BRPI0808096A2 - Enzimas de limpeza e produção de fragrâncias. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ENZIMAS DE LIMPEZA E PRODUÇÃO DE FRAGRÂNCIAS".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-sè a composições compreendendo 5 uma aciltransferase e um substrato alcoólico para a aciltransferase. Em algumas modalidades particularmente preferenciais, a composição encontra aplicação na produção de um éster fragrante. Em algumas outras modalidades, a composição encontra aplicação em detergentes de lavanderia para limpar manchas que contêm no mínimo um triglicerídeo. Em algumas moda10 Iidades adicionais, as composições são usadas para produzir compostos com propriedades de limpeza (por exemplo, um éster tensoativo). ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Quando roupas, particularmente roupas que estão manchadas com um produto da indústria de laticínios (por exemplo, leite, sorvete ou manteiga), são lavadas em um detergente de lavanderia que contém lipase, frequentemente um odor desagradável que se assemelha ao odor de "regurgitação" de bebê ou manteiga rançosa emana do tecido depois das roupas terem sido secas. Acredita-se que o mau odor seja produzido por hidrólise, catalisada por lipase, de triglicerídeos de cadeia curta (por exemplo, triglicerídeos contendo C4 a C12) que estão presentes no tecido e/ou lavagem. Esta reação de hidrólise produz ácidos graxos de cadeia curta que têm odor desagradável (por exemplo, ácido butírico) os quais são voláteis e causam um mau odor persistente. Apesar de muita pesquisa na prevenção de mau odor e/ou conferindo fragrância agradável para lavanderia, ainda permanece a necessidade na técnica de composições de lavanderia que tratem deste problema.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona composições compreendendo uma aciltransferase e um substrato alcoólico para a aciltransferase. Em algumas modalidades particularmente preferenciais, a composição encontra aplicação na produção de um éster fragrante. Em algumas outras modalidades, a composição encontra aplicação em detergentes de lavanderia para limpar manchas que contêm no mínimo um triglicerídeo. Em algumas modalidades adicionais, as composições são usadas para produzir compostos com propriedades de limpeza (por exemplo, um éster tensoativo).

A presente invenção proporciona composições para produzir um éster fragrante, compreendendo os seguintes componentes: uma SGNH aciltransferase, um substrato alcoólico para a SGNH aciltransferase, e um doador de acila, em que a SGNH aciltransferase catalisa transferência de um grupamento acila do doador de acila para o substrato alcoólico para produzir um éster fragrante em um ambiente aquoso. Em algumas modalidades, a composição é uma composição aquosa que compreende adicionalmente um éster fragrante. Em algumas modalidades adicionais, o substrato alcoólico e doador de acila são escolhidos para produzir um éster fragrante particular. Em algumas modalidades preferenciais, o doador de acila é um doador de acila Ci a Cio. Em algumas modalidades alternativas, a SGNH aciltransferase é imobilizada sobre um suporte sólido. Em algumas modalidades adicionais, a composição é uma composição desidratada, e em que o éster fragrante é produzido na re-hidratação da composição. Em algumas modalidades ainda adicionais, a composição é um gênero alimentício. Em ainda modalidades adicionais, a composição é uma composição de limpeza compreendendo no mínimo um tensoativo. Em algumas modalidades adicionais, as composições são composições de limpeza compreendendo peróxido de hidrogênio.

A presente invenção também proporciona métodos para produzir no mínimo um éster fragrante, compreendendo combinar: uma SGNH acil25 transferase, um substrato alcoólico para a SGNH aciltransferase, e um doador de acila, em que a SGNH aciltransferase catalisa transferência de um grupamento acila do doador de acila para o substrato alcoólico para produzir no mínimo um éster fragrante. Em algumas modalidades, o substrato alcoólico e doador de acila são selecionados para produzir um éster fragrante par30 ticular. Em algumas modalidades adicionais, o doador de acila é um doador de acila C2 a Ci0. Em ainda modalidades adicionais, os métodos compreendem re-hidratar os componentes depois de serem combinados. Em algumas modalidades alternativas, a re-hidratação ocorre durante mastigação. Em ainda modalidades adicionais, a SGNH aciltransferase, o substrato alcoólico, e o doador de acila são combinados em um ambiente aquoso. Em algumas modalidades alternativas, a SGNH aciltransferase é imobilizada sobre um 5 suporte sólido.

A presente invenção também proporciona métodos para a generação simultânea de um agente alvejante e uma fragrância compreendendo combinar: uma SGNH aciltransferase, um substrato alcoólico para a SGNH aciltransferase, e um doador de acila, em que a SGNH aciltransferase catali10 sa transferência de um grupamento acila do doador de acila para o substrato alcoólico para produzir fragrância e um agente alvejante. Em algumas modalidades, o agente alvejante é um perácido. Em algumas modalidades particularmente preferenciais, o perácido é ácido peracético. Em algumas modalidades adicionais preferenciais, a SGNH aciltransferase é aciltransferase de 15 M. smegmatis. Em algumas modalidades adicionais, preferenciais, a fragrância é um éster. Em algumas modalidades ainda adicionais, o éster é um éster C2 a C6 de um álcool primário. Em ainda modalidades adicionais, aplicação do agente alvejante a uma mancha resulta na remoção da mancha.

A presente invenção proporciona composições de limpeza que compreendem uma aciltransferase (por exemplo, uma SGNH aciltransferase) e um substrato alcoólico para a aciltransferase.

Em algumas destas modalidades, a aciltransferase e substrato alcoólico estão presentes em quantidades eficazes para produzir um éster detectável no contacto da composição de limpeza com um objeto contendo 25 doador de acila. Em algumas modalidades, a composição de limpeza compreende adicionalmente um objeto contendo doador de acila e um éster que é produzido em conseqüência de uma reação, catalisada pela aciltransferase, entre o substrato alcoólico e o doador de acila. Em algumas modalidades preferenciais, o doador de acila é um doador de acila Ci a Cio30 Em algumas outras modalidades, a composição de limpeza tam

bém compreende um doador de acila adicionado (por exemplo, triglicerídeo, éster de ácidos graxos ou similares) o qual reage com o substrato alcoólico. Em algumas modalidades particularmente preferenciais, o éster produzido pela composição é um éster fragrante, um éster tensoativo, um tensoativo, ou agente de tratamento de tecido, ou combinações destes.

Em algumas modalidades, o objeto contendo doador de acila é 5 sujo com o doador de acila. Em algumas modalidades preferenciais, o doador de acila é uma substância oleosa, tal como uma gordura animal, gordura vegetal, produto da indústria de laticínios ou similares. Em algumas modalidades adicionais preferenciais, a combinação do doador de acila e o substrato alcoólico resulta na produção de um éster fragrante, um éster tensoati10 vo, um éster solúvel em água, ou um agente de tratamento de tecido, ou qualquer combinação dos mesmos. Na verdade, pretende-se que a presente invenção proporcione uma combinação de benefícios.

Em algumas modalidades, a composição de limpeza compreende adicionalmente no mínimo uma lipase. Em algumas modalidades adicio15 nais, a composição de limpeza compreende adicionalmente no mínimo um tensoativo e/ou no mínimo uma fonte de peróxido. Em algumas modalidades, o tensoativo ou agente emulsificante da composição de limpeza age sobre o substrato alcoólico para transferência de acila.

Em algumas modalidades adicionais, as composições de Iimpe20 za da presente invenção compreendem adicionalmente no mínimo uma enzima adicional, incluindo mas não limitada a hemicelulases, peroxidases, proteases, celulases, xilanases, lipases, fosfolipases, esterases, cutinases, pectinases, pectato liases, amilases, mananases, queratinases, redutases, oxidases, fenoloxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, 25 pentosanases, malanases, beta-glucanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, lacase, e amilases, ou misturas das mesmas. Em algumas modalidades, é usada uma combinação de enzimas (isto é, um "coquetel") compreendendo enzimas aplicáveis convencionais como protease, lipase, cutinase e/ou celulase em combinação com aciltransferase.

Em algumas modalidades adicionais, as composições de limpe

za compreendem adicionalmente no mínimo um tensoativo, reforçador, polímero, sal, ativador de alvejante, solvente, tampão, ou perfume e etc, conforme descrito em maiores detalhes aqui, neste requerimento de patente.

Em algumas modalidades, a composição de limpeza é uma composição aquosa. Em algumas modalidades preferenciais, a composição de limpeza compreende no mínimo cerca de 90% de água, excluindo quais5 quer componentes sólidos.

A presente invenção também proporciona métodos de limpeza que utilizam as composições de limpeza proporcionadas aqui, neste requerimento de patente. Estes métodos geralmente compreendem combinar uma aciltransferase (por exemplo, uma SGNH aciltransferase, um substrato alco10 ólico para a aciltransferase, e um objeto (por exemplo, um tecido) manchado com uma substância contendo doador de acila, em que a aciltransferase catalisa transferência de um grupamento acila do doador de acila para o substrato alcoólico para produzir um éster.

Em algumas modalidades, o objeto é manchado com uma subs15 tância contendo óleo (por exemplo, uma substância contendo triacilglicerídeo, tal como uma substância que contém C4-C18 triacilglicerídeos). Em algumas modalidades preferenciais, a combinação da substância contendo óleo e o álcool, o éster produzido é um éster fragrante, ao passo que em outras modalidades, um éster não-fragrante é produzido, e em ainda outras 20 modalidades, um tensoativo ou outro agente de tratamento de tecido, ou combinações destes ésteres são produzidos.

Em algumas destas modalidades, o uso da enzima aciltransferase reduz a quantidade de mau odor que é tipicamente produzido por hidrólise de triglicerídeos, trabalhando sinergicamente com uma enzima lipase pa25 ra aumentar a taxa de remoção de cadeias de acila de triacilglicerídeo; e/ou encadeando as cadeias de acila a um substrato alcoólico, formando deste modo um produto éster ao invés de um ácido graxo volátila.

Em algumas modalidades particularmente preferenciais, a presente invenção também proporciona composições para produzir ésteres fragrantes. Em algumas modalidades, as composições compreendem uma aciltransferase (por exemplo, uma SGNH aciltransferase), um substrato alcoólico para a aciltransferase, e um doador de acila, em que a aciltransferase catalisa transferência de um grupamento acila do doador de acila para o substrato alcoólico para produzir um éster fragrante em um ambiente aquoso. Em algumas modalidades particularmente preferenciais, o substrato alcoólico e o doador de acila são utilizados para produzir um éster fragrante 5 particular. Em algumas modalidades, a composição é uma composição aquosa que compreende adicionalmente o éster fragrante. Em algumas outras modalidades, a composição é uma composição desidratada, em que o éster fragrante é produzido na re-hidratação subsequente da composição.

Em algumas modalidades, o doador de acila doa uma cadeia C 1 a C 10 acila ao substrato alcoólico. Em algumas modalidades particularmente preferenciais, as composições para produzir ésteres fragrantes são composições de limpeza.

Em algumas modalidades, a aciltransferase é imobilizada sobre um suporte sólido.

Em algumas modalidades adicionais, a composição compreende

um gênero alimentício. Em algumas outras modalidades, a composição é uma composição de limpeza. Em algumas modalidades ainda adicionais, a composição contém adicionalmente no mínimo um tensoativo.

A presente invenção também proporciona métodos que utilizam 20 as composições proporcionadas aqui, para produzir no mínimo um éster fragrante. Em geral, estes métodos compreendem combinar uma aciltransferase (por exemplo, uma SGNH aciltransferase), um substrato alcoólico para a aciltransferase, e um doador de acila, em que a aciltransferase catalisa transferência de um grupamento acila do doador de acila para o substrato 25 alcoólico para produzir o éster fragrante. Em algumas modalidades, o substrato alcoólico e o doador de acila produzem um éster fragrante particular.

Em algumas modalidades nas quais as composições são desidratadas, os métodos compreendem adicionalmente a etapa de re-hidratar os componentes depois destes serem combinados. Em algumas modalida30 des, ocorre re-hidratação pela adição de qualquer meio aquoso adequado, incluindo água, leite ou saliva. Portanto, em algumas modalidades, ocorre rehidratação durante mastigação, para liberar um éster fragrante. Em algumas outras modalidades, o substrato alcoólico e o doador de acila são combinados em um ambiente aquoso.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Alguns aspectos da seguinte descrição detalhada são melhor entendidos quando lidos em combinação com os desenhos anexados. É enfatizado que, de acordo com prática comum, as várias características dos desenhos não estão em escala. Ao contrário, as dimensões das várias características são arbitrariamente expandidas ou reduzidas para clareza.

A figura 1 proporciona gráficos mostrando a conversão de cis-3- hexenol, 2-feniletanol e 2-metila-l-butanol para seus ésteres butirílicos respectivos com tributirin e duas aciltransferases.

A figura 2 proporciona gráficos mostrando uma comparação de formas de aciltransferase (AcT) livres e encapsuladas em sol-gel para a esterificação de cis-3-hexenol com triacetin em 10, 30 e 120 minutos.

A figura 3 proporciona um painel de gráficos de dados de LC/MS

mostrando transesterificação de tetraetileno glicol usando tributirin e AcT em um fundo de detergente.

A figura 4 proporciona um painel de gráficos de dados de LC/MS mostrando transesterificação de 13C-U-glicerol usando tributirin e AcT em um fundo de detergente.

A figura 5 proporciona um gráfico mostrando produção de benziIa butirato a partir de nata e álcool benzílico na presença de Iipases e AcT.

A figura 6 proporciona uma ilustração de um método exemplar para produzir ésteres fragrantes a partir de nata.

A figura 7 proporciona resultados de análise por TLC de lipídeo

de incubação de gema de ovo/sorbitol com 1) KLM3 mutante pLA231 e 2) controle. Nesta figura, "PE" é fosfatidiletanolamina, e "PC" é fosfatidilcolina.

A figura 8 proporciona uma cromatograma por GLC da amostra 2467-112-1, gema de ovo/sorbitol tratada com KLM3, pLA231.

A figura 9 proporciona uma cromatograma por GLC da amostra

2467-1 12-2, amostra controle de gema de ovo/sorbitol.

A figura 10 proporciona um espectro por GLC/MS de monooleato de sorbitol identificado de Grindsted SMO e espectro por MS do pico identificado em gema de ovo/sorbitol tratado com KLM3 pLA 231(2467-1 12- 1)·

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona composições compreendendo

uma aciltransferase e um substrato alcoólico para a aciltransferase. Em algumas modalidades particularmente preferenciais, a composição encontra aplicação na produção de um éster fragrante. Em algumas outras modalidades, a composição encontra aplicação em detergentes de lavanderia para 10 limpar manchas que contêm no mínimo um triglicerídeo. Em algumas modalidades adicionais, as composições são usadas para produzir compostos com propriedades de limpeza (por exemplo, um éster tensoativo).

A menos que indicado de modo diverso, a prática de alguns aspectos da presente invenção envolve técnicas convencionais usadas comu15 mente nos campos de biologia molecular, microbiologia, purificação de proteína, engenharia de proteína, sequenciamento de proteína e DNA, e DNA recombinante, os quais estão dentro do conhecimento da técnica. Todas as patentes, requerimentos de patente, artigos e publicações mencionados aqui, tanto acima quanto abaixo, são por este expressamente incorporados 20 aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

Além disso, os títulos proporcionados aqui, não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da invenção os quais podem ser tidos por meio de referência à especificação como um todo. Por conseguinte, os termos determinados imediatamente abaixo são mais totalmente definidos 25 por meio de referência à especificação como um todo. Não obstante, de modo a facilitar o entendimento da invenção, uma série de termos são definidos abaixo.

Definições

A menos que indicado de modo diverso aqui, todos os termos técnicos e científicos usados aqui, têm o mesmo significado conforme comumente entendido por uma pessoa com conhecimento regular da técnica à qual diz respeito esta invenção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalente aos descritos aqui, encontrem uso na prática que é descrita aqui, métodos e materiais exemplares são descritos aqui, neste requerimento de patente. Conforme usado aqui, os termos singulares "um", "uma," e "o", "a" incluem a referência plural a menos que o contexto indique 5 claramente de modo diverso. A menos que indicado de modo diverso, ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita em orientação 5' para 3'; seqüências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita em orientação amino para carbóxi, respectivamente. Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia particular, protocolos, e reagentes 10 descritos, uma vez que estes podem variar, dependendo do contexto em que são usados por aqueles versados na técnica.

Deve ser entendido que toda limitação numérica máxima dada do início ao fim desta especificação inclui toda limitação numérica inferior, como se tais limitações numéricas menores fossem expressamente escritas 15 aqui, neste requerimento de patente. Toda limitação numérica mínima dada do início ao fim desta especificação incluirá toda limitação numérica superior, como se tais limitações numéricas superiores fossem expressamente escritas aqui, neste requerimento de patente. Toda faixa numérica dada do início ao fim desta especificação incluirá toda faixa numérica mais estreita que es20 tará dentro de tal faixa numérica mais ampla, como se similares faixas numéricas mais estreitas fossem todas expressamente escritas aqui, neste requerimento de patente.

Conforme usado aqui, o termo "grupamento acila" se refere a um grupamento orgânico da fórmula (RC=O-).

Conforme usado aqui, o termo "acilação" se refere à reação

química que transfere o grupamento acila (RCO-) de uma molécula (um "doador de acila") para outra molécula (um "substrato"), geralmente, substituindo um hidrogênio de um grupamento -OH do substrato com o grupamento acila.

Conforme usado aqui, o termo "doador de acila" se refere à mo

lécula que doa um grupamento acila em uma reação de aciltransferase.

Conforme usado aqui, o termo " substrato alcoólico" se refere a qualquer molécula orgânica compreendendo um grupamento oxidrila reativo (-OH) ligado a um átomo de carbono. Este termo exclui polissacarídeos e proteínas. Água não é um substrato alcoólico. Substratos alcoólicos exemplares incluem, mas não estão limitados a álcoois alifáticos, álcoois alicícli5 cos ou aromáticos, álcoois de terpeno, e polióis incluindo polióis monoméricos, diméricos, triméricos e tetraméricos. Em algumas modalidades, um álcool contém mais de um grupamento oxidrila. Substratos alcoólicos são capazes de receber um grupamento acila na reação de aciltransferase descrita abaixo. Em algumas modalidades, o álcool é um álcool primário, secundário 10 ou terciário.

Conforme usado aqui, o termo "transferase" se refere a uma enzima que catalisa a transferência de compostos funcionais para uma série de substratos.

O termo "aciltransferase" conforme usado aqui, se refere a qualquer enzima geralmente classificada como E. C. 2.3.1.x que é capaz de transferir um grupamento acila de um doador de acila, (por exemplo, um lipídeo), para um substrato alcoólico.

Conforme usado aqui, o termo "GDSX aciltransferase" se refere a uma aciltransferase tendo um sítio ativo distinto que contém um motivo de 20 seqüência GDSX (no qual X é frequentemente L), geralmente próximo do Ntérmino. Enzimas GDSX têm cinco seqüências de consenso (I- V). Estas enzimas são conhecidas (Vide, por exemplo, Upton et al., Trends Biochem. Sci., 20: 178-179 [1995]; e Akoh et al., Prog. Lipid Res., 43: 534-52 [2004]). Um subgrupo de GDSX aciltransferases contém resíduos SG e H conserva25 dos nas seqüências de consenso. Estas GDSX aciltransferases são "SGNH aciltransferases."

Conforme usado aqui, o termo "SGNH aciltransferase" se refere a uma aciltransferase da família SGNH hidrolase, em que membros da família SGNH hidrolase contêm um domínio esterase do tipo SGNH hidrolase, o 30 qual tem uma estrutura tricamada alfa/beta/alfa, onde as folhas-beta são compostas de cinco filamentos paralelos. Enzimas contendo este domínio agem como esterases, Iipases e aciltransferases, mas têm pouca homologia de seqüência com Iipases clássicas (Vide, Akoh et al., Prog. Lipid Res., 43: 534-552 [2004]; e Wei et al., Nat. Struct. Biol., 2: 218- 223 [1995]).

Proteínas contendo um domínio esterase do tipo SGNH hidrolase foram encontradas em uma variedade de espécies e incluem, mas não estão limitadas a uma esterase de Streptomyces scabies (Vide, Sheffield et ai, Protein Eng., 14: 513-519 [2001]); a esterase de glicoproteínas da superfície de hemaglutinina-esterase viral do vírus da influenza C, coronavírus e torovírus (Vide, Molgaard et al., Acta Crystallogr. D 58: 111-119 [2002]); acetilhidrolases de mamífero (Vide, Lo et ai., J. Mol. Biol., 330: 539-551 [2003]); ramnogalacturonano acetilesterase fúngica (Vide, Molgaard et ai, Structure 8: 373-383 [2000]); e a enzima multifuncional tioesterase I (TAP) de Escherichia coli (Vide, Molgaard et al, Acta Crystallogr.D 60: 472-478 [2004]). Domínios esterase do tipo SGNH hidrolase contêm uma rede de ligação de hidrogênio única que estabiliza seus centros catalíticos. Em algumas modalidades preferenciais, contêm uma tríade catalítica conservada Ser/Asp/His. SGNH aciltransferases também são descritas em número de acesso cdOI839.3 no banco de dados de domínio conservado do banco de dados GENBANK® (incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente). SGNH aciltransferases formam um intermediário acila-enzima em contato com um doador de acila, e transferem o grupamento acila para um aceitador diferente de água.

Conforme usado aqui, o termo "lipase clássica" se refere a uma enzima tendo atividade de lipase e um motivo de assinatura GXSXG que contém o sítio ativo serina (Vide, por exemplo, Derewenda et al., Biochem 25 Cell Biol., 69: 842-51 [1991]). Em algumas modalidades, a lipase clássica é uma lipase de triacilglicerídeo que tem especificidade para as posições sn 1 e sn3 de um triacilglicerídeo.

SGNH aciltransferases e GDSL aciltransferases têm uma estrutura similar, e ambas são estruturalmente distintas de Iipases clássicas.

O termo "transesterificação" conforme usado aqui, se refere à

transferência, catalisada por enzima, de um grupamento acila de um doador de lipídeo (diferente de um ácido graxo livre) para um aceitador de acila (diferente de água).

Conforme usado aqui, o termo "alcoólise" se refere à clivagem, catalisada por enzima, de uma ligação covalente de um derivado ácido por reação com um álcool ROH de modo que um dos produtos combina com o H 5 do álcool e o outro produto combina com o grupamento OR do álcool.

Conforme usado aqui, o termo "hidrólise" se refere à transferência de um grupamento acila, catalisada por enzima, de um Iipideo para o grupamento OH de uma molécula de água.

Conforme usado aqui, o termo "aquoso," conforme usado nas 10 expressões"composição aquosa" e "ambiente aquoso" se refere a uma composição que é composta de no mínimo cerca de 50% de água. Em algumas modalidades, composições aquosas compreendem no mínimo cerca de 50% de água, no mínimo cerca de 60% de água, no mínimo cerca de 70% de água, no mínimo cerca de 80% de água, no mínimo cerca de 90% de água, 15 no mínimo cerca de 95% de água, ou no mínimo cerca de 97% de água. Em algumas modalidades, uma porção do restante de uma composição aquosa compreende no mínimo um álcool.

Em algumas modalidades preferenciais, o termo "aquoso," se refere a uma composição tendo uma atividade de água (Aw) de no mínimo cerca de 0,75, no mínimo cerca de 0,8, no mínimo cerca de 0,9, ou no mínimo cerca de 0,95, comparada com água destilada.

Conforme usado aqui, o termo " éster fragrante" se refere a um éster que tem um aroma ou sabor agradável. Este termo engloba tanto ésteres fragrantes quanto ésteres aromatizantes. Os ésteres referidos são de conhecimento geral na técnica.

Conforme usado aqui, o termo "agente de tratamento de tecido" se refere a um composto que tem uma propriedade de limpeza e/ou confere um benefício ao tecido. Os compostos referidos incluem tensoativos e emulsificantes. Em algumas modalidades, os agentes de tratamento de tecido 30 conferem benefícios tais como amaciamento, melhora na sensação do tecido, perda de pelos perda de pelos ("de-pilling"), retenção da cor, e etc.

Conforme usado aqui, o termo " éster tensoativo " se refere a um éster que tem propriedades tensoativas, em que um tensoativo é um composto que reduz a tensão superficial de um líquido.

Conforme usado aqui, o termo "detectavelmente fragrante" se refere a uma quantidade de um éster fragrante que é detectável por um nariz 5 humano ou papilas gustativas. Um éster fragrante que está presente em uma quantidade que é somente detectável por um espectrômetro de massa, mas não pelo nariz humano ou papila gustativa, não é detectavelmente fragrante.

Conforme usado aqui, o termo "objeto" se refere a um item que 10 deve ser limpo. Pretende-se que a presente invenção englobe qualquer objeto adequado para limpeza, incluindo mas não limitado a tecidos (por exemplo, vestuário), estofados, tapetes, superfícies duras (por exemplo, balcões, pisos, e etc.), ou louça (por exemplo, pratos, copos, pires, tigelas, talheres, prataria, e etc.).

Conforme usado aqui, o termo "manchado" ou "sujo" se refere a

um objeto que está sujo. A mancha não precisa ser visível ao olho humano para o objeto estar manchado. Por exemplo, um objeto manchado ou sujo se refere a um objeto (por exemplo, um tecido), contendo uma substância gordurosa de um animal (por exemplo, um produto da indústria de laticínios), planta, suor humano, e etc.

Conforme usado aqui, o termo "produto da indústria de laticínios" se refere a leite (por exemplo, leite integral, semidesnatado, leite desnatado, ou leitelho), ou um produto fabricado a partir do mesmo tal como queijo de qualquer tipo (por exemplo, cream cheese, queijo duro, queijo mole, e etc.), 25 manteiga, iogurte, e sorvete. Na verdade, não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer produto específico da indústria de laticínios, uma vez que qualquer produto à base de leite é englobado por esta definição.

Conforme usado aqui, o termo " objeto contendo doador de acila " se refere a um objeto que compreende um doador de acila (por exemplo, um triglicerídeo). Em algumas modalidades, o doador de acila está presente como uma mancha. Conforme usado aqui, o termo "imobilizada," no contexto de uma enzima imobilizada, se refere a uma enzima que está afixada (por exemplo, aderida), a um substrato (por exemplo, um suporte sólido ou semissólido), e não-livre em solução.

Conforme usado aqui, o termo "em solução" se refere a uma

molécula (por exemplo, uma enzima), que não está imobilizada sobre um substrato e está livre em uma composição líquida.

Conforme usado aqui, os termos "quantidades eficazes" e " quantidade eficaz " no contexto da expressão "uma quantidade eficaz para 10 produzir um éster detectável" se refere a uma quantidade de um componente (por exemplo, enzima, substrato, doador de acila, ou qualquer combinação dos mesmos), para produzir um produto desejado sob as condições usadas.

Conforme usado aqui, o termo "fonte de peróxido de hidrogênio" inclui peróxido de hidrogênio bem como os componentes de um sistema que pode espontaneamente ou enzimaticamente produzir peróxido de hidrogênio como um produto da reação.

Conforme usado aqui, "produtos para tratamento pessoal" significa produtos usados na limpeza, branqueamento e/ou desinfecção de cabe20 Io, pele, couro cabeludo, e dentes, incluindo, mas não limitado a xampus, loções corporais, géis de banho, umidificantes tópicos, pasta de dentes, e/ou outros limpadores tópicos. Em algumas modalidades particulares, estes produtos são utilizados em humanos, ao passo que em outras modalidades, estes produtos encontram aplicação com animais não-humanos (por exem25 pio, em aplicações veterinárias).

Conforme usado aqui, "composições de limpeza" e "formulações de limpeza" se referem a composições que encontram aplicação na remoção de compostos indesejados de itens a serem limpos, tais como tecido, louça, lentes de contato, outros substratos sólidos, cabelo (xampus), pele (sabões 30 e cremes), dentes (enxaguatórios bucais, pastas de dentes) e etc. O termo engloba quaisquer materiais/compostos selecionados para o tipo particular de composição de limpeza desejada e a forma do produto (por exemplo, composição líquida, em gel, grânulo, ou spray), na medida que a composição seja compatível com a aciltransferase e qualquer outra uma ou mais enzimas e/ou componentes presentes na composição. A seleção específica de materiais da composição de limpeza é prontamente feita considerando o ob5 jeto/superfícia a ser limpo, e a forma desejada da composição para as condições de limpeza empregadas durante o uso.

Os termos adicionalmente se referem a qualquer composição que é conveniente para limpar, alvejar, desinfetar, e/ou esterilizar qualquer objeto e/ou superfície. Pretende-se que os termos incluam, mas não sejam 10 limitados a composições de detergente (por exemplo, detergentes de lavanderia líquidos e/ou sólidos e detergentes para tecidos finos; formulações para limpeza de superfície dura adequadas para uso na limpeza de bancadas de vidro, madeira, cerâmica e metal e janelas, e etc.; limpadores de carpete; limpadores de forno; refrescantes de tecido; amaciantes de tecido; e pré15 spotters de têxteis e de lavanderia, bem como detergentes para louça).

Na verdade, o termo "composição de limpeza," a menos que indicado de modo diverso, conforme usado aqui, inclui, agentes para lavagem em forma granular ou de pó para todos os fins ou para limpeza pesada, especialmente detergentes para limpeza; agentes para lavagem em forma 20 líquida, de gel ou pasta para todos os fins, especialmente tipos líquidos para limpeza pesada (HDL); detergentes líquidos para tecidos finos; agentes para lavar louça à mão ou agentes para lava-louça para sujeira leve, especialmente aqueles do tipo de elevada espumação; agentes para máquina lavalouça, incluindo os vários tipos de tablete, granular, líquido e para auxiliar o 25 enxague para uso doméstico e institucional; agentes líquidos de limpeza e desinfetantes, incluindo tipos antibacterianos para lavar as mãos, barras de limpeza, enxaguatórios bucais, limpadores de dentadura, xampus para carro ou carpete, limpadores de banheiro; xampus para os cabelos e enxágüe para os cabelos; géis de banho e banho de espuma e limpadores de metais; 30 bem como auxiliares de limpeza tais como aditivos de alvejante e tipos removedor de manchas ("stain-stick"), "pré-tratamento", e/ou "pré-lavagem".

Conforme usado aqui, os termos "composição detergente" e "formulação de detergente" são usados em referência a misturas as quais são pretendidas para uso em um meio de lavagem para a limpeza de objetos sujos. Em algumas modalidades, o termo é usado em referência a lavagem de tecidos e/ou roupas (por exemplo, "detergentes de lavanderia"). Em al5 gumas modalidades alternativas, o termo se refere a outros detergentes, tais como os usados para limpar pratos, prataria, talheres, e etc. (por exemplo, "detergentes para lavar louça "). Não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer formulação de detergente ou composição em particular. Na verdade, pretende-se que além de aciltransferase, o termo englobe 10 detergentes que contêm tensoativos, uma ou mais transferases diversas, enzimas hidrolíticas e diversas, oxido redutases, reforçadores, agentes alvejantes, ativadores de alvejante, agentes de solução de anila e corantes fluorescentes, inibidores de guimos, agentes de mascaramento, ativadores enzimáticos, antioxidantes, e solubilizantes.

Conforme usado aqui, o termo "composição de limpeza de su

perfícies duras," se refere a composições de detergente para limpar superfícies duras, tais como pisos, bancadas, armários, paredes, azulejo, utensílios de banheiro e cozinha, e similares. As composições referidas são proporcionadas em qualquer forma, incluindo mas não Iimitadsa a sólidos, líquidos, emulsões, e etc.

Conforme usado aqui, "composição de lavagem de louça" se refere a todas as formas de composições para limpar pratos e outros utensílios pretendidos para uso no consumo de alimentos e/ou no manuseio de alimentos, incluindo mas não limitada a formas em gel, granulares e líquidas. Conforme usado aqui, "composição de limpeza de tecido" se

refere a todas as formas de composições de detergente para limpar tecidos, incluindo mas não limitadas a formas em gel, granulares, líquidas e em barra.

Conforme usado aqui, "têxtila" se refere a panos tecidos, bem como fibras têxteis e filamentos adequados para conversão em ou uso como fios, panos tecidos, de malha, e não-tecidos. O termo engloba fios feitos de fibras naturais, bem como sintéticas (por exemplo, manufaturadas). Conforme usado aqui, "materiais têxteis" é um termo geral para fibras, intermediários de fios, fio, tecidos, e produtos feitos de tecidos (por exemplo, roupas e outros artigos).

Conforme usado aqui, "tecido" engloba qualquer material têxtila.

5 Portanto, pretende-se que o termo englobe roupas, bem como tecidos, fios, fibras, materiais não-tecidos, materiais naturais, materiais sintéticos, e qualquer outro material têxtila.

Conforme usado aqui, o termo "compatível," significa que os materiais da composição de limpeza não reduzem a atividade enzimática da 10 aciltransferase em uma extensão tal que a aciltransferase não seja eficaz conforme desejado durante situações normais de uso. Materiais de composições de limpeza específicos são exemplificados em detalhes nas partes que se seguem.

Conforme usado aqui, "quantidade de enzima eficaz" se refere à 15 quantidade de enzima necessária para obter a atividade enzimática requerida na aplicação específica (por exemplo, produto de tratamento pessoal, composição de limpeza, e etc.). As quantidades eficazes referidas são prontamente determinadas por aqueles de conhecimento regular da técnica e se baseiam em muitos fatores, tais como a enzima ou variante em particular 20 usadas, a aplicação de limpeza, a composição específica da composição de limpeza, e se é requirida uma composição líquida, em gel ou seca (por exemplo, granular, em barra), e etc.

Conforme usado aqui, "composições de limpeza não-tecido" engloba composições de limpeza de superfícies duras, composições para lavar 25 louça, composições de limpeza para tratamento pessoal (por exemplo, composições de limpeza oral, composições de limpeza de dentadura, composições para limpeza pessoal, e etc.), e composições adequadas para uso na indústria de polpa e papel.

Conforme usado aqui, o termo "conversão enzimática" se refere à modificação de um substrato para um intermediário ou a modificação de um intermediário para um produto final contatando o substrato ou intermediário com uma enzima. Em algumas modalidades, o contato é feito expondo diretamente o substrato ou intermediário à enzima apropriada. Em algumas outras modalidades, contatar compreende expor o substrato ou intermediário a um organismo que expressa e/ou excreta a enzima, e/ou metaboliza o substrato e/ou intermediário desejados para o intermediário e/ou produto final desejados, respectivamente.

Conforme usado aqui, "proteína de interesse," se refere a uma proteína (por exemplo, uma enzima ou "enzima de interesse") a qual está sendo analisada, identificada e/ou modificada. Proteínas de interesse que ocorrem naturalmente, bem como recombinantes encontram aplicação na presente invenção.

Conforme usado aqui, "proteína" se refere a qualquer composição consistindo de aminoácidos e reconhecida como uma proteína por aqueles versados na técnica. Os termos "proteína," "peptídeo" e polipeptídeo são usados de modo intercambiável aqui. Em que um peptídeo é uma porção de uma proteína, os versados na técnica entendem o uso do termo no contexto.

Conforme usado aqui, proteínas funcionalmente e/ou estruturalmente similares são consideradas como sendo "proteínas relacionadas." Em algumas modalidades, estas proteínas são derivadas de um gênero e/ou espécie diferente, incluindo diferenças entre classes de organismos (por e20 xemplo, uma proteína bacteriana e uma proteína fúngica). Em algumas modalidades, estas proteínas são derivadas de um gênero e/ou espécie diferente, incluindo diferenças entre classes de organismos (por exemplo, uma enzima bacteriana e uma enzima fúngica). Em modalidades adicionais, proteínas relacionadas são proporcionadas pelas mesma espécie. Na verdade, 25 não se pretende que a presente invenção seja limitada a proteínas relacionadas de qualquer ou quaisquer fontes em particular. Além disso, o termo "proteínas relacionadas" engloba homólogos estruturais terciários e homólogos de seqüência primária. Em modalidades adicionais, o termo engloba proteínas que são imunologicamente reativas cruzadas.

Conforme usado aqui, o termo "derivado" se refere a uma prote

ína a qual é derivada de uma proteína por adição de um ou mais aminoácidos a qualquer uma ou ambas a uma ou mais extremidades de C- e Nterminal, substituição de um ou mais aminoácidos em um ou uma série de diferentes sítios na seqüência de aminoácidos, e/ou eliminação de um ou mais aminoácidos em qualquer uma ou ambas as extremidades da proteína ou em um ou mais sítios na seqüência de aminoácidos, e/ou inserção de um 5 ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na seqüência de aminoácidos. A preparação de um derivado de proteína pode ser obtida modificando uma seqüência de DNA a qual codifica para a proteína nativa, transformação desta seqüência de DNA em um hospedeiro adequado, e expressão da seqüência de DNA modificada para formar a proteína derivada.

Proteínas relacionadas (e derivadas) compreendem "proteínas

variantes." Em algumas modalidades, proteínas variantes diferem de uma proteína de origem e uma outra por um pequeno número de resíduos aminoácido. O número de resíduos aminoácido diferindo pode ser um ou mais (por exemplo, cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, 15 cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, ou mais) resíduos aminoácido. Em algumas modalidades, o número de aminoácidos diferentes entre variantes é entre cerca de 1 e cerca de 10. Em algumas modalidades particulares, proteínas relacionadas e particularmente proteínas variantes compreendem no mínimo cerca de 35%, cerca de 40%, 20 cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou cerca de 99% de identidade de seqüências de aminoácidos. Adicionalmente, uma proteína relacionada ou uma proteína variante conforme usado aqui, se refere a uma proteína que 25 difere de outra proteína relacionada ou uma proteína de origem no número de regiões pró-eminentes. Por exemplo, em algumas modalidades, proteínas variantes têm cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, ou cerca de 10 regiões pró-eminentes correspondentes que diferem da proteína de origem.

Vários métodos são conhecidos na técnica que são adequados

para gerar variantes das enzimas da presente invenção, incluindo mas não limitados a mutagênese de saturação de sítio, mutagênese de varredura, mutagênese insercional, mutagênese aleatória, mutagênese sítio-dirigida, e evolução dirigida, bem como várias outras abordagens recombinatoriais.

Em algumas modalidades, proteínas homólogas são produzidas para produzir enzimas com a uma ou mais atividades desejadas. Em algu5 mas modalidades, as proteínas produzidas são incluídas dentro da família SGNH-hidrolase de proteínas. Em algumas modalidades, as proteínas produzidas compreendem no mínimo um ou uma combinação dos seguintes resíduos conservados: L6, W14, W34, L38, R56, D62, L74, L78, H81, P83, M90, K97, Gl IO, LI 14, L135, F180, G205. Em modalidades alternativas, es10 tas proteínas produzidas compreendem os motivos GDSL-GRTT e/ou ARTT. Em modalidades adicionais, as enzimas são multímeros, incluindo mas não limitados a dímeros, octâmeros, e tetrâmeros.

Em algumas modalidades, de modo a estabelecer homologia com uma estrutura primária, a seqüência de aminoácidos de uma aciltransferase é comparada diretamente com a seqüência de aminoácidos primária de uma aciltransferase e com uma série de resíduos que se sabe que são invariantes em todas as aciltransferases para as quais a seqüência é conhecida. Depois de alinhar os resíduos conservados, permitindo inserções e eliminações necessárias de modo a manter o alinhamento (isto é, evitar a eliminação de resíduos conservados através de eliminação e inserção arbitrárias), os resíduos equivalentes a aminoácidos particulares na seqüência primária de uma aciltransferase são definidos. Em algumas modalidades, alinhamentos de resíduos conservados definem 100% dos resíduos equivalentes. No entanto, alinhamentos de mais de cerca de 75% ou tão pouco quanto cerca de 50% de resíduos conservados também são adequados para definir resíduos equivalentes. Em algumas modalidades, são mantidas a conservação dos resíduos catalíticos serina e histidina.

Em algumas modalidades, resíduos conservados encontram aplicação na definição dos resíduos aminoácido equivalentes correspondentes de aciltransferase de M. smegmatis em, outras aciltransferases (por exemplo, aciltransferases de outras espécies de Mycobacterium, bem como quaisquer outros organismos). Em algumas modalidades da presente invenção, a seqüência de DNA codificando aciltransferase de M. smegmatis proporcionada na publicação de patente internacional N0 WO 05/056782 é modificada. Em algumas modalidades, os seguintes resíduos são modificados: Cys7, AsplO, Ser111, 5 Leu12, Thr13, Trp14, Τφ1β, Pro24, Thr25, Leu53, Ser54, Ala55, Thr64, Asp65, Arg67, Cys77, Thr91, Asn94, Asp95, Tyr99, VaM25, Pro138, Leu140, Pro 146, Pro148, Trp149, Phe150, Ile153, Phe154, Thr159, Thr186, He 192, He 194, e Phe196. No entanto, não se pretende que a presente invenção seja limitada a seqüências que são modificadas nestas posições. Na verda10 de, pretende-se que a presente invenção englobe várias modificações e combinações de modificações.

Em algumas modalidades adicionais, resíduos equivalentes são definidos determinando homologia no nível de estrutura terciária e quarternária para uma aciltransferase cuja estrutura terciária e quarternária tenha sido 15 determinada por cristalografia de raios X. Neste contexto, "resíduos equivalentes" são definidos como aqueles para os quais as coordenadas atômicas de dois ou mais átomos da cadeia principal de um resíduo aminoácido particular da carbonila hidrolase e aciltransferase de M. smegmatis (N sobre N, CA sobre CA, C sobre C, e O sobre O) estão dentro de cerca de 0,13 nm e 20 cerca de 0,1 nm depois de alinhamento. Alinhamento é obtido depois do melhor modelo ter sido orientado e posicionado para dar a máxima sobreposição de coordenadas atômicas de átomos de proteína não-hidrogênio da aciltransferase em questão para a aciltransferase de M. smegmatis. Conforme sabido na técnica, o melhor modelo é o modelo cristalográfico dando o me25 nor fator R para dados de difração experimental na maior resolução disponível. Resíduos equivalentes os quais são funcionalmente e/ou estruturalmente análogos a um resíduo específico de aciltransferase de M. smegmatis são definidos como os aminoácidos da aciltransferase que preferencialmente adotam uma conformação tal que eles ou alteram, modificam ou modulam a 30 estrutura da proteína, para efetuar alterações na ligação de substrato e/ou catálise em uma maneira definida e atribuída a um resíduo específico da aciltransferase de M. smegmatis. Além disso, são os resíduos da aciltransferase (em casos onde uma estrutura terciária tenha sido obtida por cristalografia de raios X), os quais ocupam uma posição análoga na medida que embora os átomos da cadeia principal do resíduo dado podem não satisfazer os critérios de equivalência com base na ocupação de uma posição homólo5 ga, as coordenadas atômicas de no mínimo dois dos átomos da cadeia lateral do resíduo se situam dentro de 0,13 nm dos átomos da cadeia lateral correspondentes de aciltransferase de M. smegmatis. As coordenadas da estrutura tridimensional de aciltransferase de M. smegmatis foram determinadas e estão estabelecidas no Exemplo 14 da publicação de patente internacional 10 N0 WO 05/056782 e encontram aplicação conforme resumido acima para determinar resíduos equivalentes no nível da estrutura terciária.

A caracterização de proteínas selvagens e mutantes é realizada através de quaisquer meios adequados e preferencialmente se baseia na avaliação de propriedades de interesse. Por exemplo, pH e/ou temperatura, 15 bem como estabilidade detergente e /ou oxidativa é/são determinados em algumas modalidades da presente invenção. Na verdade, é contemplado que enzimas tendo vários graus de estabilidade em uma ou mais destas características (pH, temperatura, estabilidade proteolítica, estabilidade detergente, e/ou estabilidade oxidativa) encontrarão aplicação.

Conforme usado aqui, "correspondente a," se refere a um resí

duo na posição enumerada em uma proteína ou peptídeo, ou um resíduo que é análogo, homólogo, ou equivalente a um resíduo enumerado em uma proteína ou peptídeo.

Conforme usado aqui, "região correspondente," geralmente se refere a uma posição análoga ao longo de proteínas relacionadas ou uma proteína de origem.

Os termos "molécula de ácido nucleico codificando"," seqüência de ácido nucleico codificando", " seqüência de DNA codificando," e " DNA codificando" se referem à ordem ou seqüência de desoxirribonucleotídeos 30 ao longo de um filamento de ácido desoxirribonucleico. A ordem destes desoxirribonucleotídeos determina a ordem de aminoácidos ao longo da cadeia de polipeptídeo (proteína). A seqüência de DNA portanto codifica para a sequência de aminoácidos.

Conforme usado aqui, o termo "seqüência análoga" se refere a uma seqüência dentro de uma proteína que proporciona função, estrutura terciária, e/ou resíduos conservados similares à proteína de interesse (isto é, 5 tipicamente a proteína original de interesse). Por exemplo, em regiões de epítope que contêm uma alfa hélice ou uma estrutura de beta sheet, os aminoácidos de reposição na seqüência análoga mantêm a mesma estrutura específica. O termo também se refere a seqüências de nucleotídeo, bem como seqüências de aminoácidos. Em algumas modalidades, seqüências 10 análogas são desenvolvidas de tal modo que os aminoácidos de reposição resultam em uma enzima variante apresentando uma função similar ou aprimorada. Em algumas modalidades preferenciais, a estrutura terciária e/ou resíduos conservados dos aminoácidos na proteína de interesse estão localizados em ou próximos ao segmento ou fragmento de interesse. Deste mo15 do, onde o segmento ou fragmento de interesse contém, por exemplo, uma alfa-hélice ou uma estrutura de folha-beta, os aminoácidos de reposição mantêm esta estrutura específica.

Conforme usado aqui, "proteína homóloga" se refere a uma proteína (por exemplo, aciltransferase) que tem ação e/ou estrutura similares, a uma proteína de interesse (por exemplo, uma aciltransferase de outra fonte). Não se pretende que homólogos sejam necessariamente relacionados evolucionariamente. Portanto, pretende-se que o termo englobe a(s) mesma(s) enzima(s) ou uma ou mais enzimas similares (isto é, em termos de estrutura e função) obtidas de diferentes espécies. Em algumas modalidades preferenciais, é desejável identificar um homólogo que tenha uma estrutura quaternária, terciária e/ou primária similar à proteína de interesse, como substituição para o segmento ou fragmento na proteína de interesse com um segmento análogo do homólogo reduzirá a disruptividade da alteração. Em algumas modalidades, proteínas homólogas induzem uma ou mais respostas imunológicas similares a uma proteína de interesse.

Conforme usado aqui, "genes homólogos" se refere a no mínimo um par de genes de diferentes espécies, cujos genes correspondem um ao outro e cujos genes são idênticos ou muito similares uns aos outros. O termo engloba genes que são separados por especiação (isto é, o desenvolvimento de novas espécies) (por exemplo, genes ortólogos), bem como genes que foram separados por duplicação genética (por exemplo, genes parálogos).

Estes genes codificam "proteínas homólogas."

Conforme usado aqui, "ortólogo" e "genes ortólogos" se referem a genes em diferentes espécies que evoluíram a partir de um gene ancestral comum (isto é, um gene homólogo) por especiação. Tipicamente, ortólogos conservam a mesma função durante o curso de evolução. A identificação de 10 ortólogos encontra aplicação na previsão confiável da função genética em genomas recém sequenciados.

Conforme usado aqui, "parálogo" e "genes parálogos" se referem a genes que estão relacionados por duplicação dentro de um genoma. Enquanto ortólogos conservam a mesma função através do curso de evolu15 ção, parálogos desenvolvem novas funções, muito embora algumas funções sejam frequentemente relacionadas com o original. Exemplos de genes parálogos incluem, mas não estão limitados a genes codificando tripsina, quimotripsina, elastase, e trombina, as quais são todas as proteinases serina e ocorrem juntos dentro da mesma espécie.

Conforme usado aqui, proteínas "selvagens", "nativas" e "que

ocorrem naturalmente" são aquelas encontradas na natureza. Os termos "seqüência selvagem," e "gene selvagem" são usados de modo intercambiável aqui, para se referir a uma seqüência que é nativa ou que ocorre naturalmente em uma célula hospedeira. Os genes codificando a proteína que 25 ocorrem naturalmente podem ser obtidos de acordo com os métodos gerais de conhecimento daqueles versados na técnica. Os métodos geralmente compreendem sintetizar sondas marcadas tendo seqüências putativas codificando regiões da proteína de interesse, preparar bibliotecas genômicas de organismos expressando a proteína, e triar as bibliotecas para o gene de 30 interesse por hibridização para as sondas. Clones hibridizando positivamente são então mapeados e sequenciados.

O grau de homologia entre seqüências pode ser determinado usando qualquer método adequado conhecido na técnica (Ver por exemplo, Smith e Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482 [1981]; Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443 [1970]; Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2444 [1988]; programas tais como GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA 5 no pacote de software de genética Wiseonsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, Wl); e Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12: 387-395 [1984]).

Conforme usado aqui, "percentagem (%) de identidade de seqüência de ácido nucleico " é definida como a percentagem de resíduos nucleotídeo em uma seqüência candidata que são idênticos aos resíduos nucleotídeo da seqüência.

Conforme usado aqui, o termo "hibridização" se refere ao processo pelo qual um filamento de ácido nucleico se une com um filamento complementar através de pareamento de bases, conforme de conhecimento na técnica.

Conforme usado aqui, a expressão " condições de hibridização " se refere às condições sob as quais são conduzidas reações de hibridização. Estas condições são tipicamente classificadas por grau de "estringência" das condições sob as quais a hibridização é medida. O grau de estrin20 gência pode ser baseado, por exemplo, na temperatura de fusão (Tm) do complexo ou sonda ligado ácido nucleico. Por exemplo, "estringência máxima" tipicamente ocorre a cerca de Tm-5°C (5o abaixo da Tm da sonda); " estringência elevada " a cerca de 5 a 10° abaixo da Tm; " estringência intermediária" a cerca de 10 a 20° abaixo da Tm da sonda; e "baixa estringência 25 " a cerca de 20 a 25° abaixo da Tm. Alternativamente, ou além disso, as condições de hibridização se baseiam nas condições de hibridização de sal ou força iônica e/ou uma ou mais lavagens de estringência. Por exemplo, 6xSSC = estringência muito baixa; 3xSSC = baixa a média estringência; IxSSC = estringência média; e 0.5xSSC = alta estringência. Funcionalmente, 30 condições de estringência máxima podem ser usadas para identificar seqüências de ácido nucleico tendo estrita identidade ou quase estrita identidade com a sonda de hibridização; ao passo que condições de alta estringêncis são usadas para identificar seqüências de ácido nucleico tendo cerca de 80% ou mais de identidade de seqüência com a sonda.

Para aplicações requerendo alta seletividade, em algumas modalidades, é desejável usar condições relativamente estringentes para for5 mar os híbridos (por exemplo, são usadas condições de relativamente menos sal e/ou temperatura elevada).

As expressões "substancialmente similares" e "substancialmente idênticas" no contexto de no mínimo dois ácidos nucléicos ou polipeptídeos tipicamente significa que um polinucleotídeo ou polipeptídeo compreende 10 uma seqüência que tem no mínimo cerca de 40% de identidade, no mínimo cerca de 50% de identidade, no mínimo cerca de 60% de identidade, no mínimo cerca de 75% de identidade, no mínimo cerca de 80% de identidade, no mínimo cerca de 90%, no mínimo cerca de 95%, no mínimo cerca de 97% de identidade, algumas vezes tanto quanto cerca de 98% e cerca de 15 99% de identidade de seqüência, comparada com a seqüência de referência (isto é, selvagem). A identidade de seqüência pode ser determinada usando programas conhecidos tais como BLAST, ALIGN, e CLUSTAL usando parâmetros de rotina. (Vide, por exemplo, Altschul, et al, J. Mol. Biol. 215: 403- 410 [1990]; Henikoffet al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915 [1989]; Karin 20 et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873 [1993]; e Higgins et al, Gene 73: 237 - 244 [1988]). O software para realizar análises BLAST está disponível publicamente através do National Centerfor Biotechnology Information. Além disso, bancos de dados podem ser pesquisados usando FASTA (Pearson et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2444-2448 [1988]). Uma indicação de que 25 dois polipeptídeos são substancialmente idênticos é que o primeiro polipeptídeo é imunologicamente reativo cruzado com o segundo polipeptídeo. Tipicamente, polipeptídeos que diferem por substituições de aminoácidos conservativas são imunologicamente reativos cruzados. Portanto, um polipeptídeo é substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, 30 onde os dois peptídeos diferem somente por uma substituição conservativa. Uma indicação de que duas seqüências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é que as duas moléculas hibridizam uma à outra sob condições estringentes (por exemplo, dentro de uma faixa de estringência média a elevada).

Os termos "recuperado", "isolado", e "separado" conforme usado aqui, se referem a uma proteína, célula, ácido nucleico ou aminoácido que é 5 removido de no mínimo um componente com o qual está naturalmente associado. Em alguns casos, uma proteína isolada é uma proteína que é secretada em meio de cultura e em seguida recuperada daquele meio.

O termo "recombinante" se refere a um polinucleotídeo ou polipeptídeo que não ocorre naturalmente em uma célula hospedeira. Uma mo10 lécula recombinante pode conter duas ou mais seqüências que ocorrem naturalmente que são encadeadas juntas em um modo que não ocorre naturalmente. Uma célula recombinante contém um polinucleotídeo ou polipeptídeo recombinante. Proteínas que são produzidas usando métodos recombinantes são produzidas usando células hospedeiras que não produzem nor15 malmente estas proteínas.

O termo "heterólogo" se refere a elementos que não são normalmente associados uns com os outros. Por exemplo, se uma célula hospedeira produz uma proteína heteróloga, esta proteína não é normalmente produzida naquela célula hospedeira. Igualmente, um promotor que é enca20 deado operavelmente a uma seqüência codificante heteróloga é um promotor que é encadeado operavelmente a uma seqüência seqüência codificante à qual não é geralmente encadeado operavelmepte em uma célula hospedeira selvagem. O termo "homólogo", com referência à expressão de um polinucleotídeo ou proteína, se refere a um polinucleotídeo ou proteína que 25 ocorre naturalmente em uma célula hospedeira na qual é expressado.

Conforme usado aqui, " células hospedeiras" são geralmente hospedeiros procarióticos ou eucarióticos os quais são transformados ou transfectados com vetores construídos usando técnicas de DNA recombinante conhecidas na arte. Células hospedeiras transformadas são capazes 30 de ou replicar vetores codificando as proteínas variantes ou expressando a proteína variante desejada. No caso de vetores os quais codificam a forma pré- ou prepro da proteína variante, as variantes referidas, quando expressadas, são tipicamente secretadas a partir da célula hospedeira para dentro do meio da célula hospedeira.

Em algumas modalidades, a presente invenção diz respeito à atividade de algumas aciltransferases para catalisar de modo eficaz a trans5 ferência de um grupamento acila de um doador de acila, (por exemplo, um éster C2 a C20), para um substrato alcoólico em um ambiente aquoso. Conforme descrito em maiores detalhes aqui, em algumas modalidades, esta atividade destas enzimas é explorada para produzir ésteres que tenham uma fragrância ou aroma agradável. Em algumas outras modalidades, a atividade 10 destas enzimas é preferencialmente empregada para reduzir o mau odor em aplicações de limpeza.

Sem qualquer intenção de ser limitado a qualquer enzima, substrato alcoólico, ou doador de acila em particular, e somente para ajudar no entendimento de algumas modalidades dos métodos descritos aqui, a reação realizada por algumas modalidades dos métodos em questão é ilustrada abaixo, em que "AcT" significa "aciltransferase".

O O Il AoT Il X-OH + R—C—O-Y -sr-R—C—O-X

\

Substrato

Alcoólico Doador de Acila Produto de Éster

Y-OH

Por exemplo, e novamente sem desejar ser limitado a qualquer enzima, substrato alcoólico, ou doador de acila em particular, e somente para ajudar no entendimento de algumas modalidades dos métodos descritos 20 aqui, a enzima aciltransferase é utilizada para transferir um grupamento acila de um doador de acila adequado (por exemplo, um triglicerídeo tal como tributirin ou triacetin) para um álcool de terpeno tal como geraniol ou citronelol para produzir um éster fragrante. Igualmente, em outras modalidades, a aciltransferase encontra aplicação reduzindo o mau odor de manchas oleosas. 25 Em algumas modalidades particularmente preferenciais, as manchas oleosas são manchas de produtos da indústria de laticínios. Nestas modalidades de redução/prevenção de mau odor, a enzima AcT é utilizada de modo a reduzir a quantidade de ácidos graxos voláteis de cheiro podre (por exemplo, ácido butírico) produzidos por hidrólise de triglicerídeos. Em algumas modalidades a enzima aciltransferase funciona sinergicamente com no mínimo uma enzima lipase aumentando a taxa de remoção de cadeias de acila do 5 triacilglicerídeo, ao passo que em outras modalidades, a aciltransferase funciona encadeando as cadeias de acila a um substrato alcoólico para produzir um produto de éster, ao invés de um ácido graxo volátila. Em algumas modalidades, a aciltransferase funciona em ambos os modos acima. Em algumas modalidades, uma cadeia acila do triacilglicerídeo é encadeada a um 10 substrato alcoólico para produzir um éster fragrante. Nestas modalidades, um éster fragrante, ao invés de um ácido graxo volátila de cheiro podre, é produzido como um subproduto. Esta modalidade é ilustrada esquematicamente na figura 6.

Estas modalidades, bem como muitas outras modalidades, são descritas em maiores detalhes abaixo.

Antes da descrição detalhada seguinte, observa-se que os métodos discutidos aqui, encontram apiicação com uma variedade de diferentes enzimas que têm a capacidade de catalisar a transferência de um grupamento acila de um doador de acila para um substrato alcoólico para produzir 20 um éster. As enzimas referidas incluem, mas não estão limitadas a Iipases clássicas, transferases acila-CoA-dependentes, fosfolipases, cutinases, GDSX hidrolases, SGNH hidrolases, serina proteases, e esterases, bem como qualquer enzima capaz de formar um intermediário acila-enzima em contato com um doador de acila, e transferir o grupamento acila para um 25 aceitador diferente de água.

Em algumas modalidades, a enzima é uma enzima selvagem, ao passo que em outras modalidades, a enzima tem uma seqüência de aminoácidos modificada que faz com que a enzima tenha especificidade de substrato alterada ou aumentada atividade de acila transferase, comparada com 30 a enzima selvagem. Descrevendo adicionalmente estas modalidades, são proporcionados componentes adicionais que encontram aplicação na presente invenção. Aciltransferases

Conforme observado acima, a presente invenção proporciona composições produtoras de ésteres que contêm no mínimo uma aciltransferase, e métodos para usar a uma ou mais enzimas. É contemplado que a aciltransferase das presentes composições compreende qualquer enzima que possa catalisar a transferência de um grupamento acila de um doador de acila para um substrato alcoólico. Conforme observado acima, vários tipos de enzimas encontram aplicação nos métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, a enzima empregada tem uma maior especificidade para substratos alcoólicos do que água. Em algumas destas modalidades, a enzima apresenta uma baixa atividade de hidrólise relativa (isto é, uma capacidade relativamente pobre para hidrolisar um doador de acila na presença de água) e uma atividade relativamente elevada de aciltransferase (isto é, uma melhor capacidade para hidrolisar um doador de acila na presença de um álcool, em um ambiente aquoso), em que a proporção de alcoólise: hidrólise é maior do que cerca de 1,0, uma proporção de no mínimo cerca de 1,5, ou no mínimo cerca de 2,0. Em algumas modalidades, a aciltransferase também tem uma maior especificidade para peróxido do que água, resultando na produção de agentes de limpeza de perácido, (por exempio, uma proporção de peridrólise: hidrólise de mais de cerca de 1,0, uma proporção de no mínimo cerca de 1,5, ou no mínimo cerca de 2,0).

Em algumas modalidades, uma GDSX aciltransferase, em particular uma SGNH aciltransferase encontra aplicação. SGNH aciltransferases exemplares que encontram aplicação na presente invenção incluem as SG25 NH aciltransferases selvagens depositadas no banco de dados do NCBI GENBANK® como números de acesso: YP_890535 (GID: 1 1846860; Vide também, W005/056782; M. smegmatis); NP_436338.1 (GID: 16263545; Sinorhizobium meliloti); ZP 01549788.1 (GID: 1 18592396; Stappia aggregate); NP 066659.1 (GID: 10954724; Agrobacterium rhizogenes); YP 368715.1 30 (GID: 78065946; Burkholderia sp.); YP_674187.1 (GID: 1 10633979; Mesorhizobium sp.); e NP_532123.1 (GID: 17935333; Agrobacterium tumefaciens), ortólogos selvagens e homólogos das mesmas, e variantes das mesmas que tenham uma seqüência de aminoácidos que seja no mínimo cerca de 70% idêntica, no mínimo cerca de 80% idêntica, no mínimo cerca de 90% idêntica, no mínimo cerca de 95% idêntica, ou no mínimo no mínimo cerca de 98% idêntica a quaisquer das enzimas selvagens. Estes acessos do 5 GENBANK® são incorporados por meio de referência em sua totalidade, incluindo as seqüências de ácido nucleico e de proteína dos mesmos e a anotação destas seqüências. Exemplos adicionais de similares enzimas, são obtidos realizando pesquisas à base de homologia de seqüências do banco de dados GENBANK® do NCBI usando métodos de comparação de se10 quências de rotina conhecidos na técnica (por exemplo, BLAST, e etc.). Em algumas modalidades, a aciltransferase tem uma seqüência de aminoácidos que é no mínimo cerca de 70% idêntica à seqüência de aminoácidos determinada no GENBANK® registro YP_890535 (GID: 11846860; M smegmatis; Vide também, a publicação de patente internacional N0 W005/056782 ).

Enzimas SGNH aciltransferase exemplares adicionais incluem

as seguintes, as quais são referidas por suas espécies e números de acesso do GENBANK®: Agrobacterium rhizogenes (Q9KWA6), A. rhizogenes (Q9KWB 1 ), A. tumefaciens (Q8UFG4), A. tumefaciens (Q8UAC0), A. tumefaciens (Q9ZI09), A. tumefaciens (ACA), Prosthecobacter dejongeii 20 (RVM04532), Rhizobium Ioti (Q98MY5), R. meliloti (Q92XZ1), R. meliloti (Q9EV56), R. rhizogenes (NF006), R. rhizogenes (NF00602875), R. solanacerarum (Q8XQI0), Sinorhizobium meliloti (RSM02162), S. meliloti (RSM05666), Mesorhizobium Ioti (RML000301), A. rhizogenes (Q9KWA6), A. rhizogenes (Q9KWB 1 ), Agrobacterium tumefaciens (AAD02335), Meso25 rhizobium Ioti (Q98MY5), Mesorhizobium Ioti (ZPOO 197751), Ralstonia soIanacearum (Q8XQI0), Ralstonia eutropha (ZPOO 166901), Moraxella bovis (AAK53448), Burkholderia cepacia (ZP00216984), Chromobacterium violaceum (Q7NRP5), Pirellula sp. (NP_865746), Vibrio vulnificus (AA007232), Salmonella typhimurium (AAC38796), Sinorhizobium meliloti (SMal993), Si30 norhizobium meliloti (Q92XZ1) e Sinorhizobium meliloti (Q9EV56). As seqüências de aminoácidos destas proteínas, os alinhamentos de seqüências, e todas as outras informações relativas ao acima são incorporados por meio de referência aqui, a este requerimento de patente, para todos os fins a partir da publicação de patente internacional N0 W005/056782.

Vários exemplos de similares enzimas foram cristalizados, e muitas substituições de aminoácidos exemplares que são proporcionadas 5 para enzimas variantes que conservam ou alteram sua atividade são descritos na publicação de patente internacional N0 W005/056782, a qual é incorporada por meio de referência. Listas de centenas de substituições de aminoácidos que são toleradas por e em algumas modalidades encontram aplicação na alteração da atividade hidrolítica, atividade perhidrolítica, atividade 10 de degradação de perácido e/ou estabilidade da perhidrolase de M. smegmatis são determinadas na tabela 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 e 10-9 da publicação de patente internacional N0 W005/056782. Dada a similaridade estrutural de SGNH aciltransferases, as substituições de aminoácidos descritas na publicação de patente internacional N0 W005/056782 são pron15 tamente transferíveis para outros membros da família de SGNH aciltransferases. Cada uma das substituições de aminoácidos descritas na publicação de patente internacional N0 W005/056782, e as seqüências de aminoácidos produzidas por estas substituições, são incorporadas por meio de referência aqui, a este requerimento de patente.

Em algumas modalidades, a aciltransferase empregada aqui,

não é uma enzima dependente de acetila-CoA. Em algumas modalidades alternativas, a GDSX ou SGNH aciltransferase usada nos presentes métodos é uma aciltransferase selvagem de Candida parapsilosis, Aeromonas hydrophila, ou Aeromonas salmonicida, ao passo que em outras modalida25 des, a aciltransferase é uma variante das mesmas que é no mínimo cerca de 95% idêntica a essas.

A aciltransferase usada na presente invenção é produzida e isolada usando métodos convencionais, conforme sabido na técnica. Em algumas modalidades, a produção da aciltransferase é realizada usando méto30 dos recombinantes e um hospedeiro não-nativo, o qual ou produz a aciltransferase intracelularmente, ou secreta a aciltransferase. Em algumas modalidades, uma seqüência de sinal é adicionada à enzima, a qual facilita expressão da enzima por secreção no periplasma (isto é, em organismos Gram-negativos, tais como £. colí), ou no espaço extracelular (isto é, em organismos Gram-positivos, tais como Bacillus e Actinomicetos), ou hospedeiros eucarióticos (por exemplo, Trichoderma, Aspergillus, Saccharomyces, 5 e Pichia). Não se pretende que qualquer aspecto da presente invenção seja limitado a hospedeiros específicos, uma vez que vários outros organismos encontram aplicação como hospedeiros de expressão na presente invenção.

Por exemplo, células de Bacillus são conhecidas de modo geral como hospedeiros adequados para expressão de proteínas extracelulares (por exemplo, proteases). A expressão intracelular de proteínas é menos bem conhecida. A expressão da proteína enzimática intracelularmente em Bacillus subtilis é frequentemente obtida usando uma variedade de promotores, incluindo, mas não limitado a pVeg, pSPAC, pAprE, ou pAmyE na ausência de uma seqüência de sinal sobre a extremidade 5' do gene. Em algumas modalidades, é obtida expressão a partir de um plasmídeo replicante (número de cópias alto ou baixo), ao passo que em modalidades alternativas, é obtida expressão integrando o constructo desejado no cromossoma. É possível integração em qualquer locus, incluindo mas não limitado ao Iocus aprE, amyE, ou pps. Em algumas modalidades, a enzima é expressada a partir de uma ou mais cópias do constructo integrado. Em modalidades alternativas, múltiplas cópias integradas são obtidsa pela integração de um constructo capaz de amplificação (por exemplo, encadeado a um cassete antibiótico e flanqueado por seqüências de repetição direta), ou por ligação de múltiplas cópias e subsequente integração no cromossoma. Em algumas modalidades, a expressão da enzima com ou o plasmídeo replicante ou o constructo integrado é monitorada usando a prova de atividade de pNB em uma cultura apropriada.

Como com Baeillus, em algumas modalidades, a expressão da enzima no hospedeiro Gram-positivo Streptomyees é realizada usando um plasmídeo replicante, ao passo que em outras modalidades, a expressão da enzima é realizada através de integração do vetor no cromossoma do Streptomyees. Qualquer promotor capaz de ser reconhecido em Streptomyees encontra aplicação na orientação da transcrição do gene da enzima (por exemplo, promotor de glucose isomerase, A4 promotor). Plasmídeos replicantes, quer vetores de vai-vém ou Streptomyces somente, também encontram aplicação na presente invenção para expressão (por exemplo, pSECGT).

5 Em outras modalidades, a enzima é produzida em outras células

hospedeiras, incluindo mas não limitadas a: células hospedeiras fúngicas (por exemplo, células hospedeiras de Pichia sp., Aspergillus sp., ou Trichoderma sp., e etc.).

Em algumas modalidades, a enzima é secretada pela célula hospedeira de tal modo que a enzima é recuperável do meio de cultura no qual a célula hospedeira é cultivada.

Uma vez que é secretada no meio de cultura, a enzima é recuperada por qualquer método adequado e/ou conveniente (por exemplo, por precipitação, centrifugação, afinidade, cromatografia por afinidade, cromato15 grafia por permuta iônica, cromatografia por interação hidrofóbica particionamento bi-fásico, precipitação por etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia sobre sílica ou sobre uma resina de permuta de cátions tal como DEAE, chromatofocusing, SDS-PAGE, precipitação de sulfato de amônio, filtração por gel (por exemplo, Sephadex G-75), filtração ou qualquer outro méto20 do conhecido na técnica). Na verdade, uma série de métodos adequados são de conhecimento daqueles versados na técnica. Em algumas modalidades alternativas, a enzima é usada sem purificação a partir dos outros componentes do meio de cultura. Em algumas destas modalidades, o meio de cultura é simplesmente concentrado, e em seguida usado sem purificação 25 adicional da proteína a partir dos componentes do meio de crescimento, ao passo que em outras modalidades é usada sem qualquer modificação adicional.

Substratos Alcoólicos

Substrato alcoólico que encontra aplicação na presente invenção inclui qualquer molécula orgânica contendo um grupamento oxidrila reativo que é ligado a um átomo de carbono, excluindo polissacarídeos contendo oxidrila e proteínas. Em algumas modalidades, o substrato alcoólico é da fórmula: Z - OH, onde Z é qualquer grupamento de cadeia ramificada, reta, cíclico, aromático ou linear orgânico, ou qualquer versão substituída do mesmo. Em algumas modalidades, Z é um grupamento substituído ou nãosubstituído alquila, heteroalquila, alquenila, alquinila, arila, alquilarila, alqui5 lheteroariia, ou um grupamento heteroarila contendo 2 a 30 átomos de carbono. Em algumas modalidades adicionais, Z é uma porção alifática, uma porção alifática substituída por uma porção alicíclica ou aromática (por exemplo, um terpeno). Em algumas outras modalidades, o substrato alcoólico é um poliol, tal como uma molécula contendo glicol (por exemplo, tetraetileno 10 glicol, polietileno glicol, polipropileno glicol, ou politetra-hidrofurano). Substratos alcoólicos adequados incluem polióis monomélicos (por exemplo, glicerina), bem como polióis diméricos, triméricos e tetraméricos, e álcoois de açúcares tais como eritritol, isomaltitol, lactitol, maltitol, manitol, sorbitol e xilitol. Em algumas modalidades, polióis são moléculas da fórmula (Z-OH)n ou Z 15 (OH)n, em que n é no mínimo cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, ou cerca de 6 (por exemplo, onde n é 1 a 4). Em algumas modalidades, o álcool está presente como parte de um agente tensoativo ou emulsificante (por exemplo, um álcool primário de alta linearidade tal como um detergente NEODOL®).

Em algumas modalidades, substratos alcoólicos usados nos mé

todos de produção de ésteres fragrantes descritos abaixo são da fórmula ZOH, onde Z é uma porção alicíclica ou aromática, ou um terpeno, por exemplo.

Substratos alcoólicos exemplares que encontram aplicação nos métodos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a etanol, metanol, glicerol, propanol, butanol, e os substratos alcoólicos mostrados nas Tabelas 1 a 3 abaixo.

Doadores de Acila

O doador de acila utilizado nos métodos da presente invenção compreende qualquer molécula orgânica contendo um grupamento acila transferível. Em algumas modalidades, um doador de acila típico é um éster da fórmula R1C(=0))0R2, onde R1 e R2 são de modo independente qualquer porção orgânica, embora outras moléculas também encontrem aplicação. Em algumas modalidades, doadores de acila adequados são monoméricos, ao passo que em outras modalidades, são poliméricos, incluindo diméricos, triméricos e ésteres de poliol de ordem superior.

Conforme usado aqui, um "doador de acila de cadeia curta" é

um éster da fórmula R1C(=0)0R2, onde R1 é qualquer porção orgânica que contém uma cadeia de no mínimo 1 a 9 átomos de carbono e R2 é qualquer porção orgânica. Em algumas modalidades, ésteres de acila de cadeia curta contêm uma cadeia acila de 2 a 10 átomos de carbono (isto é, uma cadeia 10 de carbono C2 a Cio). Ésteres de acila de cadeia longa exemplares contêm uma cadeia de carbono C6, C7, C8, Cg, C-io- Ésteres de acila de cadeia longa exemplares contêm grupamentos acetila, propila, butila, pentila, ou hexila, e etc.

Um " doador de acila de cadeia longa " é um éster da fórmula 15 R1C(=0)0R2, onde R1 é qualquer porção orgânica que contém uma cadeia de no mínimo 10 átomos de carbono e R2 é qualquer porção orgânica. Por exemplo, em algumas modalidades, doadores de acila de cadeia longa contêm uma cadeia acila Cu, C12, Ci3, Ci4, Ci5, Ci6, C!7, Ci8, C 19, C20, C2i, ou C22.

Ésteres exemplares que encontram aplicação na presente in

venção incluem os da fórmula:

R1Ox [(R2)m (R3)n]p

em que R1 é uma porção selecionada entre o grupo consistindo de H ou um alquila, heteroalquila, alquenila, alquinila, arila, alquilarila, alquilheteroarila, e 25 heteroarila substituída ou não-substituída. Em algumas modalidades, R1 compreende a partir de cerca de 1 a cerca de 50.000 átomos de carbono, a partir de cerca de 1 a cerca de 10.000 átomos de carbono, ou ainda a partir de cerca de 2 a cerca de 100 átomos de carbono;

em que cada R2 é uma porção alcoxilato opcionalmente substituído (em algumas modalidades, cada R2 é de modo independente uma porção etoxilato, propoxilato ou butoxilato);

R3 é uma porção formadora de éster tendo a fórmula: R4CO- em que "R4 é um H, substituído ou não-substituído alquiIa1 alquenila, alquinila, arila, alquilarila, alquilheteroarila, e heteroarila (em algumas modalidades, R4 é uma porção substituída ou não-substituída de cadeia reta ou ramificada alquila, alquenila, ou alquinila, compreendendo a 5 partir de 5 até 22 ou mais átomos de carbono, uma porção arila, alquilarila, alquilheteroarila, ou heteroarila compreendendo a partir de 5 até 12 ou mais átomos de carbono, ou R4 é uma porção alquila substituída ou nãosubstituída C5-Cio ou mais longa, ou

R4 é uma porção alquila substituída ou não-substituída C nC22 ou mais longa);

x é 1 quando R1 é H; quando R1 não é H, x é um inteiro que é igual a ou menor do que o número de carbonos em R1;

p é um inteiro que é igual a ou menor do que x; m é um inteiro de O a 50, um inteiro de 0 a 18, ou um inteiro de 0 a12, enéno mínimo 1.

Em algumas modalidades da presente invenção, a molécula compreendendo uma porção éster é um etoxilato ou propoxilato de alquila tendo a fórmula RlOx[(R2)m(R3)n]p em que:

R1 é uma porção C2-C32 alquila ou heteroalquila substituída ou não-substituída; cada R2 é de modo independente uma porção etoxilato ou propoxilato;

R3 é uma porçaõ formadora de éster tendo a fórmula:

R4CO- em que R4 é H, alquila, alquenila, alquinila, arila, alquilarila, alquilheteroarila, e heteroarila substituído ou não-substituído, e em algu25 mas modalidades, R4 é uma porção substituída ou não-substituída de cadeia reta ou ramificada alquila, alquenila, ou alquinila compreendendo a partir de 5 a 22 ou mais átomos de carbono, uma porção substituída ou nãosubstituída arila, alquilarila, alquilheteroarila, ou heteroarila compreendendo a partir de 5 a 12 átomos de carbono ou mais longa, ou R4 é uma porção 30 alquila substituída ou não-substituída C5-C10 ou mais longa, ou R4 é uma porção alquila substituída ou não-substituída C5-C22 ou mais longa;

x é um inteiro que é igual a ou menor do que o número de carbonos em R1 ;

p é um inteiro que é igual a ou menor do que x; m é um inteiro de 1 a 12; e n é no mínimo 1.

Em algumas modalidades da presente invenção, a molécula

compreendendo a porção éster tem a fórmula:

R1Ox[(R2)m(R3)n]p

em que R1 é H ou uma porção que compreende uma porção amina primária, secundária, terciária ou quaternária, a referida porção R1 que compreende 10 uma porção amina sendo selecionada entre porções substituídas ou nãosubstituídas alquila, heteroalquila, alquenila, alquinila, arila, alquilarila, alquilheteroarila, e heteroarila. Em algumas modalidades, R1 compreende a partir de cerca de 1 a cerca de 50.000 átomos de carbono, a partir de cerca de 1 a cerca de 10.000 átomos de carbono, ou a partir de cerca de 2 a cerca de 15 100 átomos de carbono;

cada R2 é uma porção alcoxilato (em algumas modalidades, cada R2 é de modo independente uma porção etoxilato, propoxilato ou butoxilato);

R3 é uma porção formadora de éster tendo a fórmula:

R4CO- em que R4 é H, alquila, alquenila, alquinila, arila, alquilari

la, alquilheteroarila, e heteroarol (em algumas modalidades, R4 é uma porção substituída ou não-substituída de cadeia reta ou ramificada alquila, alquenila, ou alquinila compreendendo a partir de 5 a 22 átomos de carbono), uma porção substituída ou não-substituída arila, alquilarila, alquilheteroarila, 25 ou heteroarila compreendendo a partir de 9 a 12 ou mais átomos de carbono, or R4 é uma porção substituída ou não-substituída alquila C5-Cio ou mais longa, ou R4 é uma porção substituída ou não-substituída Cn-C22 de alquila ou mais longa;

x é 1 quando R1 é H; quando R1 não é H, x é um inteiro que é igual a ou menor do que o número de carbonos em R1 ;

p é um inteiro que é igual a ou menor do que x; m é um inteiro de 0 a 12 ou ainda 1 a 12, e n é no mínimo 1.

Doadores de acila adequados incluem triglicerídeos de qualquer tipo, incluindo triglicerídeos derivados de animal, triglicerídeos de produtos da indústria de laticínios, triglicerídeos derivados de plantas e triglicerídeos sintéticos, incluindo, mas não limitados a triacetin, tributirin, e moléculas de cadeia mais longa, as quais proporcionam grupamentos acetila, grupamentos butirila, e grupamentos acila de cadeia mais longa, respectivamente. Diacilglicerídeos, monoacilglicerídeos, fosfolipídeos, lisofosfolipídeo, glicolipídeos também encontram aplicação na presente invenção. Em algumas modalidades, diacila- e triacilglicerídeos contêm as mesmas cadeias de ácidos graxos, ao passo que em outras modalidades contêm cadeias de ácidos graxos diferentes. Outros ésteres adequados incluem ésteres formadores de cor tais como ésteres p-nitrofenólicos. Ésteres adicionais incluem ésteres alifáticos (por exemplo, etila butirato), ésteres isoprenóides (por exemplo, acetato de citronelila) e ésteres aromáticos (por exemplo, acetato de benzila).

Em algumas das modalidades de limpeza da presente invenção,

o doador de acila está presente sobre um objeto (por exemplo, como uma mancha sobre o objeto). Em algumas modalidades particularmente preferenciais, o doador de acila é desacilado pela composição em questão in situ.

Em algumas modalidades, alguns dos métodos de produção de ésteres fragrantes descritos em maiores detalhes aqui, requerem transferência de grupamentos acila de cadeia curta (por exemplo, C2-C10) tal como grupamentos acetila, e butirila.

Composições de Limpeza

A presente invenção também proporciona composições de limpeza compreendendo no mínimo uma aciltransferase e no mínimo um substrato alcoólico para a aciltransferase. Em algumas modalidades, a composição de limpeza é formulada para limpar objetos manchados com um doador 30 de acila molécula (por exemplo, um triglicerídeo) in situ. Deste modo, em algumas modalidades, a aciltransferase e o substrato alcoólico estão presentes em quantidades eficazes para produzir um éster detectável em contato da composição de limpeza com um objeto contendo doador de acila. Em algumas modalidades, a composição de limpeza, em contato com um objeto contendo doador de acila, compreende adicionalmente o objeto contendo doador de acila, e um éster que é produzido em conseqüência de uma rea5 ção, catalisada pela aciltransferase, entre o substrato alcoólico e o doador de acila. Conforme observado acima, em algumas modalidades, a aciltransferase é uma SGNH aciltransferase. Em algumas modalidades adicionais, a composição de limpeza contém uma combinação de substrato alcoólico e doador de acila tal que quando o grupamento acila do doador de acila é 10 transferido para o substrato alcoólico pela aciltransferase, é produzido um agente de tratamento de tecido (por exemplo, um éster tensoativo).

Em algumas modalidades, o substrato alcoólico é uma molécula de dupla finalidade em que também funciona como um tensoativo ou agente emulsificante presente na composição de limpeza. Exemplos de similares 15 substratos alcoólicos incluem, mas não estão limitados a: álcoois graxos (por exemplo, álcoois alifáticos C8-C18 lineares ou ramificados), por exemplo, álcool cetílico (por exemplo, hexadecan-1-ol), etoxilatos de álcoois graxos (por exemplo, etoxilatos NEODOL®) derivados de álcoois graxos, e etoxilatos de poliol (por exemplo, etoxilatos de glicerina) os quais são empregados co20 mumente em composições de limpeza.

Conforme descrito em maiores detalhes abaixo, as composições de limpeza da presente invenção são proporcionadas em qualquer forma adequada, incluindo sólidos (por exemplo, com a enzima e substrato alcoólico adsorvidos sobre um material sólido), líquidos, e géis. Em algumas moda25 Iidades preferenciais, as composições são proporcionadas em forma concentrada. Em outras modalidades, as composições de limpeza em questão são empregadas no estado em que se encontram, e em algumas modalidades adicionais são usadas como uma composição em spray ou pré- lavagem. Na aplicação, a forma de trabalho da composição de limpeza (por e30 xemplo, a forma dissolvida ou diluída da composição de limpeza) é aquosa e portanto contém no mínimo cerca de 50% de água, e em muitos casos contém entre cerca de 50% e cerca de 99,99% de água. Em algumas modalidades, a concentração de trabalho de substrato alcoólico em uma composição de limpeza em questão é a partir de cerca de 0,0001% a cerca de 50% (em vol/vol ou em peso/ vol), menos de cerca de 1%, menos de cerca de 0,1%, menos de cerca de 0,01%, ou menos de cerca de 0,001% de álcool. Em al5 gumas modalidades, a concentração de trabalho da enzima aciltransferase em questão na composição de limpeza é cerca de 0,01 ppm (partes por milhão, em peso/ vol) a cerca de 1000 ppm, cerca de 0,01 ppm a cerca de 0,05 ppm, cerca de 0,05 ppm a cerca de 0,1 ppm, cerca de 0,1 ppm a cerca de 0,5 ppm, cerca de 0,5 ppm a cerca de 1 ppm, cerca de 1 ppm a cerca de 5 10 ppm, cerca de 5 ppm a cerca de 10 ppm, cerca de 10 ppm a cerca de 50 ppm, cerca de 50 ppm a cerca de 100 ppm, cerca de 100 ppm a cerca de 500 ppm, or cerca de 500 ppm a cerca de 1000 ppm.

Em algumas modalidades, as composições de limpeza da presente invenção compreendem adicionalmente no mínimo uma lipase (por 15 exemplo, uma triacilglicerol lipase tendo uma atividade definida como EC 3.1.1.3, de acordo com a nomenclatura de enzimas IUBMB). Em algumas modalidades, a lipase é uma lipase clássica, conforme descrito acima. É contemplado que a aciltransferase e a lipase agem sinergicamente para remover cadeias de acila de moléculas de acilglicerídeo (por exemplo, triacil20 glicerol) sobre um objeto. No entanto, não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer mecanismo de ação em particular.

Em algumas modalidades, a composição de limpeza compreende uma fonte de peróxido, a qual pode ser o próprio peróxido de hidrogênio ou uma composição que produz peróxido de hidrogênio como um produto da 25 reação. Fontes de peróxido de hidrogênio adequadas que produzem peróxido de hidrogênio como um produto da reação incluem, mas não estão limitadas a fontes de peroxigênio selecionadas entre: (i) a partir de cerca de 0,01 a cerca de 50, a partir de cerca de 0,1 a cerca de 20, ou a partir de cerca de

1 a 10 por cento em peso de um persal, um peroxiácido orgânico, peróxido de hidrogênio de uréia e misturas dos mesmos; (ii) a partir de cerca de 0,01 a cerca de 50, a partir de cerca de 0,1 a cerca de 20, ou a partir de cerca de

1 a 10 por cento em peso de um carboidrato e a partir de cerca de 0,0001 a cerca de 1, a partir de cerca de 0,001 a cerca de 0,5, a partir de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 por cento em peso de carboidrato oxidase; e (iii) misturas dos mesmos. Persais adequados incluem, mas não estão limitados a perborato de metais de álcali, percarbonato de metais de álcali, perfosfatos de metais de álcali, persulfatos de metais de álcali e misturas dos mesmos.

Em algumas modalidades, o sacarídeo é selecionado entre monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, oligossacarídeos (por exemplo, carboidratos), e misturas dos mesmos. Sacarídeos adequados incluem, mas não estão limitados a sacarídeos selecionados entre D-arabinose, L10 arabinose, D-celobiose, 2-deoxi-D-galactose, 2-deoxi-D-ribose, D-frutose, Lfucose, D-galactose, D-glucose, D- glicero-D-gulo-heptose, D-lactose, Dlixose, L-lixose, D-maltose, D-manose, melezitose, L- melibiose, palatinose, D-rafinose, L-ramnose, D-ribose, L-sorbose, estaquiose, sucrose, D- trealose, D-xilose, L-xilose, e misturas dos mesmos.

Carboidrato oxidases adequadas incluem, mas não estão limita

das a carboidrato oxidases selecionadas entre aldose oxidase (IUPAC classificação EC1 .1.3.9), galactose oxidase (IUPAC classificação EC 1.1.3.9), celobiose oxidase (IUPAC classificação EC 1.1.3.25), piranose oxidase (IUPAC classificação EC1 .1.3.10), sorbose oxidase (IUPAC classificação EC1 20 .1.3.1 1) e/ou hexose oxidase (IUPAC classificação EC 1.1.3.5), glucose oxidase (IUPAC classificação EC 1.1.3.4), e misturas das mesmas.

Em algumas modalidades, o objeto contendo doador de acila limpado pela composição de limpeza é manchado com uma substância oleosa (por exemplo, uma substância contendo triacilglicerídeo ou similares). Em algumas modalidades, o objeto (por exemplo, um tecido), é manchado com um produto da indústria de laticínios.

Apesar de não essencial para a performance dos métodos descritos abaixo, em algumas modalidades a escolha do substrato alcoólico é feita para produzir um éster fragrante em reação com o doador de acila. Ésteres fragrantes são descritos em maiores detalhes abaixo.

Em algumas modalidades, a composição de limpeza é uma composição de limpeza de tecido (isto é, um detergente de lavanderia), uma composição de limpeza de superfície, ou uma composição de limpeza de pratos, ou uma composição detergente para lava-louça automática. Formulações para composições de limpeza exemplares são descritas em maiores detalhes na N0 WO 0001826, a qual é incorporada por meio de referência 5 aqui.

Em algumas modalidades, a composição de limpeza em questão contém a partir de cerca de 1 % a cerca de 80%, cerca de 5% a cerca de 50% (em peso) de no mínimo um tensoativo (por exemplo, tensoativos nãoiônicos, tensoativos catiônicos, tensoativos aniônicos, ou tensoativos zvite10 rônicos, ou qualquer mistura dos mesmos). Tensoativos exemplares incluem, mas não estão limitados a sulfonato de benzeno de alquila (ABS), incluindo sulfonato de benzeno de alquila linear e sulfonato de sódio de alquila linear, alquila fenóxi poloetóxi etanol (por exemplo, nonila fenóxi etoxilato ou nonila fenol), dietanolamina, trietanolamina, e monoetanolamina. Tensoati15 vos exemplares que encontram aplicação em detergentes, particularmente detergentes de lavanderia, incluem os descritos nas Patentes dos E.U. N— 3.664.961, 3.919.678, 4.222.905, e 4.239.659.

Em algumas modalidades, o detergente é um sólido, ao passo que em outras modalidades é líquido, e em outras modalidades é um gel. Em algumas modalidades preferenciais os detergentes compreendem adicionalmente um tampão (por exemplo, carbonato de sódio, ou bicarbonato de sódio), um ou mais reforçadores de detergente, alvejante, um ou mais ativadores de alvejante, uma ou mais enzimas adicionais, um ou mais enzima de agentes- estabilizante, um ou mais reforçadores de espuma, um ou mais supressores, um ou mais agentes antimancha, um ou mais agentes anti-corrosão, um ou mais agentes de suspensão de sujeira, um ou mais agentes de liberação de mancha, um ou mais germicidas, um ou mais agentes de ajuste de pH, uma ou mais fontes de alcalinidade não-reforçadoras, um ou mais agentes quelantes, um ou mais enchimentos orgânicos ou inorgânicos, um ou mais solventes, um ou mais hidrótropos, um ou mais abriIhantadores óticos, um ou mais corantes, e/ou perfumes.

Em algumas modalidades, a composição de limpeza em questão compreende uma ou mais enzimas diversas (por exemplo, pectina liases, endoglicosidases, hemicelulases, peroxidases, proteases, celuiases, xilanases, lipases, fosfolipases, esterases, cutinases, pectinases, pectato liases, amilases, mananases, queratinases, redutases, oxidases, oxidorredutases, 5 fenoloxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tannases, pentosanases, malanases, beta-glucanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, lacase, e amilases) ou misturas das mesmas. Em algumas modalidades, se usa uma combinação de enzimas (isto é, um "coquetel") compreendendo enzimas aplicáveis convencionais como protease, lipase, cutinase 10 e/ou celulase em combinação com aciltransferase.

Uma ampla variedade de outros ingredientes úteis em composições de limpeza detergentes também são proporcionados nas composições aqui, incluindo outros ingredientes ativos, veículos, hidrótropos, auxiliares do processamento, corante ou pigmentos, solventes para formulações líquidas, 15 e etc. Em modalidades nas quais se deseja um incremento adicional de espumação, reforçadores de espuma tais como as C10-C16 alcolamidas são incorporados nas composições, tipicamente em níveis de cerca de 1% a cerca de 10%.

Em algumas modalidades, composições de detergente contêm 20 água e outros solventes como veículos. Álcoois primários ou secundários de baixo peso molecular exemplificados por metanol, etanol, propanol, e isopropanol são adequados. Álcoois mono-hídricos são preferenciais para solubilizar tensoativos, mas polióis tais como aqueles contendo a partir de cerca de 2 a cerca de 6 átomos de carbono e a partir de cerca de 2 a cerca de 6 25 grupamentos hidróxi (por exemplo, 1,3-propanodiol, etileno glicol, glicerina, e 1,2- propanodiol) também encontram aplicação. Em algumas modalidades, as composições contêm a partir de cerca de 5% a cerca de 90%, tipicamente a partir de cerca de 10% a cerca de 50% de tais veículos.

Em algumas modalidades, as composições de detergente proporcionadas aqui, são formuladas de tal modo que durante o uso em operações de limpeza aquosa, a água de lavagem tenha um pH entre cerca de 6,8 e cerca de 11,0. Deste modo, produtos acabados são tipicamente formulados nesta faixa. Técnicas para controlar pH em níveis de uso recomendado incluem o uso de tampões, álcalis, ácidos, e etc., e são de conhecimento geral daqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, a composição de limpeza compreende um detergente para lava-louça automática que tem um pH de trabalho na faixa de cerca de pH 9,0 a cerca de pH 11,5, cerca de pH 9,0 a cerca de pH 9,5, cerca de pH 9,5 a cerca de pH 10,0, cerca de pH 10,0 a cerca de pH 10,5, cerca de pH 10,5 a cerca de pH 11,0, ou cerca de pH 11,0 a cerca de pH 11,5. Em algumas outras modalidades, a composição de limpeza compreende um detergente líquido de lavanderia que tem um pH de trabalho na faixa de cerca de pH 7,5 a cerca de pH 8,5, cerca de pH 7,5 a cerca de pH 8,0, ou cerca de pH 8,0 a cerca de pH 8,5. Em algumas outras modalidades, a composição de limpeza compreende um detergente sólido de lavanderia que tem um pH de trabalho na faixa de cerca de pH 9,5 a cerca de pH 10,5, cerca de pH 9,5 a cerca de pH 10,0, ou cerca de pH 10,0 a cerca de pH 10,5.

Vários compostos alvejantes, tais como os percarbonatos, perboratos e similares, também encontram aplicação nas composições da presente invenção, tipicamente em níveis de cerca de 1 % a cerca de 15% em peso. Conforme desejado, as composições referidas também contêm ativa20 dores de alvejante tais como tetra-acetila etileno diamina, sulfonato de nonanoiloxibenzeno, e similares, os quais também são de conhecimento na técnica. Níveis de uso variam tipicamente de cerca de 1% a cerca de 10% em peso.

Vários agentes de liberação de mancha, especialmente do tipo 25 oligoéster aniônico, vários agentes quelantes, especialmente os aminofosfonatos e etolenodiaminadissuccinatos, vários agentes de remoção de sujeira de argila, especialmente tetraetileno pentamina etoxilada, vários agentes dispersantes, especialmente poliacrilatos e poliasparatatos, vários abrilhantadores, especialmente abrilhantadores aniônicos, vários supressores de 30 espuma, especialmente silicones e álcoois secundários, vários amaciantes de tecido, especialmente argilas de esmectita, e similares, todos encontram aplicação em várias modalidades das presentes composições em níveis variando a partir de cerca de 1% a cerca de 35% em peso. Formulários padrão são de conhecimento geral daqueles versados na técnica.

Estabilizantes enzimáticos também encontram aplicação em algumas modalidades das presentes composições de limpeza. Os estabilizan5 tes referidos incluem, mas não estão limitados a propileno glicol (preferencialmente a partir de cerca de 1% a cerca de 10%), formato de sódio (preferencialmente a partir de cerca de 0,1% a cerca de 1%), e formato de cálcio (preferencialmente a partir de cerca de 0,1% a cerca de 1%).

Em ainda modalidades adicionais, as composições de limpeza 10 da presente invenção também compreendem no mínimo um reforçador. Em algumas modalidades preferenciais, reforçadores estão presentes nas composições em níveis a partir de cerca de 5% a cerca de 50% em peso. Reforçadores típicos incluem os zeólitos de 1 a 10 micra, policarboxilatos tais como citrato e oxidissuccinatos, silicatos em camadas, fosfatos, e similares. 15 Outros reforçadores convencionais são listados em formulários de referência e são de conhecimento geral daqueles versados na técnica.

Outros ingredientes opcionais incluem agentes quelantes, agentes de remoção/antirredeposição de sujeira de argila, agentes dispersantes poliméricos, alvejantes, abrilhantadores, supressores de espuma, solventes e agentes estéticos.

A presente invenção também proporciona métodos para o uso das composições de limpeza proporcionadas aqui, neste requerimento de patente. Em algumas modalidades, os métodos de limpeza incluem: combinar no mínimo uma aciltransferase, no mínimo um substrato alcoólico para a 25 aciltransferase, e um objeto manchado com uma substância contendo doador de acila; em que a aciltransferase catalisa transferência de um grupamento acila do doador de acila para o substrato alcoólico para produzir um éster. Em algumas modalidades, o substrato alcoólico é escolhido de modo a produzir um éster fragrante resultante. Em algumas outras modalidades, o 30 grupamento acila é transferido para um tensoativo ou agente emulsificante, ou um ou mais dos outros agentes listados acima. Em algumas modalidades, a composição de limpeza compreende adicionalmente um doador de acila que não serve outra função de limpeza (isto é, não serve como um tensoativo, emulsificante, oxidante, e etc.,) diferente de produzir fragrância. Os doadores de acila referidos incluem, mas não estão limitados a triacetin e tributirin.

Em algumas modalidades alternativas, os métodos de limpeza

da presente invenção incluem a etapa de produzir um éster que tem propriedades de limpeza, tal como um éster tensoativo ou agente emulsificante de éster, que tem uma atividade de limpeza durante a lavagem.

Em algumas modalidades, o objeto pode ser um tecido (incluin10 do, mas não limitado a vestuário, estofados, tapetes, roupa de cama, e etc.), ou uma superfície dura (incluindo, mas não limitada a superfícies de cozinha, superfícies de banheiro, azulejos, e etc), ou louça. Em algumas modalidades, o tecido é manchado com uma substância contendo óleo tal como uma substância contendo triacilglicerídeo. Em algumas modalidades, a substân15 cia contendo óleo compreende no mínimo um triacilglicerídeo C4-C18 (por exemplo, produtos da indústria de laticínios).

Em algumas modalidades, os métodos de limpeza utilizam uma composição de limpeza que contém acetila transferase mas não contém uma lipase (por exemplo, uma lipase clássica). Em algumas modalidades alternativas, os métodos de limpeza em questão utilizam composição de limpeza que contém a acetiltransferase em questão e uma lipase (por exemplo, Lipolase®, Lipozym®, Lipomax®, Lipex®, lipase Amano®, lipase Toyo-Jozo®, lipase Meito® ou Diosynth®). Em algumas modalidades, o uso de uma combinação particular de uma aciltransferase-lipase resulta em significativamente menos mau odor do que se o método fosse realizado usando a enzima lipase somente. Não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer mecanismo ou teoria em particular. No entanto, é contemplado que a aciltransferase e a lipase agem sinergicamente removendo grupamentos acila do triacilglicerídeo (por exemplo, triacilglicerídeo contendo ácido butírico), para reduzir o mau odor.

Portanto, em algumas modalidades, o uso de uma aciltransferase em uma composição de limpeza resulta em mais de cerca de uma redução de 10% em ácidos graxos que causam mau odor, cerca de uma redução de 20% em ácidos graxos que causam mau odor, mais de cerca de uma redução de 30% em ácidos graxos que causam mau odor, mais de cerca de uma redução de 50% em ácidos graxos que causam mau odor, mais de cer5 ca de uma redução de 70% em ácidos graxos que causam mau odor, mais de cerca de uma redução de 80% em ácidos graxos que causam mau odor, ou mais de cerca de uma redução de 90% em ácidos graxos que causam mau odor; comparada com composições de limpeza equivalentes que não contêm a aciltransferase. Em algumas modalidades particularmente prefe10 renciais, o uso de uma aciltransferase em questão em uma composição de limpeza não produz mau odor.

Composições para Produção de Ésteres Fraqrantes

Conforme observado acima, a presente invenção proporciona composições e métodos para a produção de ésteres fragrantes. Em algumas 15 modalidades, a composição compreende no mínimo uma aciltransferase, um substrato alcoólico para a aciltransferase, e um doador de acila. Em algumas destas modalidades, a aciltransferase catalisa transferência de um grupamento acila do doador de acila para o substrato alcoólico para produzir um éster fragrante em um ambiente aquoso. Em algumas modalidades, esta 20 composição é uma composição substancialmente seca (por exemplo, desidratada) na qual o éster fragrante somente é produzido na re-hidratação da composição. Em outras modalidades, a composição é uma composição aquosa que compreende adicionalmente o éster fragrante.

Em muitas modalidades, o substrato alcoólico e o doador de aci25 Ia da composição são escolhidos para produzir um éster fragrante particular. Ésteres fragrantes exemplares que são produzidos usando a composição em questão são determinados nas Tabelas 1 a 3 abaixo, junto com uma combinação adequada de substrato alcoólico e doador de acila para a produção daqueles ésteres. Outros ésteres fragrantes são conhecidos, e dada a 30 estrutura molecular de similares ésteres fragrantes, o substrato alcoólico e éster que podem ser combinados na presença de uma aciltransferase em questão seriam evidentes. Nestas Tabelas, "AcT" é a aciltransferase selvagem de M. smegmatis, " KLM3'" é a aciltransferase de Aeromonas sp., con forme descrito na N0 WO 04/064987, e Lipomax® é uma lipase de Pseudo monas alcaligenes (Genencor).

Tabela 1: Transesterificação de Álcoois Alifáticos

Estrutura Éster

Alcool

Etanol

2-metila

butan-1-ol

3-metila

butan-1-ol

Álcool hexílico

cis-3-hexen-1-

ol

Ciclo

hexilmetanol

Ciclo

hexiletanol

OH

OH

OH

Butirato

Doadorde

Acila

Triaeetin, pNB, nata

Acetato Triacetin, pButirato NB, tributirin

OH

OH

Acetato

Butirato

Acetato

Acetato

Butirato

Acetato

Acetato

Triacetin, tributirin

Triacetin, tributirin

Triacetin, tributirin

Triacetin T riacetin

Enzima

AcT, KLM3' Lipomax

AcT, KLM3'

AcT

AcT

AcT, KLM3' AcT

AcT

Tabela 2: Transesterificação de Álcoois de Terpeno

Álcool Estrutura Éster Doador de Acila Enzima Geraniol X Acetato Triacetin, tributi¬ AcT O Butirato rin Citronelol Acetato Triacetin, tributi¬ AcT, KLM3' Butirato rin Nerol / N Acetato Triacetin AcT Mirtenol X Acetato Triacetin AcT ,OH Álcool Estrutura Éster Doador de Acila Enzima

Mirtanol ^oh Acetato Triacetin AcT

Tabela 3: Transesterificação de Álcoois Alifáticos

Álcool Estrutura Éster Doador de Enzima Acila Álcool benzíli- I Acetato Triacetin nata AcT CO O Butirato Álcool fenetíli- Acetato Triacetin AcT, KLM3' CO Álcool pipero- o Acetato T riacetin AcT nílico W cC0 Álcool veratríli- MeO^j Acetato T riacetin AcT CO Em algumas modalidades, a SGNH aciltransferase é imobilizada sobre um substrato, (por exemplo, um suporte sólido ou semissólido) tal como uma coluna ou gel para permitir que a reação seja terminada lavando o substrato alcoólico e o doador de acila da enzima.

Métodos para Produção de Esteres Fraqrantes

A composição descrita acima encontra aplicação em uma variedade de métodos de produção de ésteres fragrantes que geralmente envolvem combinar no mínimo uma aciltransferase, no mínimo um substrato alco10 ólico para a aciltransferase, e no mínimo um doador de acila, onde, em um ambiente aquoso, a aciltransferase catalisa transferência de um grupamento acila do doador de acila para o substrato alcoólico para produzir o éster fragrante. Em algumas modalidades, os métodos envolvem re-hidratar os componentes depois deles serem combinados. Em algumas modalidades alter15 nativas, a aciltransferase, o substrato alcoólico e o doador de acila são combinados em um ambiente aquoso. Conforme observado acima, em algumas modalidades alternativas, a aciltransferase é uma SGNH aciltransferase.

Estes métodos encontram utilidade em uma variedade de processos nos quais ésteres fragrantes são desejáveis. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição é incorporada em gêneros alimentícios para melhora ou produzir aromas ou fragrãncia durante o consumo, ou usadas em métodos de limpeza, conforme descrito acima. Em algumas modalidades adicionais, as composições são usadas em métodos de fabricação de ésteres.

5 Em um exemplo, a composição de produção de ésteres fragran

tes é incorporada em forma seca (por exemplo, adsorvida sob um substrato), em um gênero alimentício tal como goma de mascar ou bala. A re-hidratação do gênero alimentício (por exemplo, durante mastigação ou pela adição de líquido contendo água tal como água ou leite), inicia a reação da aciltransfe10 rase para produzir o éster fragrante in situ. Igualmente, em algumas modalidades, os métodos são usados para produzir ésteres fragrantes em volume para as indústrias de alimento, perfume e/ou limpeza.

Em algumas modalidades, o próprio substrato alcoólico um álcool fragrante. Deste modo, em algumas modalidades, o odor da reação descrita acima se altera com o tempo, (por exemplo, do odor do substrato alcoólico fragrante para o odor de um éster daquele álcool).

Em algumas modalidades adicionais, um álcool fragrante é transesterificado usando uma cadeia acila longa (por exemplo, um ácido graxo de cadeia longa) para produzir um éster não-fragrante. Em algumas destas 20 modalidades, o éster não-fragrante é hidrolisado com o tempo, espontaneamente, ou na presença de uma hidrolase, para reproduzir o álcool fragrante. Métodos para Produção de Ésteres Tensoativos in situ

Em algumas modalidades, modificação in situ de lipídeos é realizada usando partículas contendo uma aciltransferase, fosfolipídeos e sorbi25 tol. Em algumas modalidades, as partículas compreendem formas produzidas por nanoencapsulação, microencapsulação, fabricação de tabletes, peletização, e/ou usando revestimentos de éster WAX1 conforme especificado no "Bariere System" de conhecimento daqueles versados na técnica.

Em algumas modalidades, é proporcionado revestimento adicional pelo sistema de tecnologia de proteção de temperatura (TPT). Em algumas modalidades, as concentrações tanto do substrato lipídico, fosfolipídeo e a molécula aceitadora, sorbitol são muito baixas no processo de lavagem e deste modo limitam a produção de detergente verde. Em algumas modalidades, incluindo o substrato e as moléculas aceitadoras junto com a enzima KLM3 dentro de um compartimento fechado assegura que a concentração de reagentes seja suficientemente elevada para um processo de bioconver5 são rápida. Em algumas modalidades, durante armazenamento em condições especificadas de temperatura e umidade, KLM3 catalisa um proceso de modificação in situ e deste modo cria Iiso-PC e ésteres de sorbitol-acila. Para permitir uma completa conversão dos fosfolipídeos (PC) a proporção entre PC e sorbitol é otimizada até uma proporção de cerca de 1 :2; cerca de 1 :5, 10 cerca de 1 :10, cerca de 1 :50, ou o mais preferencialmente cerca de 1 :100 para PC: sorbitol. Em algumas modalidades, para conciliar a melhor composição de detergente, todos os fosfolipídeos são convertidos para os derivados de liso-fosfolipídeo e a quantidade equivalente de ésteres de sorbitolaciia. Com a KLM3 aciltransferase mutante ótima a reação enzimática so15 mente dá origem a liso-fosfolipídeos e éster de sorbitol-acila, sem quantidades significativas de ácidos graxos livre. Para obter um efeito poderoso do detergente, todos os fosfolipídeos são convertidos para os derivados lisofosfolipídeo.

Em algumas modalidades, a reação bioquímica ocorre depois da encapsulação e em algumas modalidades requer tempo de prateleira adicional. Quando a reação é completada, as partículas são adicionadas ao pó da lavagem. As partículas são solubilizadas durante o processo de lavagem e os detergentes são liberados. Uma ampla gama de ambos os substratos (triglicerídeos, diglicerídeos monoglicerídeos, fosfolipídeos, galactolipídeos, ésteres vinílicos, ésteres metílicos e etc. de ácidos graxos) encontra aplicação. Similarmente, um grande número de moléculas aceitadoras também são adequadas. Estes aceitadores compreendem sorbitol, xilitol, glucose, maltose, sucrose, polióis, e álcoois de cadeia longa, média e curta, polissacarídeos, tais como pectina, amido, galactomanano, alginato, carragenanas quitosana, quitosana hidrolisada e oligossacarídeos derivados destes polissacarídeos. Em modalidades adicionais, moléculas aceitadoras são polipeptídeos e peptídeos. A revelação completa da N0 WO 05/056782 incluindo mas não limitada a todas as descrições de enzimas aciltransferase, alterações de aminoácido, estruturas de cristal, métodos de teste, métodos de uso, seqüências, homólogos, ortólogos, alinhamentos de seqüência, figuras, tabelas, 5 composições de limpeza, e etc., é incorporada por meio de referência aqui, a este requerimento de patente, para todos os fins.

EXPERIMENTAL

Os exemplos a seguir são proporcionados de modo a demonstrar e ilustrar adicionalmente algumas modalidades e aspectos preferenciais da presente invenção e não devem ser considerados como Iimitantes no escopo da mesma.

A publicação de patente internacional PCT N0 WO 05/056782 se refere à identificação e ao uso de enzimas aciltransferase. Cada um dos exempios 1 a 27 da publicação de patente internacional PCT N0 WO 15 05/056782 é incorporado individualmente por meio de referência aqui, a este requerimento de patente, para revelação de todos os métodos revelados na mesma incluindo mas não limitada à revelação de: métodos para produzir aciltransferases, métodos para identificar aciltransferases, métodos para testar aciltransferases, seqüências de polinucleotídeo e polipeptídeo de acil20 transferases, métodos para usar aciltransferases e composições nas quais podem ser empregadas aciltransferases.

EXEMPLO 1

Acilacão de cis-3-Hexenol. 2-Feniletanol e Álcool Isoamílico

Foi realizada acilação de cis-3-hexenol, 2-feniletanol e álcool isoamílico em água com tributirin e uma aciltransferase solúvel.

Em um procedimento típico, o álcool (2 uL) e tributirin (2 uL) em tampão de fosfato a 200 mM, pH 7 (500 uL) foram tratados com aciltransferase (M. smegmatis; AcT) (34 ppm) ou KLM3' (20 ppm) a 45°C por 40 min. Diclorometano (500 uL) foi em seguida adicionado a cada frasco, seguido 30 por agitação por vórticr (10 segundos) e centrifugação para separar as camadas orgânica e aquosa. A camada orgânica foi em seguida removida e analisada por GC/MS. Esta análise foi conduzida com um Agilent 6890 GC/MS usando uma coluna de 30 m x 0,25 mm (filme de 0,25 um) HP-5MS.

O método de GC/MS utilizou hélio como o gás de veículo (1 cc/min) com uma temperatura da porta do injetor de 250°C e uma proporção de divisão de 20:1. O programa de temperatura do forno iniciou com uma retenção de 1 5 min a 60°C, aumentando até 300°C a 30°C/min por um tempo de operação total de 10 minutos. O detector de massa foi iniciado em varredura 2 min pós injeção a partir de 30 até 400 AMU.

A figura 1 indica que em cada um destes experimentos uma proporção do álcool foi convertida para seus ésteres de ácido butírico respectivos. Esta quantidade foi significativamente maior para AcT do que para KLM3'.

EXEMPLO 2

Acilacão de Citronelol e Geraniol

Os álcoois de terpeno citronelol (1) e geraniol (2) foram avaliados como substratos para a aciltransferases AcT e KLM3' usando tanto triacetin quanto tributirin como doadores de acila.

Citronelol ( 1 ) Geraniol (2)

Álcoois de terpeno (2 uL) e ou triacetin ou tributirin (2 uL) em tampão de fosfato a 50 mM, pH 7 (500 uL) foram tratados com AcT (34 ppm) 20 ou KLM3' (20 ppm) a 45°C por 40 min. Uma alíquota (50 uL) foi em seguida removida de cada reação, diluída em metanol/diclorometano (1 :3, 500 uL) e analisada por GC/MS para evidência da produção de éster. Os resultados são proporcionados na Tabela 4.

Tabela 4: Extensão da Conversão de Citronelol e Geraniol para Seus Ésteres Acetílicos e Butirílicos Respectivos com Duas Aciltransferases.

Enzima Citronelol Geraniol

Acetato Butirato Acetato Butirato Enzima Citronelol Geraniol

AcT ++ +++ +++ ++++

KLM3' Traço Traço Nenhum Nenhum

EXEMPLO 3

Acilação de Álcoois em Água com Uma Aciltransferase Adsorvida sobre o Tecido I

Uma alíquota de 1 mL de uma solução de aciltransferase (100 ppm em tampão HEPES a 5 mM, pH 8) foi adicionada ao centro de uma seção quadrada de pano de malha de algodão (10x10 cm) e o pano foi deixado para secar ao ar de um dia para o outro.

Alíquotas (10 mL) de uma solução contendo álcool benzílico (1 % em v/v) e triacetin (1 % em v/v) em tampão de fosfato de sódio a 50 mM, 10 pH 7, foram adicionadas tanto ao retalho de tecido para amostra de algodão com AcT adsorvida, bem como a um controle sem enzima. O odor característico de acetato de benzila foi gerado dentro de 2 minutos sobre o tecido contendo a enzima AcT, em contraste com o controle, o qual não produziu odor notável.

EXEMPLO 4

Acilação de Álcoois em Água com Uma Aciltransferase Imobilizada sobre o Tecido Il

Retalhos de tecido para amostra de tecido de malha de algodão (20 por 20 cm) foram colocados sobre uma folha plástica e tratados com AcT 20 (1 ml de 12 mg/mL), polietilenimina (500 uL de uma solução a 20% em peso/ vol) e água deionizada (1 mL). O tecido foi deixado para secar de um dia para o outro sob condições ambiente tempo depois do qual foi removido da folha plástica e ensopado em tampão de fosfato de sódio a 50 mM (400 mL, pH 7) com lenta agitação de um dia para o outro. O retalho de tecido para 25 amostra de algodão foi em seguida enxaguado completamente com água corrente e deixado para secar por gotejamento. Um segundo retalho de tecido para amostra de algodão foi preparado de acordo com o método descrito acima exceto que a mistura enzimática aplicada ao tecido continha uma suspensão de látex (1 mL de AIRFLEX® 423, AirProducts, Allentown, PA) em adição aos componentes listados acima.

Os dois retalhos de tecido para amostra foram colocados lado a lado e tratados com uma solução aquosa de álcool benzílico (2 % em v/v) e triacetin (2% em v/v) em tampão de fosfato de sódio a 50 mM (40 mL de pH 5 7). O odor de acetato de benzila foi claramente evidente a partir de ambos os retalhos de tecido para amostra, em contraste com um retalho de tecido para amostra controle. Os retalhos de tecido para amostra também foram tratados com uma solução de p-nitrofenila butirato (200 uL de 10 mM em água) de modo a visualizar a atividade hidrolítica da AcT ligada. Neste caso 10 o retalho de tecido para amostra de algodão tratado com AcT/PEI somente deu uma cor perceptível.

EXEMPLO 5

Acilação de Álcool Benzílico em Água por Re-hidratacão de uma Mistura de Triacetin/Álcool Adsorvida sobre Amido Álcool benzílico (0,5 mL) e triacetin (0,5 mL) foram adicionados a

10 g de maltodextrina (Grain Processing Corp., IA) seguida por vigorosa agitação mecânica resultando em um pó de livre escoamento com pouco ou nenhum odor. Uma porção desta mistura (1 g) foi colocada em uma placa de Petri e foi em seguida tratada com uma solução de AcT (1 ppm) resultando 20 na produção do odor característico de acetato de benzila em menos de 5 minutos. Um controle foi realizado usando água e não resultou na produção de acetato de benzila em menos de 1 hora.

EXEMPLO 6

Transesterificação Usando AcT Imobilizada em um Sílica Sol-Gel Aciltransferase (AcT) foi imobilizada em um sílica Sol-gel e com

parada com a forma solúvel da enzima para a capacidade para produzir ésteres fragrantes sob condições aquosas. i) Encapsulação por Sol-gel de AeT

Uma alíquota (2,2 mL) de uma mistura a 1: 1 de silicato de sódio (27% de SiO2, 14% de NaOH, Sigma Aldrich Corp., Wl) e metila siliconato de sódio (30% em água, Gelest, NJ) foi adicionada a ácido fosfórico (4 mL de 1,5 M) com agitação. Uma solução de aciltransferase (1 mL de 12 mg/mL) foi em seguida adicionada e a mistura foi deixada em repouso em temperatura ambiente até se observada gelação. O gel resultante foi em seguida lavado duas vezes com tampão de fosfato a 50 mM, pH 7 (50 mL) e curado de um dia para o outro dentro de um recipiente vedado.

ii) Esterificação de cis-3-hexenol

Uma porção do sol-gel a úmido (0,66 g, equivalente a 1 mg de AcT) descrito acima foi incubada com cis-3-hexenol (20 uL) e triacetin (40 uL) em tampão de fosfato de sódio a 50 mM, pH 7. A conversão do cis-3- hexenol para o éster acetílico foi comparada com um controle contendo AcT 10 solúvel (0,5 mg de AcT). Alíquotas (10 uL) foram tiradas das duas reações em 10, 30 e 120 minutos e foram analisadas por GC/MS. Os resultados são mostrados na figura 2.

Apesar de estar claro que a enzima imobilizada forma o éster acetílico (tempo de retenção de 4,5 minutos) em uma taxa menor do que a enzima livre, a remoção da forma imobilizada da enzima evita a hidrólise subsequente do éster fragrante, conforme é evidente para a enzima livre nos pontos do tempo de 30 e 120 minutos.

EXEMPLO 7

Transesterficacão de um Álcool e um Éster Fragrante usando AcT Uma mistura de álcool benzílico e acetato de citronelila (1% em

v/v cada) em tampão de fosfato de K a 50 mM, pH 7 foi tratada com AcT (10 ppm) em temperatura ambiente. Dentro de vários minutos os odores característicos de acetato de benzila e citronelol se tornam evidentes. A presença destes compostos foi confirmada por GC/MS usando o método descrito no 25 Exemplo 1. Os resultados do experimento demonstraram a possibilidade de produzir duas fragrâncias simultaneamente a partir de precursores com odores menos acentuados.

EXEMPLO 8

Produção de Éster Fragrante a partir de Tecido Manchado com Manteiga

Manteiga derretida (40 a 50 mg) foi aplicada a 6 retalhos de teci

do para amostra de tecido de malha de algodão (250 a 300 mg cada) e deixada para esfriar até a temperatura ambiente. Os retalhos de tecido para amostra foram pesados e em seguida tratados ou com LIPOMAX ou com AcT ou com combinações das duas enzimas (Tabela 5). Cada retalho de tecido para amostra foi adicionado a 20 mL de tampão HEPES a 5 mM, pH 7 contendo álcool benzílico (10 uL, 0,005% em v/v) e a uma ou mais enzimas.

Depois de agitação em temperatura ambiente por 20 minutos os retalhos de tecido para amostra foram removidos e avaliados para odor antes e depois de secagem por dois panelistas. A perda total no peso também foi medida depois da secagem. Os resultados estão resumidos na Tabela 6.

Tabela 5: Extensão da Remoção de Manteiga de Retalhos de Tecido para Amostra de Tecido de Algodão Manchados com Manteiga

üíca r\ n

% de Perda

4,2 % 16%

Amostra Condição peso do peso da peso da Tecido Manteiga Manteiga (mg) antes depois 1 Controle 276,6 40,7 39,0 2 1 ppm de 280,5 45,1 37,9 AcT 1 ppm de LM 3 1 ppm de 289,5 46,6 42,8 AcT somen¬ te 4 1 ppm de 271,7 45,3 38,3 LM somente 5 2 ppm de 275,4 45,9 39,4 AcT 2 ppm de LM 6 1 ppm de 261,1 47,3 40,7 AcT 5 ppm de LM 8%

15%

14%

14 %

AcT = aciltransferases de M. smegmatis; LM = Iipase LIPOMAX®.

Tabela 6: Extensão da Formação de Mau Odor de Retalhos de Tecido para Amostra Manchados com Manteiga Depois de Tratamento Enzimático

« . Odor a Úmido Odor a Seco Descrição do

m0S r (n = 2) (n = 1) odor a seco

1 0 -0,5 Traço rançoso ostra Odora Úmido Odor a Seco Descrição do (n = 2) (n = 1) odor a seco 2 +2 -2 Forte rançoso 3 +0,5 -0,5 Traço rançoso 4 -1,5 -2 Forte rançoso +2 -1 Traço frutado/rançoso 6 +1,5 0 Frutado/rançoso EXEMPLO 9

Determinação da Proporção de Transesterificacão Versus Hidrólise

Tributirin (10 uL) foi adicionado a tampão (1 mL) contendo 4% de etanol e tratado com ou AcT ou KLM3', mais um controle livre de enzima a 5 40°C durante 2 horas. Uma alíquota (100 uL) foi removida de cada amostra e diluída em diclorometano (900 uL), seguida por análise por GC/MS. A quantidade e proporção de etila butirato para ácido butírico foi observada para cada condição. O controle não apresentou transferência de acila ou hidrólise do substrato. A amostra tratada com AcT apresentou uma digestão 10 completa do tributirin, e uma proporção de ácido butírico para etila butirato de 1:2. A amostra tratada com KLM3' apresentou somente digestão parcial do tributirin, no entanto a proporção de ácido butírico para etila butirato foi de 1:5.

EXEMPLO 10

Produção Simultânea de um Perácido e uma Fraqrância Obtida Usando tanto Formas Solúvel quanto Imobilizada de AcT

A combinação de AcT1 triacetin, peróxido de hidrogênio aquoso diluído (50 a 500 ppm) e álcool benzílico (10 a 50 ppm) resulta na produção tanto de ácido peracético quanto do acetato de benzila fragrante.

Uma solução de álcool benzílico (50 uL), triacetato de glicerol

(triacetin, 100 uL) e o corante cloreto de pinacianol (50 uL de 1 mg/mL em 80% de acetona) foi tratado com 30% de peróxido de hidrogênio (100 uL) e uma solução a 75 ppm de aciltransferase (100 uL). A fragrância característica de álcool benzílico foi detectada em 1 a 2 minutos. O corante foi comple25 tamente descolorizado dentro de 10 minutos. O odor desagradável de ácido peracético foi substancialmente mascarado pela fragrância. O experimento foi repetido com ciclo-hexilmetanol (50 uL) e resultou no branqueamento do corante e na formação de acetato de ciclohexilmetila fragrante. Um experimento controle no qual AcT foi omitido não resultou em significativa formação de fragrância ou branqueamento do co5 rante.

Uma solução de aciltransferase (1 mL de 10 ppm) foi adicionado a um pequeno retalho de tecido para amostra de malha de algodão (5x5 cm) e deixado para secar. A adição de 1 a 2 mL de solução de álcool benzílico (50 uL), triacetato de glicerol (triacetin, 100 uL), 30% de peróxido de hi10 drogênio (100 uL) e o corante cloreto de pinacianol (50 uL de 1 mg/mL em 80% de acetona) resultou na produção de acetato de benzila fragrante e branqueamento do corante.

A ordem de adição pode ser revertida por meio do que 1 a 2 mL de uma solução de álcool benzílico (50 uL), triacetato de glicerol (triacetin, 15 100 uL) e o corante cloreto de pinacianol (50 uL de 1 mg/mL em 80% de acetona) foi adicionada ao retalho de tecido para amostra de tecido e deixada para secar. A adição subsequente de AcT (1 mL de 10 ppm) e peróxido de hidrogênio (1 mL de 3%) resultou no branqueamento do corante de púrpura para incolor e o odor de acetato de benzila dentro de 10 minutos.

EXEMPLO 11

Acilação de Polióis com Tributirin em um Fundo de Detergente

A) Uma emulsão de tributirin (1% em v/v) e tetraetileno glicol (1 % em v/v) em tampão HEPES a 5 mM, pH 7,8 contendo 1,5 g/L de AATCC HDL foi preparada por mistura de vórtice meticuloso. Uma alíquota (200 uL) 25 desta mistura foi diluída 10 vezes por adição a 1,8 mL de tampão HEPES a 5 mM, pH 7,8 contendo 1,5 g/L de AATCC HDL e tratada com AcT (I0 ppm) em temperatura ambiente com agitação. Pequenas alíquotas (50 uL) foram retiradas em momentos definidos e diluídas em 20% de acetonitrila aquosa seguida por análise por LC/MS.

Análise por LC/MS foi realizada em um sistema de HPLC Surve

yor interfaceado para um espectrômetro de massa triplo quadripolar Quantum TSQ (ThermoFisher, San Jose, CA) operando em modo de electrospray positivo (+ve ESI). A coluna de HPLC usada foi uma coluna Agilent Zorbax SB-Aq C18 (100 x 2,1 mm). Os compostos foram elutriados usando um gradiente iniciando com Solvente A (formato de amônio a 25 mM em H2O) com quantidades crescentes de Solvente B (90% de metanol + 10% de solvente A), retornando para solvente A durante 10 minutos.

Inicialmente somente as duas matérias-primas foram observadas, tetraetileno glicol elutriando a 3,9 minutos com m/z de 212 e tributirin a 6,9 minutos com um m/z de 320. Ambos os compostos deram as proporções esperadas de m/z para seus adutos de íon amônio. Depois da adição da en10 zima AcT, foi observado um novo pico elutriando a 5,8 minutos com um m/z de 282, correspondendo ao éster monobutirílico de tetraetileno glicol (figura 3). Depois de agitação de um dia para o outro, o odor de ácido butírico foi claramente evidente.

B) O experimento acima foi repetido usando glicerol marcado 15 uniformemente com 13C (13C-U- glicerol) e tributirin. O substrato marcado isotopicamente permitiu discriminação entre glicerol (m/z 110), monobutirin (m/z 180) e dibutirin (m/z 250) derivado do doador de acila de tributirin, dos ésteres de butirato (m/z 183 e 253 para mono- e dibutirin respectivamente) formados por acilação do aceitador de acila marcado por glicerol (m/z 113). 20 Análise por LC/MS (figura 4) da mistura depois de incubação de

um dia para o outro mostra a formação de mono- e dibutirin marcados, em adição aos análogos não marcados.

EXEMPLO 12

Produção de Fragrância a partir de Tecido Manchado com Nata Sob Condições de Lavanderia

Retalhos de tecido para amostras de algodão manchados com nata foram lavados sob condições de lavanderia em um Terg-O- tometer (U.

S. Testing, Co. Inc. Hoboken, N. J.) na presença de uma Iipase e/ou Aciltransferase (AcT) mais um álcool aceitador com o objetivo de tanto reduzir a quantidade de ácidos graxos de cadeia curta livres (C4 a C8) e a criação de ésteres de ácidos graxos de cadeia curta de aroma agradável.

Retalhos de tecido para amostra manchados com nata (CFT CS10, Test Fabrics, Inc. West Pittston, PA, EUA) (6 por pote Terg de 1 L) foram tratados ou com nenhuma lipase, Lipex (Novozymes) (l,2 ppm) ou Lipomax (Genencor) (2 ppm) mais ou menos Aciltransferase (AcT) (2 ppm) em um fundo de (1,5 g/L) detergente líquido para limpeza pesada (AATCC HDL) em 5 tampão HEPES a 5 mM, pH 7,8, dureza de 6 gpg. Álcool benzílico (I g/L) foi adicionado a cada pote antes do período de lavagem de 30 minutos a 25°C (77°F).

retirada de cada pote e extraída com hexano (2 mL). A camada de hexano 10 foi separada da emulsão aquosa em uma centrífuga e 1 mL adicionado a frascos de cromatografia gasosa (GC). Análise por GC/MS foi conduzida com um Agilent 6890 GC/MS usando uma coluna de 30 m x 0,25 mm (filme de 0,25 um) HP-5MS. O método de GC/MS utilizou hélio como o gás de veículo (I ce/min) com uma temperatura da porta do injetor de 250°C e uma 15 proporção de divisão de 20:1. O programa de temperatura do forno iniciou com uma retenção de 1 min a 60°C, aumentando para 240°C a 20°C/min por um tempo de operação total de 10 minutos. O detector de massa foi iniciado em varredura 2 min pós injeção a partir de 30 até 400 AMU.

Tabela 7. Não foi detectado butirato de benzilaa quer nos potes controle (pote 1) ou controle + AcT (pote 2). Tanto Lipex quanto Lipomax somente produziram algum butirato de benzilaa com o precedente produzindo mais em ambos os momentos. A adição de AcT reforçou a quantidade de butirato de benzilaa produzido para ambas as lipases, mas o efeito foi bem maior para 25 Lipomax, sugerindo um forte efeito sinérgico.

Tabela 7: Formação de Benzila Butirato a partir de Algodão Manchado com Nata Sob Condições de Lavanderia

Tanto nos momentos 15 e 30 minutos, uma alíquota (8 mL) foi

Os resultados de GC/MS são mostrados na figura 5 e abaixo na

Benzila Butirato (área corr. da GC)

Condição Em branco Controle Controle + AcT

minutos 0

0

0

minutos 0

0

0 Condição

Lipex

Lipex + AcT Lipomax Lipomax + AcT

EXEMPLO 13

Benzila Butirato (área corr. da GC)

minutos 30 minutos

53000 32000

77000 59000

0 11000 170000 320000

Redução do Mau odor de Tecido Manchado por Nata Sob Condições de Lavanderia

Depois do experimento de lavagem descrito no Exemplo 12, os retalhos de tecido para amostra de algodão foram secados de um dia para o outro e avaliados subjetivamente para mau odor, resumido na Tabela 8. Tabela 8: Avaliação de Mau Odor sobre Tecido Sujo com Manteiga Depois da Lavagem

N0 do Condição Comentários Pote 1 Controle Amanteigado/neutro 2 Controle + AcT Amanteigado/neutro 3 Lipex Odor Rançoso/Podre 4 Lipex + AcT Odor Rançoso/Podre Lipomax Desagradável, porém menos do que retalhos de tecido para amostra dos potes n° 3 e n° 4 6 Lipomax + AcT Odor ligeiramente mais discreto, menos desagradável do que no. 5 O pior mau odor foi associado com os retalhos de tecido para 10 amostra tratados com Lipex. Retalhos de tecido para amostra tratados com Lipex foram significativamente menos podres, embora piores de controlar. Houve uma notável redução no mau odor nos retalhos de tecido para amostra tratados com Lipomax mais AcT, em comparação com Lipomax somente. EXEMPLO 14

Uso de KLM3' para Produzir Mono-oleato de Sorbitol a partir de Sorbitol e Gema de Ovo

Lipídeo acila transferase KLM3 mutante pLA231 foi testado por incubação em um sistema contendo gema de ovo e sorbitol por 4 horas a 40°C.

O produto da reação foi extraído com solvente orgânico e os Iipídeos isolados foram analisados por HPTLC e GLC/MS. Os resultados confirmam a capacidade do KLM3 mutante pLA 231 para produzir mono-oleato de sorbitol a partir de sorbitol e gema de ovo.

Na indústria de detergente sabe-se como usar sorbitol em diferentes formulações. Também é sabido que tecidos frequentemente contêm manchas oleosas incluindo gorduras/óleos e ovos.

Uma finalidade desta investigação foi estudar o efeito de um KLM3 mutante em uma mistura de sorbitol e gema de ovo com o objetivo de produzir um tensoativo para fins de limpeza.

Materiais e Métodos:

KLM3 variante pLA231: mutação W122A, A236E, L31F ( atividade: 1,6 TlPU/ml)

Sorbitol, 70% (Danisco)

Gema de Ovo: Gema de ovo pasteurizada da Hedegaard, DK 9560 Hadsund.

Mono-oleato de sorbitol componente de referência identificado da Grindsted SMO item no. 452454 HPTLC

Aplicador: Aplicador CAMAG AST4.

Placa de HPTLC: 20 x 10 cm (Merck no. 1.05641)

A placa foi ativada antes do uso por secagem em um forno a 160°C por 20 a 30 minutos.

Aplicação: 8,0 μΙ de lipídeos extraídos dissolvidos em Clorofórmio: Metanol (2:1) foi aplicado à placa de HPTLC usando aplicador AST4.

Tampão de Operação:4: Clorofórmio: Metanol: Água (74:26:4)

Tempo de Aplicação/Elutriação: 16 minutos.

Fluido de Desenvolvimento: 6% de Cupriacetato em 16% de H3PO4 Depois da elutriação, a placa foi seca em um forno a 160°C por

10 minutos, resfriada e imersa no fluido de desenvolvimento e em seguida seca adicionalmente em 6 minutos a 160°C. A placa foi avaliada visualmente e escaneada (Camag TLC scanner).

Análise por GLC

Cromatógrafo Gasoso Capilar Perkin Elmer Autosystem 9000 equipado com coluna de sílica fundida WCOT de 12,5 m x 0,25 mm de dimensões internas x 0,1 μ de espessura de filme de 5% de fenila-metilasilicone (CP Sila 8 CB da Chrompack).

Gás de Veículo: Hélio.

Inietor: injeção de divisão a frio PSSI (temp inicial 50°C aquecida até 385°C), volume de I1O μΙ Detector FlD: 395°C

Programa do Forno: 12 3

Temperatura do forno,°C. 90 280 350 Isotérmico, tempo, min. 1 0 10 Taxa da temperatura,°C/min. 15 4 Preparação da Amostra: Lipídeo extraído das amostras foram dissolvidos em

0,5 ml de Heptano: Piridina, a 2:1 contendo heptadecano padrão interno, 0,5 mg/ml. 300 μΙ de solução da amostra foi transferido para um frasco corrugado, 300 μΙ de MSTFA (N-Metila-N-trimetilsilila- trifluoraceamid) foi adicionado e reagido por 20 minutos a 60°C.

Experimental

KLM3 pLA 231 foi testado em um substrato de gema de ovo e sorbitol de acordo com a receita mostrada na Tabela 9.

Tabela 9:

Jour.2467-112 1 2 Gema de ovo g 0,67 0,67 Sorbitol, 70% g 0,33 0,33 KLM3, pLA 231, 1 TIPU/ml ml 0,1 água ml 0,1 Procedimento

Gema de ovo e sorbitol foram misturados com stirrer magnético

em uma vidraria ("dram glass") e aquecido até 50°C. A enzima foi adicionada e incubada por 4 horas a 50°C. A reação foi interrompida adicionando 7,5 ml de Clorofórmio: Metanol a 2,1 e misturando em um Whirley. Os lipídeos foram extraídos em um Rotamix (25 rpm) por 30 minutos e as amostras foram centrifugadas a 700 g por 10 minutos. 1 ml da fase de solvente foi extraído para análise por TLC e GLC/MS.

Resultados

A análise por HPTLC dos lipídeos das amostras 1 e 2 é mostrada na figura 7.

O cromatograma por HPTLC indica a formação de um componente polar o qual se espera que seja éster de sorbitol.

Para identificação adicional as amostras foram analisadas por

GLC /MS.

O cromatograma por GLC da amostra tratada com enzima (I) e da amostra controle (2) são mostrados nas figuras 8 e 9.

Espectros MS do pico de mono-oleato de sorbitol marcado na

figura 8 são mostrados na figura 10 e comparados com os espectros MS de mono-oleato de sorbitol.

Análise por HPTLC dos produtos da reação indicam que um componente polar foi formado durante a incubação. Análise por GLC/MS confirmou que se formou mono-oleato de sorbitol. Mono-oleato de sorbitol é um componente polar com propriedades ativas na superfície que agirão como um tensoativo em sistemas de água.

Todas as patentes e publicações mencionadas na especificação são indicativas dos níveis dos versados na ténica à qual a invenção diz res25 peito. Todas as patentes e publicações são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência na mesma extensão como se cada publicação individual fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por meio de referência.

Tendo descrito algumas modalidades da presente invenção, será evidente para aqueles com conhecimento regular da técnica que várias modificações podem ser feitas para as modalidades reveladas, e que se pretende que semelhantes modificações estejam dentro do escopo da presente invenção.

Os versados na técnica reconhecem prontamente que a presente invenção é bem adaptada para realizar os objetivos e obter as finalidades e vantagens mencionados, bem como os inerentes à mesma. As composi5 ções e métodos descritos aqui, são modalidades representativas, são exemplares, e não são pretendidas como limitações do escopo da invenção. É prontamente evidente para uma pessoa versada na técnica que variação de substituições e modificações podem ser feitas para a invenção revelada aqui, sem se afastar do escopo e do espírito da invenção.

A invenção descrita ilustrativamente aqui, pode ser praticada

convenientemente na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações as quais não são especificamente reveladas aqui, neste requerimento de patente. Os termos e expressões os quais foram empregados são usados como termos de descrição e não de limitação, e não há in15 tenção de no uso de tais termos e expressões excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções das mesmas, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Portanto, deve ser entendido que embora a presente invenção tenha sido especificamente revelada por meio de referência a al20 gumas modalidades e características opcionais, pode-se recorrer a modificação e variação dos conceitos revelados aqui, por aqueles versados na técnica, e que similares modificações e variações são consideradas como estando dentro do escopo desta invenção conforme definido pelas reivindicações anexadas.

A invenção foi descrita amplamente e genericamente aqui, neste

requerimento de patente. Cada uma das espécies mais limitadas e agrupamentos subgenéricos que estão dentro da descoberta genérica também formam parte da invenção. Isto inclui a descrição genérica da invenção com uma condição ou limitação negativa removendo qualquer tema do gênero, 30 independente de se ou não o material excisado é especificamente mencionado aqui, neste requerimento de patente.

Claims (23)

1. Composição para produzir um éster fragrante, compreendendo os seguintes componentes: a) uma SGNH aciltransferase, b) um substrato alcoólico para a referida SGNH aciltransferase, e c) um doador de acila; em que a referida SGNH aciltransferase catalisa transferência de um grupamento acila do referido doador de acila para o referido substrato alcoólico para produzir um éster fragrante em um ambiente aquoso.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a referida composição é uma composição aquosa que compreende adicionalmente o referido éster fragrante.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o referido substrato alcoólico e o referido doador de acila são escolhidos para produzir um éster fragrante particular.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o referido doador de acila é um doador de acila C\ a Cio

5. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a referida SGNH aciltransferase é imobilizada sobre um suporte sólido.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a referida composição é uma composição desidratada, e em que o referido éster fragrante é produzido na re-hidratação da referida composição.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a referida composição é um gênero alimentício.

8. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a referida composição é uma composição de limpeza compreendendo no mínimo um tensoativo.

9. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a referida composição é uma composição de limpeza compreendendo uma fonte de peróxido de hidrogênio.

10. Método para produzir um éster fragrante, compreendendo combinar: a) uma SGNH aciltransferase, b) um substrato alcoólico para a referida SGNH aciltransferase, e c) um doador de acila; em que a referida SGNH aciltransferase catalisa transferência de um grupamento acila do referido doador de acila para o referido substrato alcoólico para produzir o referido éster fragrante.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o referido substrato alcoólico e o referido doador de acila são selecionados para produzir um éster fragrante particular.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o referido doador de acila é um doador de acila C2 a CIO.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o referido método compreende re-hidratar os referidos componentes depois deles serem combinados.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a referida re-hidratação ocorre durante mastigação.

15. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a referida SGNH aciltransferase, o referido substrato alcoólico e o referido doador de acila são combinados em um ambiente aquoso.

16. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a referida SGNH aciltransferase é imobilizada sobre um suporte sólido.

17. Método para a produção simultânea de um agente alvejante e uma fragrância compreendendo: combinar: a) uma SGNH acila transferase, b) um substrato alcoólico para a referida SGNH aciltransferase, e c) um doador de acila; em que a referida SGNH aciltransferase catalisa transferência de um grupamento acila do referido doador de acila para o referido substrato alcoólico para produzir a referida fragrância e o referido agente alvejante.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o referido agente alvejante é um perácido.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o referido perácido é ácido peracético.

20. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a referida SGNH aciltransferase é aciltransferase de M. smegmatis.

21. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a referida fragrância é um éster.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o referido éster é um éster C2 a C6 de um álcool primário.

23. Método de acordo com a reivindicação 17, em que aplicação do referido agente alvejante a uma mancha resulta na remoção da referida mancha.