은 합성적 또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드로의 많은 다른 형태의 변형이 당분야에 알려져 있다. 이들은 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 백본 및/또는 분자의 3' 및/또는 5'말단에서의 아크리딘 또는 폴리리신 사슬의 첨가를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해 여기서 기술된 뉴클레오타이드 서열이 당분야에 유용한 어떠한 방법에 의해 변형됨이 이해된다. 뉴클레오타이드 서열의 생체 내 활성 또는 수명을 증가시키기 위해 이러한 변형이 수행된다.
또한 본 발명은 여기서 한정도니 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열, 그의 유도체 또는 단편의 이용을 포함한다. 서열이 그의 단편에 상보적인 경우 서열은 다른 생물체 내의 유사한 코딩 서열을 확인하는 프로브로서 사용될 수 있다.
본 발명의 서열에 100% 상동적이지 않으나 본 발명의 범위 내에 있는 폴리뉴클레오타이드는 많은 방법에 의해 수득될 수 있다. 여기에 기술된 서열의 다른 변이체는 다른 집단으로부터의 개체와 같은 광범위한 개체로부터 DNA 라이브러리를 프로브함으로서 수득된다. 더욱이 다른 바이러스성/박테리아성 또는 세포성 상동체 특히 포유류 세포(즉, 래트, 마우스, 소 및 영장류 세포) 내에서 발견되는 세포성 상동체가 수득되고 이러한 상동체 및 그의 단편은 일반적으로 서열목록에 나타난 서열을 선택적으로 하이브리다이즈하는 것이 가능할 것이다. 이러한 서열은 다른 동물종으로부터 제조된 cDNA 라이브러리 또는 게놈 DNA를 프로브하고, 중간 내지 높은 스트린전시 조건 하에서 첨부된 서열목록 내의 어느 한 서열의 모두 또는 일부를 포함하는 프로브로 이러한 라이브러리를 프로브함으로서 수득된다. 유사한 고려는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 뉴클레오타이드 서열의 종 상동체 및 대립유전자 변이체를 수득하는데 적용된다.
또한 변이체 및 스트레인/종 상동체는본 발명의 서열 내에서 보존된 아미노산 서열을 인코드하는 변이체 및 상동체 내에 서열을 타겟하도록 고안된 프라이머를 이용하는 퇴화(degenerate) PCR을 이용하여 수득된다. 보존된 서열은 예를 들어 일부 변이체/상동체로부터의 아미노산 서열을 정렬시킴으로서 예측될 수 있다. 서열 정렬은 당분야에 알려진 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어 GCG Wisconsin PileUp 프로그램이 널리 이용된다.
퇴화 PCR에 사용되는 프라이머는 하나 이상의 퇴화 위치를 포함하고 알려진 서열에 대해 단일 서열 프라이머로 서열을 클로닝하는데 사용되는 것 보다 더 낮은 스트린전시 조건에서 사용될 것이다.
대안으로, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 특성화된 서열의 자리 지정 돌연변이유발에 의해 수득된다. 이는 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현되는 특정 숙주 세포에 대해 코돈 우선권을 최적화하는데 침묵 코돈 서열 변화가 필요할 때 유용하다. 제한 폴리펩타이드 인식 사이트를 도입시키거나 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드되는 폴리펩타이드의 성질 또는 기능을 변화시키기 위해 다른 서열 변화가 바람직하다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드(뉴클레오타이드 서열)는 프라이머 즉, PCR 프라이머, 대안적 증폭 반응용 프라이머, 프로브 즉, 방사성 또는 비-방사성 표지를 이용한 통상적 방법에 의해 노출 표지로 표지된 프로브를 제조하는데 사용되고 또는 폴리뉴클레오타이드는 벡터 내로 클론된다. 이러한 프라이머, 프로브 및 다른 단편은 적어도 15 이상, 바람직하게는 적어도 20 이상, 예를 들어 적어도 25, 30 또는 40 이상의 뉴클레오타이드 길이이고 또한 여기서 사용된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 포함된다.
본 발명에 따른 DNA 폴리뉴클레오타이드 및 프로브와 같은 폴리뉴클레오타이드는 재조합적으로, 합성적으로 또는 당업자에게 유용한 어떠한 방법에 의해서도 제조된다. 또한 이들은 표준 기술에 의해 클론된다.
일반적으로 프라이머는 한 번에 하나의 뉴클레오타이드에 원하는 핵선 서열의 계단식 제조를 포함한 합성적 방법에 의해 제조될 것이다. 자동화된 기술을 이용하여 이를 달성하기 위한 기술은 당분야에서 용이하게 이용된다.
더 긴 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 재조합 방법, 예를 들어 PCR(중합효소 연쇄 반응) 클로닝 기술을 이용하여 제조될 것이다. 이는 클론하기 원하는 지질 타렛팅 서열 구역의 측면에 있는 프라이머쌍(즉, 약 15 내지 30 뉴클레오타이드)를 제조하고, 프라이머를 동물 또는 인간 세포로부터 수득된 mRNA 또는 cDNA와 접촉시키고, 원하는 구역의 증폭을 야기하는 조건 하에서 중합효소 연쇄반응을 수행하고, 증폭된 단편을 분리하고(즉 아가로스겔 상에서 반응 혼합물을 정제시킴으로서), 증폭된 DNA를 회수하는 것을 포함할 것이다. 프라이머는 적당한 제한 효소 인식 사이트를 포함하여 증폭된 DNA가 적당한 클로닝 벡터 내로 클론될 수 있도록 고안된다.
하이브리디제이션
또한 본 발명은 본 발명의 서열에 상보적인 서열 또는 본 발명의 서열 또는 그에 상보적인 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열을 포함한다.
여기서 사용된 "하이브리디제이션"이라는 용어는 중합효소 연쇄반응(PCR) 기술에서 수행되는 증폭 과정뿐만 아니라 "염기 짝짓기를 통해 핵산 스트랜드를 상보적 스트랜드와 결합시키는 공정"을 포함한다.
또한 본 발명은 여기서 논의된 피험 서열 또는 그의 유도체, 단편에 상보적인 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열의 이용을 포함한다.
또한 본 발명은 여기서 논의된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
하이브리디제이션 조건은 Berger and Kimmel(1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)에 나타난 바와 같이 뉴클레오타이드 결합 복합체의 녹는점(Tm)에 기반하고, 하기 설명된 바와 같이 한정된 "스트린전시(stringency)"를 부여한다.
최대 스트린전시는 일반적으로 약 Tm-5℃(프로브 쓰의 5℃ 이하)에서; 높은 스트린전시는 5℃ 내지 10℃ 이하 Tm에서; 중간 스트린전시는 10℃ 내지 20℃ 이하 Tm에서; 낮은 스트린전시는 20℃ 내지 25℃ 이하 Tm에서 발생한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 최대 스트린전시 하이브리디제이션은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출하는데 사용될 수 있는 반면 중간(또는 낮은) 스트린전시 하이브리디제이션은 유사하거나 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출하는데 사용될 수 있다.
바람직하게는 본 발명은 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열에 높은 스트린전시 조건 또는 중간 스트린전시 조건 하에서 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
더욱 바람직하게는 본 발명은 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열에 높은 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na-구연산염 pH 7.0})하에서 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
또한 본 발명은 여기서 논의된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열에 관련된다(여기서 논의된 것의 상보적 서열을 포함).
또한 본 발명은 여기서 논의된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 관련된다(여기서 논의된 것의 상보적 서열을 포함).
또한 중간 내지 최대 스트린전시 조건 하에서 여기서 논의된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 폴리뉴클레오타이드 서열도 본 발명의 범위에 포함된다.
바람직한 관점에서 본 발명은 스트린전트 조건(즉, 50℃ 및 0.2xSSC) 하에서 여기서 논의된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보체에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
더욱 바람직한 관점에서 본 발명은 높은 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1xSSC) 하에서 여기서 논의된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보체에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
폴리펩타이드의 발현
본 발명에 사용되거나 여기서 한정된 특정 성질을 진니 폴리펩타이드를 인코드하기 위한 뉴클레오타이드 서열은 재조합 복제가능 벡터 내로 도입될 수 있다. 벡터는 적합한 숙주 세포 내 및/또는 그로부터 폴리펩타이드 형태로 뉴클레오타이드 서열을 복제하고 발현하는데 사용된다. 발현은 프로모터/인핸서 및 다른 발현 조절 신호를 포함한 조절 서열을 이용하여 조절된다. 원핵성 프로모터 및 진핵세포에서 기능적인 프로모터가 사용된다. 조직 특이적 또는 자극 특이적 프로모터가 사용된다. 상기 논의된 2 이상의 다른 프로모터로부터 서열 요소를 포함한 키메라 프로모터도 사용된다.
뉴클레오타이드의 발현에 의한 숙주 재조합 세포에 의해 제조된 폴리펩타이드는 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라 분비되거나 세폰내적으로 포함된다. 코딩 서열은 특정한 원핵 또는 진핵 세포 멤브레인을 통해 물질 코딩 서열의 분비를 지시하는 신호 서열을 지니도록 고안될 수 있다.
발현 벡터
"발현 벡터"라는 용어는 생체 내 또는 시험관 내 발현을 가능하게 하는 컨스트럭트를 의미한다.
바람직하게는 발현 벡터는 생물체의 게놈 내로 도입된다. 바람직하게는 "도입된"이라는 용어는 게놈 내로의 안정한 도입을 포함한다.
본 발명의 또는 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드를 코드하는 뉴클레오타이드 서열은 벡터 내에 존재하고, 서열이 적당한 숙주 생물체에 의해 뉴클레오타이드 서열의 발현을 제공하는 것이 가능하도록 뉴클레오타이드 서열은 조절 조절 서열에 실시가능하게 결합된다 즉, 벡터는 발현 벡터이다.
여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드의 발현을 제공하기 위해 본 발명의 벡터는 하기 기술된 바와 같은 적당한 숙주 세포 내로 형질전환된다.
벡터 즉, 플라스미드, 코스미드, 바이러스 또는 파지 벡터의 선택은 도입되는 숙주 세포에 따라 달라질 것이다.
벡터는 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자 - 항생제 저항성 즉, 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라시클린 저항성을 부여하는 유전자와 같은 -를 포함한다. 대안으로, 선택은 동시-형질전환에 의해 달성된다(WO91/17243에 기술됨).
벡터는 RNA의 제조를 위해 시험관 내에서 또는 숙주 세포를 트랜스펙트하거나 형질전환시키는데 사용된다.
따라서 또다른 실시태양에서 본 발명은 복제가능 벡터 내로 뉴클레오타이드 서열을 도입시키고, 벡터를 적합한 숙주 세포 내로 도입시키고, 벡터의 복제를 야기하는 조건 하에서 숙주 세포를 생장시킴으로서 본 발명의 뉴클레오타이드 또는 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법을 제공한다.
벡터는 벡터가 의문의 숙주 세포 내에서 복제되게 할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 더욱 포함한다. 이러한 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 및 pIJ702의 복제의 기원이다.
조절 서열
일부 적용시 본 발명에서 사용되기 위한 뉴클레오타이드 서열 또는 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열은 선택된 숙주 세로에 의해서와 같이 뉴클레오타이드 서열의 발현을 제공하는 것이 가능한 조절 서열에 실시가능하게 결합된다. 예로서 본 발명은 이러한 조절 서열에 실시가능하게 결합된 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 포함한 벡터를 포함한다 즉 벡터는 발현 벡터이다.
"실시가능하게 결합된"이라는 용어는 기술된 성분이 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 병렬을 나타낸다. 코딩 서열에 "실시가능하게 결합된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 양립가능한 조건 하에서 달성되는 방식으로 라이게이트된다.
"조절 서열"이라는 용어는 프로모터 및 인핸서 및 다른 발현 조절 신호를 포함한다.
"프로모터"라는 용어는 당분야의 일반적 의미 즉, RNA 중합효소 결합 사이트로 사용된다.
여기서 한정된 특정 성질을 지닌 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열의 증가된 발현은 이형적 조절 구역 즉, 프로모터, 분비 리더 및 터미네이터 구역의 선택에 의해 달성된다.
바람직하게는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 적어도 프로모터에 실시가능하게 결합된다.
박테리아, 진균 또는 효모 숙주 내에서 뉴클레오타이드 서열의 전사를 지시하기 위한 적당한 프로모터의 예는 당분야에 잘 알려져 있다.
컨스트럭트
"컨스트럭트"라는 용어는 - "컨쥬게이트", "카세트" 및 "하이브리드"와 같은 용어와 동의어인 - 본 발명에 따른 이용을 위해 프로모터에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 간접적 부착의 예는 프로모터와 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 매개하는 Sh1-인트론 또는 ADH 인트론 등의 인트론과 같은 적당한 간격 그룹의 제공이다. 직접 또는 간접적 부착을 포함한 본 발명에 관련된 "융합된"이라는 용어에 대해서도 동일하다. 일부의 경우 본 용어는 야생형 유전자 프로모터와 일반적으로 결합된 단백질을 코드하는 뉴클레오타이드 서열의 자연적 결합 및 이들 모두 그의 자연 환경 내에 존재하는 경우를 포함하지 않는다.
컨스트럭트는 유전자 컨스트럭트의 선택을 가능하게 하는 마커를 포함하거나 발현한다.
일부의 적용에 있어서 바람직하게는 컨스트럭트는 프로모터에 실시가능하게 결합된 적어도 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 또는 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
숙주 세포
"숙주 세포"라는 용어는 - 본 발명에 관련하여 - 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 기술되고 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드의 재조합 생성에 사용되는 발현 벡터를 포함한 어떠한 세포도 포함한다.
따라서 본 발명의 또다른 실시태양은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 또는 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드를 발현하는 뉴클레오타이드 서열로 형질전환되거나 트랜스펙트된 숙주 세포를 제공한다. 세포는 상기 벡터에 적합한 것으로 선택되고 예를 들어 원핵성(예를 들어 박테리아성), 진균성, 효모 또는 식물 세포이다. 바람직하게는 숙주 세포는 인간 세포는 아니다.
적당한 박테리아성 숙주 생물체의 예는 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아이다.
여기서 한정된 특성 성질을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열의 성질 및/또는 발현되는 단백질의 부차적인 처리에 대한 바람직함에 따라 다르게 효모 또는 다른 진균과 같은 진핵성 숙주가 바람직하다. 일반적으로 효모 세포가 조작하기에 용이하기 때문에 진균 세포보다 바람직하다. 그러나 일부 단백질은 효모 세포로부터 불충분하게 선택되거나 일부의 경우 적당히 처리되지 않는다. 이러한 경우 다른 진균 숙주 생물체가 선택된다.
효모, 진균 및 식물 숙주 세포와 같은 적당한 숙주 세포의 이용은 본 발명의 재조합 발현 생성물 상에 최적의 생물학적 활성을 부여하기 때문에 후-발현 변형(즉, 미리스토일레이션(myristoylation), 당화, 절단, 라피데이션(lapidation) 및 티로신, 세린 또는 트레오닌 인산화)을 제공한다.
숙주 세포는 프로테아제 결함 또는 프로테아제 마이너스 스트레인이다.
생물체
본 발명에 관련한 "생물체"라는 용어는 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열 또는 여기서 한정된 특성 서열을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 그로부터 수득된 생성물을 포함할 수 있는 어떠한 생물체도 포함한다.
적당한 생물체는 원핵생물, 진균, 효모 또는 식물을 포함한다.
본 발명과 관련한 "형질전환 생물체"라는 용어는 여기서 한정된 특성 서열을 지닌 폴리펩타이드를 코드하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 그로부터 수득된 생성물을 포함하고/또는 프로모터가 생물체 내에서 여기서 한정된 특성 성질을 지닌 폴리펩타이드를 코드하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능하게 할 수 있는 어떠한 생물체도 포함한다.
"형질전환 생물체"라는 용어는 자연 환경 내에도 존재하는 고유의 프로모터의 조절 하에 있는 경우 그의 자연 환경 내의 고유의 뉴클레오타이드 코딩 서열을 포함하지 않는다.
따라서 본 발명의 형질전환 생물체는 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드를 코드하는 뉴클레오타이드 서열 중의 어느 하나 또는 그의 결합, 여기서 한정된 컨스트럭트, 여기서 한정된 벡터, 여기서 한정된 플라스미드, 여기서 한정된 세포 또는 그의 생성물을 포함한 생물체를 포함한다. 또한 예를 들어 형질전환 생물체는 이형적 프로모터의 조절 하에서 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드를 코드하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
숙주 세포/생물체의 형질전환
상기 나타난 바와 같이 숙주 생물체는 원핵성 또는 진핵성 생물체가 될 수 있다. 적당한 원핵성 숙주의 예는 대장균(E. coli) 및 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)를 포함한다.
원핵성 숙주의 형질전환 상의 지침은 당분야에 잘 알려져 있고 예를 들어 Sambrook et al(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 참조. 원핵성 숙주가 사용되는 경우 뉴클레오타이드 서열은 인트론의 제거와 같이 형질전환 전에 적당히 변형될 필요가 있다.
또다른 실시태양에서 형질전환 생물체는 효모가 될 수 있다.
섬질 진균 세포는 당분야에 알려진 다양한 방법 - 원형질체의 형성 및 원형질체의 형질전환 후 잘 알려진 방법으로 세포벽을 재생시키는 것을 포함한 방법과 같은 -을 이용하여 형질전환된다. 숙주 미생물로서 아스퍼질러스(Aspergillus)의 이용이 EP 0 238 023에 기술되어 있다.
또다른 숙주 생물체는 식물이 될 수 있다. 식물을 형질전환하는데 사용되는 일반적 기술의 조사는 Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) 및 Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)에 의한 논문에 나타나 있다. 식물 형질전환에 대한 또다른 지침은 EP-A-0449375에 나타나 있다.
진균, 효모 및 식물의 형질전환에 대한 일반적 지침은 하기 섹현에 제공된다.
형질전환된 박테리아
숙주 생물체는 스트렙토마이세스(Streptomyces), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtillis) 또는 대장균(E. coli)와 같은 박테리아이다. 대장균 내의 이형적 발현의 적당한 방법은 WO04/064537에 개시되어 있다. 바실러스 내의 이형적 발현의 적당한 방법은 WO02/214490에 개시되어 있다. 적당한 박테리아성 숙주 생물체의 예는 바실러스 섭틸리스, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 렌터스(Bacillus lentus), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 스테아로테르모필러스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alkalophilus), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliqufaciens), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 라우터스(Bacillus lautus), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 및 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis)를 포함한 바실러스과와 같은 그람 양성 박테리아종, 스트렙토마이세스 무리누스(Streptomyces murinus)와 같은 스트렙토마이세스종, 락토코커스 락티스(Latococcus lactis)와 같은 락토코커스종, 락토바실러스 레우테리(Latococcus reuteri)를 포함한 락토바실러스종을 포함한 젖산 박테리아종, 류코모스토크종(Leuconostoc spp.), 페디오코커스종(Pediococcus spp.) 및 스트렙토코커스종(Streptococcus spp.)이다. 대안으로, 대장균(E. coli)을 포함한 장내세균과(Enterobacteriaceae) 또는 슈도모나다과(Pseudomonadaceae)에 속하는 그람-음성 박테리아종의 스트레인이 숙주 생물체로서 선택될 수 있다.
형질전환된 진균
숙주 생물체는 섬질 진균과 같은 진균이다. 이러한 적당한 숙주의 예는 써모마이세스(Thermomyces), 아크레모니움(Acremonium), 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리움(Penicillium), 뮤코(Mucor), 뉴로스포라(Neurospora), 트리코더마(Trichoderma) 등의 속을 포함한다.
섬질 진균의 형질전환 상의 지침은 섬질 진균의 형질전환에 대한 표준 기술을 나타내는 US-A-5741665에 보고되어 있고, 진균을 배양하는 것은 당분야에 잘 알려져 있다. N. crassa에 적용된 기술의 광범위한 조사는 Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A:79-143에 나타나 있다.
섬질 진균의 형질전환 상의 지침은 US-A-567407에 보고되어 있다.
하나의 관점에서 숙주 생물체는 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger)와 같은 아스퍼질러스속이 될 수 있다.
본 발명에 따른 형질전환 아스퍼질러스는 예를 들어 Turner G. 1994(Vector for genetic manipulation. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R.(Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp.641-666)의 지침에 따라 제조될 수 있다.
섬질 진균 내의 유전자 발현은 Punt et al.(2002) Trends Biotechnol 2002 May;20(5):200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997) 17(4):273-306에서 보고되었다.
형질전환된 효모
또다른 실시태양에서 형질전환 생물체는 효모가 될 수 있다.
효모 내에서의 이형적 유전자 발현 원리의 보고는 예를 들어 Methods Mol Biol(1995), 49:341-54 및 Curr Opin Biotechnol(1997) Oct;8(5):554-60에서 제공된다.
이러한 관점에서 효모 - 사카로마이세스 세레비시(Saccharomyces cerevisi) 또는 피키아 카스토리스(Pichia pastoris)(FEMS Microbiol Rev(2000 24(1):45-66) 종과 같은 -가 이형적 유전자 발현에 대한 운반체로서 사용된다.
사카로마이세스 세레비시 내의 이형적 유전자 발현 및 유전자 생성물의 분비 원리의 보고는 E Hinchcliffe E Kenyy(1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous gene", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.)에 의해 제공된다.
효모의 형질전환의 경우 일부 형질전환 프로토콜이 개발되었다. 예를 들어 본 발명에 따른 형질전환 사카로마이세스는 Hinnen et al.,(1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, JD (1978, Nature, London, 275, 104); 및 Ito, H et al(1983, J Bacteriology 153, 163-168)의 지침을 따라 제조될 수 있다.
형질전환된 효모 세포는 영양요구성 마커 우성 항생제 저항성 마커와 같은 다양한 선택성 마커를 이용하여 선택된다.
적당한 효모 숙주 생물체는 피키아종, 한세눌라종(Hansenula spp.), 클루이페로마이세스종(Kluyveromyces ssp.), 야로위니아종(Yarrowinia ssp.), S. cerevisiae를 포함한 사카로마이세스종 또는 스키조사카로마이세 폼베(Schizosaccharomyce pombe)를 포함한 스키조사카로마이세종으로부터 선택된 효모종과 같으나 이에 한정적이지 않은 생명공학적으로 적절한 효모종으로부터 선택될 수 있다.
메틸영양체성 효모 종인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 스트레인이 숙주 생물체로서 사용된다.
하나의 실시태양에서 숙주 생물체는 H. polymorpha와 같은 한세눌라종이다(WO01/39544에 기술됨).
형질전환된 식물/식물 세포
본 발명에 적당한 숙주 생물체는 식물이다. 일반적 기술의 보고는 Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) 및 Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)에 의한 논문 또는 WO01/16308에 나타나 있다. 형질전환 식물은 예를 들어 증가된 수준의 식물스테롤 에스테르 및 식물스타놀 에스테르를 생성한다.
따라서 본 발명은 여기서 한정된 지질 아실트랜스퍼라제로(특히 여기서 한정된 지질 아실트랜스퍼라제를 포함한 발현 벡터 또는 컨스트럭트로) 식물 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 식물 세포로부터 식물을 생장시키는 단계를 포함한, 증가된 수준의 식물스테롤 에스테르 및 식물스타놀 에스테르를 지닌 형질전환 식물의 제조 방법에 관한 것이다.
분비
종종 발현 숙주로부터 효소가 더욱 용이하게 회수되는 배양 배지 내로 폴리펩타이드가 분비되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따라 분비 리더 서열이 원하는 발현 숙주에 기반하여 선택된다. 하이브리드 신호 서열도 본 발명의 상황에 따라 사용된다.
이형적 분비 리더 서열의 일반적인 예는 진균성 아밀로글루코시다제(AG) 유전자(glaA - 아스퍼질러스로부터의 18 및 24 아미노산 버전 모두), a-인자 유전자(효모 즉, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스 및 한세눌라) 또는 α-아밀라제 유전자(바실러스)로부터 기원한 것이다.
검출
아미노산 서열의 발현을 검출하고 측정하기 위한 다양한 프로토콜은 당분야에 알려져 있다. 예는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사선면역측정법(RIA) 및 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 포함한다.
다양한 표지 및 컨쥬게이션 기술이 당업자에 의해 알려져 있고 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 사용될 수 있다.
Pharmacia Biotech(Piscataway, NJ), Promega(Madison, WI) 및 US Biochemical Corp(Cleveland, OH)와 같은 많은 회사가 이러한 절차를 위한 상품화된 키트 및 프로토콜을 공급한다.
적당한 수용체 분자 또는 표지는 기질, 조인자, 억제제, 자기입자뿐만 아니라 방사선핵종, 효소, 형광제, 화학발광제 또는 색소유전제를 포함한다. 이러한 표지의 이용을 나타내는 특허는 US-A-3,817,837; US-A-3,850,752; US-A-3,939,350; US-A-3,996,345; US-A-4,277,437; US-A-4,275,149 및 US-A-4,366,241을 포함한다.
또한 재조합 면역글로불린은 US-A-4,816,567에 나타난 바와 같이 제조된다.
융합 단백질
여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드는 그의 추출 및 정제에 도움을 주기 위해 융합 단백질로서 제조된다. 융합 단백질 파트너의 예는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 6xHis, GAL4(DNA 결합 및/또는 전사 활성 도메인) 및 β-갈락토시다제를 포함한다. 또한 융합 단백질 서열의 제거를 가능하게 하기 위해 융합 단백질 파트너와 목적 단백질 서열 사이의 가수분해성 분열 사이트를 포함하는 것이 편리하다. 바람직하게는 융합 단백질은 단백질 서열의 활서을 방해하지 않을 것이다.
E. coli 내의 유전자 융합 발현 시스템은 Curr. Opin. Biotechnol.(1995) 6(5):501-6에서 조사되었다.
본 발명의 또다른 실시태양에서 여기서 한정된 특정 성질을 지닌 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 융합 단백질을 인코드하는 이형적 서열에 라이게이트된다. 예를 들어 물질 활성에 영향을 미치는 것이 가능한 약제에 대한 펩타이드 라이브러리를 선별하기 위해 통상적으로 상품화된 항체에 의해 인식되는 이형적 에피토프를 발현하는 키메라 물질을 인코드하는 것이 유용하다.
본 발명은 하기 도면 및 실시예를 통해 설명될 것이다.
도 1은 데이터베이스 버전 6으로부터의 pfam00657(서열번호: 1) 공통 서열을 나타낸다.
도 2는 생물체 아에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)(P10480; GI:121051)로부터 수득된 아미노산 서열(서열번호: 2)을 나타낸다.
도 3은 생물체 아에로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida)(AAG098404; GI:9964017)로부터 수득된 아미노산 서열(서열번호: 3)을 나타낸다.
도 4는 생물체 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor) A3(2)(유전자은행 접근번호 NP_631558)로부터 수득된 아미노산 서열(서열번호: 4)을 나타낸다.
도 5는 생물체 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor) A3(2)(유전자은행 접근번호 CAC42140)로부터 수득된 아미노산 서열(서열번호: 5)을 나타낸다.
도 6은 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)(유전자은행 접근번호 P41734)로부터 수득된 아미노산 서열(서열번호: 6)을 나타낸다.
도 7은 pfam00657 공통 서열로의 선택된 서열의 정렬을 나타낸다.
도 8은 93% 아미노산 서열 동일서을 나타내는 서열번호 3의 서열번호 2와의 이원비교 정렬을 나타낸다. 신호 서열은 밑줄쳐있다. +는 차이를 나타낸다. 활성 사이트 세린 16 및 활성 사이트 아스파르트산 116 및 히스티딘 291을 포함한 GDSX 모티프는 강조되었다(어두운 구역 참고). 아미노산 다음의 번호는 마이너스 신호 서열이다.
도 9는 생물체 아에로모나스 하이드로필라로부터 수득된 본 발명에 따른 지질 아실트랜스퍼라제를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 7)을 나타낸다.
도 10은 생물체 아에로모나스 살모니시다로부터 수득된 본 발명에 따른 지질 아실트랜스퍼라제를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 8)을 나타낸다.
도 11은 생물체 스트렙토마이세스 코엘리콜러 A3(2)(유전자은행 접근번호 NP_003888.1:8327480..8328367)로부터 수득된 본 발명에 따른 지질 아실트랜스퍼라제를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 9)을 나타낸다.
도 12는 생물체 스트렙토마이세스 코엘리콜러 A3(2)(유전자은행 접근번호 AL939131.1:256480..266367)로부터 수득된 본 발명에 따른 지질 아실트랜스퍼라제를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 10)을 나타낸다.
도 13은 생물체 사카로마이세스 세레비시에(유전자은행 접근번호 Z75034)로부터 수득된 본 발명에 따른 지질 아실트랜스퍼라제를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 11)을 나타낸다.
도 14는 생물체 랄스토니아(Ralstonia)(유전자은행 접근번호: AL646052)로부터 수득된 본 발명에 따른 지질 아실트랜스퍼라제를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 12)을 나타낸다.
도 15는 생물체 랄스토니아로부터 수득된 본 발명에 따른 지질 아실트랜스퍼라제를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 13)을 나타낸다.
도 16은 서열번호 14를 나타낸다. Scoe1 NCBI 단백질 접근 코드 CAB39707.1 GI:4539178 보존된 추측 단백질 [스트렙토마이세스 코엘리콜러 A3(2)].
도 17은 NCBI 단백질 접근 코드 CAB39707.1 GI:4539178 보존된 추측 단백질 [스트렙토마이세스 코엘리콜러 A3(2)]를 인코드하는 서열번호 15에 나타난 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 18은 서열번호 16에 나타난 아미노산을 나타낸다. Scoe2 NCBI 단백질 접근 코드 CAC01477.1 GI:9716139 보존된 추측 단백질 [스트렙토마이세스 코엘리콜러 A3(2)].
도 19는 Scoe2 NCBI 단백질 접근 코드 CAC01477.1 GI:9716139 보존된 추측 단백질 [스트렙토마이세스 코엘리콜러 A3(2)]를 인코드하는 서열번호 17에 나타난 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 20은 아미노산 서열(서열번호: 18)을 나타낸다. Scoe3 NCBI 단백질 접근 코드 CAB88833.1 GI:7635996 추정 분비된 단백질 [스트렙토마이세스 코엘리콜러 A3(2)].
도 21은 Scoe3 NCBI 단백질 접근 코드 CAB88833.1 GI:7635996 추정 분비된 단백질 [스트렙토마이세스 코엘리콜러 A3(2)]을 인코드하는 서열번호 19에 나타난 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 22는 아미노산 서열(서열번호: 20)을 나타낸다. Scoe4 NCBI 단백질 접근 코드 CAB89450.1 GI:7672261 추정 분비된 단백질 [스트렙토마이세스 코엘리콜러 A3(2)].
도 23은 Scoe4 NCBI 단백질 접근 코드 CAB89450.1 GI:7672261 추정 분비된 단백질 [스트렙토마이세스 코엘리콜러 A3(2)]을 인코드하는 서열번호 21에 나타난 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 24는 아미노산 서열(서열번호: 22)을 나타낸다. Scoe5 NCBI 단백질 접근 코드 CAB62724.1 GI:6562793 추정 리포단백질 [스트렙토마이세스 코엘리콜러 A3(2)].
도 25는 Scoe5 NCBI 단백질 접근 코드 CAB62724.1 GI:6562793 추정 리포단백질 [스트렙토마이세스 코엘리콜러 A3(2)]을 인코드하는 서열번호 23에 나타난 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 26은 아미노산 서열(서열번호: 24)을 나타낸다. Srim1 NCBI 단백질 접 근 코드 AAK84028/1 GI:15082088 GDSL-리파제[스트렙토마이세스 리모서스].
도 27은 Srim1 NCBI 단백질 접근 코드 AAK84028/1 GI:15082088 GDSL-리파제[스트렙토마이세스 리모서스]을 인코드하는 서열번호 25에 나타난 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 28은 아미노산 서열(서열번호: 26)을 나타낸다 - 아에로모나스 하이드로필라로부터의 지질 아실트랜스퍼라제(ATCC #7965).
도 29는 아에로모나스 하이드로필라로부터의 지질 아실트랜스퍼라제(ATCC #7965)을 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 27)을 나타낸다.
도 30은 아에로모나스 살모니시다 아종 살모니시다(ATCC#14174)로부터의 지질 아실트랜스퍼라제의 아미노산 서열(서열번호: 28)을 나타낸다.
도 31은 아에로모나스 살모니시다 아종 살모니시다(ATCC#14174)로부터의 지질 아실트랜스퍼라제의 아미노산 서열(서열번호: 29)을 나타낸다.
도 32는 National Center for Biotechnology Information, NIH, MD, USA에서의 기본 지역 정렬 검색 기구 서비스 및 완전한 게놈 데이터베이스를 이용하여 확 인될 수 있다. GDSX 모티프가 데이터베이스 검색에 사용되었고 지질가수분해활서을 지닌 효소를 잠재적으로 인코드하는 많은 서열/유전자가 확인되었다. 유전자는 스트렙토마이세스속, 크산토모나스속 및 랄스토니아속으로부터 확인되었다. 하기 예에서아 같이 랄스토니아 놀라노세아룸(Ralstonia solanacearum)은 아에로모나스 살모니시다(satA) 유전자에 정렬되었다. 이원비교 정렬은 23% 동일성을 나타내었다. 활성 사이트 세린은 아미노 말단에 존재하고, 촉매성 잔기 히스티딘 및 아스파르트산이 확인될 수 있다.
도 33은 Pfam00657.11[패밀리 00657, 데이터베이스 버전 11] 공통 서열(이하 Pfam 공통으로 명명됨) 및 Pfam 공통 서열로의 다양한 서열의 정렬을 나타낸다. 화살표는 활성 사이트 잔기를 나타내고, 밑줄친 상자는 [Upton C and Buckley JT(1995) Trends Biochem Sci 20;179-179]에 의해 나타난 3개의 상동성 상자를 나타내다. Pfam 공통 내의 대문자는 많은 패밀리 멤버 내의 보존된 잔기를 나타낸다. - 기호는 Pfam 공통의 hidden Markov model이 잔기를 발견할 것으로 예측되었나 그렇지 않아서 갭이 삽입되는 위치를 나타낸다. . 기호는 Pfam 공통 내의 상응 잔기가 없는 잔기를 나타낸다. 서열은 도 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 및 30에 기입된 아미노산 서열이다.
도34는 Pfam00657.11[패밀리 00657, 데이터베이스 버전 11] 공통 서열(이하 Pfam 공통으로 명명) 및 Pfam 공통 서열로의 다양한 서열의 정렬을 나타낸다. 화 살표는 활성 사이트 잔기를 나타내고, 밑줄친 상자는 [Upton C and Buckley JT(1995) Trends Biochem Sci 20;179-179]에 의해 나타난 3개의 상동성 상자를 나타내다. Pfam 공통 내의 대문자는 많은 패밀리 멤버 내의 보존된 잔기를 나타낸다. - 기호는 Pfam 공통의 hidden Markov model이 잔기를 발견할 것으로 예측되었나 그렇지 않아서 갭이 삽입되는 위치를 나타낸다. . 기호는 Pfam 공통 내의 상응 잔기가 없는 잔기를 나타낸다. 서열은 도 2, 16, 18, 20, 26, 28 및 30에 기입된 아미노산 서열이다. 이들 단백질 모두는 지질 기질에 대해 활성인 것으로 나타났다.
도 35는 실시예 7의 아에로모나스 하이드로필라 지질 아실트랜스퍼라제 유전자의 돌연변이유발에 사용되는 융합 컨스트럭트의 아미노산 서열(서열번호: 30)을 나타낸다.
도 36은 자일라나제 신호 펩타이드를 포함한 아에로모나스 하이드로필라로부터의 지질 아실트랜스퍼라제 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 31)을 나타낸다.
도 37은 스트렙토마이세스로부터의 지질 아실트랜스퍼라제 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 32)을 나타낸다.
도 38은 스트렙토마이세스로부터의 지질 아실트랜스퍼라제 효소의 폴리펩타이드서열(서열번호: 33)을 나타낸다.
도 39는 테르모비피다(Termobifida)로부터의 지질 아실트랜스퍼라제 효소의 폴리펩타이드 서열(서열번호: 34)을 나타낸다.
도 40은 테르모비피다(Termobifida)로부터의 지질 아실트랜스퍼라제 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 35)을 나타낸다.
도 41은 테르모비피다(Termobifida)로부터의 지질 아실트랜스퍼라제 효소의 폴리펩타이드 서열(서열번호: 36)을 나타낸다.
도 42는 코리나박테리움＼에피시엔스(Corynebacterium＼efficiens)＼GDSx 300 aa로부터의 지질 아실트랜스퍼라제 효소의 폴리펩타이드(서열번호: 37)를 나타낸다.
도 43은 코리나박테리움＼에피시엔스(Corynebacterium＼efficiens)＼GDSx 300 aa로부터의 지질 아실트랜스퍼라제 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 38)을 나타낸다.
도 44는 노보스핑고비움＼아로마티시보란스(Novosphingobium＼aromaticivorans)＼GDSx 284 aa로부터의 지질 아실트랜스퍼라제 효소의 폴리펩타이드(서열번호: 39)를 나타낸다.
도 45는 노보스핑고비움＼아로마티시보란스(Novosphingobium＼aromaticivorans)＼GDSx 284 aa로부터의 지질 아실트랜스퍼라제 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 40)을 나타낸다.
도 46은 스트렙토마이세스＼코엘리콜러＼GDSx 268 aa로부터의 지질 아실트랜스퍼라제 효소의 폴리펩타이드(서열번호: 41)를 나타낸다.
도 47은 스트렙토마이세스＼코엘리콜러＼GDSx 268 aa로부터의 지질 아실트랜스퍼라제 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 42)을 나타낸다.
도 48은 스트렙토마이세스＼아베르미틸리스(Stretomyces＼avermitilis)＼GDSx 269 aa로부터의 지질 아실트랜스퍼라제 효소의 폴리펩타이드(서열번호: 43)를 나타낸다.
도 49는 스트렙토마이세스＼아베르미틸리스(Stretomyces＼avermitilis)＼GDSx 269 aa로부터의 지질 아실트랜스퍼라제 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서 열(서열번호: 44)을 나타낸다.
도 50은 스트렙토마이세스로부터의 지질 아실트랜스퍼라제 효소의 폴리펩타이드(서열번호: 45)를 나타낸다.
도 51은 스트렙토마이세스로부터의 지질 아실트랜스퍼라제 효소를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 46)을 나타낸다.
도 52는 활성 사이트 내에 글리세롤을 지닌 1IVN.PDB 결정 구조의 리본 표시를 나타내다. 상기 도면은 Deep View Swiss-PDB viewer를 이용하여 이루어졌다.
도 53은 1IVN.PDB 결정 구조를 나타낸다 - 활성 사이트 내에 글리세롤을 지닌 Deep View Swiss-PDB viewer를 이용한 측면도- 활성 사이트 글리세롤의 10Å 내의 잔기는 흑색으로 색칠됨.
도 54는 1IVN.PDB 결정 구조를 나타낸다 - 활성 사이트 내에 글리세롤을 지닌 Deep View Swiss-PDB viewer를 이용한 정면도- 활성 사이트 글리세롤의 10Å 내의 잔기는 흑색으로 색칠됨.
도 55는 정렬 1을 나타내다.
도 56은 정렬 2를 나타낸다.
도 57 및 58은 P10480(P10480은 A. hydrophila 효소에 대한 데이터 베이스 서열임)로의 1IVN의 정렬을 나타내고, 이러한 정렬은 PFAM 데이터베이스로부터 수득되고 모델 구축 과정에 사용되었다.
도 59는 P10480이 아에로모나스 하이드로필라에 대한 데이터베이스 서열인 정렬을 나타낸다. 이러한 서열은 모델 구축 및 사이트 선택에 사용된다. 전체 단백질이 묘사되고, 성숙 단백질(서열번호: 2와 동일)은 잔기 19에서 시작되고, A. sal은 아에로모나스 살모니시다(서열번호: 28) GDSX 리파제이고, A. hyd는 아에로모나스 하이드로필라(서열번호: 26) GDSX 리파제임을 주지. 공통 서열은 기입된 서열 사이의 차이점의 위치에서 *를 포함한다.
도 60은 384 클론의 일반적 세트를 나타내고, 야생형 대조군은 0.9PC, 0.8DGDG의 교점에 놓인다.
도 61은 3개의 목적 지역을 나타낸다. 섹션 1은증가된 비율 R을 지니나 DGDG에 대해 낮은 활성을 지닌 돌연변이를 포함한다. 구역 2는 증가된 비율 R 및 증가된 DGDG 활성을 지닌 돌연변이를 포함한다. 구역 3은 증가된 PC 또는 DGDG 활성을 지니나 비율 R 상에 증가가 없는 클론을 포함한다.
(실시예 1)
1IVN 상의 아에로모나스 하이드로필라 GDSx 리파제의 모델링
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 티오에스테라제(Tioesterase) 아미노산 서열(1IVN) 및 아스퍼질러스 아쿨레아터스(Aspergillus aculeatus) 람노갈락투로난(rhammogalacturonan) 아세틸에스테라제 아미노산 서열(1DEO)에 대한 아에로모나스 하이드로필라 GDSX 리파제 아미노산 서열(P10480)의 정렬이 FASTA 포맷 내의 PFAM 데이터베이스로부터 수득되었다. P10480 및 1IVN의 정렬은 1IVN.PDB 결정 구조 배위 파일(도 52)과 함께 자동화 3D 구조 모델러(SWISS-ODELLER 서버 www.expasy.org)로 입력되었다. P10480에 대해 수득된 모델은 'Deep View Swiss-PDB viewer'(www.expasy.org/spdbv/으로부터 수득됨)(도 53)를 이용한 1IVN.PDB 및 1DEO.PDB의 결정 구조 배위에 대해 구조적으로 정렬되었다. PFAM 데이터베이스로부터 수득된 아미노산 정렬(정렬 1 - (도 55))은 1DEO.PDB 및 1IVN.PDB의 구조적 정렬에 기반하여 변형되었다. 이러한 대안적 아미노산 정렬은 정렬 2(도 56)로 명명된다.
1IVN.PDB 구조는 글리세롤 분자를 포함한다. 이러한 분자는 촉매적 잔기에 인접하기 때문에 활성 사이트인 것으로 고려된다. 따라서 선택은 그의 근접에 의해 기질 결합, 생성물 분비 및/또는 촉매 상에 영향을 지니기 쉬운 활성 사이트에 가까운 잔기로 이루어질 수 있다. 1IVN.PDB 구조에서 활성 사이트 내의 글리세롤 분자의 중심 탄소 원자의 중심에 놓인 10Å 구면 내의 모든 아미노산이 선택되었다(아미노산 세트 1)(도 53 및 도 54 참조).
하기 아미노산은 P10480 서열로부터 선택되었다; (1) 정렬 1 내의 아미노산 세트 1에 상응하는 P10480 내의 모든 아미노산; (2) 정렬 2 내의 아미노산 세트 1에 상응하는 P10480 내의 모든 아미노산; (3) P10480 모델 및 1IVN의 중첩으로부터 1IVN 내의 글리세롤 분자로부터의 12Å 내의 P10480 모델 내의 모든 아미노산. 3개군이 모두 결합하여 아미노산 세트 2를 제공한다.
서열 P10480은 "AAG09804.1 GI:9964017 글리세로인지질-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제[아에로모나스 살모니시다]"에 대해 정렬되었고 아미노산 세트 2에 상응하는 AAG09804.1 내의 잔기가 선택되어 아미노산 세트 3을 제공하였다.
세트 1, 2 및 3
아미노산 세트 1:
아미노산 세트 1(이들은 1IVN 내의 아미노산임을 주지 - 도 57 및 도 58)
Figure 112006031978468-pct00011
GDSx와 같은 매우 보존된 모티프 및 촉매 잔기가 세트 1로부터 해제되었다(밑줄친 잔기). 의심의 여지를 회피하기 위해 세트 1은 1IVN 모델의 활성 사이트 내의 글리세롤의 중심 탄소 원자의 10Å 내의 아미노산 잔기를 한정한다.
아미노산 세트 2:
아미노산 세트 2(아미노산의 번호는 P10480 성숙 서열 내의 아미노산 서열을 나타냄을 주지)
Figure 112006031978468-pct00012
세트 2와 비교시 세트 1 내의 선택된 아미노산 잔기의 표
IVN 모델
IVN A.hyd 상동체		 P10480
성숙 서열 잔기
번호
PFAM 구조
Gly8 Gly32
Asp9 Asp33
Ser10 Ser34
Leu11 Leu35 Leu17
Ser12 Ser36 Ser18
Lys22
Met23
Tyr15 Gly58 Gly40
Gly44 Asn98 Asn80
Asp45 Pro99 Pro81
Thr46 Lys100 Lys82
Asn87
Asn88
Glu69 Trp129 Trp111
Leu70 Val130 Val112
Gly71 Gly131
Gly72 Ala132 Ala114
Asn73 Ans133
Asp74 Asp134
Gly75 Tyr135 Tyr117
Leu76 Leu136 Leu118
Gln106 Pro174 Pro156
Ile107 Gly177 Gly159
Arg108 Gln178 Gln160
Leu109 Asn179 Asn162
Pro110 180 to 190 Pro162
Tyr113 Ser163
Ala164
Arg165
Ser166
Gln167
Lys168
Val169
Val170
Glu171
Ala172
Phe121 His198 Tyr197 Tyr179
His198 His180
Asn199 Asn181
Phe139 Met227 Met209
Phe140 Leu228 Leu210
Met141 Arg229 Arg211
Tyr145 Asn233 Asn215
Lys284
Met151 Met303 Met285
Asp154 Asp306
Gly155 Gln307 Gln289
Ile156 Val308 Val290
His157 His309
Pro158 Pro310
아미노산 세트 3:
아미노산 세트 3은 세트 2와 동일하나 아에로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida)(서열번호: 28) 코딩 서열을 나타낸다 즉, 시그날 서열(서열번호: 28)을 포함한 단백질과 비교시 성숙 단백질(서열번호: 2)의 아미노산 번호 사이의 차이를 나타내는 바와 같이 세트 아미노산 잔기 번호는 세트 3에서 18이 더 높다.
아에로모나스 살모니시다 GDSX(서열번호: 28) 및 아에로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila)의 성숙 단백질은 5개 아미노산이 다르다. 이들은 Thr3Ser, Gln182Lys, Glu309Ala, Ser310Asn, Gly318-이고, 살모니시다 잔기는 첫 번째에 기입되어 있고, 하이드로필라 잔기는 마지막에 기입되어 있다(도 59). 하이드로필라 단백질은 단지 317개 아미노산 길이이고 318 위치에 잔기가 부재한다. 아에로모나스 살모니시다 GDSX는 아에로모나스 하이드로필라보다 갈락토리피드 기질과 같은 극성 지질에 매우 높은 활성을 지닌다. 사이트 스캐닝이 모든 5개 아미노산 위치 상에서 수행되었다.
아미노산 세트 4:
아미노산 세트 4는 S3, Q182, E309, S310 및 -318이다.
아미노산 세트 5:
F13S, D15N, S18G, S18V, Y30F, D116N, D116E, D157N, Y226F, D228N Y230F
아미노산 세트 6:
아미노산 세트 6은 Ser3, Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164, Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Gln182, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309, Ser310, -318이다.
세트 6 내의 아미노산 번호는 P10480 내의 아미노산 잔기를 나타낸다(서열번호: 2) - 다른 서열 백본 내의 상응하는 아미노산은 P10480 및/또는 1IVN에 대한 상동성 정렬 및/또는 구조적 정렬에 의해 결정될 수 있다.
아미노산 세트 7:
아미노산 세트 7은 Ser3, Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164, Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Gln182, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309, Ser310, -318, Y30X(X는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W로부터 선택됨), Y226X(X는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W로부터 선택됨), S18X(X는 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y로부터 선택됨), D157X(X는 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로부터 선택됨)이다.
세트 7 내의 아미노산 번호는 P10480 내의 아미노산 잔기를 나타낸다(서열번호: 2) - 다른 서열 백본 내의 상응하는 아미노산은 P10480 및/또는 1IVN에 대한 상동성 정렬 및/또는 구조적 정렬에 의해 결정될 수 있다.
결정 구조로부터 2차 구조 분류르 수득할 수 있다. 이는 알파-헬릭스 또는베타-시트의 일부로서 각 아미노산을 분류할 수 있다는 것을 의미한다. 도 57은 1DEO, 1IVN 및 P10480(아에로모나스 하이드로필라 데이터베이스)의 PFAM 정렬을 나타낸다. 각 서열 라인 아래에 첨가된 것은 구조적 분류이다.
PFAM 데이터베이스는 낮은 서열 동일성을 지닌 단백질의 정렬을 포함한다. 따라서 이들 정렬은 매우 양호하지 않다. 정렬 알고리즘(HAMMER 프로파일)이 보 존된 모티프를 인식하기에 적당하더라도 알고리즘은 상술된 수준 상에 매우 양호하지 않다. 따라서 PFAM 정렬 및 구조적 정렬 사이의 불일치를 발견하는 것이 놀라운 것은 아니다. 당업자가 쉽게 인식할 수 있는 바와 같이 구조적 데이터에 기반하여 PFAM 정렬을 변형시킬 수 있다. 중복된 구조적 요소를 정렬시킬 수 있음을 의미한다.
도 55는 1DEO, 1IVN 및 P10480의 본래의 PFAM 정렬을 나타낸다. 정렬에 첨가된 것은 1DEO 및 1IVN의 결정 구조로부터의 2차 구조 정보이다. 도 56 내의 정렬 2는 2차 구조 요소 사이의 매치가 개선된 수동적으로 변형된 정렬을 나타낸다. 1DEO와 P10480 또는 1IVN과 P10480 사이의 보존된 잔기에 기반하여 정렬은 P10480에 대해 변형되었다. 서열 블록을 용이하게 구별하기 위해 정렬 2 내의 서열 식별체 2는 여분의 m을 지닌다(1DEOm, 1IVNm, P10480m).
정렬 3은 1과 2의 혼합이고, 이는 블록 당 정렬을 제공한다.
(실시예 2) 사이트 스캔 라이브러리의 구축
Stratagene사의 Quick Change Multi Site-Directed Mutagenesis Kit가 제조사 지침에 따라 사용되었다. 용이한 라이브러리를 위해 하나의 NNK 또는 NNS(뉴클레오타이드 약어) 코돈을 지닌 퇴화 프라이머가 고안되었다. 프라이머 고안아 은 Stratagene 웹 사이트 상에서 이용가능한 도구를 이용하여 수행되었다. 프라이머 품질 대조군은 헤어핀 형성 또는 프라이머-이량체 형성 잠재력에 대해 프라이머를 분석하는 표준 분석 기구를 이용하여 더욱 확인되었다.
본 방법의 주요 개념은 하기와 같다; Pfu-Turbo와 같은 비-스트랜드 고-성능 DNA 중합효소 및 단일 프라이머를 이용하여 DNA 주형을 선형으로 증폭시킬 것이다. 이는 PCR 반응의 일반적인 지수 증폭 과정에 대조적이다. 이러한 선형 증폭 과정은 낮은 오류 빈도를 보증한다. 생성물은 스트랜드 비-메틸화 DNA 및 이중 스트랜드 반-메틸화 DNA이다. 주형이 적당한 숙주 생물체로부터 수득되면 주형은 이준 스트랜드의 메틸화 DNA이다. 이는 주형 DNA가 생성물 DNA를 분해하지 않고 Dpn I 엔도뉴클레아제로 분해될 수 있음을 의미한다. 따라서 적당한 숙주 내로의 DNA 형질전환시 비-돌연변이화된 플라스미드를 지닌 매우 낮은 빈도의 형질전환체만.
(실시예 3) 사이트 스캔 라이브러리로부터의 우승자의 선택
2개의 대안적 접근이 기술된다; 라이브러리 시퀀싱 후 특정 아미노산의 분석 또는 라이브러리 분석 후 우승자의 시퀀싱.
우승자 선택 방법 1; 라이브러리 시퀀싱 후 특정 아미노산의 분석
E. coli 내의 사이트 스캐닝 라이브러리/변이체의 생성 및 B. subtilis 내의 변이체의 발현에 사용되는 형질전환/발현 셔틀 벡터는 선택 카세트의 카나마이신 선택 카세트로의 교체에 의해 pDP66S, Penninaga et al.,(Biochemistry(1995), 3368-3376)로부터 유래되었다. P32 프로모터의 cgt 유전자 다운-스트림의 위치에 아실-트랜스퍼라제 변이체 유전자를 삽입시키는데 벡터가 사용되었다. 벡터는 B. subtilis 내에 아실-트랜스퍼라제 변이체의 발현을 유도하는데 P32 프로모터를 사용한다.
발현 벡터는 Chapter 3, Molecular Biological Methods for Bacillus(Ed. C.R. Harwood and S.M. Cutting), 1990. John Wiely & Sons Ltd. Chichester, UK)에 기술된 바와 같이 형질전환 방법을 이용하여 nprE-, aprA- 바실러스 섭틸리스 DB104 내로 형질전환되었다.
사이트 스캔 라이브러리는 K는 G 또는 T를 나타내고 N은 A, C, G 또는 T를 나타내는 하나의 NNK 코돈을 포함한 퇴화 올리고를 이용하여 구축되었다. 이는 NNK 프라이머('사이트 스캔 라이브러리'로 알려진)를 이용한 증폭 반응으로부터 구축된 클론 세트는 기본 32개 특정 코돈(4x4x2=32 조합 선택)에 포함됨을 의미한다. 지켜야할 성향이 없다고 가정시 32개 코돈 당 취하는 95% 기회를 지니도록 취할 필요가 있는 클론의 수는 9이다. 이는 하기 식을 이용하여 계산될 수 있다
식 1; n = {log(1-c)}/{log(1-f)}
n은 클론의 수이고, c는 신뢰 간격의 분수이고, 예를 들어 95% 신뢰 간격은 0.095의 수치를 지니고, 99% 신뢰 간격은 0.99의 분수를 지니고, f는 NNK 프라이머에 대해 1/32 또는 0.03125인 각 코돈 발생 빈도이다. n에 대한 식을 풀면 94.36 또는 95 클론이 제공된다. 95% 신뢰 간격이 너무 낮은 것으로 간주되거나 라이브러리 구축 과정의 하나 이상의 단계에서 성향을 회피할 수 없는 경우 더 많은 클론을 분석하거나 시퀀스하기로 결정할 수 있다. 예를 들어 식 1에서 n이 384로, f는 1/32 또는 0.03125로 세트되면 신뢰 간격 c는 99% 보다 훨씬 더 크다. 클론의 60%가 동일한 돌연변이 또는 야생형 코돈을 지니더라도 363개 클론이 모든 32개 코돈을 수득하는 99% 신뢰도를 제공할 것이다. 이로부터 384개 클론이 적어도 한번 이상에서 32개 코돈 각각을 포함한 99% 신뢰도를 지닐 것으로 결론 내릴 수 있다.
콜로니 PCR이 수행되었다(박테리아 내부로 플라스미드로부터의 단편을 증폭시키기 위한 박테리아 콜로니 또는 박테리아 액체 배양액 상의 PCR 반응후 돌연변이된 단편의 일부를 시퀀싱하는 것은 수립된 절차임). 콜로니 PCR, 시퀀싱 및 시퀀스 정제는 일반적으로 콜로니 PCR에 대해 미리 제작된 물질(키트로 알려진)의 유용성에 의해 96 세트에 대해 수행될 수 있다. 전체 절차는 AGOWA GmbH, Glienicker weg 185, D-12489 Berlin, Germany와 같은 회사에 의한 서비스로 제공 된다.
96개 서열 반응을 분석한 후 96개 서열 세트 내에서 유용한 각 코돈을 나타내는 개체 클론이 선택되었다. 이후 돌연변이를 나타내는 클론에 대해 50 mg/ml 카나마이신이 보충된 5 ml의 LB 브로쓰(카세인 효소 분해, 10 g/l; 저-나트륨 효모 추출물, 5 g/l; 염화나트륨, 5 g/l; 불활성 정제 보조제, 2 g/l)이 접종되었고 205 rpm에서 6시간 동안 33℃에서 인큐베이트되었다. 0.7 ml의 배양액이 50 mg/ml 카나마이신 및 고 말토즈 전분 가수분해물 용액(60 g/l)이 보충된 SAS 기질(K2PHO4, 10 g/l; MOPS(3-몰폴리노프로판 술폰산), 40 g/l; 염화나트륨, 5 g/l; 항기포제(Sin 260), 5 방울/l; 그리스 제거된 콩가루, 20 g/l; 바이오스프링거 106(100% dw YE), 20 g/l) 50 ml를 접종시키는데 사용되었다. 배양 상청액이 30분간 19000 rmp에서의 원심분리에 의해 분리되기 전까지 인큐베이션은 180 rpm에서 33℃에서 40시간 동안 계속되었다. 상청액은 청결한 튜브 내로 옮겨졌고 분석에 직접 사용되었다.
우승자 선택 방법 2; 라이브러리 선별 후 우승자의 시퀀싱
384개 클론을 선택하여 시퀀스할 수 있으나 이를 분석하고 시퀀싱 전에 증가된 변이체를 선택한다.
많은 표본이 선별될 때 많은 문제점이 고려되어야 한다. 하나의 길질 상에 변화된 활성을 지닌 변이체를 선택하는 것이 가능하나 철저하지 않더라도 높은 백그라운드를 유발하는 384개 웰 마이크로타이터판을 이용할 때에도 384개 배양액 사이의 발현 수준 차이는 실질적이 될 수 있다. 따라서 비율의 변화에 기반하여 2개 활성을 측정하고 우승자를 선택하는 것이 바람직한 방법이다. 존재하는 효소의 절대량에 관계없이 2개 활성이 특정한 비율 R을 지니는지 여부를 나타내기 위해 2개 활성 사이의 비율은 항상 R이 될 것이다. R 수치 내의 변화는 두 번째 활성에 비해 하나의 활성을 변화시키는 돌연변이를 나타낸다.
도 60은 사이트 스캔 라이브러리로부터 수득된 데이터 세트를 나타낸다. 클론은 포스파티딜콜린(PC) 및 디갈락토실디글리세리드(DGDG)에 대한 활성에 대해 모두 시험되었다. R 수치 내의 변화를 나타내지 않는 돌연변이될 수 있거나 없는 모든 클론은 오류의 특정한 한계로 직선 상에 놓일 것이다. 이들 클론을 무시하고 3개의 목적군이 도 61에 나타나 있다.
도 61 내의 섹션 1은 야생형(돌연변이되지 않음) 보다 유의적으로 더 높은 R을 지니나 전제 DGDG 활성이 낮은 모든 클론을 포함한다. 섹션 2는 야생형보다 더 높은 R 수치 및 DGDG 활성을 지닌 클론을 포함한다. 섹션 3은 높은 R 수치를 지니지 않으나 유의적을 더 높은 DGDG 또는 PC 활성을 지닌 클론을 포함한다.
DGDG에 대해 증가된 활성을 지닌 변이체 내에 삽입되면 섹션 2는 가장 흥미로운 변이체를 포함하고 섹션 3은 목적 변이체를 포함한다. 가수분해 활성 내의 큰 증가를 나타내는 섹션 3 내의 변이체는 트랜스퍼라제 활성의 감소가 동반된다.
하나의 물질은 가치있는 고지이고 특이성 결정 잔기가 hit인 경우 대부분의 20개 가능한 아미노산이 매우 다른 R 수치를 산출할 수 있다. 그러나 라이브러리가 단일 아미노산에 대한 큰 성향을 포함하는 경우(예를 들어 60%가 티로신임) 이들 모두의 변이체는 직선 상에 있을 것이다.
(실시예 4) 384 웰 마이크로타이터판 내의 PC 및 DGDG 활성에 대한 분석
시작 물질
? EM 배지
? 형질전환체를 지닌 플레이트
? 야생형을 지닌 플레이트
? 384 플레이트
? 콜로니 채취기
? Waco NEFA-C 키트
? 384 플레이트 내의 PC 및 DGDG 용액
파트 1 - 콜로니 채취
? EM 배지로 채워진 384 플레이트 내로 콜로니 도포
? 4 웰 뛰어넘고 비-돌연변이된 백본을 포함한 콜로니로 이를 접종
? 30℃에서 o/n 생장, 200 rpm 진탕 속도
파트 2 - 기질 상의 접종
? o/n 생장된 플레이트를 원심분리; 2500 rpm, 20분
? 각 웰로부터 10 ㎕ 상청액을 2개 빈 384 플레이트 내로 옮김
? 플레이트 중의 하나에 5 ㎕ 12.5 mM DGDG를 첨가, 다른 플레이트 내로 5 ㎕ 12.5 mM PC 첨가
? 37℃에서 2시간 두 플레이트를 인큐베이트, 혼합 시작시 진탕 후 진탕 정 지
? NEFA C 절차를 계속
파트 3 - NEFA-C 절차
? 10 ㎕ A 용액 첨가
? 37℃, 300 rpm에서 10분 인큐베이트
? 20 ㎕ B 용액 첨가
? 37℃, 300 rpm에서 10분 인큐베이트
? 550 nm에서 플레이트 판독
기질 조성물 - mM
25 mM PC eller DGDG
10 mM CaCl2
60 mM Triton X 100
15 mM NaN3
20 mM Briton Robinson pH 5.0
(실시예 5) 선택된 변이체
효소 활성의 측정
다양한 기질에 대한 효소 활성을 측정하기 위해 4 ㎕ 효소 용액이 37℃에서 60분간 11 ㎕ 기질로 인큐베이트되었다. 이후 자유 지방산의 양이 WACO NEFA-C 키트를 이용하여 측정되었다. 15 ㎕ 효소+기질 혼합액에 75 ㎕ NEFA 용액 A가 첨가되었고 37℃에서 15분간 인큐베이트되었다. 이후 150 ㎕ NEFA 용액 B가 첨가되었고 15분간 인큐베이트되었다. 이후 표본의 흡광도(OD)가 550 nm에서 측정되었다.
대조군으로서 각 변이체로부터 4 ㎕ 효소 용액이 37℃에서 60분간 11 ㎕ HEPES 완충액으로 인큐베이트되었다. 이후 자유 지방산의 양이 상기 기술된 바와 같이 측정되었다. 이러한 대조군 표본의 OD 수치는 각 기질 상의 관찰된 OD로부터 차감되어 교정된 활성을 수득하였다.
4개 다른 기질이 사용되었고 조성물은 일반적으로 30 mg 지질, 4.75 ml 50 mM HEPES 완충액 pH 7, 42.5 ㎕ 0.6 M CaCl2, 200 ㎕ 10% Triton X-100 무-H2O2이었다. 30 mg 지질은 포스파티딜콜린(PC), 9 대 1 비율의 콜레스테롤을 지닌 PC, 디갈락토실디글리세리드(DGDG) 또는 9 대 1 비율의 콜레스테롤을 지닌 DGDG이었다.
개선된 변이체의 선택
PC에 대해 개선된 활성을 지닌 변이체
PC 상에서 인큐베이트시 야생형 효소에 대해 OD의 증가를 나타낸 변이체는 개선된 포스파리파제 활성을 지닌 변이체로서 선택되었다.
DGDG에 대해 개선된 활성을 지닌 변이체
DGDG 상에서 인큐베이트시 야생형 효소에 대해 OD의 증가를 나타낸 변이체는 개선된 활성을 지닌 변이체로서 선택되었다.
DGDG에 대해 개선된 특이성을 지닌 변이체
DGDG에 대한 특이성은 DGDG에 대한 활성과 포스파티딜콜린(PC)에 대한 활성 사이의 비율이다. 야생형보다 DGDG와 PC 사이의 더 높은 비율을 나타낸 변이체는 DGDG에 대해 개선된 특이성을 지닌 변이체로서 선택되었다.
아실 공여체로서 PC를 지닌 개선된 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이체
효소를 PC 및 콜레스테롤을 지닌 PC상에서 인큐베이트시 형성된 자유 지방산의 양의 차이는 가수분해 활성의 양 대비 트랜스퍼라제 활성의 양의 지표이다. 트랜스퍼라제 활성은 자유 지방산의 형성을 유발하지 않을 것이다. 트랜스퍼라제 우선권은 PC가 기질로서 사용될 때 형성된 자유 지방산과 콜레스테롤을 지닌 PC가 기질로서 사용될 때 형성된 자유 지방산 사이의 비율이다. 트랜스퍼라제 우선권의 증가를 나타내고 PC에 대해 야생형보다 더 높은 활성을 나타내는 변이체는 개선된 트랜스퍼라제 활성을 지닌 것으로 선택되었다.
아실 공여체로서 DGDG를 지닌 개선된 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이체
효소를 DGDG 및 콜레스테롤을 지닌 DGDG상에서 인큐베이트시 형성된 자유 지방산의 양의 차이는 가수분해 활성의 양 대비 트랜스퍼라제 활성의 양의 지표이다. 트랜스퍼라제 활성은 자유 지방산의 형성을 유발하지 않을 것이다. 트랜스퍼라제 우선권은 DGDGG가 기질로서 사용될 때 형성된 자유 지방산과 콜레스테롤을 지닌 DGDG가 기질로서 사용될 때 형성된 자유 지방산 사이의 비율이다. 트랜스퍼라제 우선권의 증가를 나타내고 DGDG에 대해 야생형보다 더 높은 활성을 나타내는 변이체는 개선된 트랜스퍼라제 활성을 지닌 것으로 선택되었다.
선택된 변이체
상기 4개 선택 기준에 대해 많은 변이체가 선택되었다.
본 실시예 내의 "야생형" 효소는 아에로모나스 살모니시다(서열번호: 28)이다.
PC에 대해 개선된 활성을 지닌 변이체:
Figure 112006031978468-pct00013
DGDG에 대해 개선된 활성을 지닌 변이체:
Figure 112006031978468-pct00014
DGDG에 대해 개선된 특이성을 지닌 변이체:
Figure 112006031978468-pct00015
아실 공여체로서 PC를 지닌 개선된 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이체:
Figure 112006031978468-pct00016
아실 공여체로서 DGDG를 지닌 개선된 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이체:
Figure 112006031978468-pct00017
(실시예 6) 인지질:콜레스테롤 트랜스퍼라제 분석
갈락토리피드로부터의 트랜스퍼라제 분석을 제공하기 위해 인지질은 DGDG로 교체될 수 있다. 다른 수용체 예를 들어 글리세롤, 포도당, 히드록시산, 단백질 또는 말토스가 동일한 분석에 사용될 수 있다.
300 mg 포스파티딜콜린(Avanti #441601):콜레스테롤(Sigma C8503) 9:1이 Wheaton glass에 계량된다. 10 ml 50 mM HEPES 완충액 pH 7.0이 첨가되고 40℃에서의 교반은 기질을 분산시킨다. 0.5 ml 기질은 4 ml 바이알로 옮겨지고 40℃ 가열 블록 내에 놓인다. 0.050 ml 트랜스퍼라제 용액이 첨가되고, 0.050 ml 물을 지닌 대조군도 동일한 방식으로 분석된다. 반응 혼합물은 40℃에서 4시간 동안 교반되었다. 이후 표본은 동결되고 동결건조되고 GLC에 의해 분석된다.
GLC 분석으로부터 자유 지방산 및 콜레스테롤 에스테를 함량이 계산된다.
효소 활성은 하기와 같이 계산된다:
Figure 112006031978468-pct00018
Figure 112006031978468-pct00019
트랜스퍼라제/가수분해효소 비율 = %트랜스퍼라제 활성/%가수분해 활성
Δ% 콜레스테롤 에스테르 = % 콜레스테롤 에스테르(표본) - % 콜레스테롤 에스테르(대조군)
Δ% 지방산 = % 지방산(표본) - % 지방산(대조군).
갈락토리피드:콜레스테롤 트랜스퍼라제 분석
300 mg 디갈락토실디글리세리드(DGDG)(>95 순도 갈락토리피드, 사용된 DGDG는 밀 지질로부터 정제됨. Sigma D4651로부터의 DGDG도 사용에 적당함):콜레스테롤(Sigma) 9: 1이 Wheaton glass에 계량되었다. 10 ml 50 mM HEPES 완충액 pH 7.0이 첨가되고 40℃에서의 교반은 기질을 분산시킨다.
0.5 ml 기질은 4 ml 바이알로 옮겨지고 40℃ 가열 블록 내에 놓인다. 0.050 ml 트랜스퍼라제 용액이 첨가되고, 0.050 ml 물을 지닌 대조군도 동일한 방식으로 분석된다. 반응 혼합물은 40℃에서 4시간 동안 교반되었다. 이후 표본은 동결되고 동결건조되고 GLC에 의해 분석된다.
계산:
GLC 분석으로부터 자유 지방산 및 콜레스테롤 에스테르 함량이 계산된다.
효소 활성은 하기와 같이 계산된다:
Figure 112006031978468-pct00020
Figure 112006031978468-pct00021
트랜스퍼라제/가수분해효소 비율 = %트랜스퍼라제 활성/%가수분해 활성
Δ% 콜레스테롤 에스테르 = % 콜레스테롤 에스테르(표본) - % 콜레스테롤 에스테르(대조군)
Δ% 지방산 = % 지방산(표본) - % 지방산(대조군).
(실시예 7) 아에로모나스 하이드로필라에 대한 지질 아실트랜스퍼라제의 변이체(서열번호: 26)
Stratagene, La Jolla, CA92037, USA의 QuikChangeTM Multi-Site Directed Mutagenesis kit를 이용하여 Stratagene에 의해 제공된 지침하에 돌연변이가 도입되었다.
Tyr256에서의 변이체는 인지질에 대해 증가된 활성을 나타내었다.
Tyr256 및 Tyr260에서의 변이체는 갈락토리피드에 대해 증가된 활성을 나타내었다.
Tyr256에서의 변이체는 아실 공여체로서 갈락토리피드를 지닌 증가된 트랜스퍼라제 활성을 나타내었다.
번호는 하기 서열 상의 위치를 나타낸다: 아에로모나스 하이드로필라로부터의 효소 서열번호 26에 나타난 아미노산 서열. 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 27에 나타나 있다.
(실시예 8) 아에로모나스 살모니시다로부터의 글리세로인지질:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 GCAT의 돌연변이 선별
아에로모나스 살모니시다로부터의 글리세로인지질:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 GCAT의 점돌연변이로부터의 돌연변이는 공여체로서 포스파티딜콜린 또는 디갈락토디글리세리드 및 수용체로서 콜레스테롤을 이용하여 포스파티딜콜린보다 디갈락토실디글리세리드에 대해 더 좋은 활성을 지닌 돌연변이를 선택할 목적으로 트랜스퍼라제 활성에 대해 선별되었다.
GCAT 돌연변이는 공여체로서 디갈락토실디글리세리드(DG) 및 포스파티딜콜린(PC) 및 수용체로서 콜레스테롤을 이용하여 트랜스퍼라제 활성에 대해 선별되었다.
DG(>95% 순도 디갈락토실디글리세리드(사용된 DGDG는 밀 지질로부터 정제됨. Sigma D4651로부터의 DGDG도 Sigma D4651로부터의 사용에 적당함.) 및 콜레스테롤(Sigma C8503)은 9:1로 계량되었고 클로로폼 내에 용해되고 증발되어 건조되었다.
기질은 50 mM HEPES 완충액 pH 7 내에 3% DG:콜레스테롤 9:1을 분산시킴으로서 제조되었다.
0.250 ml 기질은 나사 마개를 지닌 3 ml 유리관에 옮겨졌다. 돌연변이 GCAT의 발효로부터의 0.025 ml 상청액이 첨가되었고 40℃에서 2시간 동안 인큐베이트되었다. 효소 대신 물을 지닌 참고 표본도 제조되었다. 10분간 끓는 물 욕조 내에서 반응 혼합물을 가열시키는 것은 효소 반응을 정지시켰다.
2 ml 99% 에탄올이 첨가되었고 자유 지방산 분석뿐만 아니라 콜레스테롤이 분석되었다.
콜레스테롤 분석
0.1 M TRIS,HCl 완충액 pH 6.6 + 0.5% Triton X 100(Sigma X-100) 내에 1.4 U/ml 콜레스테롤 옥시다제(SERVA 전기영동 GmbH cat. No. 17109), 0.4 mg/ml ABTS(Sigma A-18888), 6 U/ml 퍼옥시다제(Sigma 6782)를 포함한 100 ㎕ 기질이 37℃에서 5분간 인큐베이트되었다. 반응 혼합물은 5분간 추가로 인큐베이트되었고 OD 405 nm가 측정되었다. 콜레스테롤 함량은 0.4 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.20 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml 및 0 mg/ml를 함유한 콜레스테롤 표준 용액의 분석으로부터 계산되었다.
자유 지방산 분석
표본 내의 자유 지방산은 NEFA C kit(WAKO Chemicals GmbH)를 이용하여 측정되었다.
75 ㎕ NEFA 시약 A는 37℃에서 10분간 인큐베이트되었다. 15 ㎕ 효소 표본이 첨가되었고 혼합되었다. 반응 혼합물은 10분간 인큐베이트되었다. 150 ㎕ NEFA 시약 B가 첨가되고 혼합되고 10분간 추가로 인큐베이트되고 OD 540 nm가 측정되었다. 자유 지방산은 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05 및 0 mM 지방산의 표준 용액으로부터 계산되었다.
공여체로서 포스파티딜콜린을 이용한 트랜스퍼라제 분석은 DG(DGDG) 대신에 포스파티딜콜린(Avanti #441601)을 이용한 것 외에 동일한 방식으로 측정되었다.
트랜스퍼라제 활성은 참고 표본 내의 자유 콜레스테롤과 효소 표본 내의 자유 콜레스테롤 상의 차이로부터 계산된 % 에스테르화 콜레스테롤로서 표현되었다.
가수분해 활성은 효소 표본 내의 자유 지방산과 참고 표본 내의 자유 지방산 상의 차이로부터 계산된 % 생성된 자유 지방산으로서 표현되었다.
DG 및 PC에 대한 상대 트랜스퍼라제 활성은 % TDG/TPC로서 계산되었다.
돌연변이에 대한 DG 상의 가수분해 활성 HDG 대비 트랜스퍼라제 활성 TDG가 계산되었다:
Figure 112006031978468-pct00022
386 = 콜레스테롤에 대한 MW 및 280 = 지방산에 대한 MW
TDG > 50% 및 TDG/TPC > 3 및
Figure 112006031978468-pct00023
> 25를 지닌 돌연변이가 개선된 돌연변이로서 선택되었다.
TPC 대비 TDG의 증가 비율과 같은 원하는 활성 프로파일을 제공하는 중요한 사이트 및/또는 특정 아미노산 치환을 확인하고 우선 순위를 결정하기 위해 상기 실시예로부터 수득된 데이터는 통계학을 통해 분석될 수 있다. 예를 들어 하기 강한 모델링이 제안된다:
TPC 및 TDG에 대한 정보는 검열된 반응 max(0, TPC) 및 max(0, TDG)에 의해 수행된다. 본 연구의 목적은 대조군(고유의) 대비 절대 규모 및 상대 규모 모두에서 우선권으로서 양성 수치를 지닌 ln(1+ TDG)-ln(1+ TPC)에 대한 점수에 기반하여 TDG>=TPC를 결정하는 셋팅을 확인하는 것이다. 바람직한 셋팅은 이원성 반응(Event, non-Event)에 기반하여 확인되고, Event는 점수에 곤련한 바람직한 반응으로서 확인된다. 포함된 이전 정보가 없는 실험 데이터 구조에 기반한 보완적 log-log 링크를 지닌 2항식 GLIM 모델은 이원성 반응을 분석한다. 통계 분석을 어떻게 수행하는지에 대한 상세한 설명은 하기 참고문헌을 참고: proc LOGISTIC in SAS Institute Inc., SAS/STAT User's Guide, Version 6, 4.Ed, Vol.2, Cary, NC:SAS Institute Inc., 1989.
Figure 112006031978468-pct00024
Figure 112006031978468-pct00025
(실시예 9) 아에로모나스 살모니시다로부터의 글리세로인지질:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 GCAT의 개선된 돌연변이의 선택
본 실시예 내의 "모" 효소는 아에로모나스 살모니시다(서열번호: 28)이다.
아에로모나스 살모니시다로부터의 GCAT의 32 위치(230 Tyr, 182 Lys, 3 Thr, 157 Asp, 310 Thr, 318 Gly, 309 Glu, 17 Leu, 111 Trp, 117 Tyr, 179 Tyr, 118 Leu, 215 Asn, 22 Lys, 290 Val, 289 Gln, 285 Met, 18 Ser, 23 Met, 180 His, 284 Lys, 181 Asn, 209 Met, 210 Leu, 211 Arg, 40 Gly, 81 Pro, 112 Val, 80 Asn, 82 Lys, 88 Asn, 87 Asn)가 실시예 8의 실험적인 개요에 따라 선별되었다.
선별로부터의 결과 및 3개 선택 기준에 기반하여 하기 표 1에 기입된 돌연변이가 선택되었다.
위치 아미노산 T,PC T,DG T,DG/T,PC H,PC H,DG
210 GLN 10,3 59,7 5,9 0,0 0,0
215 GLY 15,1 55,8 4,5 3,1 1,0
215 LEU 19,4 51,9 3,3 4,3 1,1
215 TYR 21,3 68,0 3,9 4,3 1,8
215 ARG 16,2 62,1 4,7 5,5 2,1
215 VAL 14,7 61,6 5,2 3,5 1,7
215 HIS 5,7 50,1 10,9 4,2 1,3
215 ASN 9,4 47,4 6,2 4,0 1,2
(실시예 10) 아에로모나스 살모니시다로부터의 글리세로인지질:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 GCAT의 돌연변이에 대한 목적 특정 아미노산 구역의 선택
pfam 정렬(정렬 2; 도 56) 및 P10480 모델과 1IVN의 중첩으로부터 1IVN의 활성 사이트 내의 글리세롤 분자 주변 구역의 모든 아미노산이 선택되었고 특정 목적 구역(루프)을 한정하는데 사용되었다(번호는 P10480 성숙 서열(서열번호: 2) 내의 아미노산을 나타낸다).
Thr 20- Arg 41(루프 1, L1)
Ile 77- Leu 89(루프 2, L2)
Leu 118- Asp 127(루프 3, L3)
Gly 146- Val 176(루프 4, L4)
Glu 208- Trp 287(루프 5, L5)
중개 구역(IVR)은 하기와 같이 명명되었다:
Ala 1 - Asp 19(IVR1)
Phe 42 - Lys 76(IVR2)
Asp 90 - Tyr 117(IVR3)
Ala 128 - Asn 145(IVR4)
Ser 177 - Ala 207(IVR5)
Asp 288 - His 317(IVR6)
하기 표는 아에로모나스 살모니시다로부터의 글리세로인지질:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 GCAT의 돌연변이에 대한 바람직한 위치의 배치를 요약한다. 결과는 실시예 8-10에서 설명된 실험 개요에 기반하였다.
P10480 아미노산 위치(서열번호: 2) 증가된 TDG/TPC를 지닌 변이체를 제조하기 위한 바람직한 사이트 10Å 본 발명의 방법을 위한 바람직한 구역
IVR1 1-19 L17, S18
루프1 20-41 K22, G40, Y30 K22, M23, G40 루프 1
IVR2 42-76
루프2 77-89
 N80, N87, N88
 N80, P81, K82,
N87, N88		 루프2
IVR3



 90-117



 Y117, V112,
W111, A114


 W111, V112,
A114, Y117


 IVR3

활성 사이트
로부터의
IVR3 & 10A
루프3 118-127 L118
IVR4 128-145
루프4 146-176 P156
IVR5 177-207



 N181, Q182,
H180, Y179


 Y179, H180,
N181


 IVR5

활성사이트
로부터의
IVR5 & 10A
루프5 208-287 M209, L210
R211, N215,
Y230		 M209, L210,
R211, N215,
K284, M285,
Q289, V290		 루프5

활성사이트
로부터의
루프5 & 10A
IVR6 288-317 Q289, V290,
S310, -318		 IVR6
상기 명세서 내에 논의된 모든 논문은 참고문헌으로 포함되어 있다. 본 발명의 기술된 방법 및 시스템 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 범위 및 정신에서 벗어남이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 관련하여 기술되어 있으나 청구된 본 발명은 이러한 특정한 실시태양에 부당하게 한정되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 실제로 생화학 및 생명공학 또는 관련 분야의 숙련자에게 분명한 본 발명을 수행하기 위한 상세한 방법의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있게 된다.
SEQUENCE LISTING <110> Danisco A/S <120> Proteins <130> P020608WO <140> PCT/IB2004/004378 <141> 2004-12-23 <150> GB0330016.7 <151> 2003-12-24 <150> PCT/IB04/000655 <151> 2004-01-15 <150> GB0415999.2 <151> 2004-07-16 <150> US 10/911, 160 <151> 2004-08-02 <160> 46 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 361 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> pfam00567 <400> 1 Ile Val Ala Phe Gly Asp Ser Leu Thr Asp Gly Glu Ala Tyr Tyr Gly 1 5 10 15 Asp Ser Asp Gly Gly Gly Trp Gly Ala Gly Leu Ala Asp Arg Leu Thr 20 25 30 Ala Leu Leu Arg Leu Arg Ala Arg Pro Arg Gly Val Asp Val Phe Asn 35 40 45 Arg Gly Ile Ser Gly Arg Thr Ser Asp Gly Arg Leu Ile Val Asp Ala 50 55 60 Leu Val Ala Leu Leu Phe Leu Ala Gln Ser Leu Gly Leu Pro Asn Leu 65 70 75 80 Pro Pro Tyr Leu Ser Gly Asp Phe Leu Arg Gly Ala Asn Phe Ala Ser 85 90 95 Ala Gly Ala Thr Ile Leu Pro Thr Ser Gly Pro Phe Leu Ile Gln Val 100 105 110 Gln Phe Lys Asp Phe Lys Ser Gln Val Leu Glu Leu Arg Gln Ala Leu 115 120 125 Gly Leu Leu Gln Glu Leu Leu Arg Leu Leu Pro Val Leu Asp Ala Lys 130 135 140 Ser Pro Asp Leu Val Thr Ile Met Ile Gly Thr Asn Asp Leu Ile Thr 145 150 155 160 Ser Ala Phe Phe Gly Pro Lys Ser Thr Glu Ser Asp Arg Asn Val Ser 165 170 175 Val Pro Glu Phe Lys Asp Asn Leu Arg Gln Leu Ile Lys Arg Leu Arg 180 185 190 Ser Asn Asn Gly Ala Arg Ile Ile Val Leu Ile Thr Leu Val Ile Leu 195 200 205 Asn Leu Gly Pro Leu Gly Cys Leu Pro Leu Lys Leu Ala Leu Ala Leu 210 215 220 Ala Ser Ser Lys Asn Val Asp Ala Ser Gly Cys Leu Glu Arg Leu Asn 225 230 235 240 Glu Ala Val Ala Asp Phe Asn Glu Ala Leu Arg Glu Leu Ala Ile Ser 245 250 255 Lys Leu Glu Asp Gln Leu Arg Lys Asp Gly Leu Pro Asp Val Lys Gly 260 265 270 Ala Asp Val Pro Tyr Val Asp Leu Tyr Ser Ile Phe Gln Asp Leu Asp 275 280 285 Gly Ile Gln Asn Pro Ser Ala Tyr Val Tyr Gly Phe Glu Thr Thr Lys 290 295 300 Ala Cys Cys Gly Tyr Gly Gly Arg Tyr Asn Tyr Asn Arg Val Cys Gly 305 310 315 320 Asn Ala Gly Leu Cys Asn Val Thr Ala Lys Ala Cys Asn Pro Ser Ser 325 330 335 Tyr Leu Leu Ser Phe Leu Phe Trp Asp Gly Phe His Pro Ser Glu Lys 340 345 350 Gly Tyr Lys Ala Val Ala Glu Ala Leu 355 360 <210> 2 <211> 317 <212> PRT <213> Aeromonas hydrophila <400> 2 Ala Asp Ser Arg Pro Ala Phe Ser Arg Ile Val Met Phe Gly Asp Ser 1 5 10 15 Leu Ser Asp Thr Gly Lys Met Tyr Ser Lys Met Arg Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Arg Phe Ser Asn Gly Pro Val Trp 35 40 45 Leu Glu Gln Leu Thr Asn Glu Phe Pro Gly Leu Thr Ile Ala Asn Glu 50 55 60 Ala Glu Gly Gly Pro Thr Ala Val Ala Tyr Asn Lys Ile Ser Trp Asn 65 70 75 80 Pro Lys Tyr Gln Val Ile Asn Asn Leu Asp Tyr Glu Val Thr Gln Phe 85 90 95 Leu Gln Lys Asp Ser Phe Lys Pro Asp Asp Leu Val Ile Leu Trp Val 100 105 110 Gly Ala Asn Asp Tyr Leu Ala Tyr Gly Trp Asn Thr Glu Gln Asp Ala 115 120 125 Lys Arg Val Arg Asp Ala Ile Ser Asp Ala Ala Asn Arg Met Val Leu 130 135 140 Asn Gly Ala Lys Glu Ile Leu Leu Phe Asn Leu Pro Asp Leu Gly Gln 145 150 155 160 Asn Pro Ser Ala Arg Ser Gln Lys Val Val Glu Ala Ala Ser His Val 165 170 175 Ser Ala Tyr His Asn Gln Leu Leu Leu Asn Leu Ala Arg Gln Leu Ala 180 185 190 Pro Thr Gly Met Val Lys Leu Phe Glu Ile Asp Lys Gln Phe Ala Glu 195 200 205 Met Leu Arg Asp Pro Gln Asn Phe Gly Leu Ser Asp Gln Arg Asn Ala 210 215 220 Cys Tyr Gly Gly Ser Tyr Val Trp Lys Pro Phe Ala Ser Arg Ser Ala 225 230 235 240 Ser Thr Asp Ser Gln Leu Ser Ala Phe Asn Pro Gln Glu Arg Leu Ala 245 250 255 Ile Ala Gly Asn Pro Leu Leu Ala Gln Ala Val Ala Ser Pro Met Ala 260 265 270 Ala Arg Ser Ala Ser Thr Leu Asn Cys Glu Gly Lys Met Phe Trp Asp 275 280 285 Gln Val His Pro Thr Thr Val Val His Ala Ala Leu Ser Glu Pro Ala 290 295 300 Ala Thr Phe Ile Glu Ser Gln Tyr Glu Phe Leu Ala His 305 310 315 <210> 3 <211> 336 <212> PRT <213> Aeromonas salmonicida <400> 3 Met Lys Lys Trp Phe Val Cys Leu Leu Gly Leu Ile Ala Leu Thr Val 1 5 10 15 Gln Ala Ala Asp Thr Arg Pro Ala Phe Ser Arg Ile Val Met Phe Gly 20 25 30 Asp Ser Leu Ser Asp Thr Gly Lys Met Tyr Ser Lys Met Arg Gly Tyr 35 40 45 Leu Pro Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Arg Phe Ser Asn Gly Pro 50 55 60 Val Trp Leu Glu Gln Leu Thr Lys Gln Phe Pro Gly Leu Thr Ile Ala 65 70 75 80 Asn Glu Ala Glu Gly Gly Ala Thr Ala Val Ala Tyr Asn Lys Ile Ser 85 90 95 Trp Asn Pro Lys Tyr Gln Val Tyr Asn Asn Leu Asp Tyr Glu Val Thr 100 105 110 Gln Phe Leu Gln Lys Asp Ser Phe Lys Pro Asp Asp Leu Val Ile Leu 115 120 125 Trp Val Gly Ala Asn Asp Tyr Leu Ala Tyr Gly Trp Asn Thr Glu Gln 130 135 140 Asp Ala Lys Arg Val Arg Asp Ala Ile Ser Asp Ala Ala Asn Arg Met 145 150 155 160 Val Leu Asn Gly Ala Lys Gln Ile Leu Leu Phe Asn Leu Pro Asp Leu 165 170 175 Gly Gln Asn Pro Ser Ala Arg Ser Gln Lys Val Val Glu Ala Val Ser 180 185 190 His Val Ser Ala Tyr His Asn Lys Leu Leu Leu Asn Leu Ala Arg Gln 195 200 205 Leu Ala Pro Thr Gly Met Val Lys Leu Phe Glu Ile Asp Lys Gln Phe 210 215 220 Ala Glu Met Leu Arg Asp Pro Gln Asn Phe Gly Leu Ser Asp Val Glu 225 230 235 240 Asn Pro Cys Tyr Asp Gly Gly Tyr Val Trp Lys Pro Phe Ala Thr Arg 245 250 255 Ser Val Ser Thr Asp Arg Gln Leu Ser Ala Phe Ser Pro Gln Glu Arg 260 265 270 Leu Ala Ile Ala Gly Asn Pro Leu Leu Ala Gln Ala Val Ala Ser Pro 275 280 285 Met Ala Arg Arg Ser Ala Ser Pro Leu Asn Cys Glu Gly Lys Met Phe 290 295 300 Trp Asp Gln Val His Pro Thr Thr Val Val His Ala Ala Leu Ser Glu 305 310 315 320 Arg Ala Ala Thr Phe Ile Glu Thr Gln Tyr Glu Phe Leu Ala His Gly 325 330 335 <210> 4 <211> 295 <212> PRT <213> Streptomyces coelicolor <400> 4 Met Pro Lys Pro Ala Leu Arg Arg Val Met Thr Ala Thr Val Ala Ala 1 5 10 15 Val Gly Thr Leu Ala Leu Gly Leu Thr Asp Ala Thr Ala His Ala Ala 20 25 30 Pro Ala Gln Ala Thr Pro Thr Leu Asp Tyr Val Ala Leu Gly Asp Ser 35 40 45 Tyr Ser Ala Gly Ser Gly Val Leu Pro Val Asp Pro Ala Asn Leu Leu 50 55 60 Cys Leu Arg Ser Thr Ala Asn Tyr Pro His Val Ile Ala Asp Thr Thr 65 70 75 80 Gly Ala Arg Leu Thr Asp Val Thr Cys Gly Ala Ala Gln Thr Ala Asp 85 90 95 Phe Thr Arg Ala Gln Tyr Pro Gly Val Ala Pro Gln Leu Asp Ala Leu 100 105 110 Gly Thr Gly Thr Asp Leu Val Thr Leu Thr Ile Gly Gly Asn Asp Asn 115 120 125 Ser Thr Phe Ile Asn Ala Ile Thr Ala Cys Gly Thr Ala Gly Val Leu 130 135 140 Ser Gly Gly Lys Gly Ser Pro Cys Lys Asp Arg His Gly Thr Ser Phe 145 150 155 160 Asp Asp Glu Ile Glu Ala Asn Thr Tyr Pro Ala Leu Lys Glu Ala Leu 165 170 175 Leu Gly Val Arg Ala Arg Ala Pro His Ala Arg Val Ala Ala Leu Gly 180 185 190 Tyr Pro Trp Ile Thr Pro Ala Thr Ala Asp Pro Ser Cys Phe Leu Lys 195 200 205 Leu Pro Leu Ala Ala Gly Asp Val Pro Tyr Leu Arg Ala Ile Gln Ala 210 215 220 His Leu Asn Asp Ala Val Arg Arg Ala Ala Glu Glu Thr Gly Ala Thr 225 230 235 240 Tyr Val Asp Phe Ser Gly Val Ser Asp Gly His Asp Ala Cys Glu Ala 245 250 255 Pro Gly Thr Arg Trp Ile Glu Pro Leu Leu Phe Gly His Ser Leu Val 260 265 270 Pro Val His Pro Asn Ala Leu Gly Glu Arg Arg Met Ala Glu His Thr 275 280 285 Met Asp Val Leu Gly Leu Asp 290 295 <210> 5 <211> 295 <212> PRT <213> Streptomyces coelicolor <400> 5 Met Pro Lys Pro Ala Leu Arg Arg Val Met Thr Ala Thr Val Ala Ala 1 5 10 15 Val Gly Thr Leu Ala Leu Gly Leu Thr Asp Ala Thr Ala His Ala Ala 20 25 30 Pro Ala Gln Ala Thr Pro Thr Leu Asp Tyr Val Ala Leu Gly Asp Ser 35 40 45 Tyr Ser Ala Gly Ser Gly Val Leu Pro Val Asp Pro Ala Asn Leu Leu 50 55 60 Cys Leu Arg Ser Thr Ala Asn Tyr Pro His Val Ile Ala Asp Thr Thr 65 70 75 80 Gly Ala Arg Leu Thr Asp Val Thr Cys Gly Ala Ala Gln Thr Ala Asp 85 90 95 Phe Thr Arg Ala Gln Tyr Pro Gly Val Ala Pro Gln Leu Asp Ala Leu 100 105 110 Gly Thr Gly Thr Asp Leu Val Thr Leu Thr Ile Gly Gly Asn Asp Asn 115 120 125 Ser Thr Phe Ile Asn Ala Ile Thr Ala Cys Gly Thr Ala Gly Val Leu 130 135 140 Ser Gly Gly Lys Gly Ser Pro Cys Lys Asp Arg His Gly Thr Ser Phe 145 150 155 160 Asp Asp Glu Ile Glu Ala Asn Thr Tyr Pro Ala Leu Lys Glu Ala Leu 165 170 175 Leu Gly Val Arg Ala Arg Ala Pro His Ala Arg Val Ala Ala Leu Gly 180 185 190 Tyr Pro Trp Ile Thr Pro Ala Thr Ala Asp Pro Ser Cys Phe Leu Lys 195 200 205 Leu Pro Leu Ala Ala Gly Asp Val Pro Tyr Leu Arg Ala Ile Gln Ala 210 215 220 His Leu Asn Asp Ala Val Arg Arg Ala Ala Glu Glu Thr Gly Ala Thr 225 230 235 240 Tyr Val Asp Phe Ser Gly Val Ser Asp Gly His Asp Ala Cys Glu Ala 245 250 255 Pro Gly Thr Arg Trp Ile Glu Pro Leu Leu Phe Gly His Ser Leu Val 260 265 270 Pro Val His Pro Asn Ala Leu Gly Glu Arg Arg Met Ala Glu His Thr 275 280 285 Met Asp Val Leu Gly Leu Asp 290 295 <210> 6 <211> 238 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 6 Met Asp Tyr Glu Lys Phe Leu Leu Phe Gly Asp Ser Ile Thr Glu Phe 1 5 10 15 Ala Phe Asn Thr Arg Pro Ile Glu Asp Gly Lys Asp Gln Tyr Ala Leu 20 25 30 Gly Ala Ala Leu Val Asn Glu Tyr Thr Arg Lys Met Asp Ile Leu Gln 35 40 45 Arg Gly Phe Lys Gly Tyr Thr Ser Arg Trp Ala Leu Lys Ile Leu Pro 50 55 60 Glu Ile Leu Lys His Glu Ser Asn Ile Val Met Ala Thr Ile Phe Leu 65 70 75 80 Gly Ala Asn Asp Ala Cys Ser Ala Gly Pro Gln Ser Val Pro Leu Pro 85 90 95 Glu Phe Ile Asp Asn Ile Arg Gln Met Val Ser Leu Met Lys Ser Tyr 100 105 110 His Ile Arg Pro Ile Ile Ile Gly Pro Gly Leu Val Asp Arg Glu Lys 115 120 125 Trp Glu Lys Glu Lys Ser Glu Glu Ile Ala Leu Gly Tyr Phe Arg Thr 130 135 140 Asn Glu Asn Phe Ala Ile Tyr Ser Asp Ala Leu Ala Lys Leu Ala Asn 145 150 155 160 Glu Glu Lys Val Pro Phe Val Ala Leu Asn Lys Ala Phe Gln Gln Glu 165 170 175 Gly Gly Asp Ala Trp Gln Gln Leu Leu Thr Asp Gly Leu His Phe Ser 180 185 190 Gly Lys Gly Tyr Lys Ile Phe His Asp Glu Leu Leu Lys Val Ile Glu 195 200 205 Thr Phe Tyr Pro Gln Tyr His Pro Lys Asn Met Gln Tyr Lys Leu Lys 210 215 220 Asp Trp Arg Asp Val Leu Asp Asp Gly Ser Asn Ile Met Ser 225 230 235 <210> 7 <211> 1005 <212> DNA <213> Aeromonas hydrophila <400> 7 atgaaaaaat ggtttgtgtg tttattggga ttggtcgcgc tgacagttca ggcagccgac 60 agccgtcccg ccttctcccg gatcgtgatg tttggcgaca gcctctccga taccggcaag 120 atgtacagca agatgcgcgg ttacctcccc tccagccccc cctactatga gggccgcttc 180 tccaacgggc ccgtctggct ggagcagctg accaacgagt tcccgggcct gaccatagcc 240 aacgaggcgg aaggcggacc gaccgccgtg gcttacaaca agatctcctg gaatcccaag 300 tatcaggtca tcaacaacct ggactacgag gtcacccagt tcctgcaaaa agacagcttc 360 aagccggacg atctggtgat cctctgggtc ggcgccaacg actatctggc ctatggctgg 420 aacacagagc aggatgccaa gcgggtgcgc gacgccatca gcgatgcggc caaccgcatg 480 gtgctgaacg gcgccaagga gatactgctg ttcaacctgc cggatctggg ccagaacccc 540 tcggcccgca gccagaaggt ggtcgaggcg gccagccatg tctccgccta ccacaaccag 600 ctgctgctga acctggcacg ccagctggct cccaccggca tggtgaagct gttcgagatc 660 gacaagcagt ttgccgagat gctgcgtgat ccgcagaact tcggcctgag cgaccagagg 720 aacgcctgct acggtggcag ctatgtatgg aagccgtttg cctcccgcag cgccagcacc 780 gacagccagc tctccgcctt caacccgcag gagcgcctcg ccatcgccgg caacccgctg 840 ctggcccagg ccgtcgccag ccccatggct gcccgcagcg ccagcaccct caactgtgag 900 ggcaagatgt tctgggatca ggtccacccc accactgtcg tgcacgccgc cctgagcgag 960 cccgccgcca ccttcatcga gagccagtac gagttcctcg cccac 1005 <210> 8 <211> 1011 <212> DNA <213> Aeromonas salmonicida <400> 8 atgaaaaaat ggtttgtttg tttattgggg ttgatcgcgc tgacagttca ggcagccgac 60 actcgccccg ccttctcccg gatcgtgatg ttcggcgaca gcctctccga taccggcaaa 120 atgtacagca agatgcgcgg ttacctcccc tccagcccgc cctactatga gggccgtttc 180 tccaacggac ccgtctggct ggagcagctg accaagcagt tcccgggtct gaccatcgcc 240 aacgaagcgg aaggcggtgc cactgccgtg gcttacaaca agatctcctg gaatcccaag 300 tatcaggtct acaacaacct ggactacgag gtcacccagt tcttgcagaa agacagcttc 360 aagccggacg atctggtgat cctctgggtc ggtgccaatg actatctggc atatggctgg 420 aatacggagc aggatgccaa gcgagttcgc gatgccatca gcgatgcggc caaccgcatg 480 gtactgaacg gtgccaagca gatactgctg ttcaacctgc cggatctggg ccagaacccg 540 tcagcccgca gtcagaaggt ggtcgaggcg gtcagccatg tctccgccta tcacaacaag 600 ctgctgctga acctggcacg ccagctggcc cccaccggca tggtaaagct gttcgagatc 660 gacaagcaat ttgccgagat gctgcgtgat ccgcagaact tcggcctgag cgacgtcgag 720 aacccctgct acgacggcgg ctatgtgtgg aagccgtttg ccacccgcag cgtcagcacc 780 gaccgccagc tctccgcctt cagtccgcag gaacgcctcg ccatcgccgg caacccgctg 840 ctggcacagg ccgttgccag tcctatggcc cgccgcagcg ccagccccct caactgtgag 900 ggcaagatgt tctgggatca ggtacacccg accactgtcg tgcacgcagc cctgagcgag 960 cgcgccgcca ccttcatcga gacccagtac gagttcctcg cccacggatg a 1011 <210> 9 <211> 888 <212> DNA <213> Streptomyces coelicolor <400> 9 atgccgaagc ctgcccttcg ccgtgtcatg accgcgacag tcgccgccgt cggcacgctc 60 gccctcggcc tcaccgacgc caccgcccac gccgcgcccg cccaggccac tccgaccctg 120 gactacgtcg ccctcggcga cagctacagc gccggctccg gcgtcctgcc cgtcgacccc 180 gccaacctgc tctgtctgcg ctcgacggcc aactaccccc acgtcatcgc ggacacgacg 240 ggcgcccgcc tcacggacgt cacctgcggc gccgcgcaga ccgccgactt cacgcgggcc 300 cagtacccgg gcgtcgcacc ccagttggac gcgctcggca ccggcacgga cctggtcacg 360 ctcaccatcg gcggcaacga caacagcacc ttcatcaacg ccatcacggc ctgcggcacg 420 gcgggtgtcc tcagcggcgg caagggcagc ccctgcaagg acaggcacgg cacctccttc 480 gacgacgaga tcgaggccaa cacgtacccc gcgctcaagg aggcgctgct cggcgtccgc 540 gccagggctc cccacgccag ggtggcggct ctcggctacc cgtggatcac cccggccacc 600 gccgacccgt cctgcttcct gaagctcccc ctcgccgccg gtgacgtgcc ctacctgcgg 660 gccatccagg cacacctcaa cgacgcggtc cggcgggccg ccgaggagac cggagccacc 720 tacgtggact tctccggggt gtccgacggc cacgacgcct gcgaggcccc cggcacccgc 780 tggatcgaac cgctgctctt cgggcacagc ctcgttcccg tccaccccaa cgccctgggc 840 gagcggcgca tggccgagca cacgatggac gtcctcggcc tggactga 888 <210> 10 <211> 888 <212> DNA <213> Streptomyces coelicolor <400> 10 tcagtccagg ccgaggacgt ccatcgtgtg ctcggccatg cgccgctcgc ccagggcgtt 60 ggggtggacg ggaacgaggc tgtgcccgaa gagcagcggt tcgatccagc gggtgccggg 120 ggcctcgcag gcgtcgtggc cgtcggacac cccggagaag tccacgtagg tggctccggt 180 ctcctcggcg gcccgccgga ccgcgtcgtt gaggtgtgcc tggatggccc gcaggtaggg 240 cacgtcaccg gcggcgaggg ggagcttcag gaagcaggac gggtcggcgg tggccggggt 300 gatccacggg tagccgagag ccgccaccct ggcgtgggga gccctggcgc ggacgccgag 360 cagcgcctcc ttgagcgcgg ggtacgtgtt ggcctcgatc tcgtcgtcga aggaggtgcc 420 gtgcctgtcc ttgcaggggc tgcccttgcc gccgctgagg acacccgccg tgccgcaggc 480 cgtgatggcg ttgatgaagg tgctgttgtc gttgccgccg atggtgagcg tgaccaggtc 540 cgtgccggtg ccgagcgcgt ccaactgggg tgcgacgccc gggtactggg cccgcgtgaa 600 gtcggcggtc tgcgcggcgc cgcaggtgac gtccgtgagg cgggcgcccg tcgtgtccgc 660 gatgacgtgg gggtagttgg ccgtcgagcg cagacagagc aggttggcgg ggtcgacggg 720 caggacgccg gagccggcgc tgtagctgtc gccgagggcg acgtagtcca gggtcggagt 780 ggcctgggcg ggcgcggcgt gggcggtggc gtcggtgagg ccgagggcga gcgtgccgac 840 ggcggcgact gtcgcggtca tgacacggcg aagggcaggc ttcggcat 888 <210> 11 <211> 717 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 11 atggattacg agaagtttct gttatttggg gattccatta ctgaatttgc ttttaatact 60 aggcccattg aagatggcaa agatcagtat gctcttggag ccgcattagt caacgaatat 120 acgagaaaaa tggatattct tcaaagaggg ttcaaagggt acacttctag atgggcgttg 180 aaaatacttc ctgagatttt aaagcatgaa tccaatattg tcatggccac aatatttttg 240 ggtgccaacg atgcatgctc agcaggtccc caaagtgtcc ccctccccga atttatcgat 300 aatattcgtc aaatggtatc tttgatgaag tcttaccata tccgtcctat tataatagga 360 ccggggctag tagatagaga gaagtgggaa aaagaaaaat ctgaagaaat agctctcgga 420 tacttccgta ccaacgagaa ctttgccatt tattccgatg ccttagcaaa actagccaat 480 gaggaaaaag ttcccttcgt ggctttgaat aaggcgtttc aacaggaagg tggtgatgct 540 tggcaacaac tgctaacaga tggactgcac ttttccggaa aagggtacaa aatttttcat 600 gacgaattat tgaaggtcat tgagacattc tacccccaat atcatcccaa aaacatgcag 660 tacaaactga aagattggag agatgtgcta gatgatggat ctaacataat gtcttga 717 <210> 12 <211> 347 <212> PRT <213> Ralstonia <400> 12 Met Asn Leu Arg Gln Trp Met Gly Ala Ala Thr Ala Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ala Ala Cys Gly Gly Gly Gly Thr Asp Gln Ser Gly Asn Pro 20 25 30 Asn Val Ala Lys Val Gln Arg Met Val Val Phe Gly Asp Ser Leu Ser 35 40 45 Asp Ile Gly Thr Tyr Thr Pro Val Ala Gln Ala Val Gly Gly Gly Lys 50 55 60 Phe Thr Thr Asn Pro Gly Pro Ile Trp Ala Glu Thr Val Ala Ala Gln 65 70 75 80 Leu Gly Val Thr Leu Thr Pro Ala Val Met Gly Tyr Ala Thr Ser Val 85 90 95 Gln Asn Cys Pro Lys Ala Gly Cys Phe Asp Tyr Ala Gln Gly Gly Ser 100 105 110 Arg Val Thr Asp Pro Asn Gly Ile Gly His Asn Gly Gly Ala Gly Ala 115 120 125 Leu Thr Tyr Pro Val Gln Gln Gln Leu Ala Asn Phe Tyr Ala Ala Ser 130 135 140 Asn Asn Thr Phe Asn Gly Asn Asn Asp Val Val Phe Val Leu Ala Gly 145 150 155 160 Ser Asn Asp Ile Phe Phe Trp Thr Thr Ala Ala Ala Thr Ser Gly Ser 165 170 175 Gly Val Thr Pro Ala Ile Ala Thr Ala Gln Val Gln Gln Ala Ala Thr 180 185 190 Asp Leu 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tcgttaaacg gctctacgac gcactaggcg tcttgaagcc ggactcgctg 1500 gtcgagaacc cctgctacga cggcggctat gtgtggaagc cgtttgccac cagctcttgg 1560 ggacgatgct gccgccgata cacaccttcg gcaaacggtg ccgcagcgtc agcaccgacc 1620 gccagctctc cgccttcagt ccgcaggaac ggcgtcgcag tcgtggctgg cggtcgagag 1680 gcggaagtca ggcgtccttg gcctcgccat cgccggcaac ccgctgctgg cacaggccgt 1740 tgccagtcct cggagcggta gcggccgttg ggcgacgacc gtgtccggca acggtcagga 1800 atggcccgcc gcagcgccag ccccctcaac tgtgagggca agatgttctg taccgggcgg 1860 cgtcgcggtc gggggagttg acactcccgt tctacaagac ggatcaggta cacccgacca 1920 ctgtcgtgca cgcagccctg agcgagcgcg cctagtccat gtgggctggt gacagcacgt 1980 gcgtcgggac tcgctcgcgc ccgccacctt catcgcgaac cagtacgagt tcctcgccca 2040 ctgatgaggc ggtggaagta gcgcttggtc atgctcaagg agcgggtgac tact 2094 <210> 32 <211> 1371 <212> DNA <213> Streptomyces <400> 32 acaggccgat gcacggaacc gtacctttcc gcagtgaagc gctctccccc catcgttcgc 60 cgggacttca tccgcgattt tggcatgaac acttccttca acgcgcgtag cttgctacaa 120 gtgcggcagc agacccgctc gttggaggct cagtgagatt gacccgatcc ctgtcggccg 180 catccgtcat cgtcttcgcc ctgctgctcg cgctgctggg catcagcccg gcccaggcag 240 ccggcccggc ctatgtggcc ctgggggatt cctattcctc gggcaacggc gccggaagtt 300 acatcgattc gagcggtgac tgtcaccgca gcaacaacgc gtaccccgcc cgctgggcgg 360 cggccaacgc accgtcctcc ttcaccttcg cggcctgctc gggagcggtg accacggatg 420 tgatcaacaa tcagctgggc gccctcaacg cgtccaccgg cctggtgagc atcaccatcg 480 gcggcaatga cgcgggcttc gcggacgcga tgaccacctg cgtcaccagc tcggacagca 540 cctgcctcaa ccggctggcc accgccacca actacatcaa caccaccctg ctcgcccggc 600 tcgacgcggt ctacagccag atcaaggccc gtgcccccaa cgcccgcgtg gtcgtcctcg 660 gctacccgcg catgtacctg gcctcgaacc cctggtactg cctgggcctg agcaacacca 720 agcgcgcggc catcaacacc accgccgaca ccctcaactc ggtgatctcc tcccgggcca 780 ccgcccacgg attccgattc ggcgatgtcc gcccgacctt caacaaccac gaactgttct 840 tcggcaacga ctggctgcac tcactcaccc tgccggtgtg ggagtcgtac caccccacca 900 gcacgggcca tcagagcggc tatctgccgg tcctcaacgc caacagctcg acctgatcaa 960 cgcacggccg tgcccgcccc gcgcgtcacg ctcggcgcgg 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cgaagatctc atcctgctcg agggtgctca ggccactctc cggatcgata 540 tcgggggcgt ccttgatggc gtccttgctg aaaccgaggt gcagcttgtg ggcttccaat 600 ttcgcaccac ggagcgggac gaggctggaa tgacggccga agagcccgtg gtggacctca 660 acgaaggtgg gtagtcccgt gtcatcattg aggaacacgc cctccaccgc acccagcttg 720 tggccggagt tgtcgtaggc gctggcatcc agaagggaaa cgatctcata tttgtcggtg 780 tgctcagaca tgatcttcct ttgctgtcgg tgtctggtac taccacggta gggctgaatg 840 caactgttat ttttctgtta ttttaggaat tggtccatat cccacaggct ggctgtggtc 900 aaatcgtcat caagtaatcc ctgtcacaca aaatgggtgg tgggagccct ggtcgcggtt 960 ccgtgggagg cgccgtgccc cgcaggatcg tcggcatcgg cggatctggc cggtaccccg 1020 cggtgaataa aatcattctg taaccttcat cacggttggt tttaggtatc cgcccctttc 1080 gtcctgaccc cgtccccggc gcgcgggagc ccgcgggttg cggtagacag gggagacgtg 1140 gacaccatga ggacaacggt catcgcagca agcgcattac tccttctcgc cggatgcgcg 1200 gatggggccc gggaggagac cgccggtgca ccgccgggtg agtcctccgg gggcatccgg 1260 gaggaggggg cggaggcgtc gacaagcatc accgacgtct acatcgccct cggggattcc 1320 tatgcggcga tgggcgggcg ggatcagccg ttacggggtg agccgttctg cctgcgctcg 1380 tccggtaatt acccggaact cctccacgca gaggtcaccg atctcacctg ccagggggcg 1440 gtgaccgggg atctgctcga acccaggacg ctgggggagc gcacgctgcc ggcgcaggtg 1500 gatgcgctga cggaggacac caccctggtc accctctcca tcgggggcaa tgacctcgga 1560 ttcggggagg tggcgggatg catccgggaa cggatcgccg gggagaacgc tgatgattgc 1620 gtggacctgc tgggggaaac catcggggag cagctcgatc agcttccccc gcagctggac 1680 cgcgtgcacg aggctatccg ggaccgcgcc ggggacgcgc aggttgtggt caccggttac 1740 ctgccgctcg tgtctgccgg ggactgcccc gaactggggg atgtctccga ggcggatcgt 1800 cgttgggcgg ttgagctgac cgggcagatc aacgagaccg tgcgcgaggc ggccgaacga 1860 cacgatgccc tctttgtcct gcccgacgat gccgatgagc acaccagttg tgcaccccca 1920 cagcagcgct gggcggatat ccagggccaa cagaccgatg cctatccgct gcacccgacc 1980 tccgccggcc atgaggcgat ggccgccgcc gtccgggacg cgctgggcct ggaaccggtc 2040 cagccgtagc gccgggcgcg cgcttgtcga cgaccaaccc atgccaggct gcagtcacat 2100 ccgcacatag cgcgcgcggg cgatggagta cgcaccatag aggatgagcc cgatgccgac 2160 gatgatgagc agcacactgc cgaagggttg ttccccgagg gtgcgcagag ccgagtccag 2220 acctgcggcc tgctccggat catgggccca accggcgatg acgatcaaca cccccaggat 2280 cccgaaggcg ataccacggg cgacataacc ggctgttccg gtgatgatga tcgcggtccc 2340 gacctgccct gaccccgcac ccgcctccag atcctcccgg aaatcccggg tggccccctt 2400 ccagaggttg tagacacccg cccccagtac caccagcccg gcgaccacaa ccagcaccac 2460 accccagggt tgggatagga cggtggcggt gacatcggtg gcggtctccc catcggaggt 2520 gctgccgccc cgggcgaagg tggaggtggt caccgccagg gagaagtaga ccatggccat 2580 gaccgccccc ttggcccttt ccttgaggtc ctcgcccgcc agcagctggc tcaattgcca 2640 gagtcccagg gccgccaggg cgatgacggc aacccacagg aggaactgcc cacccggagc 2700 ctccgcgatg gtggccaggg cacctgaatt cgaggcctca tcacccgaac cgccggatcc 2760 agtggcgatg cgcaccgcga tccacccgat gaggatgtgc agtatgccca ggacaatgaa 2820 accacctctg gccagggtgg tcagcgcggg gtggtcctcg gcctggtcgg cagcccgttc 2880 gatcgtccgt ttcgcggatc tggtgtcgcc cttatccata gctcccattg aaccgccttg 2940 aggggtgggc ggccactgtc agggcggatt gtgatctgaa ctgtgatgtt ccatcaaccc 3000 <210> 39 <211> 284 <212> PRT <213> Novosphingobium aromaticovorans <400> 39 Met Gly Gln Val Lys Leu Phe Ala Arg Arg Cys Ala Pro Val Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Ala Gly Leu Ala Pro Ala Ala Thr Val Ala Arg Glu Ala Pro 20 25 30 Leu Ala Glu Gly Ala Arg Tyr Val Ala Leu Gly Ser Ser Phe Ala Ala 35 40 45 Gly Pro Gly Val Gly Pro Asn Ala Pro Gly Ser Pro Glu Arg Cys Gly 50 55 60 Arg Gly Thr Leu Asn Tyr Pro His Leu Leu Ala Glu Ala Leu Lys Leu 65 70 75 80 Asp Leu Val Asp Ala Thr Cys Ser Gly Ala Thr Thr His His Val Leu 85 90 95 Gly Pro Trp Asn Glu Val Pro Pro Gln Ile Asp Ser Val Asn Gly Asp 100 105 110 Thr Arg Leu Val Thr Leu Thr Ile Gly Gly Asn Asp Val Ser Phe Val 115 120 125 Gly Asn Ile Phe Ala Ala Ala Cys Glu Lys Met Ala Ser Pro Asp Pro 130 135 140 Arg Cys Gly Lys Trp Arg Glu Ile Thr Glu Glu Glu Trp Gln Ala Asp 145 150 155 160 Glu Glu Arg Met Arg Ser Ile Val Arg Gln Ile His Ala Arg Ala Pro 165 170 175 Leu Ala Arg Val Val Val Val Asp Tyr Ile Thr Val Leu Pro Pro Ser 180 185 190 Gly Thr Cys Ala Ala Met Ala Ile Ser Pro Asp Arg Leu Ala Gln Ser 195 200 205 Arg Ser Ala Ala Lys Arg Leu Ala Arg Ile Thr Ala Arg Val Ala Arg 210 215 220 Glu Glu Gly Ala Ser Leu Leu Lys Phe Ser His Ile Ser Arg Arg His 225 230 235 240 His Pro Cys Ser Ala Lys Pro Trp Ser Asn Gly Leu Ser Ala Pro Ala 245 250 255 Asp Asp Gly Ile Pro Val His Pro Asn Arg Leu Gly His Ala Glu Ala 260 265 270 Ala Ala Ala Leu Val Lys Leu Val Lys Leu Met Lys 275 280 <210> 40 <211> 1500 <212> DNA <213> Novosphingobium aromaticovorans <400> 40 tgccggaact caagcggcgt ctagccgaac tcatgcccga aagcgcgtgg cactatcccg 60 aagaccaggt ctcggacgcc agcgagcgcc tgatggccgc cgaaatcacg cgcgaacagc 120 tctaccgcca gctccacgac gagctgccct atgacagtac cgtacgtccc gagaagtacc 180 tccatcgcaa ggacggttcg atcgagatcc accagcagat cgtgattgcc cgcgagacac 240 agcgtccgat cgtgctgggc aagggtggcg cgaagatcaa ggcgatcgga gaggccgcac 300 gcaaggaact ttcgcaattg ctcgacacca aggtgcacct gttcctgcat gtgaaggtcg 360 acgagcgctg ggccgacgcc aaggaaatct acgaggaaat cggcctcgaa tgggtcaagt 420 gaagctcttc gcgcgccgct gcgccccagt acttctcgcc cttgccgggc tggctccggc 480 ggctacggtc gcgcgggaag caccgctggc cgaaggcgcg cgttacgttg cgctgggaag 540 ctccttcgcc gcaggtccgg gcgtggggcc caacgcgccc ggatcgcccg aacgctgcgg 600 ccggggcacg ctcaactacc cgcacctgct cgccgaggcg ctcaagctcg atctcgtcga 660 tgcgacctgc agcggcgcga cgacccacca cgtgctgggc ccctggaacg aggttccccc 720 tcagatcgac agcgtgaatg gcgacacccg cctcgtcacc ctgaccatcg gcggaaacga 780 tgtgtcgttc gtcggcaaca tcttcgccgc cgcttgcgag aagatggcgt cgcccgatcc 840 gcgctgcggc aagtggcggg agatcaccga ggaagagtgg caggccgacg aggagcggat 900 gcgctccatc gtacgccaga tccacgcccg cgcgcctctc gcccgggtgg tggtggtcga 960 ttacatcacg gtcctgccgc catcaggcac ttgcgctgcc atggcgattt cgccggaccg 1020 gctggcccag agccgcagcg ccgcgaaacg gcttgcccgg attaccgcac gggtcgcgcg 1080 agaagagggt gcatcgctgc tcaagttctc gcatatctcg cgccggcacc atccatgctc 1140 tgccaagccc tggagcaacg gcctttccgc cccggccgac gacggcatcc cggtccatcc 1200 gaaccggctc ggacatgctg aagcggcagc ggcgctggtc aagcttgtga aattgatgaa 1260 gtagctactg cactgatttc aaatagtatt gcctgtcagc tttccagccc ggattgttgc 1320 agcgcaacag aaacttgtcc gtaatggatt gatggtttat gtcgctcgca aattgccgtc 1380 gaagggaacg ggcgcgtcgc tcgttaacgt cctgggtgca gcagtgacgg agcgcgtgga 1440 tgagtgatac tggcggtgtc atcggtgtac gcgccgccat tcccatgcct gtacgcgccg 1500 <210> 41 <211> 268 <212> PRT <213> Streptomyces coelicolor <400> 41 Met Arg Arg Phe Arg Leu Val Gly Phe Leu Ser Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gly Ala Ala Leu Thr Gly Ala Ala Thr Ala Gln Ala Ala Gln Pro 20 25 30 Ala Ala Ala Asp Gly Tyr Val Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Ser Ser Gly 35 40 45 Val Gly Ala Gly Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Asp Cys Lys Arg Ser 50 55 60 Thr Lys Ala His Pro Tyr Leu Trp Ala Ala Ala His Ser Pro Ser Thr 65 70 75 80 Phe Asp Phe Thr Ala Cys Ser Gly Ala Arg Thr Gly Asp Val Leu Ser 85 90 95 Gly Gln Leu Gly Pro Leu Ser Ser Gly Thr Gly Leu Val Ser Ile Ser 100 105 110 Ile Gly Gly Asn Asp Ala Gly Phe Ala Asp Thr Met Thr Thr Cys Val 115 120 125 Leu Gln Ser Glu Ser Ser Cys Leu Ser Arg Ile Ala Thr Ala Glu Ala 130 135 140 Tyr Val Asp Ser Thr Leu Pro Gly Lys Leu Asp Gly Val Tyr Ser Ala 145 150 155 160 Ile Ser Asp Lys Ala Pro Asn Ala His Val Val Val Ile Gly Tyr Pro 165 170 175 Arg Phe Tyr Lys Leu Gly Thr Thr Cys Ile Gly Leu Ser Glu Thr Lys 180 185 190 Arg Thr Ala Ile Asn Lys Ala Ser Asp His Leu Asn Thr Val Leu Ala 195 200 205 Gln Arg Ala Ala Ala His Gly Phe Thr Phe Gly Asp Val Arg Thr Thr 210 215 220 Phe Thr Gly His Glu Leu Cys Ser Gly Ser Pro Trp Leu His Ser Val 225 230 235 240 Asn Trp Leu Asn Ile Gly Glu Ser Tyr His Pro Thr Ala Ala Gly Gln 245 250 255 Ser Gly Gly Tyr Leu Pro Val Leu Asn Gly Ala Ala 260 265 <210> 42 <211> 2000 <212> DNA <213> Streptomyces coelicolor <400> 42 cccggcggcc cgtgcaggag cagcagccgg cccgcgatgt cctcgggcgt cgtcttcatc 60 aggccgtcca tcgcgtcggc gaccggcgcc gtgtagttgg cccggacctc gtcccaggtg 120 cccgcggcga tctggcgggt ggtgcggtgc gggccgcgcc gaggggagac gtaccagaag 180 cccatcgtca cgttctccgg ctgcggttcg ggctcgtccg ccgctccgtc cgtcgcctcg 240 ccgagcacct tctcggcgag gtcggcgctg gtcgccgtca ccgtgacgtc ggcgccccgg 300 ctccagcgcg agatcagcag cgtccagccg tcgccctccg ccagcgtcgc gctgcggtcg 360 tcgtcgcggg cgatccgcag cacgcgcgcg ccgggcggca gcagcgtggc gccggaccgt 420 acgcggtcga tgttcgccgc gtgcgagtac ggctgctcac ccgtggcgaa acggccgagg 480 aacagcgcgt cgacgacgtc ggacggggag tcgctgtcgt ccacgttgag ccggatcggc 540 agggcttcgt gcgggttcac ggacatgtcg ccatgatcgg gcacccggcc gccgcgtgca 600 cccgctttcc cgggcacgca cgacaggggc tttctcgccg tcttccgtcc gaacttgaac 660 gagtgtcagc catttcttgg catggacact tccagtcaac gcgcgtagct gctaccacgg 720 ttgtggcagc aatcctgcta agggaggttc catgagacgt ttccgacttg tcggcttcct 780 gagttcgctc gtcctcgccg ccggcgccgc cctcaccggg gcagcgaccg cccaggcggc 840 ccaacccgcc gccgccgacg gctatgtggc cctcggcgac tcctactcct ccggggtcgg 900 agcgggcagc tacatcagct cgagcggcga ctgcaagcgc agcacgaagg cccatcccta 960 cctgtgggcg gccgcccact cgccctccac gttcgacttc accgcctgtt ccggcgcccg 1020 tacgggtgat gttctctccg gacagctcgg cccgctcagc tccggcaccg gcctcgtctc 1080 gatcagcatc ggcggcaacg acgccggttt cgccgacacc atgacgacct gtgtgctcca 1140 gtccgagagc tcctgcctgt cgcggatcgc caccgccgag gcgtacgtcg actcgacgct 1200 gcccggcaag ctcgacggcg tctactcggc aatcagcgac aaggcgccga acgcccacgt 1260 cgtcgtcatc ggctacccgc gcttctacaa gctcggcacc acctgcatcg gcctgtccga 1320 gaccaagcgg acggcgatca acaaggcctc cgaccacctc aacaccgtcc tcgcccagcg 1380 cgccgccgcc cacggcttca ccttcggcga cgtacgcacc accttcaccg gccacgagct 1440 gtgctccggc agcccctggc tgcacagcgt caactggctg aacatcggcg agtcgtacca 1500 ccccaccgcg gccggccagt ccggtggcta cctgccggtc ctcaacggcg ccgcctgacc 1560 tcaggcggaa ggagaagaag aaggagcgga gggagacgag gagtgggagg ccccgcccga 1620 cggggtcccc gtccccgtct ccgtctccgt cccggtcccg caagtcaccg agaacgccac 1680 cgcgtcggac gtggcccgca ccggactccg cacctccacg cgcacggcac tctcgaacgc 1740 gccggtgtcg tcgtgcgtcg tcaccaccac gccgtcctgg cgcgagcgct cgccgcccga 1800 cgggaaggac agcgtccgcc accccggatc ggagaccgac ccgtccgcgg tcacccaccg 1860 gtagccgacc tccgcgggca gccgcccgac cgtgaacgtc gccgtgaacg cgggtgcccg 1920 gtcgtgcggc ggcggacagg cccccgagta gtgggtgcgc gagcccacca cggtcacctc 1980 caccgactgc gctgcggggc 2000 <210> 43 <211> 269 <212> PRT <213> Streptomyces avermitilis <400> 43 Met Arg Arg Ser Arg Ile Thr Ala Tyr Val Thr Ser Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Val Gly Cys Ala Leu Thr Gly Ala Ala Thr Ala Gln Ala Ser Pro Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Thr Gly Tyr Val Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Ser Ser Gly 35 40 45 Val Gly Ala Gly Ser Tyr Leu Ser Ser Ser Gly Asp Cys Lys Arg Ser 50 55 60 Ser Lys Ala Tyr Pro Tyr Leu Trp Gln Ala Ala His Ser Pro Ser Ser 65 70 75 80 Phe Ser Phe Met Ala Cys Ser Gly Ala Arg Thr Gly Asp Val Leu Ala 85 90 95 Asn Gln Leu Gly Thr Leu Asn Ser Ser Thr Gly Leu Val Ser Leu Thr 100 105 110 Ile Gly Gly Asn Asp Ala Gly Phe Ser Asp Val Met Thr Thr Cys Val 115 120 125 Leu Gln Ser Asp Ser Ala Cys Leu Ser Arg Ile Asn Thr Ala Lys Ala 130 135 140 Tyr Val Asp Ser Thr Leu Pro Gly Gln Leu Asp Ser Val Tyr Thr Ala 145 150 155 160 Ile Ser Thr Lys Ala Pro Ser Ala His Val Ala Val Leu Gly Tyr Pro 165 170 175 Arg Phe Tyr Lys Leu Gly Gly Ser Cys Leu Ala Gly Leu Ser Glu Thr 180 185 190 Lys Arg Ser Ala Ile Asn Asp Ala Ala Asp Tyr Leu Asn Ser Ala Ile 195 200 205 Ala Lys Arg Ala Ala Asp His Gly Phe Thr Phe Gly Asp Val Lys Ser 210 215 220 Thr Phe Thr Gly His Glu Ile Cys Ser Ser Ser Thr Trp Leu His Ser 225 230 235 240 Leu Asp Leu Leu Asn Ile Gly Gln Ser Tyr His Pro Thr Ala Ala Gly 245 250 255 Gln Ser Gly Gly Tyr Leu Pro Val Met Asn Ser Val Ala 260 265 <210> 44 <211> 1980 <212> DNA <213> Steptomyces avermitilis <400> 44 ccaccgccgg gtcggcggcg agtctcctgg cctcggtcgc ggagaggttg gccgtgtagc 60 cgttcagcgc ggcgccgaac gtcttcttca ccgtgccgcc gtactcgttg atcaggccct 120 tgcccttgct cgacgcggcc ttgaagccgg tgcccttctt gagcgtgacg atgtagctgc 180 ccttgatcgc ggtgggggag ccggcggcga gcaccgtgcc ctcggccggg gtggcctggg 240 cgggcagtgc ggtgaatccg cccacgaggg cgccggtcgc cacggcggtt atcgcggcga 300 tccggatctt cttgctacgc agctgtgcca tacgagggag tcctcctctg ggcagcggcg 360 cgcctgggtg gggcgcacgg ctgtgggggg tgcgcgcgtc atcacgcaca cggccctgga 420 gcgtcgtgtt ccgccctggg ttgagtaaag cctcggccat ctacgggggt ggctcaaggg 480 agttgagacc ctgtcatgag tctgacatga gcacgcaatc aacggggccg tgagcacccc 540 ggggcgaccc cggaaagtgc cgagaagtct tggcatggac acttcctgtc aacacgcgta 600 gctggtacga cggttacggc agagatcctg ctaaagggag gttccatgag acgttcccga 660 attacggcat acgtgacctc actcctcctc gccgtcggct gcgccctcac cggggcagcg 720 acggcgcagg cgtccccagc cgccgcggcc acgggctatg tggccctcgg cgactcgtac 780 tcgtccggtg tcggcgccgg cagctacctc agctccagcg gcgactgcaa gcgcagttcg 840 aaggcctatc cgtacctctg gcaggccgcg cattcaccct cgtcgttcag tttcatggct 900 tgctcgggcg ctcgtacggg tgatgtcctg gccaatcagc tcggcaccct gaactcgtcc 960 accggcctgg tctccctcac catcggaggc aacgacgcgg gcttctccga cgtcatgacg 1020 acctgtgtgc tccagtccga cagcgcctgc ctctcccgca tcaacacggc gaaggcgtac 1080 gtcgactcca ccctgcccgg ccaactcgac agcgtgtaca cggcgatcag cacgaaggcc 1140 ccgtcggccc atgtggccgt gctgggctac ccccgcttct acaaactggg cggctcctgc 1200 ctcgcgggcc tctcggagac caagcggtcc gccatcaacg acgcggccga ctatctgaac 1260 agcgccatcg ccaagcgcgc cgccgaccac ggcttcacct tcggcgacgt caagagcacc 1320 ttcaccggcc atgagatctg ctccagcagc acctggctgc acagtctcga cctgctgaac 1380 atcggccagt cctaccaccc gaccgcggcc ggccagtccg gcggctatct gccggtcatg 1440 aacagcgtgg cctgagctcc cacggcctga atttttaagg cctgaatttt taaggcgaag 1500 gtgaaccgga agcggaggcc ccgtccgtcg gggtctccgt cgcacaggtc accgagaacg 1560 gcacggagtt ggacgtcgtg cgcaccgggt cgcgcacctc gacggcgatc tcgttcgaga 1620 tcgttccgct cgtgtcgtac gtggtgacga acacctgctt ctgctgggtc tttccgccgc 1680 tcgccgggaa ggacagcgtc ttccagcccg gatccgggac ctcgcccttc ttggtcaccc 1740 agcggtactc cacctcgacc ggcacccggc ccaccgtgaa ggtcgccgtg aacgtgggcg 1800 cctgggcggt gggcggcggg caggcaccgg agtagtcggt gtgcacgccg gtgaccgtca 1860 ccttcacgga ctgggccggc ggggtcgtcg taccgccgcc gccaccgccg cctcccggag 1920 tggagcccga gctgtggtcg cccccgccgt cggcgttgtc gtcctcgggg gttttcgaac 1980 <210> 45 <211> 267 <212> PRT <213> Streptomyces <400> 45 Met Arg Leu Thr Arg Ser Leu Ser Ala Ala Ser Val Ile Val Phe Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ile Ser Pro Ala Gln Ala Ala Gly Pro 20 25 30 Ala Tyr Val Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Ser Ser Gly Asn Gly Ala Gly 35 40 45 Ser Tyr Ile Asp Ser Ser Gly Asp Cys His Arg Ser Asn Asn Ala Tyr 50 55 60 Pro Ala Arg Trp Ala Ala Ala Asn Ala Pro Ser Ser Phe Thr Phe Ala 65 70 75 80 Ala Cys Ser Gly Ala Val Thr Thr Asp Val Ile Asn Asn Gln Leu Gly 85 90 95 Ala Leu Asn Ala Ser Thr Gly Leu Val Ser Ile Thr Ile Gly Gly Asn 100 105 110 Asp Ala Gly Phe Ala Asp Ala Met Thr Thr Cys Val Thr Ser Ser Asp 115 120 125 Ser Thr Cys Leu Asn Arg Leu Ala Thr Ala Thr Asn Tyr Ile Asn Thr 130 135 140 Thr Leu Leu Ala Arg Leu Asp Ala Val Tyr Ser Gln Ile Lys Ala Arg 145 150 155 160 Ala Pro Asn Ala Arg Val Val Val Leu Gly Tyr Pro Arg Met Tyr Leu 165 170 175 Ala Ser Asn Pro Trp Tyr Cys Leu Gly Leu Ser Asn Thr Lys Arg Ala 180 185 190 Ala Ile Asn Thr Thr Ala Asp Thr Leu Asn Ser Val Ile Ser Ser Arg 195 200 205 Ala Thr Ala His Gly Phe Arg Phe Gly Asp Val Arg Pro Thr Phe Asn 210 215 220 Asn His Glu Leu Phe Phe Gly Asn Asp Trp Leu His Ser Leu Thr Leu 225 230 235 240 Pro Val Trp Glu Ser Tyr His Pro Thr Ser Thr Gly His Gln Ser Gly 245 250 255 Tyr Leu Pro Val Leu Asn Ala Asn Ser Ser Thr 260 265 <210> 46 <211> 1371 <212> DNA <213> Streptomyces <400> 46 acaggccgat gcacggaacc gtacctttcc gcagtgaagc gctctccccc catcgttcgc 60 cgggacttca tccgcgattt tggcatgaac acttccttca acgcgcgtag cttgctacaa 120 gtgcggcagc agacccgctc gttggaggct cagtgagatt gacccgatcc ctgtcggccg 180 catccgtcat cgtcttcgcc ctgctgctcg cgctgctggg catcagcccg gcccaggcag 240 ccggcccggc ctatgtggcc ctgggggatt cctattcctc gggcaacggc gccggaagtt 300 acatcgattc gagcggtgac tgtcaccgca gcaacaacgc gtaccccgcc cgctgggcgg 360 cggccaacgc accgtcctcc ttcaccttcg cggcctgctc gggagcggtg accacggatg 420 tgatcaacaa tcagctgggc gccctcaacg cgtccaccgg cctggtgagc atcaccatcg 480 gcggcaatga cgcgggcttc gcggacgcga tgaccacctg cgtcaccagc tcggacagca 540 cctgcctcaa ccggctggcc accgccacca actacatcaa caccaccctg ctcgcccggc 600 tcgacgcggt ctacagccag atcaaggccc gtgcccccaa cgcccgcgtg gtcgtcctcg 660 gctacccgcg catgtacctg gcctcgaacc cctggtactg cctgggcctg agcaacacca 720 agcgcgcggc catcaacacc accgccgaca ccctcaactc ggtgatctcc tcccgggcca 780 ccgcccacgg attccgattc ggcgatgtcc gcccgacctt caacaaccac gaactgttct 840 tcggcaacga ctggctgcac tcactcaccc tgccggtgtg ggagtcgtac caccccacca 900 gcacgggcca tcagagcggc tatctgccgg tcctcaacgc caacagctcg acctgatcaa 960 cgcacggccg tgcccgcccc gcgcgtcacg ctcggcgcgg gcgccgcagc gcgttgatca 1020 gcccacagtg ccggtgacgg tcccaccgtc acggtcgagg gtgtacgtca cggtggcgcc 1080 gctccagaag tggaacgtca gcaggaccgt ggagccgtcc ctgacctcgt cgaagaactc 1140 cggggtcagc gtgatcaccc ctcccccgta gccgggggcg aaggcggcgc cgaactcctt 1200 gtaggacgtc cagtcgtgcg gcccggcgtt gccaccgtcc gcgtagaccg cttccatggt 1260 cgccagccgg tccccgcgga actcggtggg gatgtccgtg cccaaggtgg tcccggtggt 1320 gtccgagagc accgggggct cgtaccggat gatgtgcaga tccaaagaat t 1371

Claims (42)

  1. (a) 아미노산 서열 모티프 GDSX를 포함하고, 이때 X는 하나 이상의 하기 아미노산 잔기 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S임을 특징으로 하는 지질 아실트랜스퍼라제 효소인 모효소를 선택하는 단계; (b) 변이 지질 아실트랜스퍼라제를 생성하기 위해 하나 이상의 아미노산을 모디파이시키는 단계; (c) 갈락토리피드 기질 상에서의 트랜스퍼라제 활성 또는 가수분해 활성에 대해 변이 지질 아실트랜스퍼라제를 시험하는 단계; (d) 모효소와 비교시 갈락토리피드에 대해 증가된 활성을 지닌 변이 효소를 선택하는 단계; 및 (e) 다량의 변이 효소를 제조하는 단계를 포함한 변이 당지질 아실트랜스퍼라제 효소의 제조 방법에 있어서,
    상기 효소의 제조 방법은 구조적 상동성 맵핑 또는 서열 상동성 정렬 단계를 하나 이상 더욱 포함하고,
    이때 상기 구조적 상동성 맵핑은
    (a') 구조 모델을 통해 모서열을 정렬하는 단계;
    (b') 활성 사이트 내의 글리세롤 분자의 중심 탄소 원자의 중심에 놓인 10Å 구면 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 선택하는 단계;
    (c') 단계 (b')에 따라 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적인지 여부를 결정하는 단계; 및
    (d') 상기 모서열 내에서 단계 (c')에 따라 확인된 보존 구역을 제외하고 단계 (b')에 따라 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법이고,
    상기 서열 상동성 정렬은
    ⅰ) 첫 번째 모 지질 아실트랜스퍼라제를 선택하는 단계;
    ⅱ) 갈락토리피드 아실트랜스퍼라제 활성을 지닌 두 번째 관련 지질 아실트랜스퍼라제를 확인하는 단계;
    ⅲ) 상기 첫 번째 모 지질 아실트랜스퍼라제와 두 번째 관련 지질 아실트랜스퍼라제를 정렬시키는 단계;
    ⅳ) 두 서열 사이에서 차이를 보이는 아미노산 잔기를 확인하는 단계; 및
    ⅴ) 단계 (ⅳ)에 따라 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적인지 여부를 결정하는 단계; 및
    ⅵ) 상기 모서열 내에서 단계 (ⅴ)에 따라 확인된 보존 구역을 제외하고 단계 (ⅳ)에 따라 확인된 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시키는 단계를 하나 이상 포함함을 특징으로 하는 방법으로,
    서열번호 2의 서열로 정렬된 모서열에서 S18M 또는 T; Y30G, I, L, S, E, M, A 또는 R; G40L, R, M, Q 또는 V; N80R, D, P, G 또는 E; N87R, D, E M, C 또는 G; N88W; Y179V, E, R, N 또는 Q; H180T, K, Q 또는 I; M209Y, L, K 또는 M; L210N, D, H, R, E, A, Q, P, K, G, T, W, I, V, S 또는 M; R211G, Q, K, D 또는 T; N215H, L, G, V, R, 또는 Y로 모서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형됨을 특징으로 하는 변이 당지질 아실트랜스퍼라제 효소의 제조 방법
  2. 제 1항에 있어서, 상기 방법은
    (ⅰ) 갈락토리피드 기질로부터의 트랜스퍼라제 활성 및 인지질 기질로부터의 트랜스퍼라제 활성에 대해 변이 지질 아실트랜스퍼라제를 시험하는 단계; 및
    (ⅱ) 모효소와 비교시 인지질 대비 갈락토리피드로부터의 트랜스퍼라제 활성의 증가된 비율을 지닌 변이 효소를 선택하는 단계;
    를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법
  3. 제 2항에 있어서, 상기 인지질 대비 갈락토리피드로부터의 트랜스퍼라제 활성의 증가된 비율은 적어도 3 이상임을 특징으로 하는 방법
  4. 제 1항에 있어서,
    (ⅰ) 갈락토리피드 기질로부터의 트랜스퍼라제 활성 및 갈락토리피드 기질 상의 가수분해 활성에 대해 변이 지질 아실트랜스퍼라제를 시험하는 단계; 및
    (ⅱ) 모효소와 비교시 당지질 상의 가수분해 활성에 비해 갈락토리피드로부터의 트랜스퍼라제 활성의 증가된 비율을 지닌 변이 효소를 선택하는 단계;
    를 더욱 포함함을 특징으로 하는 방법
  5. 제 4항에 있어서, 갈락토리피드 상의 가수분해 활성 대비 갈락토리피드 상의 트랜스퍼라제 활성의 증가된 비율은 적어도 1.5 이상임을 특징으로 하는 방법
  6. 제 1항에 있어서, 상기 모 지질 아실트랜스퍼라제는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 45에 나타난 아미노산 서열을 지님을 특징으로 하는 방법
  7. 제 6항에 있어서, 상기 모 지질 아실트랜스퍼라제는 서열번호 2 또는 서열번호 28에 나타난 아미노산 서열로 이루어짐을 특징으로 하는 방법
  8. 제 1항에 있어서, 모 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 하기 뉴클레오티드 서열; 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 35, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44 또는 서열번호 46, 또는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 35, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44 또는 서열번호 46에 나타난 서열 중 하나로 암호화됨을 특징으로 하는 방법
  9. 제 1항에 있어서, GDSX 모티프의 X는 L임을 특징으로 하는 방법
  10. 아미노산 서열 모티프 GDSX를 포함하고, X는 하나 이상의 하기 아미노산 잔기 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S이고 이때 변이 효소는 하나 이상의 아미노산 잔기의 모서열과 비교시 하나 이상의 아미노산 변형: S18M 또는 T; Y30G, I, L, S, E, M, A 또는 R; G40L, R, M, Q 또는 V; N80R, D, P, G 또는 E; N87R, D, E M, C 또는 G; N88W; Y179V, E, R, N 또는 Q; H180T, K, Q 또는 I; M209Y, L, K 또는 M; L210N, D, H, R, E, A, Q, P, K, G, T, W, I, V, S 또는 M; R211G, Q, K, D 또는 T; N215H, L, G, V, R, 또는 Y로 구성되며 이때 번호는 서열번호 2로 표시되는 참조서열과 변이서열과의 배열의 잔기 번호임을 특징으로 하는 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소
  11. 제 10항에 있어서, 상기 변이 효소는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 45에 나타난 아미노산 서열 중에서 S18M또는 T; Y30G, I, L, S, E, M, A 또는 R; G40L, R, M, Q 또는 V; N80R, D, P, G 또는 E; N87R, D, E M, C 또는 G; N88W; Y179V, E, R, N 또는 Q; H180T, K, Q 또는 I; M209Y, L, K 또는 M; L210N, D, H, R, E, A, Q, P, K, G, T, W, I, V, S 또는 M; R211G, Q, K, D 또는 T; N215H, L, G, V, R, 또는 Y에서의 하나 이상의 아미노산 변형을 지니고, 이때 번호는 서열번호 2로 표시되는 참조서열과 변이서열과의 배열의 잔기 번호임을 특징으로 하는 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소
  12. 제 10항에 있어서, 상기 지질 아실트랜스퍼라제 모효소는 다음의 뉴클레오티드 서열;서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 35, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44 또는 서열번호 46 또는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 35, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44 또는 서열번호 46에 나타난 서열 중 하나로 암호화됨을 특징으로 하는 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소
  13. 제 10항에 있어서, 상기 변이 효소는 모효소와 비교시 인지질 또는 트리글리세리드 대비 갈락토리피드 상의 증가된 활성 비율을 지님을 특징으로 하는 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소
  14. 제 10항에 있어서, 상기 변이 효소는 모효소와 비교시 증가된 갈락토리피드 트랜스퍼라제 활성을 지님을 특징으로 하는 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소
  15. 아미노산 서열 모티프 GDSX를 포함하고, X는 하나 이상의 하기 아미노산 잔기 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S임을 특징으로 하는 효소인 아실트랜스퍼라제 변이 지질 효소; 이때 상기 변이 효소는 하나 이상의 아미노산 잔기;S3N, E, K, R, A, P 또는 M; D157S, R, E, N, G, T, V, Q, K 또는 C; S310T; 318E; E309R, E, L, R 또는 A; Y179D, T, E, R, N, V, K, Q 또는 S; N215S, L, R 또는 Y; K22E, R, C 또는 A; Q289R, E, G, P 또는 N; M23K, Q, L, G, T 또는 S; H180Q, R 또는 K; M209Q, S, R, A, N, Y, E, V 또는 L; L210R, A, V, S, T, I, W 또는 M; R211T; P81G; V112C; N80R, G, N, D, P, T, E, V, A 또는 G; L82N, S 또는 E; N88C; N87M 또는 G에서 모서열과 비교시 하나 이상의 아미노산 변이를 포함함을 특징으로 하며 이때 번호는 서열번호 2로 표시되는 참조서열과 변이서열과의 배열의 잔기 번호임을 특징으로 하는 변이 지질 아실트랜스퍼라제
  16. 부분적 가수분해 생성물인 리소-당지질(lyso-glycolipid)을 생성하기 위해 제 1항의 방법에 의해 수득된 변이 지질분해효소로 당지질을 처리함으로서 리소-당지질을 제조하기 위한 기질 내에서의 제 10항의 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소의 이용방법
  17. 제 16항에 있어서, 상기 리소-당지질은 디갈락토실 모노글리세리드(DGMG) 또는 모노갈락토실 모노글리세리드 (MGMG)임을 특징으로 하는 방법
  18. 제 16항에 있어서, 상기 당지질은 디갈락토실 디글리세리드(DGDG) 또는 모노갈락토실 디글리세리드(MGDG)임을 특징으로 하는 방법
  19. 제 16항에 있어서, 상기 기질은 식품임을 특징으로 하는 방법
  20. 제 1항의 방법에 따라 수득된 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소를 식품의 하나 이상의 성분에 첨가시키는 것을 포함한 식품의 제조 방법
  21. 제 1항의 방법에 따라 수득된 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소를 반죽에 첨가하는 것을 포함하는 반죽으로부터 베이커리 제품의 제조 방법
  22. 리소인지질을 제조하기 위한 계란-주성분 제품의 제조시 제 1항의 방법에 의해 수득된 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소의 이용방법
  23. 인지질 또는 당지질의 주요 부분을 가수분해하기 위해 제 1항의 방법에 의해 수득된 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소로 식용유 또는 식물유를 처리하는 것을 포함하는 식물유 또는 식용유의 효소적 탈검(degumming) 방법
  24. 제 23항에 있어서, 상기 극성 지질은 인지질 또는 당지질 또는 모두 임을 특징으로 하는 방법
  25. 인지질의 주요 부분을 가수분해하기 위해 상기 변이 지질분해효소로 기름을 처리하는 단계 및 가수분해된 인지질을 포함한 수성상을 기름으로부터 분리하는 단계를 포함하는 식용유 내의 인지질 함량을 감소시키는 공정시 제 1항의 방법에 의해 수득된 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소의 이용방법
  26. 탄수화물 에스테르, 단백질 에스테르, 단백질 서브유니트 에스테르 또는 히드록시산 에스테르와 같은 고가 생성물을 제조하기 위해 당지질의 생물변환(bioconversion)시 제 1항의 방법에 의해 수득된 변이 당지질 아실트랜스퍼라제 효소의 이용방법
  27. 제 26항에 있어서, 상기 극성 지질은 당지질임을 특징으로 하는 방법
  28. 제 1항의 방법에 의해 수득된 고정된 변이 지질 아실트랜스퍼라제 효소
  29. 제 1항의 방법으로 수득된 변이 당지질 아실트랜스퍼라제
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