JP5604032B2 - 食用油の酵素的脱ガム方法 - Google Patents

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Description

本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを使用して食用油を酵素的に脱ガムする方法に関する。
本発明はさらに、一又は二以上の脂質アシルトランスフェラーゼに関する。
本発明はさらに、食用油の脱ガムにおける脂質アシルトランスフェラーゼの使用に関する。
伝統的に、油の脱ガムについては物理的脱ガム及び化学的脱ガム工程という二つの工程が使用されてきた。１９９０年代に遡ると酵素的脱ガム工程は膵臓由来のホスホリパーゼの使用により発展してきた。この酵素はコーシャーではなかったので、ホスホリパーゼは微生物由来のホスホリパーゼＡ１に置き換えられた。酵素的工程は化学的、若しくは物理的脱ガム工程に比べ経費削減、より高い収率、そしてより環境にやさしい工程であることを含め、いくつかの利点がある。
以下の関連文献、即ち、１９９９年７月２０日に出願された米国特許出願第０９／７５０，９９０号、米国特許出願第１０／４０９，３９１号、ＷＯ２００４／０６４５３７、ＷＯ２００４／０６４９８７、ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００４３７８及びＰＣＴ／ＩＢ２００４／００４３７４を参照されたい。これらの出願の各々、及びこれらの出願の各々において引用されたそれぞれの文書（「出願引用文書」）、及び明細書中でも、若しくはこれらの出願の手続き中のいずれにおいても、並びにそのような手続き中に提出された特許性を支持するすべての意見書（argument）を参照により、本明細書に援用する。様々な文書がまた、本明細書でも引用されている（「本願引用文書」）。本願引用文書の各々、及び本願引用文書中で引用又は参照された各文書を参照により本明細書に援用する。
第一の態様では、本発明は、ここに定義されているとおり脂質アシルトランスフェラーゼを使用した植物油又は食用油を酵素的に脱ガムする方法を提供する。
本発明は、また、リン脂質の大部分を除去することについての本発明による脂質アシルトランスフェラーゼで食用又は植物油を処理することを含む、植物又は食用油の酵素的脱ガムの工程を提供する。
本発明はまた、リン脂質の大部分からアシル基を、一又は二以上のアシル受容体に、例えば一又は二以上のステロール及び／又はスタノールに転移するために、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼで食用油又は植物油を処理することを含む、植物又は食用油の酵素的脱ガムの工程を提供する。
別の態様では、本発明は１又は二以上の脂質アシルトランスフェラーゼを提供する。
一態様では、本発明は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼを提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を、或いは配列番号１６と７５％若しくはそれ以上、好ましくは８５％若しくはそれ以上、より好ましくは９０％若しくはそれ以上、さらにより好ましくは９５％若しくはそれ以上、さらにより好ましくは９８％若しくはそれ以上、又はさらにより好ましくは９９％若しくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼを提供する。
さらに別の実施態様では、本発明は、（i）リン脂質（ホスファチジルコリンなどの）を除去するために、並びに／或いは（ii）油におけるステロールエステル及び／又はスタノールエステルの形成を増加させるために、並びに／或いは（iii）実質的に油における遊離脂肪酸を増加させることなく、リン脂質（ホスファチジルコリンなどの）を除去するために、及び／又は油におけるステロールエステル及び／若しくはスタノールエステルの形成を増加させるために、食用油の脱ガムにおける脂質アシルトランスフェラーゼの使用を提供する。
本発明において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、天然脂質アシルトランスフェラーゼであり、又は脂質アシルトランスフェラーゼの変異体である。
例えば、本発明の方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、例えばＷＯ２００４／０６４５３７、ＷＯ２００４／０６４９８７、ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００４３７８、又はＧＢ０５１３８５９．９に記述されているうちの一つである。
本明細書で使用される「脂質アシルトランスフェラーゼ」なる用語は、アシルトランスフェラーゼ活性（一般的にはＥ．Ｃ．２．３．１．ｘと分類されている）を意味し、酵素は、アシル基を脂質から一又は二以上の受容体基質へ転移することができ、受容体基質は、ステロール、スタノール、炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット、グリセロールから選択される１又は２以上のものであり、好ましくはステロール及び／又はスタノールである。
好ましくは、本発明による、又は本発明の方法及び／若しくは使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル基を脂質（本明細書で定義される）から一又は二以上の以下のアシル受容体基質、即ちステロール又はスタノール、好ましくはステロールに、転移することができる。
いくつかの態様では、本発明による「アシル受容体」は、例えば、グリセロ−ルを含む多価アルコール等のヒドロキシ基（−ＯＨ）を含む化合物と、ステロールと、スタノールと、炭水化物と、フルーツ酸、クエン酸、酒石酸、酪酸及びアスコルビン酸を含むヒドロキシ酸と、タンパク質又は、例えばアミノ酸、加水分解タンパク質、ペプチド（部分的に分解されたタンパク質）のようなタンパク質のサブユニット及びそれらの混合物又は派生物である。好ましくは、本発明による「アシル受容体」は、水ではない。
アシル受容体は、好ましくはモノグリセリドでない。
一態様では、本発明による、又は本発明の方法及び／若しくは使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル基を脂質からステロール及び／又はスタノールに転移(transfer)できると同様、加えて、アシル基を脂質から、炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット、グリセロールのうち１又は２以上に転移できる。
好ましくは、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼが作用する脂質基質は、一又は二以上の以下の脂質、例えばホスファチジルコリンなどのレシチンのようなリン脂質である。
この脂質基質は、本明細書では「脂質アシル供与体(lipid acyl donor)」と呼ばれる。本明細書で使われるレシチンという用語は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン及び、ホスファチジルグリセロールを含む。
いくつかの態様では、好ましくは、本発明による、又は本発明の方法及び／若しくは使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼが作用する脂質基質は、例えばホスファチジルコリンなどのレシチンのようなリン脂質である。
いくつかの態様では、好ましくは、本発明による、又は本発明の方法及び／若しくは使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリド及び／又は１−モノグリセリド及び／又は２−モノグリセリドには作用することができない、或いは実質的に作用することができない。
好適には、本発明による、又は本発明の方法及び／若しくは使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、一又は二以上の、以下のホスホリパーゼ活性、即ちホスホリパーゼＡ２活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）又はホスホリパーゼＡ１活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）を示す。
好適には、いくつかの態様では、本発明による、又は本発明の方法及び／若しくは使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル基をリン脂質からステロール及び／又はスタノールに転移することができる。
いくつかの態様では、好ましくは、本発明による、又は本発明の方法及び／若しくは使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル基をリン脂質から、少なくともステロールエステル又は／及びスタノールエステルを形成するように、ステロール及び／又はスタノールに転移することができる。
いくつかの態様では、好ましくは、本発明による、又は本発明の方法及び／若しくは使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、トリアシルグリセロールリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を示さず、若しくは有意なトリアシルグリセロールリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を示さない。
本発明による、又は本発明の方法及び／若しくは使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル基をリン脂質からステロール及び／又はスタノールに転移することができる。それゆえ、一実施形態では、本発明による「アシル受容体」はステロール、又はスタノール、又はステロールとスタノール両方の組合せのいずれかである。
好ましくは、本発明による、又は本発明の方法及び／若しくは使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の基準、即ち、
（i） 酵素が、脂質アシル供与体の元のエステル結合のアシル部分が、新しいエステルを形成するためにアシル受容体に転移される、エステル転移活性として定義されるアシルトランスフェラーゼ活性を有すること、
（ii）酵素が、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含み、Ｘが、以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、又はＳの一又は二以上であること、
を使用することで特徴づけられる。
好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのＸは、Ｌ又はＹである。より好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのＸは、Ｌである。それゆえ、好ましくは、本発明による酵素はアミノ酸配列モチーフＧＤＳＬを含む。
ＧＤＳＸモチーフは、４つの保存されたアミノ酸で構成されている。好ましくは、モチーフ内のセリンは脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の触媒作用的セリンである。好適には、ＧＤＳＸモチーフのセリンは、Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Apr.1996, Vol.178,No.7, p2060-2064)に教示されているアエロモナス・ハイドロフィラの脂肪分解性酵素におけるセリン−１６に相当するポジションである。
タンパク質が、本発明によるＧＤＳＸモチーフを有するかどうかを決定するために、配列は、ＷＯ２００４／０６４５３７又はＷＯ２００４／０６４９８７に教示されている手順によりｐｆａｍデータベースの隠れマルコフモデルプロファイル(hidden markov model profiles)(HMM profiles)と、好ましくは比較される。
Ｐｆａｍは、タンパク質のドメインファミリーのデータベースである。Ｐｆａｍは新しい配列におけるこれらのドメインを同定するため、プロファイル隠れマルコフモデル(profiles HMMs)とともに、各々のファミリーの、管理された配列多重アラインメント（curated multiple sequence alignments）を含む。Ｐｆａｍの紹介は、Bateman A et al.(2002) Nucleic Acids Res. 30;276-280で見ることができる。隠れマルコフモデルは、タンパク質を分類することを目的とするいくつかのデータベースで使用されており、概説としては、Bateman A and Haft DH(2002) Brief Bioinform 3;236-245を参照。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list uids=12230032&dopt=Abstract
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list uids=11752314&dopt=Abstract
隠れマルコフモデルと、それらがＰｆａｍデータベースにどのように適用されているかについての詳細な説明は、Durbin R, Eddy S, Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4を参照せよ。ハンマー（Hammer）ソフトウェアパッケージが、Washington University, St Louis, USA より入手できる。
或いは、ＧＤＳＸモチーフは、ハンマーソフトウェアパッケージによっても同定されることができ、その使用説明は、Durbin R, Eddy S,and Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4及びその参照文献、及び仕様書において提供されるＨＭＭＥＲ２プロファイルにおいて提供される。
ＰＦＡＭデータベースは、例えば、現在以下のウェブサイトにあるいくつかのサーバーを通じてアクセスできる。
http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml
http://pfam.wustl.edu/
http://pfam.jouy.inra.fr/
http://pfam.cgb.ki.se/
データベースは、タンパク質配列を入力することができる検索機能を提供している。データベースのデフォルトパラメーター（default parameters）を使用し、タンパク質配列は、その後Ｐｆａｍドメインの存在について分析される。ＧＤＳＸドメインは、データベースにおいて確立したドメインであり、いかなるクエリー配列（query sequence）においても、その存在は認識されるであろう。データベースは、クエリー配列に対してｐｆａｍ００６５７共通配列のアラインメント（alignment）を返答してくるであろう。
好ましくは、本発明の方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、Ｐｆａｍ００６５７共通配列を使用してアライン（align）されることができる（詳述については、ＷＯ２００４／０６４５３７又はＷＯ２００４／０６４９８７を参照せよ）。
好ましくは、ｐｆａｍ００６５７ドメインファミリーの、隠れマルコフモデルプロファイル(HMM profile)との肯定的な適合（positive match）は、本発明によるＧＤＳＬ又はＧＤＳＸドメインの存在を示すものである。
好ましくは、Ｐｆａｍ００６５７共通配列とアラインした場合には、本発明の方法又は使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、少なくとも１つ、好ましくは２以上の、好ましくは３以上の、以下のようなＧＤＳｘブロック（block）、ＧＡＮＤＹブロック、ＨＰＴブロックを有する。好適には、脂質アシルトランスフェラーゼは、ＧＤＳｘブロック及びＧＡＮＤＹブロックを有する。或いは、酵素は、ＧＤＳｘブロック、及びＨＰＴブロックを有する。好ましくは、酵素は少なくともＧＤＳｘブロックを含む。
好ましくは、ＧＡＮＤＹモチーフの残基は、ＧＡＮＤＹ、ＧＧＮＤＡ、ＧＧＮＤＬ、最も好ましくはＧＡＮＤＹから選択される。
好ましくは、Ｐｆａｍ００６５７共通配列とアラインした場合には、本発明の方法又は使用において使われる酵素は、アエロモナス・ハイドロフィラのポリペプチド配列との照会、即ち、配列番号１：２８ｈｉｄ，２９ｈｉｄ，３０ｈｉｄ，３１ｈｉｄ，３２ｇｌｙ，３３Ａｓｐ，３４Ｓｅｒ，３５ｈｉｄ，１３０ｈｉｄ，１３１Ｇｌｙ，１３２Ｈｉｄ，１３３Ａｓｎ，１３４Ａｓｐ，１３５ｈｉｄ，３０９Ｈｉｓと比較したときに、少なくとも１つ、好ましくは２以上、好ましくは３以上、好ましくは４以上、好ましくは５以上、好ましくは６以上、好ましくは７以上、好ましくは８以上、好ましくは９以上、好ましくは１０以上、好ましくは１１以上、好ましくは１２以上、好ましくは１３以上、好ましくは１４以上、好ましくは１５以上のアミノ酸残基を有する。
ｐｆａｍ００６５７ＧＤＳＸドメインは、他の酵素からこのドメインを有するタンパク質を識別するユニークな鑑定者（identifier）である。
ｐｆａｍ００６５７共通配列は、図１２に配列番号２として示されている。これは、本明細書ではｐｆａｍ００６５７．６としても言及されている、ｐｆａｍファミリー００６５７、データベースｖｅｒｓｉｏｎ６の同定から得られる。
共通配列は、ｐｆａｍデータベースの追加のリリース（further releases）（例えばＷＯ２００４／０６４５３７又はＷＯ２００４／０６４９８７を参照せよ）を使用することで更新される。
ＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ、及びＨＰＴブロックの存在は、双方のデータベースのリリースによりｐｆａｍファミリー００６５７に見出される。ｐｆａｍデータベースの将来的なリリースは、ｐｆａｍファミリー００６５７を同定するのに使用されることができる。
一実施形態では、本発明の方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の基準、即ち、
（ｉ）酵素が、脂質アシル供与体の元のエステル結合のアシル部分が、新しいエステルを形成するためにアシル受容体に転移される、エステル転移活性として定義されるアシルトランスフェラーゼ活性を有すること、
（ii）酵素が、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含み、Ｘが、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、又はＳから選択される１又は２以上のアミノ酸残基であること、
（iii）酵素が、Ｈｉｓ-３０９を含み、或いは図１１及び１３（配列番号１又は配列番号３）に示されるアエロモナス・ハイドロフィラ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の、Ｈｉｓ-３０９位に相当するポジションにヒスチジン残基を含むこと、
を使用することで特徴づけられる。
好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのアミノ酸残基はＬである。
配列番号３又は配列番号１における最初の１８アミノ酸残基は、シグナル配列を形成する。シグナル配列を含むタンパク質である完全長配列のＨｉｓ-３０９は、タンパク質の成熟部分の、即ちシグナル配列を含まない配列の、Ｈｉｓ-２９１に一致する。
一実施形態では、本発明の方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素が、以下の触媒三つ組（catalytic triad）、Ｓｅｒ-３４、Ａｓｐ-１３４及びＨｉｓ-３０９を含み、或いは図１３（配列番号３）、又は図１１（配列番号１）に示される、アエロモナス・ハイドロフィラ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素におけるＳｅｒ-３４、Ａｓｐ-１３４及びＨｉｓ-３０９に相当するポジションにおいて、それぞれセリン残基、アスパラギン酸残基及びヒスチジン残基を含む。上述のように、配列番号３又は配列番号１に示される配列において、最初の１８アミノ酸残基は、シグナル配列を形成する。シグナル配列を含むタンパク質である、完全長配列のＳｅｒ-３４、Ａｓｐ-１３４及びＨｉｓ-３０９は、タンパク質の成熟部分の、即ちシグナル配列を含まない配列の、Ｓｅｒ-１６、Ａｓｐ-１１６及びＨｉｓ-２９１に一致する。図１２（配列番号２）で示されるｐｆａｍ００６５７共通配列において、活性部位残基は、Ｓｅｒ-７、Ａｓｐ-１５７及びＨｉｓ-３４８に相当する。
一実施形態では、本発明の方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の基準、即ち、
（ｉ）酵素が、一番目の脂質アシル供与体の元のエステル結合のアシル部分が、新しいエステルを形成するためにアシル受容体に転移される、エステル転移活性として定義されうるアシルトランスフェラーゼ活性を有すること、
及び、
（ii）酵素は、少なくとも、Ｇｌｙ-３２、Ａｓｐ-３３、Ｓｅｒ-３４、Ａｓｐ-１３４及びＨｉｓ-３０９を含み、或いは図１３（配列番号３）若しくは図１１（配列番号１）に示される、アエロモナス・ハイドロフィラ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素においては、Ｇｌｙ-３２、Ａｓｐ-３３、Ｓｅｒ-３４、Ａｓｐ-１３４、及びＨｉｓ-３０９に相当するポジションにおいてそれぞれ、グリシン、アスパラギン酸、セリン、アスパラギン酸、及びヒスチジン残基を含むこと、
を使用することで特徴づけられる。
好適には、本発明の方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、一又は二以上の以下のアミノ酸配列、即ち、
（ｉ） 配列番号３（図１３参照）に示されるアミノ酸配列
（ii） 配列番号４（図１４参照）に示されるアミノ酸配列
（iii） 配列番号５（図１５参照）に示されるアミノ酸配列
（iv） 配列番号６（図１６参照）に示されるアミノ酸配列
（ｖ） 配列番号７（図１７参照）に示されるアミノ酸配列
(vi) 配列番号８（図１８参照）に示されるアミノ酸配列
(vii) 配列番号９（図１９参照）に示されるアミノ酸配列
(viii) 配列番号１０（図２０参照）に示されるアミノ酸配列
(ix) 配列番号１１（図２１参照）に示されるアミノ酸配列
(ｘ) 配列番号１２（図２２参照）に示されるアミノ酸配列
(xi) 配列番号１３（図２３参照）に示されるアミノ酸配列
(xii) 配列番号１４（図２４参照）に示されるアミノ酸配列
(xiii) 配列番号１ （図１１参照）に示されるアミノ酸配列
(xiv) 配列番号１５（図２５参照）に示されるアミノ酸配列
を、
或いは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５に示される配列のいずれか１つと７５％若しくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を、含む。
好適には、本発明の方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号３又は配列番号４又は配列番号１又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列のいずれかを有し、或いは、配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１５に示されるアミノ酸配列と、７５％若しくはそれ以上、好ましくは８０％若しくはそれ以上、好ましくは８５％若しくはそれ以上、好ましくは９０％若しくはそれ以上、好ましくは９５％若しくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
好適には、本発明の方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、又は配列番号１５に示される配列のいずれか１つと８０％若しくはそれ以上、好ましくは８５％若しくはそれ以上、より好ましくは９０％若しくはそれ以上、及びさらにより好ましくは９５％若しくはそれ以上、同一性を有するアミノ酸配列を含む。
好適には、本発明の方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、一又は二以上の以下のアミノ酸配列、即ち、
（ａ）配列番号３又は配列番号１の１〜１００位のアミノ酸残基に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号３又は配列番号１の１０１〜２００位のアミノ酸残基に示されるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号３又は配列番号１の２０１〜３００位のアミノ酸残基に示されるアミノ酸配列、又は、
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）に定義されたアミノ酸配列のいずれか１つと、７５％若しくはそれ以上、好ましくは８５％若しくはそれ以上、より好ましくは９０％若しくはそれ以上、さらにより好ましくは９５％若しくはそれ以上の、同一性を有するアミノ酸配列、
を含む。
好適には、本発明の方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、一又は二以上の以下のアミノ酸配列、即ち、
（ａ） 配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基２８〜３９位に示されるアミノ酸配列、
（ｂ） 配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基７７〜８８位に示されるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基１２６〜１３６位に示されるアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基１６３〜１７５位に示されるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号３又は配列番号１のアミノ酸残基３０４〜３１１位に示されるアミノ酸配列、又は、
（ｆ）上記（ａ）〜（ｅ）に定義されたアミノ酸配列のいずれか１つと、７５％若しくはそれ以上、好ましくは８５％若しくはそれ以上、より好ましくは９０％若しくはそれ以上、さらにより好ましくは９５％若しくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列、
を含む。
一態様では、本発明の方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、ＥＰ１２７５７１１で教示されている、カンジダ・パラプシロシス由来の脂質アシルトランスフェラーゼである。それゆえ、一態様では、本発明の方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号１７（図２８）、又は配列番号１８（図２９）で教示されるアミノ酸配列のうちの１つを含む、脂質アシルトランスフェラーゼである。
さらに好ましくは、本発明の方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号１６（図１０）に示されるアミノ酸配列を含み、或いは７５％若しくはそれ以上、好ましくは８５％若しくはそれ以上、より好ましくは９０％若しくはそれ以上、さらに好ましくは９５％若しくはそれ以上、さらにより好ましくは９８％若しくはそれ以上、さらにより好ましくは９９％若しくはそれ以上、配列番号１６と同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。この酵素は、酵素の変異体が考慮される。
一態様では，本発明の方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、又はその変異体（例えば、分子進化により作られた変異体）である。
好適なＬＣＡＴは、当業界に知られており、例えば、以下の、哺乳類、ラット、マウス、ニワトリ、黄色ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、シロイヌナズナ及びイネを含む植物、線虫、真菌、酵母などの生物の一又は二以上から得られる。
一実施形態では、本発明の方法及び使用に使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、それぞれアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１２０４及びＮＣＩＭＢ４１２０５により、２００３年１２月２２日にNational Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria（ＮＣＩＭＢ）、23 St.マハル通り、アバディーン、スコットランド、ＧＢにおいて特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の下に、Danisco A/S社 Langebrogade 1, DK-1001 Copenhagen K,デンマークより寄託されたpPet12aAhydro、及びpPet12aASalmoをハーバリングしている大腸菌株TOP 10から得られる、好ましくは得られた脂質アシルトランスフェラーゼである。
非常に好まれて本発明の方法に使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、アエロモナス種から単離されたものを含み、好ましくは、アエロモナス・ハイドロフィラ又はアエロモナス・サルモニシダであり、最も好ましくはアエロモナス・サルモニシダである。最も好まれて本発明において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号１、３、４、１５、１６によりコードされるものである。アシルトランスフェラーゼのシグナルペプチドがトランスフェラーゼの発現の間に切断されていることが好ましいことは、当業者に認識されるであろう。配列番号１、３、４、１５、及び１６のシグナルペプチドは、アミノ酸１〜１８位である。したがって、最も好ましい領域は、配列番号１及び配列番号３（アエロモナス・ハイドロフィラ）のアミノ酸１９〜３３５位、並びに配列番号４、配列番号１５、及び配列番号１６（アエロモナス・サルモニシダ）のアミノ酸１９〜３３６位である。アミノ酸配列の同一性の相同性を決定するために使用される場合は、本明細書で記述されているアラインメントは成熟配列を使用することが好ましい。
したがって、相同性（同一性）を決定する最も好ましい領域は、配列番号１及び配列番号３（アエロモナス・ハイドロフィラ）のアミノ酸１９〜３３５位、並びに配列番号４、１５、及び１６（アエロモナス・サルモニシダ）のアミノ酸１９〜３３６位である。配列番号３４及び３５は、それぞれアエロモナス・ハイドロフィラとアエロモナス・サルモニシダ由来の、非常に好まれる脂質アシルトランスフェラーゼの成熟タンパク質配列である。
本発明において使われる脂質アシルトランスフェラーゼはまた、サーモビフィダ、好ましくはサーモビフィダ・フスカ、最も好ましくは配列番号２８によってコード化されているものから単離される。
本発明において使われる脂質アシルトランスフェラーゼはまた、ストレプトマイセス、好ましくはストレプトマイセス・アベルミチリス、最も好ましくは、配列番号３２によってコード化されているものから単離される。ストレプトマイセス由来の本発明において使われる他の可能性のある酵素は、配列番号５、６、９、１０、１１、１２、１３、１４、３１、３３によってコード化されているものを含む。実施例は、配列番号３３でコード化されている酵素は、酵素的脱ガムにおいて高度に効果的であることを示している。
本発明において使われる酵素はまた、コリネバクテリウム、好ましくはコリネバクテリウム・エフィシェンス、最も好ましくは、配列番号２９によってコード化されているものから単離される。
好適には、本発明による方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号３７、３８、４０、４１、４３、４５若しくは４７で示されるアミノ酸配列のうちいずれか１つを、又はこれらの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは、配列番号３６、３９、４２、４４、４６、若しくは４８に示されるヌクレオチド配列のうちいずれか１つにより、又はこれらの配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、若しくは９８％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコード化されている脂質アシルトランスフェラーゼである。
好ましくは、本発明による方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、少なくともガラクト脂質を加水分解することができ、且つ／或いはアシル基を、少なくともガラクト脂質から一又は二以上のアシル受容体基質に転移することができる、脂質アシルトランスフェラーゼであり、酵素は、ストレプトマイセス種から得ることができる、好ましくは得られたものである。
一実施形態では、本発明による方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、好ましくは、少なくともガラクト脂質を加水分解することができ、且つ／或いはアシル基を少なくともガラクト脂質から一又は二以上のアシル受容体基質に転移することができる脂質アシルトランスフェラーゼであり、酵素は、以下よりなる群、即ち、
ａ）配列番号３６に示されるヌクレオチド配列を含む核酸、
ｂ） 遺伝子コードの変性により、配列番号３６のヌクレオチド配列と関連している核酸、及び
ｃ）配列番号３６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸、
から選択される核酸によりコード化されている。
一実施形態では、本発明の方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、好ましくは、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を、又はこの配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。
別の実施形態では、本発明による方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、好ましくは、少なくともガラクト脂質を加水分解することができ、且つ／或いはアシル基を少なくともガラクト脂質から一又は二以上のアシル受容体基質に転移することができる、脂質アシルトランスフェラーゼであり、酵素は、配列番号３７に示されるアミノ酸配列、又はこの配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
好ましくは、本発明による方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、少なくともガラクト脂質を加水分解することができ、且つ／或いはアシル基を少なくともガラクト脂質から一又は二以上のアシル受容体基質にアシル基を転移することができる、脂質アシルトランスフェラーゼであり、酵素は、サーモビフィダ種、好ましくはサーモビフィダ・フスカから得ることができる、好ましくは得られたものである。
好ましくは、本発明による方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、少なくともガラクト脂質を加水分解することができ、且つ／或いはアシル基を少なくともガラクト脂質から一又は二以上のアシル受容体基質に、転移することができる脂肪分解酵素であり、酵素は、コリネバクテリウム種、好ましくはコリネバクテリウム・エフィシェンスから得ることができる、好ましくは得られたものである。
追加的な実施形態では、本発明による方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号３７、３８、４０、４１、４３、４５、若しくは４７で示されるアミノ酸配列のうちいずれか１つを、又はこれらの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは、配列番号３９、４２、４４、４６、若しくは４８に示されるヌクレオチド配列のうちいずれか１つにより、又はこれらの配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、若しくは９８％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコード化されている脂質アシルトランスフェラーゼである。
追加的な実施形態では、本発明による方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号３８、４０、４１、４５、若しくは４７で示されるアミノ配列のうちいずれか１つを、又は本明細書で記述されている使用のためのこれらの配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。
追加的な実施形態では、本発明による方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号３８、４０、若しくは４７で示されるアミノ酸配列のうちいずれか１つを、又は本明細書で記述されている使用のためのこれらの配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。
より好ましくは一実施形態では、本発明による方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号４７で示されるアミノ酸配列を、又はこの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。
別の実施形態では、本発明による方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号４３若しくは４４で示されるアミノ酸配列を、又はこれらの配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。
別の実施形態では、本発明による方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号４１で示されるアミノ酸配列を、又はこの配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、若しくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。
一実施形態では、本発明による方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、少なくともガラクト脂質を加水分解することができ、且つ／或いはアシル基を、少なくともガラクト脂質から一又は二以上のアシル受容体基質に転移することができる、脂質アシルトランスフェラーゼであり、酵素は、以下よりなる群、即ち、
ａ）配列番号３６に示されるヌクレオチド配列を含む核酸、
ｂ）遺伝子コードの変性により、配列番号３６のヌクレオチド配列と関連をもつ核酸、及び
ｃ）配列番号３６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性があるヌクレオチド配列を含む核酸、
から選択される核酸によりコード化されている。
一実施形態では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、それぞれアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１２２６及びＮＣＩＭＢ４１２２７により、２００４年６月２５日にＮＣＩＭＢ（National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria）、23 St.マハル通り、アバディーン、スコットランド、ＧＢにおいて特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の下に、Danisco A/S社 Langebrogade 1, DK-1001 Copenhagen K,デンマークより寄託されたストレプトマイセス株Ｌ１３０若しくはＬ１３１から得られる、好ましくは得られた脂質アシルトランスフェラーゼである。
本発明による及び／又は本発明の方法における使用のための脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、且つ／又は以下のヌクレオチド配列によりコード化されている、
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコード化するポリヌクレオチド（配列番号１６）
本発明の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１７）である。
本発明の方法において使われる好適な脂質アシルトランスフェラーゼは、デフォルト設定を使用したベクターＮＴＩ（VectorNTI）のクラスタルＷ．ペアワイズアラインメントアルゴリズム（Clustal W pairwise alignment algorithm）のアラインＸを使用して、Ｌ１３１（配列番号３７）についてのアラインメントにより同定される。
Ｌ１３１のアラインメント、並びにストレプトマイセス・アベルミチリス及びサーモビフィダ・フスカ由来の相同物は、ＧＤＳｘモチーフ（Ｌ１３１、及びストレプトマイセス・アベルミチリス、及びサーモビフィダ・フスカにおけるＧＤＳＹ）と、ＧＧＮＤＡ又はＧＧＮＤＬのいずれかであるＧＡＮＤＹボックスと、ＨＰＴブロック（保存された触媒的ヒスタジン）との保存を説明するものである。これらの三つの保存されたブロックは、図６１にハイライトされている。
ｐｆａｍＰｆａｍ００６５７共通配列（ＷＯ０４／０６４９８７に記述されているように）、及び／又は本明細書に開示されている（配列番号３７）Ｌ１３１の配列のいずれかとアラインした場合、三つの保存されたブロックである、ＧＤＳｘブロック、ＧＡＮＤＹブロック、及びＨＴＰブロックを同定することが可能である（より詳細は、ＷＯ０４／０６４９８７を参照せよ）。
ＰｆａｍＰｆａｍ００６５７共通配列（ＷＯ０４／０６４９８７に記述されているように）及び／又は本明細書に開示されている（配列番号３７）Ｌ１３１の配列のいずれかとアラインした場合、
i） 本発明の、又は本発明の方法において使われる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、好ましくはＧＤＳｘモチーフを、より好ましくはＧＤＳＬ若しくはＧＤＳＹモチーフから選択されるＧＤＳｘモチーフを有し、
且つ／又は
ii）本発明の、又は本発明の方法において使われる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、好ましくはＧＡＮＤＹブロックを、より好ましくはアミノ基ＧＧＮＤｘで、より好ましくはＧＧＮＤＡ若しくはＧＧＮＤＬを含む、ＧＡＮＤＹブロックを有し、
且つ／又は
iii）本発明の、又は本発明の方法において使われる酵素は、好ましくはＨＴＰブロックを有し、
且つ好ましくは、
iv）本発明の、又は本発明の方法において使われるガラクトリパーゼ／脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、好ましくはＧＤＳｘ又はＧＤＳＹモチーフ、及びアミノ基ＧＧＮＤｘで、好ましくはＧＧＮＤＡ若しくはＧＧＮＤＬを含むＧＡＮＤＹブロック、及びＨＴＰブロック（保存されたヒスタジン）を有する。
本発明による方法又は使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、脂質アシルトランスフェラーゼの変異体である場合、酵素は、酵素がアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含み、Ｘが、以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、又はＳの一又は二以上であり、酵素の変異体が、セット２、又はセット４、又はセット６又はセット７（定義は後述）において定義されるアミノ酸残基のいずれか一又は二以上の箇所で親配列と比較した場合に、一又は二以上のアミノ酸の改変を含んでいる、ということで特徴づけられる。
例えば、本発明の方法又は使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼの変異体は、酵素が、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含み、Ｘが、以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、又はＳの一又は二以上であり、酵素の変異体が、本明細書で教示されている１ＩＶＮ．ＰＤＢ及び／又は１ＤＥＯ．ＰＤＢとｐ１０４８０の結晶構造座標（crystal structure coordinates）の構造アラインメントにより好ましくは得られる、本明細書で定義されるｐ１０４８０構造モデル（structural model）と構造的にアラインされている前記親配列により同定されるセット２、又はセット４、又はセット６、又はセット７（定義は後述）において詳細に記述されるアミノ酸残基のいずれか一又は二以上の箇所で親配列と比較した場合に、一又は二以上のアミノ酸の改変を含んでいる、ということで特徴づけられる。
追加的な実施形態では、発明の方法又は使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼの変異体は、酵素が、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含み、Ｘが、以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、又はＳの一又は二以上であり、酵素の変異体が、前記親配列がｐｆａｍ共通配列（配列番号２−図１２）にアラインしたとき、また本明細書で教示されているベストフィットオーバーラップ（best fit overlap）（図３０を参照）を確かにするためにｐ１０４８０の構造モデルにより改変されたときに、同定されたセット２において教示のあるアミノ酸残基の一又は二以上の箇所で親配列と比較した場合に、一又は二以上のアミノ酸の改変を含んでいる、ということで特徴づけられる。
好適には、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の変異体は、配列番号３４の配列アラインメントにより同定される、セット２、又はセット４、又はセット６、又はセット７（定義は後述）において定義される、一又は二以上のいずれかのアミノ酸残基における、一若しくは二以上のアミノ酸の変異を除いた、配列番号３４、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、又は配列番号３３に示されるアミノ酸配列である、アミノ酸配列を含む。
或いは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の変異体は、本明細書で教示されている１ＩＶＮ．ＰＤＢ及び／又は１ＤＥＯ．ＰＤＢとｐ１０４８０の結晶構造座標の構造アラインメントにより好ましくは得られる、本明細書で定義されるｐ１０４８０構造モデルと構造的にアラインされている親配列により同定される、セット２、又はセット４、又はセット６、又はセット７において定義される、一又は二以上のいずれかのアミノ酸残基における、一若しくは二以上のアミノ酸の変異を除いた、配列番号３４、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、又は配列番号３３に示されるアミノ酸配列である、アミノ酸配列を含む酵素の変異体である。
或いは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の変異体は、親配列がｐｆａｍ共通配列（セット２）とアラインするとき、また下記に記述されているようにベストフィットオーバーラップを確かにするためにＰ１０４８０を構造モデルにより改変されているときに、同定されたセット２において教示される、一又は二以上のいずれかのアミノ酸残基における、一若しくは二以上のアミノ酸の変異を除いた、配列番号３４、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、又は配列番号３３に示されるアミノ酸配列である、アミノ酸配列を含む酵素の変異体である。
本明細書で使用される「改変する」（modifying）という用語は、付加、置換、及び／又は削除することを意味する。好ましくは、「改変する」という用語は、置換するという意味である。
誤解を避けるため、アミノ酸が親酵素において置換される場合、好ましくは、アミノ酸は、親酵素におけるポジションに元々あるアミノ酸と異なるアミノ酸と置換され、それゆえ酵素の変異体を作り出す。言いかえれば、「置換」という用語は、アミノ酸を同一のアミノ酸と代替することを対象としない。
好ましくは、親酵素は、配列番号３４、及び／又は配列番号１５、及び／又は配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む酵素である。
好ましくは、酵素の変異体は、セット２、又はセット４、又はセット６、又はセット７において定義される、一又は二以上のいずれかのアミノ酸残基における、一又は二以上のアミノ酸の改変を除いた、配列番号３４又は配列番号３５に示されるアミノ酸配列である、アミノ酸配列を含む酵素である。
一実施形態では、好ましくは、酵素の変異体は、セット４で定義されたアミノ酸残基の少なくとも１つにおいて、親配列と比較して一又は二以上のアミノ酸の改変を含む。
好適には、酵素の変異体は、親酵素を比較して、一又は二以上の以下のアミノ酸の改変
Ｓ３Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｙ、Ｒ、Ｐ、Ｎ、Ｔ又はＧ
Ｅ３０９Ｑ、Ｒ、又はＡ、好ましくはＱ又はＲ
―３１８Ｙ、Ｈ、Ｓ、又はＹ、好ましくはＹ、
を含む。
好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのＸは、Ｌである。それゆえ、好ましくは、親酵素はアミノ酸配列モチーフＧＤＳＬを含む。
好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の変異体を作り出す方法は、さらに一又は二以上の以下の
・ 構造的相同性マッピング（structural homology mapping）、又は
・ 配列相同性アラインメント、
のステップを含む。
好適には、構造的相同性マッピングは、一又は二以上の以下の
i） 図４６に示される構造モデル（１ＩＶＮ．ＰＤＢ）と親配列をアラインするステップ
ii） 活性部位（図４７参照）（セット１又はセット２において定義される一又は二以上のアミノ酸残基のような）におけるグリセロール分子の中心炭素原子を中心として１０Å以内にある一又は二以上のアミノ酸残基を選択するステップ
iii） 前記親配列において、ステップ（ii）により選択された一又は二以上のアミノ酸を改変するステップ
を含む。
一実施形態では、選択されたアミノ酸残基は、活性部位（図４７参照）におけるグリセロール分子の中心炭素原子を中心として９以内、好ましくは、８、７、６、５、４又は３Å以内に存在する。
好適には、構造的相同性マッピングは、一又は二以上の以下の、
i） 図４６に示される構造モデル（１ＩＶＮ．ＰＤＢ）と親配列をアラインするステップ
ii） 活性部位（図４７参照）（セット１又はセット２において定義される一又は二以上のアミノ酸残基のような）におけるグリセロール分子の中心炭素原子を中心として１０Å以内にある一又は二以上のアミノ酸を選択するステップ
iii）ステップ（ii）により選択された一又は二以上のアミノ酸が、高度に保存されている（特に、活性部位、及び／又はＧＤＳｘモチーフの一部、及び／又はＧＡＮＤＹモチーフの一部）かどうかを決定するステップ、及び
iv） 前記親配列においてステップ（iii）により同定された保存領域を除いた、ステップ（ii）により選択された一又は二以上のアミノ酸を改変するステップ
を含む。
一実施形態では、選択されたアミノ酸残基は、活性部位（図４７参照）におけるグリセロール分子の中心炭素原子を中心として９以内、好ましくは、８、７、６、５、４又は３Å以内に存在する。
或いは、又は上述の構造的相同性マッピングと組み合わせて、構造的相同的マッピングは、Ｐ１０４８０モデルと１ＩＶＮに覆われた（overlaid）、ｐｆａｍアラインメント（アラインメント２、図４８）から由来する特異的なループ領域（ＬＲｓ）又は介在領域（intervening regions）（ＩＶＲｓ）によって行われる。ループ領域（ＬＲｓ）又は介在領域（ＩＶＲｓ）は、以下の表に定義されている。
Figure 0005604032
 本発明のいくつかの実施形態では、本発明の方法及び使用に使われる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の変異体は、セット１〜４及び６〜７のいずれの１つにおいて定義される、一又は二以上のアミノ酸においてアミノ酸の改変を含むだけでなく、上記に定義された介在領域（ＩＶＲ１〜６）（好ましくはＩＶＲ３、５、及び６の一又は二以上において、より好ましくはＩＶＲ５若しくはＩＶＲ６において）の一又は二以上において、並びに／或いは、上記に定義されているループ領域（ＬＲ１〜５）（好ましくは、ＬＲ１、ＬＲ２若しくはＬＲ５の一又は二以上において、より好ましくはＬＲ５において）の一又は二以上において、少なくとも１つのアミノ酸の改変をもまた含む。
一実施形態では、本発明の方法及び使用において使われるアシルトランスフェラーゼの変異体は、セット２、４、６及び７の一又は二以上によって定義されるのみでなく、ＩＶＲ１〜６（好ましくはＩＶＲ３、５、若しくは６において、より好ましくはＩＶＲ５若しくはＬＶＲ６において）の一又は二以上において、或いはＬＲ１〜５（好ましくはＬＲ１、ＬＲ２若しくはＬＲ５において、より好ましくはＬＲ５において）の一又は二以上において、一又は二以上のアミノ酸改変をもまた含む。
好適には、本発明の方法及び使用において使われるアシルトランスフェラーゼの変異体は、セット１又は２においてだけでなくＩＶＲ３においても、一又は二以上のアミノ酸改変を含む。
好適には、本発明の方法及び使用において使われるアシルトランスフェラーゼの変異体は、セット１又は２においてだけでなくＩＶＲ５においても、一又は二以上のアミノ酸改変を含む。
好適には、本発明の方法及び使用において使われるアシルトランスフェラーゼの変異体は、セット１又は２においてだけでなくＩＶＲ６においても、一又は二以上のアミノ酸改変を含む。
好適には、本発明の方法及び使用において使われるアシルトランスフェラーゼの変異体は、セット１又は２だけでなくＬＲ１においても、一又は二以上のアミノ酸改変を含む。
好適には、本発明の方法及び使用において使われるアシルトランスフェラーゼの変異体は、セット１又は２においてだけでなくＬＲ２においても、一又は二以上のアミノ酸改変を含む。
同様に、本発明のいくつかの実施形態では、本発明の方法及び使用において使われるアシルトランスフェラーゼの変異体は、活性部位（図４７参照）におけるグリセロール分子の中心炭素原子を中心として１０、好ましくは、９、８、７、６、５、４又は３Å以内に存在する一又は二以上のアミノ酸におけるアミノ酸残基の改変を含むだけでなく、一又は二以上の上記に定義されている介在領域（ＩＶＲ１〜６）（好ましくはＩＶＲ３、５、若しくは６の一又は二以上において、より好ましくはＩＶＲ５若しくはＬＶＲ６において）の一又は二以上において、並びに／或いは上記に定義されたループ領域（ＬＲ１〜５）（好ましくはＬＲ１、ＬＲ２若しくはＬＲ５の一又は２以上において、より好ましくはＬＲ５において）の一又は二以上において、少なくとも１つのアミノ酸改変をもまた含む。
一実施形態では、好ましくは、アミノ酸改変は、１０Å以内であって、且つＬＲ５内に存在する一又は二以上のアミノ酸残基の位置である。
それゆえ、構造的相同性マッピングは、一又は二以上の以下の、
i） 親配列を、図４６に示される構造モデル（１ＩＶＮ．ＰＤＢ）とアラインするステップ
ii） 活性部位（図４７参照）（セット１又はセット２において定義される一又は二以上のアミノ酸残基のような）において、グリセロール分子の中心炭素原子を中心として１０Å以内に存在する、一又は二以上のアミノ酸残基を選択し、
且つ／或いは、
ＩＶＲ１〜６において（好ましくはＩＶＲ３、５、若しくは６において、より好ましくはＩＶＲ５若しくはＬＶＲ６において）、一又は二以上のアミノ酸残基を選択し、
且つ／或いは、
ＬＲ１〜５において（好ましくはＬＲ１、ＬＲ２若しくはＬＲ５において、より好ましくはＬＲ５において）、一又は二以上のアミノ酸残基を選択するステップ
iii）前記親配列において、ステップii）により選択された一又は二以上のアミノ酸を改変するステップ
を含む。
一実施形態では、選択されたアミノ酸残基は、活性部位（図４７参照）においてグリセロール分子の中心炭素原子を中心として９以内、好ましくは８、７、６、５、４又は３Å以内に存在する。
好適には、構造的相同性マッピングは一又は二以上の以下の、
i） 親配列を、図４６に示される構造モデル（１ＩＶＮ．ＰＤＢ）とアラインするステップ、
ii） 活性部位（図４７参照）（セット１又はセット２に定義される一又は二以上のアミノ酸残基のように）においてグリセロール分子の中心炭素原子を中心として１０Å以内に存在する、一又は二以上のアミノ酸残基を選択し、
且つ／或いは、
ＩＶＲ１〜６（好ましくはＩＶＲ３、５、若しくは６において、より好ましくはＩＶＲ５若しくはＬＶＲ６において）において、一又は二以上のアミノ酸残基を選択し、
且つ／或いは、
ＬＲ１〜５（好ましくはＬＲ１、ＬＲ２若しくはＬＲ５において、より好ましくはＬＲ５において）において、一又は二以上のアミノ酸残基を選択するステップ、
iii）ステップ（ii）により選択された一又は二以上のアミノ酸が、高度に保存されている（特に、活性部位、及び／又はＧＤＳｘモチーフの一部、及び／又はＧＡＮＤＹモチーフの一部が、）かどうかを決定するステップ、
且つ、
前記親配列においてステップ（iii）により同定された高度に保存されている領域を除いた、ステップ（ii）により選択された一又は二以上のアミノ酸を改変するステップ、
を含む。
好適には、上記に詳述された方法において選択された一又は二以上のアミノ酸は、活性部位（図４７参照）（セット１又はセット２に定義される一又は二以上のアミノ酸残基のように）においてグリセロール分子の中心炭素原子を中心として１０Å以内に存在するばかりでなく、ＩＶＲ１〜６（好ましくはＩＶＲ３、５、若しくは６において、より好ましくはＩＶＲ５若しくはＬＶＲ６において）の一又は二以上において、或いはＬＲ１〜５（好ましくはＬＲ１、ＬＲ２若しくはＬＲ５において、より好ましくはＬＲ５において）の一又は二以上においてもまた存在する。
一実施形態では、好ましくは、一又は二以上のアミノ酸改変は、ＬＲ５において行われる。改変がＬＲ５にあるときは、改変は、セット５において定義されるものではない。好適には、一又は二以上のアミノ酸改変は、ＬＲ５によって定義される領域にあるだけではなく、セット２、セット４、セット６、セット７の一又は二以上におけるアミノ酸を構成する。
好適には、配列相同性アラインメントは、一又は二以上の以下の、
i） 一番目の親脂質アシルトランスフェラーゼを選ぶステップ、
ii） 目的の（desirable）活性を有する二番目に関連した脂質アシルトランスフェラーゼを同定するステップ、
iii）前記一番目の親脂質アシルトランスフェラーゼと二番目に関連した脂質アシルトランスフェラーゼをアラインするステップ、
iv） ２つの配列の間の異なるアミノ酸残基を同定するステップ、
及び
v） 前記親脂質アシルトランスフェラーゼにおいて、ステップ（iv）により同定されたアミノ酸残基の一又は二以上を改変するステップ、
を含む。
好適には、配列相同性アラインメントは、一又は二以上の以下の、
i） 一番目の親脂質アシルトランスフェラーゼを選ぶステップ、
ii） 目的の活性を有する二番目に関連した脂質アシルトランスフェラーゼを同定するステップ、
iii）前記一番目の親脂質アシルトランスフェラーゼと二番目に関連した脂質アシルトランスフェラーゼをアラインするステップ、
iv) ２つの配列の間の異なるアミノ酸残基を同定するステップ、
ｖ） ステップ（iv）により選択されたアミノ酸残基の一又は二以上が、高度に保存された（特に活性部位の残基及び／又はＧＤＳxモチーフの一部及び／又はＧＡＮＤＹモチーフの一部）であるかを決定するステップ、
及び
vi) 前記親配列におけるステップ（v）により同定される保存領域を排除するステップ（iv）により同定されたアミノ酸残基の一又は二以上を改変するステップ、
を含む。
好適には、一番目の親脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアミノ酸配列、配列番号３４、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３のいずれか１つを含む。
好適には、二番目に関連した脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアミノ酸配列、配列番号３、配列番号３４、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３のいずれか１つを含む。
酵素の変異体は、少なくとも、親酵素と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含まなければならない。いくつかの実施形態では、酵素の変異体は、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、好ましくは少なくとも４、好ましくは少なくとも５、好ましくは少なくとも６、好ましくは少なくとも７、好ましくは少なくとも８、好ましくは少なくとも９、好ましくは少なくとも１０の親配列と比較したアミノ酸改変を含む。
本明細書の特異的なアミノ酸残基に対応した場合、番号付与は、配列の変異体と、配列番号３４若しくは配列番号３５に示された参照配列とのアラインメントより得られるものである。
一態様では、好ましくは、酵素の変異体は、一又は二以上の以下のアミノ酸置換を含む。
Ｓ３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｌ１７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｓ１８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｋ２２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｍ２３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｙ３０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷ、及び／又は、
Ｇ４０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｎ８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｐ８１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｋ８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｎ８７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｎ８８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｗ１１１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｖ１１２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ａ１１４Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｙ１１７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷ、及び／又は、
Ｌ１１８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｐ１５６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｄ１５７Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｇ１５９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｑ１６０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｎ１６１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｐ１６２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｓ１６３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ａ１６４Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｒ１６５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｓ１６６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｑ１６７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｋ１６８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｖ１６９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｖ１７０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｅ１７１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ａ１７２Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｙ１７９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷ、及び／又は、
Ｈ１８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｎ１８１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｑ１８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、好ましくはＫ、及び／又は、
Ｍ２０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｌ２１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｒ２１１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｎ２１５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｙ２２６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷ、及び／又は、
Ｙ２３０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷ、及び／又は、
Ｋ２８４Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｍ２８５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｑ２８９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｖ２９０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｅ３０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ、及び／又は、
Ｓ３１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹ
それに加えて、又は或いは、一又は二以上のＣ末端の伸長がある。好ましくは、付加的なＣ−末端の伸長は、一又は二以上の脂肪族のアミノ酸から、好ましくは、非極性のアミノ酸から、より好ましくは、Ｉ，Ｌ，Ｖ，又はＧから成るものである。それゆえ、本発明はさらに、以下のＣ−末端の伸長、即ち３１８Ｉ、３１８Ｌ、３１８Ｖ、３１８Ｇの一又は二以上を含む酵素の変異体を提供するものである。
親バックボーン（backbone）の残基が、ｐ１０４８０及び／又は１ＩＶＮの相同性アラインメント及び／又は構造アラインメントにより決定されるような、ｐ１０４８０（配列番号２）における残基とは異なる場合には、Ｐ１０４８０（配列番号２）における以下のアミノ酸残基、即ちＳｅｒ３、Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｇｌｎ１８２、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、Ｖａｌ２９０、Ｇｌｕ３０９、又はＳｅｒ３１０）の一又は二以上のいずれかとアラインする残基とＰ１０４８０に見い出されるそれぞれの残基とを置換することが望ましい。
ホスファチジルコリン（ＰＣ）などのリン脂質に対する、減少した加水分解活性を有する酵素の変異体はまた、リン脂質からの増加したトランスフェラーゼ活性を有する。
ホスファチジルコリン（ＰＣ）などのリン脂質からの、増加したトランスフェラーゼ活性を有する酵素の変異体はまた、増加した加水分解活性を有する。
好適には、一又は二以上の以下の部位、即ちＬｅｕ１７、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、Ｖａｌ２９０は結合している基質に関係する。
一又は二以上の以下の残基の改変は、リン脂質に対して絶対的に増加したトランスフェラーゼ活性を有する酵素の変異体を生じる。
Ｓ３、Ｄ１５７、Ｓ３１０、Ｅ３０９、Ｙ１７９、Ｎ２１５、Ｋ２２、Ｑ２８９、Ｍ２３、Ｈ１８０、Ｍ２０９、Ｌ２１０、Ｒ２１１、Ｐ８１、Ｖ１１２、Ｎ８０、Ｌ８２、Ｎ８８、Ｎ８７
リン脂質からの改良されたトランスフェラーゼ活性を有する酵素の変異体を供給する特異的な改変は、一又は二以上の以下の、
Ｓ３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくは、Ｎ、Ｅ、Ｋ，Ｒ、Ａ、Ｐ、又はＭ、最も好ましくはＳ３Ａ
Ｄ１５７Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくは、Ｄ１５７Ｓ、Ｒ、Ｅ、Ｎ，Ｇ、Ｔ、Ｖ、Ｑ，Ｋ又はＣ
Ｓ３１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＳ３１０Ｔ−３１８Ｅ
Ｅ３０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくはＥ３０９Ｒ、Ｅ、Ｌ、Ｒ又はＡ
Ｙ１７９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ又はＷ、好ましくは、Ｙ１７９Ｄ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ，Ｑ又はＳ、最も好ましくはＥ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ又はＱ
Ｎ２１５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくは、Ｎ２１５Ｓ、Ｌ、Ｒ又はＹ
Ｋ２２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくは、Ｋ２２Ｅ、Ｒ、Ｃ、又はＡ
Ｑ２８９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくは、Ｑ２８９Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｐ又はＮ
Ｍ２３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくは、Ｍ２３Ｋ、Ｑ、Ｌ、Ｇ、Ｔ又はＳ
Ｈ１８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくは、Ｈ１８０Ｑ、Ｒ又はＫ
Ｍ２０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくは、Ｍ２０９Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、Ｖ又はＬ
Ｌ２１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくは、Ｌ２１０Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｗ又はＭ
Ｒ２１１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくは、Ｒ２１１Ｔ
Ｐ８１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくは、Ｐ８１Ｇ
Ｖ１１２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ又はＹ、好ましくは、Ｖ１１２Ｃ
Ｎ８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくは、Ｎ８０Ｒ、Ｇ、Ｎ、Ｄ、Ｐ、Ｔ、Ｅ、Ｖ、Ａ又はＧ
Ｌ８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくは、Ｌ８２Ｎ、Ｓ又はＥ
Ｎ８８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくは、Ｎ８８Ｃ
Ｎ８７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ、好ましくは、Ｎ８７Ｍ又はＧ
から選択される。
一又は二以上の以下の残基の改変、即ち、
Ｓ３ Ｎ、Ｒ、Ａ、Ｇ
Ｍ２３ Ｋ、Ｑ、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｓ
Ｈ１８０ Ｒ
Ｌ８２ Ｇ
Ｙ１７９ Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ又はＱ
Ｅ３０９ Ｒ、Ｓ、Ｌ又はＡ
は、リン脂質に対する絶対的に増加したトランスフェラーゼ活性を有する酵素の変異体を生じる。
一つの好ましい改変は、Ｎ８０Ｄである。これは、特に参照配列の配列番号３５を使用したときの場合である。それゆえ、本発明の好ましい実施形態では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号３５を含む。
上述したように、本明細書で特異的なアミノ酸残基を参照している場合、番号付与は、配列番号３４又は配列番号３５に示される参照配列の、配列の変異体のアラインメントから得られたものである。
非常に好ましくは、本発明の方法及び使用において使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号１６（図１０）に示されるアミノ酸配列と、又は７５％若しくはそれ以上、好ましくは８５％若しくはそれ以上、より好ましくは９０％若しくはそれ以上、さらにより好ましくは９５％若しくはそれ以上、さらにより好ましくは９８％若しくはそれ以上、さらにより好ましくは９９％若しくはそれ以上、配列番号１６との同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。この酵素は、酵素の変異体と見なされる。
誤解を避けるため、特異的なアミノ酸が特異的部位、例えばＬ１１８である旨教示があるとき、これは、特に断りが無い場合は、配列番号３４の残基番号１１８における特異的なアミノ酸に対応するものである。しかしながら、異なる親酵素における１１８位におけるアミノ酸残基は、ロイシンとは異なる。
それゆえ、アミノ酸を１１８位の残基において置換することが教示されているとき、参照ではＬ１１８を作るようになっているが，配列番号３４で示されるアミノ酸配列を有する酵素でない親配列のアミノ酸を置換するとき、新しい（置換する）アミノ酸は、配列番号３４で教示されているものと同じである。これは、例えば、残基１１８位のアミノ酸がロイシンでなく、それゆえ、配列番号３４における残基１１８位のアミノ酸と異なる場合である。言い換えれば、例えば１１８位において、親酵素は、そのポジションにロイシン以外のアミノ酸を有している場合、このアミノ酸は、本発明によりロイシンと置き換えられる。
本発明の目的のため、同一性の程度は、同じ配列因子の番号に基づいている。本発明による同一性の程度は、好適には、以下のようなポリペプチド配列比較、即ちＧＡＰクリエーションペナルティー３．０及びＧＡＰエクステンションペナルティー０．１を使用して、ＧＣＧプログラムパッケージ(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, US53711）(Needleman & Wunsch (1970),J of Molecular Biology 48,443-45)において提供されているＧＡＰのような、当業者に知られているコンピュータープログラムの手段によって決定される。好適には、アミノ酸配列に関しての同一性の程度は、少なくとも２０以上の隣接するアミノ酸、好ましくは少なくとも３０以上の隣接するアミノ酸、好ましくは少なくとも４０以上の隣接するアミノ酸、好ましくは少なくとも５０以上の隣接するアミノ酸、好ましくは少なくとも６０以上の隣接するアミノ酸によって決定される。
好適には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の、アエロモナス、ストレプトマイセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルフォロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソルヒゾビウム、ラルストニア、ザントモナス、カンジダ、サーモビフィダ、及びコリネバクテリウム由来の一又は二以上の属の生物から得ることができる、又は得られたものである。
好適には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の、アエロモナス・ハイドロフィラ、アエロモナス・サルモニシダ、ストレプトマイセス・コレリコロル、ストレプトマイセス・リモスス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ラクトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトマイセス・サーモサッカリ、ストレプトマイセス・アベルミチリス、ラクトバチルス・ヘルべティカス、デサルフィトバクテリウム・デハロゲナンス、バチルス種、カンピロバクター・ジェジュニ、ビブリオナシエ、キシレラ・ファスティディオサ、スルフォロブス・ソルファタリクス、サッカロミセス・セルビシエ、アスペルギルス・テレウス、シゾサッカロミセス・ポンベ、リステリア・イノキュア、リステリア・モノサイトゲネス、ナイセリア・メニンギチジス、メソルヒゾビウム・ロティ、ラルストニア・ソラナセアラム、ザントモナス・カンペストリス、ザントモナス・アクソノポディス、カンジダ・パラプシロシス、サーモビフィダ・フスカ、及びコリネバクテリウム・エフィシェンスの、一又は二以上の生物から得ることができる、好ましくは得られたものである。
一態様では、好ましくは本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、好ましくは一又は二以上の、アエロモナス・ハイドロフィラ、又はアエロモナス・サルモニシダから得ることができる、好ましくは得られたものである。
一実施形態では、好適には、ステノール及び／又はスタノールは、一又は二以上の以下の構造的特徴、
i） ３−ベータヒドロキシ基、又は３−アルファヒドロキシ基、及び／又は
ii）シスポジションにおけるＡ：Ｂリング、又はトランスポジションにおけるＡ：Ｂリング、又はＣ５−Ｃ６が不飽和であること、
を有する。
好適なステロールアシル受容体は、コレステロール、フィトステロール、例えば、アルファ−シトステロール、ベータ−シトステロール、スティグマステロール、エルゴステロール、カンペステロール、５，６−デヒドロステロール、ブラシカステロール、アルファ−スピナステロール、ベータ−スピナステロール、ガンマ−スピナステロール、デルタ−スピナステロール、フコステロール、ディモステロール、アスコステロール、セレビステロール、エピステロール、アナステロール、ハイポステロール、コンドリラステロール、デズモステロール、チャリノステロール、ポリフェラステロール、クリオナステロール、ステロールグリコシド、トコフェロール、トコトリエール、並びに他の天然の、又は合成の異性体及び派生物を含む。
有利な一実施形態では、ステロールアシル受容体はトコフェロールである。好適には、トコフェロールは、一又は二以上のガンマ、デルタ、ベータ、又は、例えばｄ−アルファトコフェロール酸コハク酸を含むｄ−アルファトコフェロールである。一実施形態では、好ましくは、ステロールアシル受容体は、アルファトコフェロールである。
一実施形態では、好ましくは、本発明による方法は、油にトコフェロールを、好ましくはアルファトコフェロールを添加するステップを含む。
一実施形態では、好ましくは、ステロールアシル受容体は、コレステロールである。
一態様では、好ましくは、ステロール及び／又はスタノールのアシル受容体は、コレステロール以外のステロール及び／又はスタノールである。
本発明の一態様では、好適には二以上のステロール及び／又はスタノールは、アシル受容体として役割を果たし、好適には三以上のステロール及び／又はスタノールは、アシル受容体として役割を果たす。言い換えれば、本発明の一態様では、好適には、二以上のステロールエステル及び／又はスタノールエステルが作り出される。好適には、コレステロールがアシル受容体であるとき、一若しくは二以上の他のステロール、又は一若しくは二以上のスタノールもまた、アシル受容体として役割を果たす。それゆえ、一態様では、本発明は、トコフェロールエステルと、少なくとも１つの他のステロール又はスタノールエステルの組合せとの両方の、インサイチュの形成の方法を提供する。言い換えれば、本発明のいくつかの態様における脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル基を脂質からトコフェロールと、少なくとも１つの他の別のステロール及び／又は少なくとも一のスタノールとの両方に転移する。
いくつかの態様では、本発明により調整される油は、循環器系疾患のリスクを軽減するために使用される。
一態様では、本発明により調整される油は、血清中のコレステロールを減らし、及び／又は低比重リポタンパク質を減らす。血清コレステロールと低比重リポタンパク質は例えばアテローム性動脈硬化症、及び／又は心疾患などのある種の人間の病気に関連しているものである。それゆえ、本発明により調整される油は、これらの病気のリスクを軽減するために使用されることが予想される。
別の態様では、本発明は、循環器系疾患の治療及び／又は予防において使用される本発明による食用油の使用を提供する。
それゆえ、本発明の一態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化症及び／又は心疾患の治療及び／又は予防において使用される本発明による食用油の使用を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、本発明による食用油を含む薬剤を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、本発明による食用油の効果的な量を患者に投与することを含む方法であって、人間又は動物の患者における病気を治療及び／又は予防する方法を提供する。
好適には、ステロールアシル受容体は、自然界で食用又は植物油に見出されるものである。
或いは、又は加えて、ステロールアシル受容体は、食用又は植物油に加えられるものである。
ステロール及び／又はスタノールが食用油に加えられる場合、ステロール及び／又はスタノールは、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼを添加する前に、同時に、及び／又は後に加えられる。好適には、本発明は、本発明による酵素を添加する前に、又は同時に食用又は植物油に外生のステロール／スタノール、特にフィトステロール／フィトスタノールを加えることを含む。
いくつかの態様では、食用油に存在するステロールの一又は二以上は、本発明により脂質アシルトランスフェラーゼが添加される前に、又は同時に一又は二以上のスタノールに変換される。ステロールをスタノールに変換する適切な方法が使用される。例えば、変換は、例えば化学的な水素化により行われる。変換は、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼの添加の前に、又は本発明による脂質アシルトランスフェラーゼの添加と同時に行われる。好適には、ステロールをスタノールに変換する酵素は、ＷＯ００／０６１７７１に教示されている。
好適には、本発明は、食用油の中でインサイチュにフィトスタノールエステルを作り出すために使用される。フィトスタノールエステルは、脂質の膜を通じることで増加した溶解性、生物学的利用能、及び増進された健康効果を有する（ＷＯ９２／９９６４０を参照せよ）。
本発明の有利な点は、ステロール及び／又はスタノールエステルが、脱ガムの間に食用油で形成されることである。さらに有利な点は、酵素が食用油の遊離脂肪酸量が増加せず、又は実質的な増加をせずに脱ガムがなされることである。遊離脂肪酸の形成は、食用油においては有害である。好ましくは、本発明による方法は、遊離脂肪酸の蓄積が減少及び／又は除去されるように、食用油の脱ガムを行うことができる。理論にしばられることなく、本発明による、脂肪から除去された脂肪酸は、脂質アシルトランスフェラーゼにより、例えば、ステロール及び／又はスタノールのようなアシル受容体に転移される。それゆえ、食材における遊離脂肪酸の全体的なレベルは、有意な程度にまでも増加しない、又は増加するということはない。このことは、レシターゼウルトラ（登録商標）（Lecitase UltraTM）のようなホスホリパーゼが、食用油の酵素的脱ガムにおいて使用される場合の状況とは、鋭く対比される。特に、そのようなホスホリパーゼの使用は、食用油において有害となりうる遊離脂肪酸の量の増加をもたらす。レシターゼウルトラのようなホスホリパーゼＡ酵素が、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼの代わりに使われたとしたならば蓄積するであろう遊離脂肪酸の量と比較した場合、本発明では、遊離脂肪酸の蓄積は減少し、且つ／又は除かれる。
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、植物又は食用油の酵素的脱ガムにおける使用に適切である。植物又は食用油の処理において、リン脂質の大部分を加水分解するために、食用又は植物油は本発明による脂質アシルトランスフェラーゼで処理される。好ましくは、脂質アシル基は、極性脂質からアシル受容体に転移される。脱ガム工程は典型的に、リン脂質の大部分（即ち５０％以上）の加水分解のため食用油における、極性脂質の、特にリン脂質の含有量の減少を招く。典型的には、加水分解されたリン脂質を含む水相は、油から分離する。好適には、食用又は植物油は、始めに（本発明による酵素による前処理）、５０〜２５０ｐｐｍのリン含有量を有する。
当業者であれば承知しているように、本明細書で使用される「脱ガム」という用語は、ホスファチド（レシチン、リン脂質及び閉塞油（occluded oil）など）を、水和できる（hydratable）ホスファチドに変換することによる油の精製を意味する。脱ガムされた油は、より流動性があり、それゆえ脱ガムされていない油よりもよりよい取扱適性がある。
本明細書における「トランスフェラーゼ」という用語は、「脂質アシルトランスフェラーゼ」という用語と置換え可能である。
好適には、本明細書で定義される脂質アシルトランスフェラーゼは、一又は二以上の以下の、インターエステル交換（interesterification）、トランスエステル交換（transesterification）、アルコーリシス（alcoholysis）、加水分解といった反応を触媒する。
「インターエステル交換」という用語は、脂質供与体が遊離アシル基でない場合に、脂質供与体と脂質受容体との間の、アシル基の酵素的に触媒された転移に対応する。
本明細書で使われる「トランスエステル交換」という用語は、脂質供与体（遊離脂肪酸以外）からアシル受容体（水以外）への、酵素的に触媒されたアシル基の転移をいう。
本明細書で使われるように、「アルコーリシス」という用語は、生成物の１つがアルコールのＨと結合し、他の生成物がアルコールのＯＲと結合するような、アルコールＲＯＨとの反応による酸誘導体の共有結合の酵素的開裂に対応する。
本明細書で使われるように、「アルコール」という用語は、ヒドロキシ基を含むアルキル化合物に対応する。
本明細書で使われるように、「加水分解」という用語は、アシル基の、脂質から水分子のＯＨ基への酵素的触媒転移に対応する。
本明細書で使われるように、「遊離脂肪酸量が増加せず、又は実質的な増加をせずに」という用語は、好ましくは、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼが１００％のトランスフェラーゼ活性を有している（即ち、アシル基の１００％をアシル供与体からアシル受容体に、加水分解活性なしに転移する）ことを意味するが、しかしながら、酵素は、脂質アシル供与体に存在するアシル基の１００％未満をアシル受容体に転移する。どのケースにおいても、好ましくは、アシルトランスフェラーゼ活性は、少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、及びより好ましくは少なくとも９８％の総酵素活性を占める。トランスフェラーゼ活性の％（即ち、総酵素活性のパーセンテージとしてのトランスフェラーゼ活性）は、以下のプロトコルにより決定される。
本発明の方法において使われる適当な酵素は、好ましくは、後述のとおりの標準的なホスホリパーゼ活性アッセイにおけるホスホリパーゼ活性を有する。
ホスホリパーゼ活性の決定（ホスホリパーゼ活性アッセイ（ＰＬＵ−７）
基質
０．６％Ｌ−αホスファチジルコリン９５％ Plant（Avanti社製#441601）、０.４％ Triton-X 100（Sigma社製X-100）及び５ｍＭＣａＣｌ2 を０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝剤ｐＨ７中に溶解した。
アッセイ手順
４００μｌの基質が、１.５ｍｌエッペンドルフチューブに加えられ、エッペンドルフサーモミキサー内に３７℃にて５分間置かれた。Ｔ＝０ｍｉｎに、５０μｌの酵素溶液が加えられた。酵素の代わりに水をいれたブランクも分析された。試料は、エッペンドルフサーモミキサー内において、３７℃にて１０分間１０ｘ１００ｒｐｍで混合された。ｔ＝１０ｍｉｎに、エッペンドルフチューブは、反応を停止するため、別のサーモミキサー内に９９℃にて１０分間置かれた。
試料内の遊離脂肪酸は、Wako GmbH社製 NEFA C kitを用いて分析された。
酵素活性ＰＬＵ−７ ｐＨ７が、アッセイ条件下において１分ごとに形成されたマイクロモル脂肪酸として計算された。
より好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼは、下記のプロトコルに定義されたトランスフェラーゼ活性をも有するであろう。
アシルトランスフェラーゼ活性％の決定のためのプロトコル
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼに加えられている食用油は、ＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＯＨ２：１との以下の酵素反応で抽出され、脂質物質を含む有機相が単離され、下記に詳細が記されている手順により、ＧＬＣ及びＨＰＬＣにより分析される。ＧＬＣ及びＨＰＬＣ分析から、遊離脂肪酸と一又は二以上のステロール／スタノールエステルとの量が決定される。本発明による酵素が添加されていないコントロールの食用油が、同様に分析される。
計算
ＧＬＣ及びＨＰＬＣの結果から、遊離脂肪酸とステロール／スタノールエステルの増加が計算される
Δ％脂肪酸 ＝％ 脂肪酸（酵素）− ％ 脂肪酸（コントロール）
Ｍｖ脂肪酸 ＝脂肪酸の平均分子量
Ａ＝Δ％ステロールエステル／Ｍｖステロールエステル（Δ％ステロールエステル＝％ステロール／スタノールエステル（酵素）− ％ステロール／スタノールエステル（コントロール）及びＭｖステロールエステル＝ステロール／スタノールエステルの平均分子量である場合）。
トランスフェラーゼ活性は、総酵素活性のパーセンテージとして計算される。
％トランスフェラーゼ活性 ＝ Ａ ｘ １００
Ａ ＋ Δ％脂肪酸（Ｍｖ脂肪酸）
遊離脂肪酸が食用油において増加しているとしても、それらは、好ましくは、実質的に、即ち有意な程度には増加していない。これにより我々において、遊離脂肪酸の増加は、食用油の質に不利に作用することはないことを意味する。
アシルトランスフェラーゼ活性アッセイのために使用される食用油は、好ましくは、実施例３の方法を使用して、植物ステロール（１％）及びホスファチジルコリン（２％）の油が補完された大豆油である。アッセイのために使用された酵素濃度は、好ましくは０．２ＰＬＵ−７／ｇ油であり、より好ましくは０．０８ＰＬＵ−７／ｇ油である。油に存在するリン脂質のレベル及び／又はステロールの変換の％は、好ましくは４時間後、より好ましくは２０時間後に決定される。
本発明のいくつかの態様では、本明細書で使用される「遊離脂肪酸量が実質的な増加をせずに」という用語は、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼにより処理される食用油内の遊離脂肪酸の量が、従来のホスホリパーゼ酵素、例えばレシターゼウルトラ（Novoenzymes A/S社製、デンマーク）などが使われたときに形成された遊離脂肪酸の量と比較されるときのように、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼ以外の酵素が使われた場合には、食用油内で形成される遊離脂肪酸の量よりも少ないことを意味する。
油（上記の）の％トランスフェラーゼ活性を評価することに加えて、又はその代わりに、本発明の方法において使用するために最も好ましい脂質アシルトランスフェラーゼ酵素を同定するために、「本発明において使われる脂質アシルトランスフェラーゼを同定するためのプロトコル」と題されている以下のアッセイが用いられる。
脂質アシルトランスフェラーゼを同定するためのプロトコル
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の結果をもたらす。
i） 実施例３で教示されている方法を使用して、植物ステロール（１％）及びホスファチジルコリン（２％）油で補完された大豆油に存在するリン脂質の除去
及び／又は
ii）実施例３で教示されている方法を使用して、加えられたステロールの、ステロールエステルへの変換（変換％）。例５に教示されているステロールとステロールエステルのレベルを決定するＧＬＣの方法が使用される。
アッセイのために使用される酵素量は、０．２ＰＬＵ−７／ｇ油、好ましくは、０．０８ＰＬＵ−７／ｇ油である。油に存在するリン脂質のレベル及び／又はステロールの変換（変換％）は、好ましくは４時間後、より好ましくは２０時間後に決定される。
脂質アシルトランスフェラーゼを同定するためのプロトコルにおいて、酵素処理後５％の水が好ましくは加えられ完全に油と混合される。油は、その後遠心分離（”Enzyme-catalyzed degumming of vegetable oils”by Buchold, H.and Laurgi A.-G., Fett Wissenschaft Technologie (1993),95(8),300-4,ISSN:0931-5985参照せよ）を使用して油及び水の相に分離され、油相は、その後以下のプロトコル（リン含有量のアッセイ）を使用して、リン含有量について分析される。
リン含有量のアッセイ
脱ガム後の油に存在するリン脂質のレベルは、ＡＯＡＣ公定法（official method）９９９．１０（＞鉛、カドミウム、亜鉛、銅、又は鉄のマイクロ波分解後の食品原子吸光光度計における、ファーストアクション１９９９ＮＭＫＬ−ＡＯＡＣ方法）において教示されている試料調製による油の試料の最初の調製により決定される。油におけるリン脂質の量は、ＡＯＡＣ公定法９８５．０１〔＞植物とペットフードにおける金属と他の成分、誘導結合プラズマスペクトロスコーピック分析法（Inductively Coupled Plasma Spectroscopic Method）ファーストアクション１９８５ファイナルアクション１９８８〕による脱ガム後の油の試料におけるリン含有量を分析することにより測定される。
脱ガム後の油に存在するリン含有量は、好ましくは５０ｐｐｍ未満、好ましくは４０ｐｐｍ未満、好ましくは３０ｐｐｍ未満、好ましくは２０ｐｐｍ未満、好ましくは１０ｐｐｍ未満、好ましくは５ｐｐｍ未満である。脱ガム後の油は、実施例に説明されているように、実質的にリン脂質を含んでいない、即ち１ｐｐｍ未満のリン脂質を含む。
油に存在するステロールの変換％は、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％である。
一実施形態では、油に存在するステロールの変換％は、少なくとも５％、好ましくは少なくとも２０％である。
低水分脱ガム
驚くべきことに、脂質アシルトランスフェラーゼが食用油の酵素的脱ガムの処理において使用される場合、酵素的脱ガムは、とても低い水分環境において行うことができることが見出された。幾分かの水分は、それでもやはり必要であるが、例えば、油に酵素を添加するときに、酵素は、１％未満、好ましくは０．５％、より好ましくは０．２％未満、より好ましくは１％未満といった少量の水に加えられる。
好ましくは、本発明による処理及び使用における食用油の水分量は、１％未満、好ましくは０．５％未満、より好ましくは０．２％未満、より好ましくは０．１％未満である。
それゆえ、本発明の有利な点の一つは、少量の水分（即ち、＜５％、好ましくは＜１％、好ましくは＜０．５％、好ましくは＜０．２％）が、酵素的脱ガムの間に使用されたとき、ガム（即ちリンを含む部分）は、例えば、固体沈殿物の形で油から分離する。固体沈殿物は、単に油を静かに移す、又は例えば濾過によりガムを除去するなどの方法により、脱ガムされた油から容易に除去されうる。
このことは、油に相当量の水が加えられる従来の酵素的脱ガム処理とはっきりと対照をなすものである。これは、従来の酵素的脱ガム処理においては、脱ガム後、高い水分量のためリンを含む部分（たとえばリゾ脂質を含む部分）を含む水相を得ることになるからである。この水相は、除去されなければならないものであり、例えば、遠心分離により除去されうるものである。しかしながら、水相の除去は、本発明の処理に使用する場合に得られる固体沈殿物の除去よりも、かなり困難である。
それゆえ、本発明における酵素的脱ガム処理は、「低水分脱ガム処理」として見なすことができる。
本発明の一実施形態では、ガムは、油の遠心分離により、油を水分５％に調整することにより除去される（”Enzyme-catalyzed degumming of vegetable oils”by Buchold, H. and Laurgi A.-G.,Fett Wissenschaft Technologie (1993),95(8), 300-4参照）。
それゆえ、本発明は、膵臓由来のホスホリパーゼ及びレシターゼウルトラのような従来のホスホリパーゼを使用するときに必要とされる、脱ガム前の前洗浄ステップ及び／又は脱ガムの間に加えられる水を除去するステップのいずれをも必要とせずに、粗食用油（例えば粗大豆油）のような食用油の脱ガムのための処理を提供する。
好ましくは、食用油は、４．５％未満、好ましくは４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満の水分量を有する。
好適には、食用油は、少なくとも０．３％、０．４％又は０．５％というような、少なくとも０．１％の水分を含む。
本発明において使われる好ましい脂質アシルトランスフェラーゼは、油環境においてリン脂質に対し、高いリン脂質加水分解活性若しくは高いリン脂質のトランスフェラーゼ活性のような高い活性を有するものとして同定され、最も好ましくは、酵素的脱ガムにおいて使われる脂質アシルトランスフェラーゼは、リン脂質からステロールへの高いトランスフェラーゼ活性を有する。
上記に詳述されているように、本発明の方法において使われる適当な他のアシルトランスフェラーゼは、ｐＦａｍ００６５７共通配列（配列番号１）のアラインメント及び／又は例えば配列番号２８のＧＤＳｘアシルトランスフェラーゼのアラインメントのいずれかにより、ＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ及びＨＰＴブロックの存在を同定することにより同定される。脱ガムの適合性を調査するため、即ち総酵素活性の少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％のトランスフェラーゼ活性を有する酵素を同定するためには、そのようなアシルトランスフェラーゼは、上記に詳述されている「アシルトランスフェラーゼ活性％の決定のためのプロトコル」を使用して試験される。
本発明は、食用植物油及び／若しくは食用油の脱ガムにおける本発明による脂質アシルトランスフェラーゼの使用、並びに食用若しくは植物油の脱ガムのための方法に関する。
一態様では、本発明は、水和できないリン（ＮＨＰ）含有量を、比較的高いＮＨＰ量を含む油において、除去するために脂質アシルトランスフェラーゼを使用を含む方法を提供する。
本明細書で使用される「食用油(edible oil)」という用語は、植物油を含む。
好ましくは、本発明による処理の前の食用油は、５０〜２５０ｐｐｍ、好ましくは少なくとも６０ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも１００ｐｐｍ、及びさらにより好ましくは少なくとも２００ｐｐｍ、さらにより好ましくは２５０ｐｐｍ以上の水和できないリン含有量を含む。
より好ましくは、本発明による処理の前の食用油は、６０〜５００ｐｐｍの範囲で、より好ましくは１００〜５００ｐｐｍの範囲で、及びさらにより好ましくは２００〜５００ｐｐｍの範囲で、水和できないリン含有量を含む。
本明細書に対応する食用油は、比較的多量の水和できないリンを有するいずれかの油であり、これらは、水により脱ガムされた油、又はより好ましくは粗油若しくは準粗油である。
一態様では、粗食用油は、本発明の方法を行う前に、３５０ｐｐｍ以上、より好ましくは４００ｐｐｍ以上、さらにより好ましくは５００ｐｐｍ以上、及び最も好ましくは６００ｐｐｍ以上のリン含有量を有する。
本発明による方法に含まれる油は、これらに限定されるわけではないが、一又は二以上の大豆油、キャノーラ油、コーン油、綿実油、パーム油、ココナッツ油、ピーナッツ油、オリーブ油、ベニハナ油、パーム核油、菜種油、及びひまわり油である。
好ましくは、油は、一又は二以上の大豆油、ひまわり油及び菜種油（キャノーラ油と呼ばれることもある）である。
より好ましくは、油は、一又は二以上の大豆油、ひまわり油又は菜種油である。
より好ましくは、油は、一又は二以上の大豆油である。
これらの油は、粗油、準粗油、又は水により脱ガムされた油の形である。
本明細書に使われる「粗油（crude oil）」（脱ガムされていない油として本明細書で言及されている）は、圧搾された、若しくは抽出された油、又は例えば菜種、大豆、ひまわりからの油の混合物である。粗油におけるホスファチド含有量は、２００〜１２００ｐｐｍの範囲の、より好ましくは２５０〜１２００ｐｐｍの範囲のリン含有量に相当する、０．５〜３％ｗ／ｗの範囲で変化する。ホスファチドは別として、粗油は、低濃度の炭水化物、糖類（sugar compounds）、及び金属／ホスファチド酸、Ｃａ、Ｍｇ若しくはＦｅの錯体を含む。
本明細書で使用されるように、「準粗油」は、粗油ではないが、ホスファチド含有量が２５０ｐｐｍ以上、より好ましくは５００ｐｐｍ以上であるいずれかの油に対応する。そのような油は、例えば、粗油を下記に述べられている水による脱ガム処理に類似する処理を行うことで得ることができる。
本明細書で使用されるように、「水−脱ガム油」は、１〜３％ｗ／ｗの熱水を温かい（６０〜９０℃）の粗油と混合することを含む水−脱ガム処理により、典型的に得られる。通常の処理時間は、３０〜６０分である。水−脱ガムステップは、水和したときに油の中で不溶性になるホスファチドと粘着性のガムを除去する。水和したホスファチドとガムは、定着（settling）、濾過又は遠心分離により油から分離させることができるが、遠心分離がより普及した方法である。前記の水−脱ガム処理における本質的な目的は、水和したホスファチドを油から分離することである。上述の、油に熱水を混合することは、当業界における標準的な水−脱ガム手順において水溶液を油に混合することとして広く理解されている。
長所として、本発明の方法及び使用は、低い水分（＜５％、好ましくは２％未満、より好ましくは１％未満）環境における食用油の脱ガムを可能にする。それゆえ、脱ガムは、従来の酵素を使うときよりも少ない水を加えることでも行うことができる。本発明の更なる有利な点は、ステロールエステル（特にトコフェロールエステル）の形成である。さらに、本発明の長所として、リン脂質の除去（好ましくは完全な除去）がある。本発明の更なる長所は、フィトステロール、特にトコフェロールを除去せずにリン脂質を除去（好ましくは完全な除去）することである。フィトステロールのエステル化のため、油からのトコフェロールなどのフィトステロールの有意な除去は無く、その代わりに単にエステル化されることが好まれる。しかしながら、一実施例において、トコフェロールなどのフィトステロールの量は、減少する。そのような実施例においては、トコフェロールなどのフィトステロールの絶対的レベルは、好ましくは１０％を超えない、或いは２５％を超えない、或いは５０％を超えない、或いは７５％を超えずに減少する。本発明の更なる長所は、トリグリセリドの加水分解の無いリン脂質の除去（好ましくは完全な除去）である。
参照を容易にするために、本発明のこれらの、又は追加的な態様は、適切な項目の見出しで論じられている。しかしながら、それぞれの項目における教示は、必ずしもそれぞれの個々の項目に限られるものではない。
セットの定義
アミノ酸セット１
アミノ酸セット１
Ｇｌｙ８、Ａｓｐ９、Ｓｅｒ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１２、Ｔｙｒ１５、Ｇｌｙ４４、Ａｓｐ４５、Ｔｈｒ４６、Ｇｌｕ６９、Ｌｅｕ７０、Ｇｌｙ７１、Ｇｌｙ７２、Ａｓｎ７３、Ａｓｐ７４、Ｇｌｙ７５、Ｌｅｕ７６、Ｇｌｎ１０６、Ｉｌｅ１０７、Ａｒｇ１０８、Ｌｅｕ１０９、Ｐｒｏ１１０、Ｔｙｒ１１３、Ｐｈｅ１２１、Ｐｈｅ１３９、Ｐｈｅ１４０、Ｍｅｔ１４１、Ｔｙｒ１４５、Ｍｅｔ１５１、Ａｓｐ１５４、Ｈｉｓ１５７、Ｇｌｙ１５５、Ｉｌｅ１５６、Ｐｒｏ１５８
ＧＤＳｘと触媒残基のように高度に保存されたモチーフは、セット１（残基は下線が引かれている）から除外された。誤解を避けるため、セット１は、１ＩＶＮモデルの活性部位におけるグリセロールの中心炭素原子から１０Å以内にあるアミノ酸残基を定義するものとする。
アミノ酸セット２
アミノ酸セット２（アミノ酸の番号は、Ｐ１０４８０成熟配列におけるアミノ酸に対応することに留意すること）
Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、及びＶａｌ２９０。
Figure 0005604032
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アミノ酸セット３
アミノ酸セット３は、セット２と同一であるが、アエロモナス・サルモニシダ（配列番号２８）コード配列に対応しており、即ちセット３においては、シグナル配列（配列番号２８）を含むタンパク質と比較した、成熟タンパク質（配列番号２）におけるアミノ酸番号付与との間の違いを反映するので、アミノ酸残基番号が１８個より多いものとなっている。
アエロモナス・サルモニシダＧＤＳＸ（配列番号２８）の成熟タンパク質、及びアエロモナス・ハイドロフィラＧＤＳＸ（配列番号２６）では、５つのアミノ酸が異なる。それらは、Ｔｈｒ３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１８２Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３０９Ａｌａ、Ｓｅｒ３１０Ａｓｎ、Ｇｌｙ３１８―、であり、サルモニシダ残基は最初に記載され、ハイドロフィラ残基は、最後に記載されている（図５９）。ハイドロフィラタンパク質は、３１７アミノ酸長のみであり、３１８位の残基を欠いている。アエロモナス・サルモニシダ ＧＤＳＸは、アエロモナス・ハイドロフィラタンパク質よりも、ガラクト脂質基質のような極性脂質に対して相当高い活性を有する。部分的走査は、５つのアミノ酸位のすべてにおいて行なわれた。
アミノ酸セット４
アミノ酸セット４は、Ｓ３、Ｑ１８２、Ｅ３０９、Ｓ３１０及び―３１８である。
アミノ酸セット５
Ｆ１３Ｓ、Ｄ１５Ｎ、Ｓ１８Ｇ、Ｓ１８Ｖ、Ｙ３０Ｆ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６Ｅ、Ｄ１５７Ｎ、Ｙ２２６Ｆ、Ｄ２２８Ｎ Ｙ２３０Ｆ。
アミノ酸セット６
アミノ酸セット６は、Ｓｅｒ３、Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｇｌｎ１８２、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、Ｖａｌ２９０、Ｇｌｕ３０９、Ｓｅｒ３１０、―３１８である。
セット６におけるアミノ酸の番号付与は、Ｐ１０４８０（配列番号２）におけるアミノ酸残基に対応し、他の配列のバックボーンにおいて相当するアミノ酸は、Ｐ１０４８０及び／又は１ＩＶＮに対する相同性アラインメント及び／又は構造アラインメントにより決定される。
アミノ酸セット７
アミノ酸セット７は、Ｓｅｒ３、Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｇｌｎ１８２、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、Ｖａｌ２９０、Ｇｌｕ３０９、Ｓｅｒ３１０、―３１８、Ｙ３０Ｘ（Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷから選択される）、Ｙ２２６Ｘ（Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷから選択される）、Ｙ２３０Ｘ（Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷから選択される）、Ｓ１８Ｘ（Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、又はＹから選択される）、Ｄ１５７Ｘ（Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、又はＹから選択される）である。
セット７におけるアミノ酸の番号付与は、Ｐ１０４８０（配列番号２）におけるアミノ酸残基に対応し、他の配列のバックボーンにおいて対応するアミノ酸は、Ｐ１０４８０、及び／又は１ＩＶＮの相同性アラインメント及び／又は構造アラインメントにより決定される。
単離された
ある態様において、好ましくは、本発明における使用のためのポリペプチド又はタンパク質は、単離された形態である。「単離された」という用語は、配列が、自然界においてその配列に自然に会合する他の成分を少なくとも実質的に有さず、自然界で存在する状態にあることを意味する。
精製された
ある態様において、好ましくは本発明における使用のためのポリペプチド又はタンパク質は、精製された形態である。「精製された」という用語は、配列が、比較的純粋状態にあること、例えば少なくとも約５１％純粋、又は少なくとも約７５％純粋、又は少なくとも約８０％純粋、又は少なくとも約９０％純粋、又は少なくとも約９５％純粋、又は少なくとも約９８％純粋であるということを意味する。
本発明によるポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列のクローニング
本明細書で定義される特異性を有するポリペプチド、又は改変に適しているポリペプチドのいずれかは、前記ポリペプチドを作り出す任意の細胞又は生物から単離される。ヌクレオチド配列の単離については当業界において様々な方法がよく知られている。
例えば、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーは、ポリペプチドを作り出す生物由来の染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを使用して構築されることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列が知られている場合、オリゴヌクレオチド標識プローブが合成され、且つ生物から作成された、ゲノムライブラリー由来のポリペプチドでコード化しているクローンを同定するために使用される。或いは、別の既知のポリペプチド遺伝子と相同の配列を含むオリゴヌクレオチド標識プローブは、ポリペプチドでコード化しているクローンを同定するために使用されうる。後者の場合、ストリンジェンシーがより低いハイブリダイゼーションと洗浄の条件が使用される。
或いは、ポリペプチドでコード化しているクローンは、プラスミドのような発現ベクターにゲノムＤＮＡの断片を挿入し、その結果得られたゲノムＤＮＡライブラリーと酵素陰性のバクテリアをもって形質転換し、それから形質転換されたバクテリアをポリペプチドによって阻害された酵素を含む寒天培地に培養し、それによってポリペプチドを発現するクローンが同定されうる。
さらに他には、ポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列は、確立された標準的な方法、例えばBeucage S.L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22, p1859-1869 に記述されているphosphoroamidite法、又はMatthes et al (1984) EMBO J.3, p801-805 に記述されている方法により、合成で作成される。phosphoroamidite法においては、例えば、自動ＤＮＡ合成機によってオリゴヌクレオチドが合成され、精製され、再会合され、連結され、そして適切なベクターにおいてクローン化される。
ヌクレオチド配列は、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ由来の断片を標準的な技術により（適宜）連結することで作成された、ゲノム由来配列と合成配列との混合配列、合成配列とｃＤＮＡ由来配列との混合配列、又はゲノム由来配列とｃＤＮＡ由来配列との混合配列である。それぞれの連結された断片は、ヌクレオチド配列全体の様々な部分に相当する。ＤＮＡ配列は、例えばＵＳ４、６８３、２０２又は、Saiki R K et al(Science (1988) 239, pp487-491)に記述されているように、特定のプライマーを使用したポリメレラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によっても作成される。
ヌクレオチド配列
本発明は、本明細書に定義されている特異性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列をも含む。本明細書で使用される「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド配列若しくはポリヌクレオチド配列、及び変異体、相同物、断片、それらの（それらの一部などの）派生物に対応する。ヌクレオチド配列は、ゲノム、又は合成、又は組換え由来であって、二重鎖又はセンス若しくはアンチセンス鎖のいずれかに相当する一本鎖である。
本発明に関する「ヌクレオチド配列」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡを含む。好ましくはＤＮＡを意味し、より好ましくは配列をコードするｃＤＮＡを意味する。
好ましい実施例において、自然界に存在する野生型（native）ヌクレオチド配列が、やはり自然界に存在し前記野生型ヌクレオチド配列と自然に会合する配列に結合している場合、かかる野生型ヌクレオチド配列は、本明細書で定義される特異性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列自体には含まれない。参照を容易にするために、本発明者らは、この好ましい実施例を「非野生型（non-native）ヌクレオチド配列」と呼ぶ。この関連で、「野生型ヌクレオチド配列」とは、自然界に存在する配列が、その配列と自然に会合し、やはり自然界にある完全プロモーターと作動的に結合している完全ヌクレオチド配列をいう。それゆえ、本発明のポリペプチドは、それが由来する生物におけるヌクレオチド配列によって発現させることができるが、それが可能なのは、このヌクレオチド配列が、かかる生物内で自然に会合するプロモーターの制御下にない場合である。
好ましくは、ポリペプチドは、野生型ポリペプチドではない。この関連で、「野生型ポリペプチド」という用語は、野生型ヌクレオチド配列により発現されているときの、自然環境におけるポリペプチド全体を意味する。
典型的には、本明細書で定義される特異性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術（即ち組換えＤＮＡ）を使用して作成される。しかしながら、発明の別の実施例においては、全体若しくは部分において、当業界によく知られた化学的方法（Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23、及び Horn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232 参照せよ）を使用して、ヌクレオチド配列は合成されうる。
分子進化
酵素をコード化しているヌクレオチド配列が単離されて、又は推測上の酵素をコード化しているヌクレオチド配列が同定されると、選択されたヌクレオチド配列を改変することが望ましく、例えば本発明による酵素を作成するために、配列を変異させることが望ましい。
変異は、合成オリゴヌクレオチドを使用して導入される。これらのオリゴヌクレオチドは、目的とする変異部位と隣接するヌクレオチド配列を含む。
適当な方法は、Morinaga et al (Biotechnology (1984)2, p646-649) に開示されている。酵素をコード化するヌクレオチド配列に変異を導入する別の方法は、Nelson and Long (Analytical Biochemistry(1989),180,p147-151)に記述されている。
上述のような、部位特異的突然変異誘発法の代わりに、例えばStratagene社製ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＰＣＲ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット、又はClontech社製 Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ ＰＣＲ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットのような商業的キットを使用して、変異を無作為に導入することができる。ＥＰ０５８３２６５は、ＰＣＲを基礎とした突然変異生成を至適化する方法について言及しており、ＥＰ０８６６７９６で記述されているような変異ＤＮＡ類似体の使用と組み合せることもできる。間違いの発生しやすいＰＣＲ技術は、好ましい特徴をもつ脂質アシルトランスフェラーゼの変異体の作成に適している。ＷＯ０２０６４５７は、リパーゼの分子進化について言及している。
新規の配列を得る３番目の方法は、任意の数の制限酵素、若しくはＤｎａｓｅＩのような酵素のいずれかを使用して、同一でないヌクレオチド配列を断片化し、機能的なタンパク質をコードしている完全長のヌクレオチド配列を再構築することである。或いは、一又は複数野の同一でないヌクレオチド配列を使用し、完全長のヌクレオチド配列の再構築する間に変異を導入することができる。ＤＮＡシャッフリングとファミリーシャッフリング技術は、好ましい特徴をもつ脂質アシルトランスフェラーゼの変異体の作成に適している。シャッフリングを起こす適当な方法は、ＥＰ０７５２００８、ＥＰ１１３８７６３、ＥＰ１１０３６０６で見られる。シャッフリングは、ＵＳ６、１８０、４０６及びＷＯ０１／３４８３５に記述されているようなＤＮＡの突然変異生成の他の形態と組み合せることもできる。
それゆえ、ヌクレオチド配列に多数の部位特異的な、又は無作為の変異を、インビボ又はインビトロのいずれかにおいて作り出し、且つコード化されたポリペプチドの改良された機能性を、様々な手段により実質的に選別することは可能である。コンピューター及びexo mediatedを組み合せた方法（ＷＯ００／５８５１７、ＵＳ６、３４４、３２８、ＵＳ６、３６１、９７４参照）を使用して、例えば、分子進化は、作成された変異体が既知の酵素及びタンパク質ととても低い相同性を保持する場合でも行なわれることができる。それによって得られたそのような変異体は、既知のトランスフェラーゼ酵素の重要な構造的類似性を有するが、とても低いアミノ酸配列相同性を有する。
非制限的な例として、加えて、ポリヌクレオチド配列の変異体又は自然変異体は、新しい変異体を作り出すための野生型又は他の変異又は自然変異体のいずれかと組み合せられることができる。そのような新しい変異体は、コード化されたポリペプチドの改良された機能性について選別されることもできる。
上記の及び類似の分子進化技術の適用は、タンパク質構造又は機能のいずれの以前の知識なしに、好ましい特徴を有する本発明の酵素変異体の同定及び選択を許容し、予測できない、しかし有用な変異又は変異体の作成を許容するものである。酵素活性の至適化又は変更について、当業界においては分子進化の適用について多数の例があり、そのような例は、それに限定されるものではないが、一又は二以上の以下の、宿主細胞又はインビトロにおける至適化された発現若しくは活性、増加した酵素活性、変更された基質及び／若しくは生成物の特異性、増加した若しくは減少した酵素的又は構造的安定性、例えば温度、ｐＨ，及び／若しくは基質といった好ましい環境状況における変更された酵素活性／特異性を含む。
当業者には明らかであろうが、分子進化手段を使用することで、酵素は、酵素の機能性を改良するために変更される。
好適には、本発明において使用される脂質アシルトランスフェラーゼは変異体であり、即ち親酵素と比較したときに、少なくとも一のアミノ酸の置換、欠失、付加を含む。酵素の変異体は、少なくとも１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％の親酵素との相同性を保持する。好適な親酵素は、エステラーゼ若しくはリパーセ活性のあるいずれかの酵素を含む。好ましくは、親酵素はｐｆａｍ００６５７共通配列とアラインする。
好ましい実施例では、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の変異体は、ＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ，及びＨＰＴブロックに見出される、少なくとも一又は二以上のｐｆａｍ００６５７共通配列アミノ酸残基を保持し、又は組み入れている。
水性環境において脂質アシルトランスフェラーゼ活性がない又は低い、リパーゼのような酵素は、本発明の構成及び方法における使用のために適当で重要なトランスフェラーゼ活性をもつ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素を作成するように、トランスフェラーゼ活性を導入若しくは増強するために分子進化手段を使用して、変異をさせることができる。
好適には、発明における使用のための脂質アシルトランスフェラーゼは、親酵素と比較した場合、リン脂質の酵素活性が増強された変異体である。好ましくは、そのような変異体はまた、リゾ極性脂質に対して活性が低い、若しくは無い。リン脂質についての増強された活性は、加水分解及び／又は、トランスフェラーゼ活性、又は両者の組合せの結果である。
本発明における使用のための脂質アシルトランスフェラーゼの変異体は、親酵素と比較して、トリグリセリド、及び／又はモノグリセリド、及び／又はジグリセリドについて低下した活性を有する。
好適には、酵素の変異体は、トリグリセリド、及び／又はモノグリセリド、及び／又はジグリセリドについて活性を有しない。
或いは、発明における使用のための酵素の変異体は、トリグリセリドについて増加した活性を有し、且つ／又は一又は二以上の以下の極性脂質、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリンについて増加した活性を有する。
脂質アシルトランスフェラーゼの変異体は知られており、一若しくは二以上のそのような変異体は、本発明による方法及び使用において、及び／又は本発明による酵素構成において使用されるために適しているものである。一例としてのみであるが、脂質アシルトランスフェラーゼの変異体は、以下の文献、即ちHilton & Buckley J Biol. Chem. 1991 Jan 15:266(2): 997-1000; Robertson et al J. Biol. Chem. 1994 Jan 21; 269(3): 2146-50; Brumlik et al J. Bacteriol 1996 Apr; 178(7): 2060-4; Peelman et al Protein Sci. 1998 Mar; 7(3): 587-99、に記述されており、本発明により使用される。
アミノ酸配列
本発明はまた、本発明に定義されている特異性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を含む。
本明細書に使用されているように、「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」という用語、及び／又は「タンパク質」という用語と同義語である。いくつかの例においては、「アミノ酸配列」という用語は、「ペプチド」という用語と同義語である。
アミノ酸配列は、適当な起源から作製され／単離され、又は合成により作られ、組換えＤＮＡ技術の使用により作製される。
好適には、アミノ酸配列は、標準的な技術により本明細書に教示されているように、単離されたポリペプチドにより得られる。
単離されたポリペプチドからアミノ酸配列を決定する適当な方法の１つは、以下の通りである。
精製ポリペプチドを凍結乾燥し、凍結乾燥した原料１００μｇを、８Ｍの尿素と０．４Ｍの炭酸水素アンモニウムとの混合液５０μｌに溶解させる。溶解させたタンパク質を窒素で覆い、４５ｍＭのジチオスレイトール５μｌを加えて、１５分間５０℃にて変性させ、還元させる。室温に冷却後、１００ｍＭのヨードアセトアミド５μｌを加え、暗所窒素下で１５分間室温にてシステイン残基を誘導体化する。
１３５μｌの水及び５μｌの水に溶解した５μｇのＬｙｓ−Ｃエンドプロテアーゼは、上述の反応混合液に加えられ、３７℃にて窒素下で２４時間消化が行なわれた。
結果として生じたペプチドは、水に溶解した０．１％ＴＦＡである溶媒Ａと、アセトニトリルに溶解した０．１％のＴＦＡである溶媒Ｂを使用して、ＶＹＤＡＣ Ｃ１８カラム（０．４６×１５ｃｍ；１０μｍ；The Separation Group社製, California, USA）により逆相ＨＰＬＣで分離される。選択されたペプチドは、Ｎ−末端の配列決定の前に同じ溶媒系を使用してDevelosil、C18カラムにより、再度クロマトグラフされる。配列決定は、パルス液体高速周期を使いApplied Biosystems 476Aシーケンサーを用いて、製造者（Applied Biosystems社 California, USA）の指示により行なわれる。
配列の同一性、又は配列の相同性
本発明はまた、本明細書で定義される特異性を有するポリペプチドの、若しくはそのようなポリペプチドをコード化しているいずれかのヌクレオチド配列（以後相同配列と呼ぶ）の、アミノ酸配列とある程度の配列の同一性若しくは配列の相同性を有している配列の使用を含む。ここで、「相同物」という用語は、対象となるアミノ酸配列、及び対象となるヌクレオチド配列とある程度の相同性を有するエンティティ（entity）を意味する。ここで、「相同性」という用語は、同一性と同義である。
相同性のあるアミノ酸配列及び／若しくはヌクレオチド配列は、機能活性を保持し且つ／又は酵素の活性を増強するポリペプチドを、提供及び／又はコード化するものでなければならない。
現在の状況において、相同配列は、少なくとも７５、８５、若しくは９０％同一、好ましくは少なくとも９５若しくは９８％対象となる配列と同一であるアミノ酸配列を含むように取得される。典型的には、相同物は、対象となるアミノ酸配列と同じ活性部位などを含むであろう。相同性は、類似という観点でも考慮され得るが（即ち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明との関連では、配列の同一性という観点で相同性は表現されるのが好ましい。
現在の状況において、相同配列は、少なくとも７５、８５、若しくは９０％同一、好ましくは少なくとも９５、若しくは９８％本発明のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列（対象配列）と同一であるヌクレオチド配列を含むように取得される。典型的には、相同物は、活性部位をコードする対象配列と同じ配列などを含むであろう。相同性は、類似という観点でも考慮され得るが（即ち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明との関連では、配列の同一性という観点で相同性は表現されるのが好ましい。
相同性の比較は、視覚により、またより通常には、すぐに入手できる配列比較プログラムを用いて行なうことができる。これらの商業的に利用できるコンピュータープログラムは、二又は三以上の配列の間の相同性の％を計算することができる。
相同性％は、隣接する配列について計算され、即ち１つの配列は、他の配列とアラインされ、１つの配列の中のそれぞれのアミノ酸は、他の配列において対応するアミノ酸と一残基ずつ直接比較される。これは、ギャップのない（ungapped）アラインメントと呼ばれる。典型的には、そのようなギャップのないアラインメントは、比較的残基数が少ない場合についてのみ行なわれる。
これは、とても簡単で、一貫性のある方法であるが、例えば、同一の一対の配列において、１つの挿入又は欠失が、以下のアミノ酸残基をアラインメントから締め出すということを起こすであろう。それゆえ、潜在的には、広範囲のアラインメントが行なわれる場合は、相同性の％が大幅に低下する。結果的には、ほとんどの配列比較方法は、全体的な相同性のスコアを過度に不利にすることなく、可能な挿入と欠失を考慮に入れる至適なアラインメントを作成するように設計されている。これは、局部的な相同性を最大化するように試みる配列アラインメントにおけるギャップを挿入することによる達成される。
しかしながら、これらのより複雑な方法は、同じ数の同一のアミノ酸について、比較する配列の間のより高い関係性を反映して、できるだけギャップ数が少ない配列アラインメントが、ギャップ数の多いものよりも高スコアを得るよう、ギャップペナルティーをアラインメントにおけるそれぞれのギャップに割り当てる。「アフィンギャップコスト」は、典型的にギャップが存在すると比較的高いコストを課し、ギャップ中において次に続く各残基については、より少ないペナルティーを課す。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、もちろんより少ないギャップについて至適化されたアラインメントを作り出すであろう。ほとんどのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティーを変更することができる。しかしながら、そのようなソフトウェアを配列比較のために使用するときは、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧウィスコンシンベストフィットパッケージ（GCG Wisconsin Bestfit package）を使用するときは、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティーは、ギャップにつき−１２であり、各伸長につき−４である。
最大の相同性％の計算は、それゆえ第一に、ギャップペナルティーを考慮に入れつつ至適なアラインメントの作成を要求する。そのようなアラインメントを実行するための好適なコンピュータープログラムは、ＧＣＧウィスコンシンベストフィットパッケージ(Devereux et al 1984 Nuc.Acids Research 12 p387)である。配列比較を行なうことができる他のソフトウェアの例は、これらに制限されないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed-Chapter 18参照）、ＦＡＳＴＡ（Altschul et al 1990 J. Mol. Biol.403-410参照）、及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較手段セットである。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡは両方とも、オフラインとオンラインの検索で利用できる（Ausubel et al 1999、pages 7-58 to 7-60参照）。しかしながら、いくつかの適用においてＧＣＧウィスコンシンベストフィットプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ２配列と呼ばれる新しい手段は、タンパク質とヌクレオチド配列を比較することにも利用できる（FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8 及び tatiana@ncbi.nlm.nih.gov参照）。
最終的な相同性％は、同一性に関して測定されるが、アラインメントの過程それ自体は、典型的にオールオアナッシングの一対比較に基づくものではない。それよりむしろ、スケール（scaled）類似スコアマトリックスは、一般的に、化学的類似性又は進化距離に基づくそれぞれの一対ごとに比較をスコアとするように使用されている。通常使用されているそのようなマトリックスの例は、ＢＬＡＳＴのプログラム一式のデフォルトマトリックスである、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。ＧＣＧウィスコンシンプログラム（GCG Wisconsin programs）は、一般的に、もし提供されるならば（詳細は使用説明書参照）、公的デフォルトバリュー、又はカスタムシンボル比較表（custom symbol comparison table）のいずれかを使用する。いくつかの適用については、ＧＣＧパッケージのための公的デフォルトバリューを、又は他のソフトウェアの場合はＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルトマトリックスを使用するのが好ましい。
或いは、相同性のパーセンテージは、ＣＬＵＳＴＡＬ(Higgins DB & Sharp PM (1988), Gene 73(1),237-244)に類似する演算手順に基づいて、ＤＮＡＳＩＳＴＭ(Hitachi Software社製)において、複合的なアラインメントの特徴を使用して計算される。
一旦ソフトウェアが至適なアラインメントを作り出したならば、相同性％、好ましくは配列の同一性の％を計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部としてこれを行ない、数値結果を出力する。
本発明の好ましい態様では、以下のソフトウェアと、相同性／同一性のパーセンテージを計算する設定とが使用される。アミノ酸配列について、同一性（相同性）のパーセンテージ、又は「正数（positive）」は、アラインＸベクターＮＴＩ(Vector NTI Advance 9.1 Invitrogen Corporation社製,Carlsbad, California, USA.)により計算され、アミノ酸配列のそれぞれの可能な一対について、設定は、デフォルトパラメーター（Gap opening penalty-10、Gap extension penalty 0.1）である。
配列はまた、沈黙の変更を作り出し、且つ機能的には同等の物質を生じる、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有するかもしれない。意図的なアミノ酸の置換は、対象の二次的結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質における類似性に基づいて作られる。例えば、負に帯電したアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含み、正に帯電したアミノ酸は、リジンやアルギニンを含み、類似の疎水性価を有する荷電していない極性頭部基を伴うアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンを含む。
保存的な置換は、例えば下記の表のとおり行なわれる。２列目の同じ区画におけるアミノ酸と好ましくは３列目の同じ行のアミノ酸は、お互いに置換できる。
Figure 0005604032
 本発明はまた、相同的な置換（置換と代替は、双方とも本明細書では、既存のアミノ酸残基と別の残基との交換を意味するために使用される）、即ち塩基性と塩基性、酸性と酸性、極性と極性等のような同種置換（like-for-like substitution）を起こしうるものを含む。非相同の、即ち一の部類の残基から他の部類へ、或いはオルニチン（以下Ｚと呼ぶ）、diaminobutyric acid ornithine（以下Ｂと呼ぶ）、norleucin ornithine（以下Ｏと呼ぶ）、pyriylalanine、thienylalanine、naphtyl alanine、及びphenylglycineのような不自然なアミノ酸の包含に関わるような置換もまた起こる。
代替は、非天然アミノ酸によっても作り出されうる。
アミノ酸配列の変異体は、グリシン又はβ―アラニン残基のようなアミノ酸スペーサーに加えて、メチル、エチル、又はプロピル基のようなアルキル基を含む配列のいずれか二つのアミノ酸残基の間に挿入される適切なスペーサー群を含む。ペプトイド形の一又は二以上のアミノ酸残基の存在に関わるさらに進んだ形の変異は、当業者にとって良く理解されるであろう。誤解を避けるため、ペプトイド形とは、α―炭素置換基が、残基のα―炭素ではなく窒素原子上のアミノ酸残基変異体を意味する。ペプトイド形のペプチドを作成する過程は、当業者には、知られており、例えば、Simon RJ et al.,PNAS(1992)89(20),9367-9371及び Horwell DC,Trends Biotechnol.(1995) 13 (4), 132-134である。
本発明において使用されるヌクレオチド配列、又は本明細書に定義されている特異性を有するコード化されているポリペプチドは、合成の、又は改変されたヌクレオチドをそれらの中に含む。オリゴヌクレオチドについての多くの異なったタイプの改変が当業界に知られている。これらは、メチルホスホネート、及びホスホロチオエートのバックボーン並びに／或いは分子の３’及び／又は５’末端にアクリジン 若しくはポリリジン鎖の付加を含む。本発明の目的は、本明細書に記述されているヌクレオチド配列が、当業界で利用できるいずれの方法によっても改変されることが理解されるということである。そのような改変は、インビボ活性、又はヌクレオチド配列の寿命を増強するために行なわれる。
本発明はまた、本明細書で論じられている配列と相補的なヌクレオチド配列、又は派生物、断片若しくはそれらの派生物のいずれかの使用を含む。配列がその断片と相補的であれば、配列は、他の生物等において類似のコード配列を同定するプローブとして使用することができる。
本発明の配列と１００％相同ではないが、本発明の範囲に入るポリヌクレオチドは、多くの方法で得ることができる。
本明細書に記述されている配列の他の変異体は、例えば、個人、例えば母集団の異なる個人の範囲で作られたＤＮＡライブラリーを精査することで得られる。加えて、他のウイルス／バクテリア、又は細胞の相同物、特に哺乳類の細胞（ラット、ネズミ、ウシ、若しくは霊長類の細胞）に見出される細胞の相同物が得られ、そのような相同物とその断片は一般に、本明細書に記載されている配列に示される配列と選択的にハイブリダイズすることができるであろう。そのような配列は、他の動物種から作成されたｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリーを精査することで、並びにそのようなライブラリーを添付されている配列リストのいずれか一の配列のすべて又は一部を含むプローブを用いて、中程度から高度のストリンジェンシーを有する条件下で探索することで得ることができる。同様の考慮は、相同分子種、及び本発明のポリペプチド又はヌクレオチド配列の対立遺伝子多型を得ることについて適用する。
変異体及び菌株／種の相同物はまた、本発明の配列内の保存されたアミノ酸配列をコード化する変異体及び相同物における配列を標的とするために設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを使用して得られる。保存された配列は、例えば、いくつかの変異体／相同物からアミノ酸配列をアラインすることで、予想されることができる。配列アラインメントは、当業界に知られたコンピューターソフトウェアを使用することで行なわれる。例えば、ＧＣＧウィスコンシンパイルアップ（GCG Wisconsin PileUp）プログラムが広く使用されている。
縮重ＰＣＲにおいて使用されるプライマーは、一又は二以上の縮重位置を含み、且つ既知の配列に対して単一の配列プライマーで配列をクローニングするために使用されるよりも、低いストリンジェンシー条件で使用されるものである。
或いは、そのようなポリヌクレオチドは、特徴ある配列の部位特異的突然変異誘発により得ることができる。このことは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現している特定の宿主細胞についてコドン選択を至適化するために、沈黙のコドン配列の変更が要求される場合に有用である。他の配列変更は、制限的なポリペプチドの認識部位を導入し、又はポリヌクレオチドにコード化されているポリペプチドの特性若しくは機能を変更するために望ましいものである。
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）は、プライマー、例えばＰＣＲプライマーで、選択的な増幅反応のためのプライマー、プローブ例えば放射性若しくは非放射性の標識を使用した常法による明白な（retrieving）標識により標識されたもの、を作成するために使用され、或いは、ポリヌクレオチドはベクターにクローニングされる。そのようなプライマー、プローブ及び他の断片は、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０、又は４０ヌクレオチド長であり、且つ本明細書で使用される本発明のポリヌクレオチドという用語の範疇にある。
ＤＮＡポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチド及び本発明によるプローブは、組換えにより、合成により、又は当業者に利用可能ないずれかの手段によって作成されうる。それらもまた、標準的な技術によりクローンされる。
一般的にプライマーは、一ヌクレオチドずつ作製して所望のヌクレオチド配列を得るという段階的な作製法を含む合成手法によって作製される。これを達成するための自動化された技術を使用した技術は、既に当業界で利用可能である。
より長いポリヌクレオチドは一般的に組換え手段を使用して、例えばＰＣＲ（ポリメレラーゼ連鎖反応）クローン技術を使用して作成される。これは、クローンすることが望まれる脂質標的配列領域に隣接する一対のプライマー（例えば約１５から３０ヌクレオチド）を作ること、動物や人間の細胞から得られたｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとプライマーを接触させること、目的とする領域の増幅を起こす条件下でポリメレラーゼ連鎖反応を行なうこと、目的とする増幅された断片（例えばアガロースゲル上で反応混合物を精製することにより）を単離すること、及び増幅されたＤＮＡを回復することに関わるものである。プライマーは、増幅されたＤＮＡが適当なクローニングベクターでクローンされることができるように、適当な制限酵素認識部位を含むように設計される。
ハイブリダイゼーション
本発明はまた、本発明の配列と相補的な配列、又は本発明の配列若しくはそれと相補的な配列のいずれかとハイブリダイズすることができる配列を含む。
「ハイブリダイゼーション」という用語は、本明細書で使用されているように、ポリメレラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術において行なわれる増幅の過程と同様、核酸鎖が塩基対を通じて相補鎖と結合する過程を含む。
本発明はまた、本明細書で論じられている対象配列、又は派生物、断片若しくはその派生物のいずれかと相補的である配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列の使用を含む。
本発明はまた、本明細書で論じられているヌクレオチド配列とハイブリダイズできる配列と相補的である配列を含む。
ハイブリダイゼーションの条件は、Berger and Kimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology,Vol.152,Academic Press, San Diego CA)で教示されているように、ヌクレオチドの結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、且つ下記に説明されるように、定義された「ストリンジェンシー」を付与するものである。
最高度のストリンジェンシーは、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃下）、高度のストリンジェンシーは、Ｔｍの５℃から１０℃下、中程度のストリンジェンシーは、Ｔｍの１０℃から２０℃下、低いストリンジェンシーはＴｍの２０℃から２５℃下で起こる。当業者には理解されるように、中程度の（若しくは低い）ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションが、類似の、又は関連したポリヌクレオチド配列を同定又は検出するために使用されることができるのに対し、最高度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、同一のヌクレオチド配列を同定又は検出するために使用されることができる。
好ましくは、本発明は、本明細書で定義されている特異性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を、高度のストリンジェンシーの条件、又は中程度のストリンジェンシーの条件下においてハイブリダイズすることができる配列に相補的な配列を含む。
より好ましくは、本発明は、高度のストリンジェンシーの条件下（例えば、６５℃で0.1xSSC｛1xSSC=0.15M NaCl,0.015M Na-citrate pH7.0｝）で、本明細書で定義される特異性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる配列と相補的な配列を含む。
本発明はまた、本明細書で論じられているヌクレオチド配列（本明細書で論じられているものと相補的な配列を含む）とハイブリダイズできるヌクレオチド配列と関連する。
本発明はまた、本明細書で論じられているヌクレオチド配列（本明細書で論じられているものと相補的な配列を含む）とハイブリダイズできる配列と相補的なヌクレオチド配列と関連する。
また、本発明の範囲内に含まれるのは、中程度から最高度のストリンジェンシーの条件下で、本明細書に論じられているヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列である。
好ましい態様では、本発明は、本明細書で論じられているヌクレオチド配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を、又はストリンジェントな条件（例えば、５０℃及び０．２×ＳＳＣ）下で、その相補体を対象とする。
より好ましい態様では、本発明は、本明細書で論じられているヌクレオチド配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を、又は高度のストリンジェントな条件下（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ）でその相補体を対象とする。
ポリペプチドの発現
本発明における使用のための、又は本明細書で定義される特異性を有するポリペプチドをコード化するためのヌクレオチド配列は、複製可能な組換えベクターに組み入れられることができる。ベクターは、ヌクレオチド配列をポリペプチドの形で、適合性のある宿主細胞内で及び／又は宿主細胞から複製又は発現するために使用される。発現は、プロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む制御配列（control sequences）を使用することで調整される。原核生物のプロモーターと真核細胞において機能できるプロモーターが使用される。細胞組織特有の又は刺激特有のプロモーターが使用される。上述の２又は３以上の異なるプロモーター由来の配列要素を含むキメラのプロモーターもまた使用される。
ヌクレオチド配列の発現による宿主組換え細胞によって作製されたポリペプチドは、使用した配列及び／若しくはベクターに応じて、分泌され、或いは細胞内に含まれる。コード配列は、配列をコードする物質の、特定の原核又は真核細胞膜を介した分泌を誘導するシグナル配列を用いて設計することができる。
発現ベクター
発現ベクターという用語は、インビボ又はインビトロの発現ができる構築物(construct)を意味する。
好ましくは、発現ベクターは、生物のゲノムに組み入れられる。好ましくは、「組み入れられる」という用語は、ゲノムの中に安定して組み入れられることを対象とする。
本発明の、又は本明細書で定義される特異性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、調節配列（regulatory sequences）が適当な宿主生物によるヌクレオチド配列の発現を提供できる調節配列であるようにヌクレオチド配列が調節配列に作動的に連結しているベクターに存在する、即ちベクターは発現ベクターである。
本発明のベクターは、後述のように本明細書に定義される特異性を有するポリペプチドの発現を提供するための適当な宿主細胞に形質転換される。
ベクターの選択は、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ又はベクターであり、多くの場合導入される宿主細胞に応じたものとなろう。
ベクターは、抗生物質抵抗性の、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン抵抗を有する遺伝子のような一又は二以上の選択できるマーカー遺伝子を含むことができる。或いは、選択は（ＷＯ９１／１７２４３に記述されているように）同時形質転換によって達成される。
ベクターは、例えばＲＮＡの作成のためにインビトロで使用され、又は宿主細胞の形質移入若しくは形質転換のために使用される。
それゆえ、更なる実施例において、本発明は、本発明のヌクレオチド配列、又はヌクレオチド配列を複製可能なベクターに導入することにより、ベクターを互換性のある宿主細胞に導入することにより、及びベクターの複製を引き起こす条件下で宿主細胞を培養することにより、本明細書に定義される特異性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を作る方法を提供する。
ベクターは、さらに問題となっている宿主細胞においてベクターを複製させるヌクレオチド配列を含む。そのような配列の例は、プラスミドpUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、及びpIJ702の複製起点である。
調節配列
いくつかの適用においては、本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、又は本明細書に定義される特異性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、選択された宿主細胞による場合のように、ヌクレオチド配列の発現を提供できる調節配列に作動的に連結（operably linked）される。一例として、本発明は、そのような調節配列に作動的に連結する本発明のヌクレオチド配列を含むベクター、即ちベクターは発現ベクターである、を対象とする。
「作動的に連結された」という用語は、記述された要素が、意図されたように機能することができるような並列関係を意味する。コード配列に「作動的に連結された」調節配列は、制御配列に適合する条件下でコード配列が発現されるように連結されている。
「調節配列」という用語は、プロモーターとエンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む。
「プロモーター」という用語は、当業界の普通の意味で使用され、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
本明細書に定義される特異性を有する酵素をコード化するヌクレオチド配列の発現増強は、非相同性の調節領域、例えばプロモーター、分泌リーダー、及びターミネーター領域、の選択によっても達成される。
好ましくは、本発明のヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターに作動的に連結される。
バクテリア、真菌、酵母宿主におけるヌクレオチド配列の転写を誘導する適当なプロモーターの例は、当業界によく知られている。
構築物
「構築物」という用語は、「抱合体」（conjugate）、「カセット」、及び「ハイブリッド」の同義語であり、直接的に又は間接的にプロモーターに結合している本発明による使用のために本明細書に定義される特異性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。間接的な結合の例は、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列の間に介在するＳｈ１−イントロン若しくは、ＡＤＨイントロンのような適当なイントロン配列などの適当なスペーサー群の提供である。同様のことは、直接的又は間接的な結合を含む本発明との関係で「融合する（fused）」という用語についてもあてはまる。いくつかのケースにおいては、この用語は、双方がそれらの自然環境に存在する場合に、野生型遺伝子のプロモーターと通常に会合するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の自然な組合せを対象としていない。
構築物は、遺伝的構築物の選択を可能とするマーカーを含み、又は発現させることができる。
いくつかの適用において好ましくは、構築物は、少なくとも本発明のヌクレオチド配列、又はプロモーターに作動的に連結している、本明細書で定義される特異性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む。
宿主細胞
本発明との関連における「宿主細胞」という用語は、本明細書で定義される特異性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列、又は上述の本明細書で定義される特異性を有するポリペプチドの組換え体産生において使用される発現ベクターのいずれかを含む任意の細胞を含む。
それゆえ、本発明の更なる実施例は、形質転換された、若しくは本発明のヌクレオチド配列により形質移入された宿主細胞、又は本明細書で定義される特異性を有するポリペプチドを発現するヌクレオチド配列を提供する。細胞は、前記ベクターと互換性があるように選択され、例えば、原核生物（例えばバクテリア）、真菌、酵母、又は植物細胞である。好ましくは、宿主細胞は人間の細胞ではない。
適当なバクテリアの宿主生物は、グラム陽性細菌又はグラム陽性細菌である。
本明細書で定義される特異性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列の性質の、及び／又は発現されるタンパク質の更なる修飾の望ましい状況に応じて、酵母や他の真菌のような真核生物の宿主が好まれる。一般的に、操作がより簡単なため、酵母細胞が真菌の細胞よりも好まれる。しかしながら、いくつかのタンパク質は、酵母細胞からの分泌が乏しいか、いくつかのケースでは正しく修飾されない（例えば酵母では過剰糖鎖付加）かのいずれかである。
酵母、真菌、及び植物宿主細胞のような適当な宿主細胞の使用は、本発明の組換え発現生成物の至適な生物的活性を与えることが必要されたうえで、翻訳後の修飾（例えば、ミリストイル化、糖鎖付加、切断（truncation）、投石（lapidation）、及びチロシン、セリン、若しくはトレオニンのリン酸化）を提供する。
宿主細胞は、プロテアーゼ欠損又は、プロテアーゼマイナス株である。
生物
本発明との関連における「生物」(organism)という用語は、本発明によるヌクレオチド配列、又は本明細書で定義される特異性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列及び／又はそれらから得られる産生物を含むことができるいかなる生物を含む。
好適な生物は、原核生物、真菌、酵母、又は植物である。
本発明との関係においての、「遺伝子導入生物」（transgenic organism）という用語は、本明細書で定義される特異性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、及び／若しくはそれから得られる生成物とを含み、並びに／又はプロモーターは、生物に本明細書で定義される特異性のあるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させることができる、いかなる生物をも含んでおり、好ましくはヌクレオチド配列が、生物のゲノムに組み入れられたものである。
「遺伝子導入生物」という用語は、自然環境においても野生型のプロモーターの制御下にある場合に、自然の環境において配列をコードする野生のヌクレオチドを対象としない。
従って、本発明の遺伝子導入生物は、本明細書で定義される特異性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、本明細書で定義される構築物、本明細書で定義されるベクター、本明細書で定義されるプラスミド、本明細書で定義される細胞又はその産生物のいずれかを含む生物を含む。例えば、遺伝子導入生物は、非相同のプロモーターの制御下で、本明細書で定義される特異性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をも含むこともできる。
宿主細胞／生物の形質転換
先に述べたように、宿主生物は、原核又は真核生物でありうる。好適な原核生物の宿主の例としては、大腸菌及び枯草菌が含まれる。
一実施例では、宿主細胞はバクテリア、好ましくはグラム陽性菌であり、好ましくはビフィドバクテリア及びアエロモナス、特に好ましくはアエロモナス・サルモニシダのようなアクチノバクテリアから選択された宿主細胞である。さらにより好ましくは、コリネバクテリア、とりわけコリネバクテリウム・グルタミカム及びノカルディアである。特に好ましいのは、ストレプトマイセス、特にストレプトマイセス・リビダンスのようなストレプトマイセス科のものが好まれる。
微生物の宿主は、例えば真正細菌、古細菌、酵母を含む真菌などの、ガラクトリパーゼ遺伝子の発現に使用される。好まれるのは真正細菌であり、例えば枯草菌や他のバチルス種のようなファーミキューテス（グラム陽性低ＧＣ含量細菌）、ラクトバチルス及びラクトコッカス属の菌種などの乳酸菌である。
また、グラム陰性プロテオバクテリア、特にシュードモナス、ザントモナス、シトロバクターと、エシェリキア属特に大腸菌に属する宿主種のような、ガンマプロテオバクテリアが好ましい。
好ましくは、宿主種は、英国出願番号０５１３８５９．９に詳述されているアエロモナス・サルモニシダ、ストレプトマイセス・リビダンス、又はコリネバクテリウム・グルタミカムのようなグラム陽性発現宿主である。
他の実施例では、宿主細胞は野生の宿主種と同じ属であり、即ち組換え遺伝子は、組換え遺伝子が単離された種と同じ種に再導入され、且つ発現している。
他の実施例では、宿主細胞は野生の宿主種であり、即ち組換え遺伝子は、組換え遺伝子が単離された種と同じ種に再導入され、且つ発現している。
当業界では、原核生物の宿主の形質転換についての教示は充分に文書化されている。例えば、Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ndedition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) を参照せよ。原核生物の宿主が使用される場合、ヌクレオチド配列は形質転換の前に、例えばイントロンの除去のように、適切に改変される必要がある。
別の実施例では、遺伝子導入生物は酵母でありうる。
糸状体の真菌は、プロトプラスト形成と、既知の方法で細胞壁の再生を伴うプロトプラストの形質転換とに関わる処理のような、当業界に知られた様々な方法を使用して形質転換される。アスペルギルスの宿主微生物としての使用は、ＥＰ０２３８０２３に記述されている。
別の宿主生物は、植物でありうる。植物を形質転換するのに使用される一般的技術の概説は、Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol (1991)42:205-225)及び Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27) の論文に見られる。植物の形質転換についての更なる教示は、ＥＰ−Ａ−０４４９３７５に見られる。
真菌、酵母、及び植物の形質転換についての一般的教示は、以下の項で示されている。
形質転換された真菌
宿主生物は、糸状菌のような真菌でありうる。好適な宿主の例としては、テルモマイセス、アクレモニウム、アスペルギルス、ペニシリウム、ムコール、ニューロスポラ、トリコデルマ属などに属する任意の菌を含む。
糸状菌の形質転換についての教示は、当業界によく知られている糸状菌の形質転換及び真菌の培養の標準的な技術を記載しているＵＳ−Ａ−５７４１６６５に概説されている。ニューロスポラ・クラッサに適用される技術の広範囲にわたる概説が、例えば、Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971)17A: 79-143 に見られる。
さらに、ＵＳ−Ａ５６７４７０７に糸状菌の真菌の形質転換についての教示が総説されている。
一態様では、宿主生物はアスペルギルス・ニガーのようなアスペルギルス属のものである。
本発明による遺伝子導入アスペルギルスは、以下の例えばTurner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli S.D.,Kinghorn J.R.(Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp641-666)の教示により作成される。
糸状菌の遺伝子発現は、Punt et al.(2002) Trends Biotechnol 2002 May;20(5):200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997)17(4):273-306 で概説されている。
形質転換酵母
別の実施例では、遺伝子導入生物が酵母でありうる。
酵母における非相同遺伝子発現の原理の概説は、例えば、Methods Mol Biol (1995),49:341-4, 及び Curr Opin Biotechnol(1997) Oct;8(5):554-60にて提供されている。
この点で、サッカロミセス・セルビシ(saccharomyces cerevisi)、又はピキア・パストリス種（FEMS Microbiol Rev(2000 24(1):45-66 参照) のような酵母が、非相同遺伝子発現の媒体として使用される。
サッカロミセス・セルビシエにおける、非相同遺伝子発現、及び遺伝子産生物の分泌についての原理の概説は、E Kenny (1993, “Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes”, Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.)に示されている。
酵母の形質転換のためには、いくつかの形質転換プロトコルが開発されている。例えば、本発明による遺伝子導入サッカロミセスは、以下の Hinnen et al.,(1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, London, 275,104); 及び Ito, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168) の教示により作成されうる。
形質転換された酵母細胞は、栄養要求性マーカーや、優性抗生物質マーカーのような、様々な選択マーカーを使用して選択できる。
好適な酵母宿主生物は、バイオ技術的に適切な、これらに制限されるものではないが、ピキア種、ハンゼヌラ種、クルイベロマイセス、Yarrowinia種,サッカロミセス・セルビシエを含むサッカロミセス種、又はシゾサッカロミセス・ポンベを含むシゾサッカロミセス種のような、酵母菌種から選択できる。
メチロトローフ酵母種であるピキア・パストリスの菌株が、宿主として使用される。
一実施例では、宿主は、ハンゼヌラ・ポリモルファ（ＷＯ０１／３９５４４に記述されている）のようなハンゼヌラ種である。
形質転換植物／植物細胞
本発明に適した宿主生物は、植物でありうる。一般的技術の概説については、Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol (1991) 42:205-225)及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)又は、ＷＯ０１／１６３０８に見られる。
分泌物
しばしばポリペプチドは、分泌される酵素がより容易に回収されうる培地へ、発現宿主から分泌されることが望ましい。本発明によれば、分泌リーダー配列は、目的とする発現宿主を基に選択される。ハイブリッドシグナル配列もまた、本発明を背景として使用される。
非相同分泌リーダー配列の典型的な例は、真菌のアミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（ｇｌａＡ−双方とも、例えばアスペルギルス由来の１８及び２４アミノ酸の種類）、ａ−ファクター遺伝子（酵母、例えば、サッカロミセス、クルイベロマイセス、及びハンゼヌラ）又は、α−アミラーゼ遺伝子（バチルス）由来の配列である。
検出
アミノ酸配列の発現を検出及び測定するための様々なプロトコルが、当業界に知られている。例としては、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光抗体法（ＦＡＣＳ）が含まれる。
多様な標識及びコンジュゲイション（conjugation）技術が当業者に知られており、様々な核酸及びアミノ酸アッセイにおいて使用可能である。
Pharmacia Biotech社(Piscatway, NJ), Promega社(Madison, WI)、 及びUS Biochemical Corp社(Cleveland, OH) のような多数の会社が、これらの手順についての市販キットやプロトコルを供給している。
適切なレポーター分子又は標識は、基質、補因子、阻害物質、磁粉などと同様にこれらの放射性核種、酵素、蛍光、化学発光法、色原体を含む。これらの標識の使用について特許では、ＵＳ−Ａ−３，８１７，８３７、ＵＳ−Ａ−３，８５０，７５２、ＵＳ−Ａ−３，９３９、３５０、ＵＳ−Ａ−３，９９６，３４５、ＵＳ−Ａ−４，２７７，４３７、ＵＳ−Ａ−４，２７５，１４９、及びＵＳ−Ａ−４，３６６，２４１を含む。
また、組換え免疫グロブリンは、ＵＳ−Ａ−４，８１６，５６７に示されるように作成される。
融合タンパク質
本明細書で定義される特異性を有するポリペプチドは、例えば、抽出、精製において補助となる融合タンパク質として生産される。融合タンパク質の相手の例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合及び／若しくは転写の活性化ドメイン）、並びにβ―ガラクトシダーゼを含む。融合タンパク質の相手と興味あるタンパク質配列の間にある、融合タンパク質配列の除去を可能とするタンパク質分解的切断部位を含むことも便宜となりうる。好ましくは、融合タンパク質は、タンパク質配列の活性の妨げにならないものである。
大腸菌における遺伝子融合発現システムは、Curr. Opin. Biotechnol. (1995)6(5):501-6で概説されている。
本発明の別の実施例では、本発明で定義される特異性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は、融合タンパク質をコードするために非相同配列に連結される。例えば、物質（substance）の活性に影響を与えることができる試薬についてのペプチドライブラリーの選別にとって、商業的に利用可能な抗体により認識される非相同的なエピトープを発現するキメラの物質をコード化する。
実施例
この研究は, 大豆油、ひまわり油、菜種油のような植物油の脱ガムにおける脂質アシルトランスフェラーゼ（本明細書においては、グリセロリン脂質コレステロールアシル−トランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）と呼ばれることがある）の使用可能性について検討することを目的とする。
この研究の目的の１つは、特に、脂質アシルトランスフェラーゼ変異体（Ｎ８０Ｄ）が、脱ガムにより適した酵素であるかどうかを調査することにある。従前の研究により、脂質アシルトランスフェラーゼ（特にＧＣＡＴS）は、リン脂質からステロールへの脂肪酸のアシル転移を触媒し、リゾレシチンとステロールエステルを生成することが知られている。
今回の研究は、ホスファチジルコリンと植物ステロールが添加された精製された大豆油に基づくモデルにおいて行なわれた。このモデルは、粗大豆油を使用する代わりに、モデルシステムにおいて反応生成物を分析することがより容易であることから選択された。
大豆油や菜種油を含む植物油の酵素的脱ガム工程は、この工程が油からレシチンを除去するのにより安価であり、より優れた工程であるので、近年拡大している。油の脱ガムに使用される酵素は、ホスホリパーゼＡ１(レシターゼウルトラ、又は膵臓由来のホスホリパーゼＡ２−Novoenzymes A/S社製、デンマーク)である。
脱ガムに使用される本発明に関する酵素の、以前の当業界におけるホスホリパーゼＡ１と比較したときの利点の一つは、本発明による酵素は、脱ガム工程中にステロールエステルの生成を促進し、ステロールエステルの蓄積に寄与することであり、このことは、現時点で使用されているホスホリパーゼＡ１(レシターゼウルトラ)については、現時点では達成されていない。
材料及び方法
酵素
・ 本発明による脂質アシルトランスフェラーゼ：アエロモナス・サルモニシダ由来の酵素の変異体Ａｓｎ８０Ａｓｐ（成熟酵素のアミノ酸８０）（配列番号１６（図１０参照））
・ レシターゼウルトラ（#3108）Novozymes社製、デンマーク
大豆油 ： Soya olie IP (Item No. 005018/バッチ番号T-618-4)
レシチン ： Ｌ−αホスファチジルコリン９５％Plant（Avanti社製 #441601）
植物ステロール ： Generol 122N Henkel社製、ドイツ
トコフェロール ： アルファートコフェロール
（Item no.050908/lot.nr4010140554）
ホスホリパーゼ活性
基質
０.６％Ｌ−αホスファチジルコリン９５％Plant（Avanti社製#441601）、
０.４％ Triton-X100（Sigma社製 X-100）及び５ｍＭ ＣａＣｌ2 を０．０５ＭHEPES緩衝剤ｐＨ７中に溶解した。
アッセイ手順
４００μｌの基質が、１.５ｍｌエッペンドルフチューブに加えられ、エッペンドルフサーモミキサー内に３７℃にて５分間置かれた。Ｔ＝０ｍｉｎに、５０μｌの酵素溶液が加えられた。酵素の代わりに水をいれたブランクも分析された。試料は、エッペンドルフサーモミキサー内において、３７℃にて１０分間１０ｘ１００ｒｐｍで混合された。Ｔ＝１０ｍｉｎに、エッペンドルフチューブは、反応を停止するため、別のエッペンドルフサーモミキサー内に９９℃にて１０分間置かれた。
試料内の遊離脂肪酸は、Wako GmbH社製NEFA C kitを用いて分析された。
酵素活性ＰＬＵ−ＮＥＦＡ ｐＨ７が、アッセイ条件下において１分ごとに形成されたマイクロモル脂肪酸として計算された。
高性能薄層クロマトグラフィー
装置 ：Automatic TLC sampler4、CAMAG社製
高性能薄層クロマトグラフィープレート：２０ｘ１０ｃｍ，Merck社製 no．1.05641.
使用前に１６０℃にて３０分間活性化された。
手順 ： 緩衝液中に８％溶液とした油１μｌを自動ＴＬＣアプリケーターを使用して高性能薄層クロマトグラフィープレートに用いる。
展開溶媒１： P-エーテル：メチル-tert-ブチルエーテル：酢酸 ６０：４０：１
展開溶媒４： クロロホルム：メタノール：水 ７５：２５：４
展開溶媒５： P-エーテル：メチル-tert-ブチルエーテル：酢酸 ７０：３０：１
処理／溶出時間 展開溶媒１：１２分
展開溶媒４：２０分
展開溶媒５：１０分
検出
プレートは乾燥器内で１０分間１６０℃にて乾燥させ、冷却し、１６％Ｈ３ＰＯ４に溶解した６％酢酸銅（cupri acetate）に浸漬する。さらに１０分間１６０℃にて乾燥させ、直接評価される。
酵素精製
試料： 脂質アシルトランスフェラーゼ（Ａｓｎ８０Ａｓｐ）（配列番号１６）は、０．８/０．２２μｍフィルターで濾過された。５１０ｍｌの濾液が採取された。
ステップ１. 脱塩、 Sephadex 25G, 3.21g ゲル （10cm id)
Sephadexカラムは、製造者（Amersham biosciences社）の記述により調整された。カラムは２０ｍＭ Na-P-緩衝液ｐＨ８.０で平衡化された。試料（５１０ｍｌ）は流出速度２５ｍｌ／分でカラムに展開された。８１５ｍｌの脱塩された試料が採取され、＋４℃にて保持された。
ステップ２. 陰イオン交換クロマトグラフィー、Q-Sepharose FF 300mlゲル(XK50)
Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラムは、製造者（Amersham biosciences社）の記述により調整された。カラムは２０ｍＭ Na-P-緩衝液ｐＨ８.０で平衡化された。脱塩された試料は、流出速度１５ｍｌ／分でカラムに展開された。その後カラムは緩衝液Ａで洗われた。リパーゼは、２０ｍＭNa-P-緩衝液（ｐＨ８.０、緩衝液Ｂ）中に０〜０．４ＭＮａＣｌの直線的濃度勾配をもって溶出された。リパーゼは、約０．２ＭＮａＣｌにより溶出し、リパーゼ活性は、展開中の画分を通じて検出されなかった。
ＰＮＰ−カプリル酸塩による酵素アッセイ
ＰＮＰ−カプリル酸塩を基質として使用するアッセイは以下のとおり行なわれた。
１ｍｌのエタノールに溶解した１０ｍｇの基質は、０.４％ＴＸ１００を含む９ｍｌの５０ｍＭ Tris-HCl緩衝液（ｐＨ７.３）に混合された。
２４０μｌの基質は３５℃にてプレインキュベートされた。反応は２５μｌの試料及びブランクを加えることで開始された。混合液は、５分間３５℃にて振盪しながらインキュベートされた。分光光度計を使用し、ＰＮＰの生成は、４１０ｎｍにおいて連続して測定された。ブランクは、試料以外のすべての構成成分と緩衝液を含んでいる。リパーゼ活性の１ユニットは、３５℃にて分単位で遊離カプリル酸１μｌを放出する酵素量として定義された。
分子量と純度の決定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは４−１２％Nu-PAGEゲル（＋ＤＴＴ）により行なわれ、製造者（Novex社 アメリカ）の指示どおりにクーマシーで染色された。スタンダードマーカーは、See Blue Plus2であり、Novex社 アメリカより得た。
結果
脂質アシルトランスフェラーゼ変異体Ｎ８０Ｄのイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）による精製のクロマトグラムを、表１に示す。採取された画分はリパーゼ活性（ＰＮＰ−カプリル酸塩アッセイに基づく）が分析された。画分ごとの活性を表１−aに示す。
脂質アシルトランスフェラーゼ活性を含む画分（２７−３９、１９５ｍｌ）はプールされた。部分的に精製された脂質アシルトランスフェラーゼの最終的な回収率は、約８０％であった（ＰＮＰ−カプリル酸塩によるアッセイに基づく）。
精製された脂質アシルトランスフェラーゼの画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付された。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルは、脂質アシルトランスフェラーゼタンパク質が、分子量約２８ＫＤａであることを示した。部分的に精製された脂質アシルトランスフェラーゼは、１０ＫＤａの微量の不純物を含んでいた（図２参照）。
ＩＥＣ後の脂質アシルトランスフェラーゼプール２７−３９は、ホスホリパーゼ活性について分析され、２０.４ＰＬＵ−７／ｍｌの結果を得た。
全体的な精製スキームを表１に示す。脂質アシルトランスフェラーゼは、８０％の回収率で部分的に精製されていた。
Figure 0005604032
脱ガム実験
実施例１による脂質アシルトランスフェラーゼの試料は、表２に示されている処方により脱ガムの研究に使用された。
植物ステロール、アルファ−トコフェロール及びホスファチジルコリンを９０℃に温めた大豆油に溶解した。油はその後約４０℃に冷却され酵素が添加された。試料は、１７時間撹拌されながら４０℃にて置かれ、その後試料採取されてクロロホルム：メタノール ２：１に溶解して、高性能薄層クロマトグラフィーが行なわれた。
Figure 0005604032
 高性能薄層クロマトグラフィーの結果を図３及び図４に示す。
図３に示される薄層クロマトグラフィーの結果は、油に脂質アシルトランスフェラーゼを加えることにより、ホスファチジルコリンがほぼ１００％除去されることを明白に示している。試料１０のみが少量のホスファチジルコリンを含んでいる。試料１０は水分量が一番高いので、水分量が低い場合に酵素がより働くのかもしれないということを示しており、或いは、試料１０は５％水分を含んでいるので、二相が形成されて酵素と反応物質の接触が起こりにくくなっているかもしれないということにより説明可能かもしれない。
図４に示された結果からは、少量の脂肪酸が生成されていることが観察された。しかし、ステロール又はアルファ−トコフェロールも油に存在するときは、ホスファチジルコリン由来の脂肪酸はステロールやトコフェロールに転移してステロールエステルやトコフェロールエステルを生成するので、遊離脂肪酸量はより少ない。
ステロールエステルの生成は、図５に示された薄層クロマトグラフィーの結果から明らかに観察される。使用された対照材料であるコレステロールエステルは、植物ステロールエステルと同じ保持時間をとっていることに注意すべきである。
脱ガム実験（２）
もう１つの実験において、ＩＥＣクロマトグラフィーから得られた脂質アシルトランスフェラーゼプール２７−３９は、酵素の添加量、及びホスファチジルコリンと植物ステロールを含んだ大豆油における水分量を変えて試験がされた。この実験では、市販のホスホリパーゼであるレシターゼウルトラも供給者が脱ガムについて推奨する濃度において試験がされた。
この実験における試料の組成を表３に示す。
Figure 0005604032
 植物ステロールとホスファチジルコリンは、９５℃に温めた大豆油に撹拌しながら溶解された。油はその後約４０℃に冷却され酵素が添加された。試料はマグネティックスターラで撹拌されながら４０℃で維持され、４又は２０時間後に取り出されて、薄層クロマトグラフィーによって分析された。４又は２０時間後に取り出された試料の高性能薄層クロマトグラフィー分析の結果を図６−９に示す。
脂質アシルトランスフェラーゼの最低量の添加（油０.０８ＰＬＵ−７／ｇに対応する０．４％）は、２０時間の反応時間後に大豆油中のホスファチジルコリンを除去するに充分であることを、高性能薄層クロマトグラフィーの結果は、示している。水を最大量含んだ場合（５％）は、油中のホスファチジルコリンの加水分解について脂質アシルトランスフェラーゼに悪影響を与えているようであることが観察される。それゆえ、最も高い濃度の脂質アシルトランスフェラーゼの試料におけるより低い程度の加水分解は、より多くの水分も加えられているという事実により説明される。これと反対に、レシターゼウルトラ は最低量の水分（１％）において、より少量のホスファチジルコリンを加水分解をしており、一方で、レシターゼウルトラは、５％水分の試料においては、ホスファチジルコリンをほぼ完全に除去することが観察される。
図７の結果はまた、植物ステロールの大部分は、脂質アシルトランスフェラーゼによって処理された試料内で植物ステロールエステルに変換されているが、レシターゼウルトラによって処理された試料内ではステロールエステルは生成しないということを示している。図７は、レシターゼウルトラが、脂質アシルトランスフェラーゼよりも遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を多く形成することを示している。
結論
ホスファチジルコリン、植物ステロール及びトコフェロールを含む大豆油モデルにおける脱ガム実験は、部分的に精製された脂質アシルトランスフェラーゼ酵素が、植物ステロールエステル生成を伴い、またごく少量の遊離脂肪酸を形成するが、ホスファチジルコリンをすべて除去できることを示している。
脂質アシルトランスフェラーゼのさらなる利点の一つは、ステロールエステル、特にトコフェロールエステルの形成である。なぜなら、ステロールエステル（トコフェロールエステルを含む）は、健康に有益な特質を有するからである。通常の食用油の加工においては、脱ガムに引続き、加水分解された極性を有する脂質（リン脂質及び／又は糖脂質）を含む水相が、油から分離される。従来法では、ステロールは油精製工程で食用油から除かれる（本明細書では、脱臭と呼ばれることがある）。しかしながら、ステロールエステル（及びトコフェロールエステル）は脱臭に抗し、それゆえ油に残存する。油中にステロールエステルが蓄積することは魅力的である。なぜなら植物ステロールエステルの高摂取は人間の循環器系疾患のリスクを軽減するからである。
実験は、脂質アシルトランスフェラーゼが、これもまた油に蓄積するトコフェロールエステルを形成できるということをも示している。
これは、油の酸化に対する安定性の改善に寄与するものであり、それゆえ本発明による脂質アシルトランスフェラーゼを脱ガムに使用することの更なる有利な点である。
粗油における脱ガム実験
別の実験では、イオン交換クロマトグラフィーにより得られた脂質アシルトランスフェラーゼプール２７−３９は、Solae Company社, Aarhus, Denmarkより得た粗大豆油（脱ガム前）について、酵素濃度及び水分量を変えて試験がなされた。この実験では、商業用ホスホリパーゼであるレシターゼウルトラについても供給者が脱ガムについて推奨する濃度において試験がなされた。この試験における試料の組成を表４に示す。
試料は、マグネティックスターラで撹拌しながら、４０℃にてヒーティングブロック内に置かれた。２０時間後分析のため試料は取り出された。
Figure 0005604032
 油の試料は高性能薄層クロマトグラフィーによって分析された。結果を図２６及び２７に示す。
図２６における高性能薄層クロマトグラフィー分析は、脂質アシルトランスフェラーゼが、試料（試料３、４、６及び７）にリゾレシチンを何ら残存させること無く、粗大豆油からリン脂質を効果的に除去することを示すものである。レシターゼウルトラもリン脂質（ＰＣ）を除去するが、クロマトグラムにはいくつかのバンドが残っており、リゾレシチンであると思われる。脂質アシルトランスフェラーゼは非常に低い水分環境においても作用するが、レシターゼウルトラは、作用するには１％から５％の水分を必要とすることも観察される。
図２７の結果は、脂質アシルトランスフェラーゼは、遊離ステロールをステロールエステルに変換し、レシターゼウルトラはステロールには何の効果も及ぼさないことを確認するものである。 図２７の結果はまた、脂質アシルトランスフェラーゼ及びレシターゼウルトラを加えた試料双方において、いくらかの遊離脂肪酸が生成していることを示している。脂質アシルトランスフェラーゼによる遊離脂肪酸の生成理由は、アシル供与体（ステロール）が充分に存在せず、それゆえ加水分解も起こるということで説明される。
表４においては試料１、２、３、６、８及び１０がＧＬＣで分析され、ステロール及びステロールエステル量が定量化された。結果を表５に示す。
Figure 0005604032
 表５における結果は、本発明における脂質アシルトランスフェラーゼは、粗大豆油中のすべてのステロールをステロールエステルに変換でき、商業用ホスホリパーゼであるレシターゼウルトラはステロールに何ら効果を及ぼさないということを確認するものである。
結論
本発明の脂質アシルトランスフェラーゼの粗大豆油に対する効果は、本発明の脂質アシルトランスフェラーゼが、粗大豆油のリン脂質を効果的に除去し、ステロールエステルの生成を伴うことを確認するものである。
さらに実験において、ストレプトマイセス・サーモサッカリＬ１３１由来のホスホリパーゼが粗大豆油において試験された。
結果は、ストレプトマイセス・サーモサッカリＬ１３１由来のホスホリパーゼは、粗大豆油におけるリン脂質を効果的に加水分解し、植物油の脱ガムについて代替酵素として適していることを確認するものである。
大豆油及び菜種油を含む植物油の酵素的脱ガム工程は、この工程が費用があまりかからず、レシチンを植物油から取り除くのにより良い工程であるので、現在拡大している。脱ガムに使用されている商業用の酵素は、微生物由来のホスホリパーゼＡ１及び動物由来のホスホリパーゼＡ２である。
ストレプトマイセス・サーモサッカリＬ１３１由来の（リン）脂質アシルトランスフェラーゼは脱ガムに使用可能なもう１つの酵素である。
序文
この研究の目的は、大豆油、ひまわり油又は菜種油のような植物油の脱ガムについて、ストレプトマイセス・サーモサッカリＬ１３１由来の脂質アシルトランスフェラーゼの使用の可能性について調査することである。
伝統的に油の脱ガムについては、二つの工程が使用されてきた。すなわち物理的脱ガム及び化学的脱ガムである。１９９０年代に遡り、膵臓由来のホスホリパーゼの使用に基づいて酵素的脱ガム工程は発展した。この酵素は、コーシャーではなかったので、ホスホリパーゼは微生物由来のホスホリパーゼＡ１に置き換えられた。酵素的工程は化学的或は物理的脱ガム工程に比べ経費削減、より高い収率、そしてより環境面で望ましい工程であることを含め、いくつかの利点がある。
この研究の目的は、ストレプトマイセス・サーモサッカリＬ１３１由来の脂質アシルトランスフェラーゼが、脱ガムに適した酵素であるかどうかを調査することであった。上述の研究により、ストレプトマイセス・サーモサッカリＬ１３１は、トリグリセリドに対して何らの活性を示さずに、ガラクト脂質及びリン脂質に対して加水分解能力を有することが知られており、この酵素はある種の低水分環境でトランスフェラーゼの反応を促進することが期待される。この研究は天然のリン脂質を含む粗大豆油により行なわれた。
材料及び方法
酵素
K371(jour2390-30)：デンプン上で凍結乾燥されたストレプトマイセス・サーモサッカリＬ１３１/ストレプトマイセス・リビダンス
（活性：１０８ＰＬＵ−７／ｇ）
レシターゼウルトラ(#3108)Novozymes社製 デンマーク
コレステロールエステル、 Fluka 26950
植物ステロール：Generol122N Henkel社、ドイツ
粗大豆油：Solae社製 Aarhus デンマーク
レシチン：Ｌ−αホスファチジルコリン９５％Plant(Avanti#441601)
ホスホリパーゼ活性
基質：
０．６％Ｌ−αホスファチジルコリン９５％Ｐｌａｎt(Avanti#441601)、０.４％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（Sigma X-100）、及び５ｍＭ ＣａＣｌ2は、０.０５ＭＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７に溶解された。
アッセイ方法
４００μｌの基質は、１.５ｍｌのエッペンドルフチューブに加えられ、エッペンドルフサーモメーター内に３７℃にて５分間置かれた。Ｔ＝０ｍｉｎに、５０μｌの酵素溶液が加えられた。酵素の代わりに水を加えたブランクも分析された。試料は、エッペンドルフサーモミキサー内において、３７℃にて１０分間１０＊１００ｒｐｍで混合された。Ｔ＝１０ｍｉｎに、エッペンドルフチューブをもう１つのエッペンドルフサーモミキサー内に９９℃にて１０分間置くことで反応は中止された。試料内の遊離脂肪酸量は、 Wako GmbH社製 NEFA C kitを用いて分析された。
酵素活性ＰＬＵ−ＮＥＦＡｐＨ７がアッセイ条件における１分ごとの脂肪酸のマイクロモル量として計算された。
ＧＬＣ（ガスクロマトグラフィー）
ＷＣＯＴ溶融シリカカラム１２.５ｍ ｘ ０.２５ＩＤ ｘ ０.１μｍ ５％フェニル−メチル−シリコーン（CPSil8CB Crompack社製））を用いたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ８４２０キャピラリーガスクロマトグラフ
キャリヤー： ヘリウム
インジェクション： １.５μＬ スプリット
検出器： ＦＩＤ. ３８５℃
乾燥機プログラム： １ ２ ３ ４
乾燥機温度（℃） ８０ ２００ ２４０ ３６０
等温、時間（分） ２ ０ ０ １０
昇温速度（℃／分） ２０ １０ １２
試料調整：
０.２ｇの試料から抽出された脂質を、２ｍｇ／ｍＬのヘプタデカンを内部標準として含む２ｍＬのヘプタン：ピリジン２：１に溶解した。５００μＬの試料はクリンプバイアルに移された。１００μＬのＭＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオロアセアミドが加えられ、１５分間９０℃にて保温されて反応を行なった。
高性能薄層クロマトグラフィー
装置 ： Ａｕｔｏｍａｔｉｃ ＴＬＣ ｓａｍｐｌｅｒ４、CAMAG社製
高性能薄層クロマトグラフィープレート ２０ｘ１０ｃｍ，Merck社製no.1.05641.
使用前に１６０℃にて３０分間活性化する。
手順 ： 緩衝液に溶解し８％溶液とした油１μｌを高性能薄層クロマトグラフィープレートに用いた。
展開溶媒４： クロロホルム：メタノール：水 ７５：２５：４
展開溶媒５： P-エーテル：メチル-tert-ブチルエーテル：酢酸 ７０：３０：１
手順／溶出時間
展開溶媒４ ：２０分
展開溶媒５ ：１０分
検出
プレートは１６０℃に保った乾燥機内で１０分間乾燥させ、冷却し、１６％Ｈ３ＰＯ４に溶解した６％ｃｕｐｒｉ ａｃｅｔａｔｅに浸漬した。さらに１０分間乾燥させて直接評価された。
結果
脱ガム実験
ストレプトマイセス・サーモサッカリＬ１３１が表６に示す処方により脱ガム研究に使用された。
試料は１８時間撹拌されながら４０℃にて置かれ、その後試料は採取されてクロロホルム：メタノール ２：１に溶解して高性能薄層クロマトグラフィーが行なわれた。
Figure 0005604032
 高性能薄層クロマトグラフィーでの分析結果を、図５９及び６０に示す。
図５９、表６による粗大豆油試料を酵素処理した反応生成物の高性能薄層クロマトグラフィー（溶媒４）。参考として、ホスファチジルコリン（ＰＣ）も分析された。ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）についても示されている。
図６０、表６による粗大豆油を酵素処理した反応生成物の高性能薄層クロマトグラフィー（溶媒５）。コレステロール、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドにも言及している。遊離脂肪酸（ＦＦＡ）についても示されている。
図５９に示された薄層クロマトグラフィーの結果は、ストレプトマイセス・サーモサッカリＬ１３１を油に加えることによりホスファチジルコリンは、完全に除去されたことを、明白に示すものである。最低濃度のもの（試料２）のみが、リン脂質を完全に加水分解しなかった。レシターゼウルトラも、５％水分が存在するとき（試料６）にはリン脂質を加水分解したが、余分に水分を加えないとき（試料５）は、部分的にのみリン脂質は加水分解された。
図６０に示されている結果は、リン脂質の加水分解は遊離脂肪酸の生成と同時に行なわれていることを示唆している。
結論
ストレプトマイセス・サーモサッカリＬ１３１は、粗大豆油において遊離脂肪酸を生成し、リン脂質を効果的に加水分解する。
前述の規格に言及されたすべての文献は、ここにおいて参照文献に組み入れられている。本発明の様々な改変や記述されている方法やシステムの変更は、本発明の範囲を逸脱するものでないことは当業者にとっては明らかなものであろう。本発明は、特定の好適な実施例に関して説明されてきたが、本発明が請求するように、そのような特異な実施例のみに、不当に制限されることがあってはならないことは理解されなければならない。実際、発明を実行するために記載された方法を様々に改変することは、生化学やバイオテクノロジーや関連分野の当業者にとっては明らかであり、以下の請求の範囲に収まることを意図するものである。
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）後得られた、脂質アシルトランスフェラーゼ活性（ＰＮＰ―カプリル酸アッセイ）の分析結果を示すものである. 精製された脂質アシルトランスフェラーゼの画分（４〜１２％ Ｍｅｓ、＋ＤＴＴ、４０／１０ μｌ 試料がゲルにふされた。）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示すものである. レーン１. 脱塩後の脂質アシルトランスフェラーゼ試料、４０μｌがゲルにふされた。 レーン２. 脱塩後の脂質アシルトランスフェラーゼ試料、１０μｌがゲルにふされた。 レーン３. ＩＥＣ後の精製された脂質アシルトランスフェラーゼリパーゼ（プール２７〜３９）、４０μｌがゲルにふされた。 レーン４. ＩＥＣ後の精製された脂質アシルトランスフェラーゼリパーゼ（プール２７〜３９）、１０μｌがゲルにふされた。 表２により、大豆油の試料を脂質アシルトランスフェラーゼで処理した反応生成物のＴＬＣ（溶媒４）を示すものである。対照として、ホスファチジルコリン（ＰＣ）も分析された。 表２により、大豆油の試料を脂質アシルトランスフェラーゼで処理した反応生成物のＴＬＣ（溶媒１）を示すものである。対照として、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）とモノ−ジ−トリグリセリド（ＴＲＩ／ＤＩ／ＭＯＮＯ）も分析された。 表２により、大豆油の試料を脂質アシルトランスフェラーゼで処理した反応生成物のＴＬＣ（溶媒５）を示すものである。対照として、コレステロール（ＣＨＬ）及びコレステロールエステル（ＣＨＬエステル）も分析された。 表３により、２０時間、大豆油の試料を脂質アシルトランスフェラーゼ又はレシターゼウルトラで処理した反応生成物のＴＬＣ（溶媒４）を示すものである。 表３により、２０時間、大豆油の試料を脂質アシルトランスフェラーゼ又はレシターゼウルトラで処理した反応生成物のＴＬＣ（溶媒５）を示すものである。コレステロールエステル（ＣＨＬエステル）；モノ−ジ−トリグリセリド（ＭＯＮＯ／ＤＩ／ＴＲＩ）及び、植物ステロールもまた、対照として分析された。遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の同定も示されている。 表３により、４時間、大豆油の試料を脂質アシルトランスフェラーゼ又はレシターゼウルトラで処理した反応生成物のＴＬＣ（溶媒４）を示すものである。 表３により、４時間、大豆油の試料を脂質アシルトランスフェラーゼ又はレシターゼウルトラで処理した反応生成物のＴＬＣ（溶媒５）を示すものである。コレステロールエステル（ＣＨＬエステル）、モノ−ジ−トリグリセリド（ＭＯＮＯ／ＤＩ／ＴＲＩ）、及び植物ステロールもまた、対照として分析された。遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の同定も示されている。 Ａｓｎ８０Ａｓｐの変異による（明白に、アミノ酸８０は成熟酵素に存在する）、アエロモナス・サルモニシダの成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）の変異体のアミノ酸配列示すものである。 アエロモナス・ハイドロフィラ (ATCC #7965) 由来の脂質アシルトランスフェラーゼ（配列番号１）のアミノ酸配列を示すものである。 データベースｖｅｒｓｉｏｎ６（配列番号２）からのｐｆａｍ００６５７の共通配列を示すものである。 生物アエロモナス・ハイドロフィラ (P10480;GI:121051)から得られた、アミノ酸配列（配列番号３）を示すものである。 生物アエロモナス・サルモニシダ (AAG098404;GI:9964017)から得られた、アミノ酸配列（配列番号４）を示すものである。 生物ストレプトマイセス・コエリコロルＡ３（２） (Genbank アクセッション番号NP_631558)〜得られた、アミノ酸配列（配列番号５）を示すものである。 生物ストレプトマイセス・コエリコロルＡ３（２） (Genbank アクセッション番号CAC42140)から得られた、アミノ酸配列（配列番号６）を示すものである。 生物サッカロミセス・セルビシエ(Genbank アクセッション番号P41734)から得られた、アミノ酸配列（配列番号７）を示すものである。 生物ラルスト二ア (Genbank アクセッション番号AL646052)から得られた、アミノ酸配列（配列番号８）を示すものである。 Scoe1 NCBI タンパク質アクセッションコード CAB39707.1 GI:4539178保存されている、立体構造は解かれたけれども機能がわからないタンパク質 (hypothetical protein) ［ストレプトマイセス・コレリコロルＡ３（２）］配列番号９を示すものである。 Ｓｃｏｅ２ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコード CAC01477.1 GI:9716139保存されている、立体構造は解かれたけれども機能がわからないタンパク質［ストレプトマイセス・コレリコロルＡ３（２）］ 配列番号１０によって示されるアミノ酸を示すものである。 Ｓｃｏｅ３ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８８８３３．１ ＧＩ：７６３５９９６の推定分泌タンパク質［ストレプトマイセス・コレリコロルＡ３（２）］のアミノ酸配列（配列番号１１）を示すものである。 Ｓｃｏｅ４ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８９４５０．１ ＧＩ：７６７２２６１の推定分泌タンパク質［ストレプトマイセス・コレリコロルＡ３（２）］のアミノ酸配列（配列番号１２）を示すものである。 Ｓｃｏｅ５ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ６２７２４．１ ＧＩ：６５６２７９３の推定リポタンパク質［ストレプトマイセス・コレリコロルＡ３（２）］のアミノ酸配列（配列番号１３）を示すものである。 Ｓｒｉｍ１ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＡＡＫ８４０２８．１ ＧＩ：１５０８２０８８ ＧＤＳＬ−リパーゼ［ストレプトマイセス・リモスス］のアミノ酸配列（配列番号１４）を示すものである。 アエロモナス・サルモニシダ subsp.サルモニシダ（ATCC#14174）由来の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１５）を示すものである。 表４により、試料１〜１０の粗大豆油の試料を酵素で２０時間処理した反応生成物のＴＬＣ（溶媒４）を示すものである。ＰＣは、５種類の異なる濃度（対照材料）に加えられたホスファチジルコリンである。 表４により（２０時間）、粗大豆油の試料を脂質アシルトランスフェラーゼ又はレシターゼウルトラで処理した反応生成物のＴＬＣ（溶媒５）を示すものである。コレステロールエステル（ＣＨＬ−エステル）、モノ−ジ−トリグリセリド（ＭＯＮＯ／ＤＩ／ＴＲＩ）、及び植物ステロールもまた参照として分析された。遊離脂肪酸の同定もまた、示されている。 カンジダ・パラプシロシス由来の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列である配列番号１７を示すものである。 カンジダ・パラプシロシス由来の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列である配列番号１８を示すものである。 アラインメント１を示すものである。 Ｓｃｏｅ１ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ３９７０７．１ ＧＩ：４５３９１７８保存されている、立体構造は解かれたけれども機能がわからないタンパク質［ストレプトマイセス・コレリコロルＡ３（２）］配列番号１９を示すものである。 アエロモナス・ハイドロフィラ脂質アシルトランスフェラーゼ遺伝子の突然変異生成のために使用される融合構築物のアミノ酸配列（配列番号２５）を示すものである。下線の引かれたアミノ酸は、キシラナーゼ（xylanase）のシグナルペプチドである。 ストレプトマイセス由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド配列（配列番号２６）を示すものである。 サーモビフィダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド配列（配列番号２７）を示すものである。 サーモビフィダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド配列（配列番号２８）を示すものである。 コリネバクテリウム・エフィシェンスＧＤＳｘ ３００アミノ酸由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド（配列番号２９）を示すものである。 ノボスフィンゴビウム・アロマチシボランス（Novosphingobium aromaticivorans）ＧＤＳｘ２８４アミノ酸由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド（配列番号３０）を示すものである。 ストレプトマイセス・コレリコロルＧＤＳｘ２６９ａａ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド（配列番号３１）を示すものである。 ストレプトマイセス・アベルミチリス／ＧＤＳｘ２６９アミノ酸由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド（配列番号３２）を示すものである。 ストレプトマイセス由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド（配列番号３３）を示すものである。 活性部位にグリセロールを有する１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造のリボン表現（ribbon representation）を示すものである。図は、Ｄｅｅｐ Ｖｉｅｗ Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢ ｖｉｅｗｅｒを使用して作成された。 Ｄｅｅｐ Ｖｉｅｗ Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢ ｖｉｅｗｅｒを使用した、活性部位にグリセロールを有する１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造―側面を示すものである。グリセロールの活性部位から１０Å以内にある残基は、黒く塗られている。 アラインメント２を示すものである。 生物アエロモナス・ハイドロフィラ（P10480;GI121051）（明白に、これは成熟配列である。）から得られたアミノ酸配列（配列番号３４）を示すものである。 アエロモナス・サルモニシダ成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）（明白に、これは成熟配列である。）の変異体のアミノ酸配列（配列番号３５）を示すものである。 ストレプトマイセス・サーモサッカリ由来のヌクレオチド配列（配列番号３６）を示すものである。 ストレプトマイセス・サーモサッカリ由来のアミノ酸配列（配列番号３７）を示すものである。 サーモビフィダ・フスカ／ＧＤＳｘ５４８アミノ酸由来のアミノ酸配列（配列番号３８）を示すものである。 サーモビフィダ・フスカ由来のヌクレオチド配列（配列番号３９）を示すものである。 サーモビフィダ・フスカ／ＧＤＳｘ由来のアミノ酸配列（配列番号４０）を示すものである。 コリネバクテリウム・エフィシェンス／ＧＤＳｘ３００アミノ酸由来のアミノ酸配列（配列番号４１）を示すものである。 コリネバクテリウム・エフィシェンス由来のヌクレオチド配列（配列番号４２）を示すものである。 ストレプトマイセス・コレリコロル／ＧＤＳｘ２６８アミノ酸由来のアミノ酸配列（配列番号４３）を示すものである。 ストレプトマイセス・コレリコロル由来のヌクレオチド配列（配列番号４４）を示すものである。 ストレプトマイセス・アベルミチリス由来のアミノ酸配列（配列番号４５）を示すものである。 ストレプトマイセス・アベルミチリス由来のヌクレオチド配列（配列番号４６）を示すものである。 サーモビフィダ・フスカ／ＧＤＳｘ由来のアミノ酸配列（配列番号４７）を示すものである。 サーモビフィダ・フスカ／ＧＤＳｘ由来のヌクレオチド配列（配列番号４８）を示すものである。 表６により、粗大豆油の試料を酵素で処理した反応生成物のＴＬＣ（溶媒４）を示すものである。対照として、ホスファチジルコリン（ＰＣ）もまた分析された。ＰＥホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）もまた、示されている。 表６により、粗大豆油の試料を酵素で処理した反応生成物のＴＬＣ（溶媒５）を示すものである。コレステロールエステル、モノ−ジ−トリグリセリドと植物ステロールが対照とされている。遊離脂肪酸（ＦＦＡ）もまた、示されている。 Ｌ１３１のアラインメントを示し、ストレプトマイセス・アベルミチリス及びサーモビフィダ・フスカ由来の相同物は、ＧＤＳｘモチーフ（Ｌ１３１及びストレプトマイセス・アベルミチリス及びサーモビフィダ・フスカにおけるＧＤＳＹ）、ＧＧＮＤＡ又はＧＧＮＤＬいずれかのＧＡＮＤＹボックス、及びＨＰＴブロック（保存された触媒的ヒスタジンとみなされている）の保存を説明する。これらの３つの保存されたブロックは、ハイライトされている。
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Claims (33)

  1. リン脂質の大部分からアシル基を、一又は二以上のアシル受容体に転移するための、脂質アシルトランスフェラーゼによる食用油の処理を含み、アシル受容体が一又は二以上のステロール及び／若しくはスタノールであり、
    脂質アシルトランスフェラーゼが、
    配列番号１６に示されるアミノ酸配列と８０％若しくはそれ以上の同一性を有し、かつＡｓｎ８０Ａｓｐ変異があるアミノ酸配列からなり、
    アシルトランスフェラーゼ活性％の決定のためのプロトコルを用いて試験した場合に、少なくとも５％のアシルトランスフェラーゼ活性を有し、Ｅ．Ｃ．２．３．１．ｘに分類されていることを特徴とする食用油を酵素的に脱ガムする方法。
  2. ステロールエステル及び／又はスタノールエステルが形成される、請求項１記載の方法。
  3. アシル受容体が、ステロールである、請求項２記載の方法。
  4. リン脂質がレシチンである、請求項１〜３いずれか記載の方法。
  5. 脂質アシルトランスフェラーゼが、脂質からステロール及び／又はスタノールにアシル基を転移できると同様に、加えて、脂質から一又は二以上の炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット、及びグリセロールにアシル基を転移する、請求項１〜４いずれか記載の方法。
  6. 脂質アシルトランスフェラーゼが、天然の脂質アシルトランスフェラーゼである、請求項１〜５いずれか記載の方法。
  7. 脂質アシルトランスフェラーゼが、脂質アシルトランスフェラーゼの変異体である、請求項１〜６いずれか記載の方法。
  8. 脂質アシルトランスフェラーゼが、アエロモナスに由来する生物から得ることができる、請求項１〜７いずれか記載の方法。
  9. 脂質アシルトランスフェラーゼが、アエロモナス・サルモニシダから得ることができる、請求項１〜８いずれか記載の方法。
  10. 脂質アシルトランスフェラーゼが、
    （ａ）脂質アシルトランスフェラーゼが、脂質アシル供与体の元のエステル結合のアシル部分が、新しいエステルを形成するためにアシル受容体に転移される、エステル転移活性として定義されるアシルトランスフェラーゼ活性を有すること、及び
    （ｂ）酵素が、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含み、Ｘが、以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、又はＳの一又は二以上であること、
    を特徴とする、請求項１〜９いずれか記載の方法。
  11. ＧＤＳＸモチーフのＸがＬである、請求項１０記載の方法。
  12. アミノ酸配列が、配列番号１６で示されるアミノ酸配列と８５％若しくはそれ以上の同一性を有し、かつＡｓｎ８０Ａｓｐ変異があるアミノ酸配列である、請求項１〜１１いずれか記載の方法。
  13. 脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２記載の方法。
  14. 脂質アシルトランスフェラーゼが、酵素がアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含み、Ｘが、以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、又はＳの一又は二以上であり、且つ酵素の変異体が、セット２、又はセット４、又はセット６、又はセット７において定義されるアミノ酸残基の、一又は二以上のいずれかにおいて、親配列と比較して一又は二以上のアミノ酸変異を含むことを特徴とする請求項７記載の方法。
  15. 処理する間の食用油中の水分が１％未満である、請求項１〜１４いずれか記載の方法。
  16. 水分が０.５％未満である、請求項１５記載の方法。
  17. 水分が０.１％未満である、請求項１６記載の方法。
  18. 脂質アシルトランスフェラーゼの作用で形成されたリゾリン脂質の濾過による除去を含む、請求項１〜１７いずれか記載の方法。
  19. リン脂質を除去するため、並びに油におけるステロールエステル及び／又はスタノールエステルの形成を増加させるための食用油の脱ガムにおける脂質アシルトランスフェラーゼの使用であって、脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と８０％若しくはそれ以上の同一性を有し、かつＡｓｎ８０Ａｓｐ変異があるアミノ酸配列からなり、アシルトランスフェラーゼ活性％の決定のためのプロトコルを用いて試験した場合に、少なくとも５％のアシルトランスフェラーゼ活性を有し、脂質アシルトランスフェラーゼが、Ｅ．Ｃ．２．３．１．ｘに分類されていることを特徴とする使用。
  20. 処理後に、油中の遊離脂肪酸の顕著な増加がない、請求項１９記載の使用。
  21. リン脂質がレシチンである、請求項１９又は２０記載の使用。
  22. 脂質アシルトランスフェラーゼが、天然脂質アシルトランスフェラーゼである、請求項１９〜２１いずれか記載の使用。
  23. 脂質アシルトランスフェラーゼが、脂質アシルトランスフェラーゼの変異体である、請求項１９〜２２いずれか記載の使用。
  24. 脂質アシルトランスフェラーゼが、アエロモナスに由来する生物から得ることができる、請求項１９〜２３いずれか記載の使用。
  25. 脂質アシルトランスフェラーゼが、アエロモナス・サルモニシダから得ることができる、請求項１９〜２４いずれか記載の使用。
  26. 脂質アシルトランスフェラーゼが、
    （ａ）脂質アシルトランスフェラーゼが、脂質アシル供与体の元のエステル結合のアシル部分が、新しいエステルを形成するためにアシル受容体に転移される、エステル転移活性として定義されるアシルトランスフェラーゼ活性を有すること、及び
    （ｂ）酵素が、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含み、Ｘが、以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、又はＳの一又は二以上であること、
    を特徴とする、請求項１９〜２５いずれか記載の使用。
  27. ＧＤＳＸモチーフのＸがＬである、請求項２６記載の使用。
  28. アミノ酸配列が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と８５％若しくはそれ以上の同一性を有し、かつＡｓｎ８０Ａｓｐ変異があるアミノ酸配列である、請求項１９〜２７いずれか記載の使用。
  29. 脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２８記載の使用。
  30. 脂質アシルトランスフェラーゼが、酵素がアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含み、Ｘが、以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、又はＳの一又は二以上であり、且つ酵素の変異体が、セット２、又はセット４、又はセット６、又はセット７において定義されるアミノ酸残基の、一又は二以上のいずれかにおいて、親配列と比較して一又は二以上のアミノ酸変異を含むことを特徴とする請求項２３記載の使用。
  31. 処理の間、食用油中の水分が１％未満である、請求項１９〜３０いずれか記載の使用。
  32. 水分が０.５％未満である、請求項３１記載の使用。
  33. 水分が０.１％未満である、請求項３２記載の使用。
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