ES2539006T3 - Enzima lipolítica, usos de la misma en la industria alimentaria - Google Patents

Enzima lipolítica, usos de la misma en la industria alimentaria Download PDF

Info

Publication number
ES2539006T3
ES2539006T3 ES05773820.5T ES05773820T ES2539006T3 ES 2539006 T3 ES2539006 T3 ES 2539006T3 ES 05773820 T ES05773820 T ES 05773820T ES 2539006 T3 ES2539006 T3 ES 2539006T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
lipolytic enzyme
enzyme
present
acyl
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES05773820.5T
Other languages
English (en)
Inventor
Andrei Miasnikov
Jørn Borch Søe
Jørn Dalgaard Mikkelsen
Mira Povelainen
Virve Pitkanen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DuPont Nutrition Biosciences ApS
Original Assignee
DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB0416035.4A external-priority patent/GB0416035D0/en
Priority claimed from GB0513859A external-priority patent/GB0513859D0/en
Application filed by DuPont Nutrition Biosciences ApS filed Critical DuPont Nutrition Biosciences ApS
Application granted granted Critical
Publication of ES2539006T3 publication Critical patent/ES2539006T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B3/00—Refining fats or fatty oils
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/042—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J7/00—Phosphatide compositions for foodstuffs, e.g. lecithin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B3/00—Refining fats or fatty oils
    • C11B3/003—Refining fats or fatty oils by enzymes or microorganisms, living or dead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6418—Fatty acids by hydrolysis of fatty acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6481—Phosphoglycerides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Seasonings (AREA)
  • General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
  • Seeds, Soups, And Other Foods (AREA)

Abstract

Una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos un galactolípido y/o capaz de transferir un grupo acilo desde un galactolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo, en la que la enzima se puede obtener de especies Streptomyces y comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 4 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con la misma.

Description

E05773820
09-06-2015
DESCRIPCIÓN
Enzima lipolítica, usos de la misma en la industria alimentaria
5 CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una nueva enzima lipolítica, en particular una nueva enzima lipolítica, y secuencias de nucleótidos que codifican la misma. La presente invención también se refiere a métodos de producción de la nueva enzima lipolítica y a usos de la misma. La presente invención también se refiere a métodos y
10 usos de una enzima lipolítica.
ANTECEDENTES TÉCNICOS
El uso beneficioso de enzimas lipolíticas activas sobre glucolípidos en la fabricación de pan se mostró en el
15 documento EP 1 193 314. Se mostró que los productos de hidrolisis parcial, los lisoglucolípidos, se descubrió que tenían funcionalidad emulsionante muy elevada. Sin embargo, también se descubrió que las enzimas mostradas en el documento EP 1 193 314 tenían significativa actividad no selectiva sobre triglicéridos que provocaba un contenido de ácidos grasos libres innecesariamente elevado.
20 Una enzima lipolítica de Fusarium oxysporum que tiene actividad fosfolipasa se ha mostrado en el documento EP 0 869 167. Esta enzima lipolítica tiene alta actividad de hidrolisis de triacilglicéridos (lipasa). Esta enzima ahora se vende por Novozymes A/S (Dinamarca) como Lipopan FTM .
El documento WO02/00852 describe cinco enzimas lipasa y sus polinucleótidos codificantes, aislados de Fusarium
25 venenartum, F. sulphureum, Aspergillus berkeleyanum, F. culmorum y F. solani. Las cinco enzimas se describen como con actividad hidrolizante de triacilglicerol, fosfolipasa y actividad galactolipasa.
Se han producido variantes de enzima lipolítica, con sustituciones de aminoácidos específicas y fusiones; algunas de las cuales tienen actividad potenciada sobre los lípidos polares en comparación con las enzimas precursoras de
30 tipo silvestre. El documento WO01/39602 describe dicha variante, mencionada como SP979, que es una fusión de la lipasa de Thermomyces lanuginosus, y la lipasa de Fusarium oxysporum descrita en el documento EP 0 869 167. Se ha descubierto que esta variante tiene una proporción significativamente elevada de actividad sobre fosfolípidos y glucolípidos en comparación con triglicéridos.
35 En el documento WO02/094123 se descubrió que mediante la selección de enzimas lipolíticas que eran activas sobre los lípidos polares (glucolípidos y fosfolípidos) en una masa, pero sustancialmente no activas sobre triglicéridos o 1-mono-gliceridos, podía conseguirse una funcionalidad mejorada.
En la solicitud PCT en trámite junto con la presente número PCT/IB2005/00875, publicación número WO
40 2005087918, se muestran enzimas lipolíticas de tipo silvestre que tienen una proporción mayor de actividad sobre lípidos polares en comparación con triglicéridos. Sin embargo, este documento no muestra enzimas lipolíticas de especies Streptomyces, Thermobifida o Corynebacterium.
Previo a la presente invención, no se habían publicado enzimas lipolíticas que tuvieran actividad o actividad
45 significativa sobre glucolípidos de especies Streptomyces. Asimismo, no se habían publicado enzimas lipolíticas que tuvieran actividad o actividad significativa sobre glucolípidos de especies Thermobifida o especies Corynebacterium. Aunque se han aislado lipasas, es decir, enzimas hidrolizantes de triacilglicerol de especies Streptomyces (véase Vujaklija et al Arch Microbial (2002) 178: 124-130 por ejemplo), estas enzimas nunca se han identificado como con actividad hidrolizante de glucolípidos.
50 ASPECTOS DE LA INVENCIÓN
La presente invención se basa en el hallazgo seminal de una enzima lipolítica que tiene actividad galactolipídica significativa del género Streptomyces. En particular, la enzima lipolítica del género Streptomyces tiene significativa
55 actividad hidrolizante de galactolípidos y/o actividad significativa galactolípido aciltransferasa, particularmente cuando se usa en los métodos y usos de acuerdo con la presente invención.
Además, las enzimas lipolíticas de los géneros Thermobifida o Corynebacterium tienen significativa actividad galactolipídica. En particular, las enzimas lipolíticas de los géneros Thermobifida o Corynebacterium tienen
60 significativa actividad hidrolizante de galactolípidos y/o significativa actividad galactolípido aciltransferasa, particularmente cuando se usan en los métodos y usos de la presente invención.
En un amplio aspecto, la presente invención se refiere a una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos glucolípidos y/o capaz de transferir un grupo acilo de al menos un glucolípido a uno o más sustratos aceptores de 65 acilo, donde la enzima se puede obtener, y preferiblemente se obtiene, de especies Streptomyces y comprende una
E05773820
09-06-2015
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 2 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con la misma.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos 5 galactolípidos y/o capaz de transferir un grupo acilo de al menos un galactolípido a uno o más sustratos aceptores de acilo, donde la enzima está codificada por un ácido nucleico seleccionado entre el grupo que consiste en:
a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 3; b) un ácido nucleico que está relacionado con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 por la degeneración
10 del código genético; y c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 3.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos un
15 galactolípido y/o capaz de transferir un grupo acilo de al menos un galactolípido a uno o más sustratos aceptores de acilo, donde la enzima comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 4 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con la misma.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica una enzima lipolítica 20 capaz de hidrolizar al menos un galactolípido y/o capaz de transferir un grupo acilo de al menos un galactolípido a uno o más sustratos aceptores de acilo que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 4
o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con la misma.
La SEC ID Nº 3 se muestra en la Figura 3 y la SEC ID Nº 4 se muestra en la Figura 4.
25 La presente invención proporciona además adicionalmente un ácido nucleico que codifica una enzima lipolítica capaz de hidrolizar lípidos polares y/o capaz de transferir un grupo acilo de un lípido polar a uno o más sustratos aceptores de acilo, en que dicho ácido nucleico se selecciona entre el grupo que consiste en:
30 a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 3; b) un ácido nucleico que está relacionado con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 por la degeneración del código genético; y c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 3.
35 La presente invención proporciona además adicionalmente el uso de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención en un sustrato (preferiblemente un producto alimenticio) para preparar un lisoglucolípido, por ejemplo digalactosil monoglicérido (DGMG) o monogalactosil monoglicérido (MGMG) por tratamiento de un glucolípido (por ejemplo digalactosil diglicérido (DGDG) o monogalactosil diglicérido (MGDG)) con la enzima lipolítica
40 de acuerdo con la presente invención para producir el producto de hidrolisis parcial, es decir, el lisoglucolípido.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención en un sustrato (preferiblemente un producto alimenticio) para preparar un lisofosfolípido, por ejemplo lisolecitina, por tratamiento de un fosfolípido (por ejemplo, lecitina) con la enzima de acuerdo con la
45 presente invención para producir un producto de hidrolisis parcial, es decir, un lisofosfolípido.
En un amplio aspecto, la presente invención se refiere a un método para preparar un producto alimenticio, comprendiendo el método mezclar una enzima lipolítica de la presente invención con uno o más ingredientes del producto alimenticio.
50 Otro amplio aspecto de la presente invención se refiere a un método para preparar un producto horneado a partir de una masa, comprendiendo el método mezclar una enzima lipolítica de la presente invención con la masa.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para preparar un producto lácteo, 55 comprendiendo el método mezclar una enzima lipolítica de la presente invención con uno o más ingredientes del producto lácteo.
El método se refiere al uso de una enzima lipolítica de la presente invención en la fabricación de un producto lácteo para reducir uno o más de los siguientes efectos nocivos: malos olores y/o malos sabores y/o gusto jabonoso.
60 En otro aspecto de la presente invención se proporciona el uso de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención en un proceso para tratar productos de huevo o basados en huevo para producir lisofosfolípidos.
En otro aspecto de la presente invención se proporciona el uso de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente 65 invención en un proceso para tratar productos de huevo o basados en huevo para producir lisoglucolípidos.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60 E05773820
09-06-2015
Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un proceso de desgomado enzimático de aceites vegetales o comestibles, que comprende tratar el aceite comestible o vegetal con una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención para hidrolizar una parte principal de los lípidos polares (por ejemplo, fosfolípido y/o glucolípido).
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención en un proceso que comprende el tratamiento de un fosfolípido para hidrolizar los grupos acilo grasos.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención en un proceso para reducir el contenido de un fosfolípido en un aceite comestible, que comprende tratar el aceite con la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención para hidrolizar una parte principal del fosfolípido, y separar una fase acuosa que contiene el fosfolípido hidrolizado del aceite.
También se proporciona un método para preparar una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención, comprendiendo el método transformar una célula hospedadora con un ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima lipolítica, siendo capaz la célula hospedadora de expresar la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la enzima lipolítica, cultivar la célula hospedadora transformada en condiciones en las que se exprese el ácido nucleico y recoger la enzima lipolítica.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención en la bioconversión de lípidos polares (preferiblemente glucolípidos) para preparar productos de alto valor, tales como ésteres de carbohidrato y/o ésteres de proteína y/o ésteres de subunidad de proteína y/o un éster de hidroxiácido.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención en un proceso de desgomado enzimático de aceite vegetal o comestible, que comprende tratar dicho aceite comestible o vegetal con dicha enzima lipolítica para hidrolizar una parte principal de los lípidos polares.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención en un proceso que comprende el tratamiento de un fosfolípido para hidrolizar los grupos acilo grasos.
También se describe una enzima lipolítica inmovilizada de acuerdo con la presente invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para preparar un lisoglucolípido que comprende tratar un sustrato que comprende un glucolípido con al menos una enzima lipolítica descrita anteriormente para producir dicho lisoglucolípido, donde dicha enzima lipolítica tiene actividad glucolipasa.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método para preparar un lisofosfolípido que comprende tratar un sustrato que comprende un fosfolípido con al menos una enzima lipolítica descrita anteriormente para producir dicho lisofosfolípido, donde dicha enzima lipolítica tiene actividad fosfolipasa.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método de desgomado enzimático de aceite vegetal o comestible, que comprende tratar dicho aceite comestible o vegetal con una enzima lipolítica descrita anteriormente capaz de hidrolizar una parte principal de los lípidos polares.
La presente invención se refiere adicionalmente a un método de bioconversión de lípidos polares para preparar productos de alto valor que comprende tratar dichos lípidos polares con una enzima lipolítica descrita anteriormente para producir dichos productos de alto valor, donde dicha enzima lipolítica es capaz de hidrolizar dichos lípidos polares.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para preparar un producto alimenticio que comprende mezclar al menos una enzima lipolítica descrita anteriormente con uno o más ingredientes de un producto alimenticio donde dicha enzima lipolítica es capaz de hidrolizar un glucolípido y/o un fosfolípido presente en o como al menos uno de dichos ingredientes.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de una enzima lipolítica descrita anteriormente en un sustrato para preparar un lisofosfolípido donde dicha enzima lipolítica tiene actividad fosfolipasa.
La presente invención se refiere adicionalmente al uso de una enzima lipolítica descrita anteriormente para desgomado enzimático de aceite vegetal o comestible para hidrolizar una parte principal de los lípidos polares.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de una enzima lipolítica descrita anteriormente en un proceso que comprende el tratamiento de un fosfolípido para hidrolizar grupos acilo grasos.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65 E05773820
09-06-2015
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de una enzima lipolítica descrita anteriormente en la bioconversión de lípidos polares para preparar productos de alto valor, donde dicha enzima lipolítica es capaz de hidrolizar dichos lípidos polares.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de una enzima lipolítica descrita anteriormente en la preparación de un producto alimenticio, donde dicha enzima lipolítica es capaz de hidrolizar un glucolípido y/o un fosfolípido.
Aspectos de la presente invención se presentan en las reivindicaciones.
Otras características respecto a la secuencias de nucleótidos de la presente invención incluyen: una construcción que comprende las secuencias de la presente invención; un vector que comprende las secuencias para su uso en la presente invención; un plásmido que comprende las secuencias para su uso en la presente invención; una célula transformada que comprende las secuencias para su uso en la presente invención; un tejido transformado que comprende las secuencias para su uso en la presente invención; un órgano transformado que comprende las secuencias para su uso en la presente invención; un hospedador transformado que comprende las secuencias para su uso en la presente invención; un organismo transformado que comprende las secuencias para su uso en al presente invención. También se describen métodos para expresar la secuencia de nucleótidos para su uso en la presente invención usando los mismos, tales como expresión en una célula hospedadora; incluyendo métodos para transferir las mismas.
Se describen métodos adicionales para aislar la secuencia de nucleótidos, tal como aislamiento desde una célula hospedadora.
Otras características respecto a la secuencia de aminoácidos para su uso en la presente invención incluyen: una construcción que codifica las secuencias de aminoácidos para su uso en la presente invención; un vector que codifica las secuencias de aminoácidos para su uso en la presente invención; un plásmido que codifica las secuencias de aminoácidos para su uso en la presente invención; una célula transformada que expresa las secuencias de aminoácidos para su uso en la presente invención; un tejido transformado que expresa las secuencias de aminoácidos para su uso en la presente invención; un órgano transformado que expresa las secuencias de aminoácidos para su uso en la presente invención; un hospedador transformado que expresa las secuencias de aminoácidos para su uso en la presente invención; un organismo transformado que expresa las secuencias de aminoácidos para su uso en la presente invención. También se describen métodos para purificar la secuencia de aminoácidos para su uso en la presente invención usando los mismos, tales como expresión en una célula hospedadora; incluyendo métodos para transferir la misma, y después purificar dicha secuencia.
Para facilidad de referencias, los aspectos de la presente invención se analizan ahora en el encabezado apropiado de sección. Sin embargo, los contenidos en cada sección no están necesariamente limitados a cada sección particular.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Adecuadamente, la enzima lipolítica para su uso en los métodos y usos de acuerdo con la presente invención pueden ser una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos un galactolípido y/o capaz de transferir un grupo acilo desde al menos un galactolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo, que comprende las secuencias de aminoácidos mostradas como SEC ID Nº 4 o una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con la misma, o una enzima lipolítica capaz de hidrolizar lípidos polares y/o capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido polar hasta uno o más sustratos aceptores de acilo codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID Nº 3 o una secuencia de nucleótidos que tenga al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con la misma.
En una realización, la enzima lipolítica para su uso en los métodos y usos de acuerdo con la presente invención es preferiblemente una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos galactolípidos y/o capaz de transferir un grupo acilo desde al menos un galactolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo, donde la enzima está codificada por un ácido nucleico seleccionado entre el grupo que consiste en:
a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 3; b) un ácido nucleico que está relacionado con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 por la degeneración del código genético; y c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 3.
En una realización, la enzima lipolítica para su uso en los métodos y usos de acuerdo con la presente invención es preferiblemente una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos un galactolípido y/o capaz de transferir un grupo acilo desde al menos un galactolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo que comprende una secuencia
15
25
35
45
55
65
E05773820
09-06-2015
de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 4 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con la misma.
En otra realización, la enzima lipolítica para su uso en los métodos y usos de acuerdo con la presente invención es preferiblemente una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos un galactolípido y/o capaz de transferir un grupo acilo desde al menos un galactolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo, donde la enzima comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 4 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con la misma.
En una realización adicional, la enzima lipolítica para su uso en los métodos y usos de acuerdo con la presente invención pueden ser una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos un galactolípido y/o capaz de transferir un grupo acilo desde al menos un galactolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas como SEC ID Nº 4 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con la misma, o una enzima lipolítica capaz de hidrolizar lípidos polares y/o capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido polar hasta uno o más sustratos aceptores de acilo codificada por una cualquiera de las secuencias de nucleótidos mostradas como SEC ID Nº 3 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con la misma.
En una realización, la enzima lipolítica para su uso en los métodos y usos de acuerdo con la presente invención puede ser una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos galactolípidos y/o capaz de transferir un grupo acilo desde al menos un galactolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo, donde la enzima está codificada por un ácido nucleico seleccionado entre el grupo que consiste en:
a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 3; b) un ácido nucleico que está relacionado con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 por la degeneración del código genético; y c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 3.
En una realización, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención puede ser una enzima lipolítica que se puede obtener, y que preferiblemente se obtiene, de las cepas de Streptomyces L130 o L131 depositadas por Danisco A/S de Langebrogade 1, DK-1001 Copenhague K, Dinamarca según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con fines de procedimiento de patente en la National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St. Machar Street, Aberdeen Scotland, GB el 25 de junio de 2004 con los números de acceso NCIMB 41226 y NCIMB 41227, respectivamente.
Preferiblemente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención actúa sobre al menos un glucolípido, tal como digalactosildiglicérido (DGDG) por ejemplo. Adecuadamente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención también puede actuar sobre uno o más sustratos diferentes de lípido polar, tal como un fosfolípido, por ejemplo una lecitina, por ejemplo, fosfatidilcolina.
Un modo alternativo para expresar la expresión "capaz de hidrolizar glucolípidos" como se usa en este documento sería decir que la enzima lipolítica tiene actividad hidrolizante de glucolípidos.
Preferiblemente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención hidroliza un glucolípido, tal como digalactosildiglicérido (DGDG) por ejemplo, y también un fosfolípido, tal como una lecitina, por ejemplo fosfatidilcolina.
Preferiblemente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención actúa sobre glucolípidos tales como DGDG o MGDG.
En un aspecto, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención hidroliza DGDG a DGMG y/o MGDG a MGMG.
En un aspecto, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención hidroliza lecitina a lisolecitina.
Cuando es el caso en que la enzima lipolítica es capaz de transferir un grupo acilo desde al menos un glucolípido hasta un sustrato donante, el sustrato de lípido polar puede mencionarse en este documento como "donante de acilo lipídico".
En una realización, la enzima de acuerdo con la presente invención que también tiene actividad fosfolipasa y/o glucolipasa (generalmente clasificada como E.C. 3.1.1.26; E.C. 3.1.1.4 o E.C. 3.1.1.32 de acuerdo con las Recomendaciones de Nomenclatura de Enzimas (1992) del Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology) también tiene actividad acetiltransferasa (generalmente clasificada como E.C. 2.3.1.x), mediante lo cual la enzima es capaz de transferir un grupo acilo desde un donante de acilo lipídico hasta
E05773820
09-06-2015
uno o más sustratos aceptores, tales como uno o más de los siguientes: un esterol; un estanol; un carbohidrato; una proteína; una subunidad proteica; glicerol.
Las lípido acetiltransferasas y sus usos se muestran en la solicitud de patente internacional en trámite junto con la 5 presente número PCT/IB2004/000655. Sin embargo, las enzimas lipolíticas de los géneros Streptomyces de acuerdo con la presente invención no se muestran en el documento PCT/IB2004/000655.
En algunos aspectos, la enzima lipolítica para su uso en los métodos y/o usos de la presente invención pueden ser capaces de transferir un grupo acilo desde un lípido polar (como se define en este documento) hasta uno o más de 10 los siguientes sustratos aceptores de acilo: un esterol, un estanol, un carbohidrato, una proteína o subunidades de la misma, o un glicerol.
Para algunos aspectos, el "aceptor de acilo" de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier compuesto que comprenda un grupo hidroxi (-OH), tal como por ejemplo, alcoholes polivalentes, incluyendo glicerol; esterol;
15 estanoles; carbohidratos; hidroxiácidos incluyendo ácidos frutales, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido láctico y ácido ascórbico; proteínas o una subunidad de las mismas, tales como aminoácidos, hidrolizados proteicos y péptidos (proteína parcialmente hidrolizada) por ejemplo; y mezclas y derivados de los mismos.
En algunos aspectos, el "aceptor de acilo" de acuerdo con la presente invención puede ser preferiblemente no agua. 20 En una realización, el aceptor de acilo es preferiblemente no un monoglicérido y/o un diglicérido.
En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido hasta un esterol y/o un estanol.
25 En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido hasta un carbohidrato.
En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido hasta una proteína o 30 una subunidad de la misma. Adecuadamente, la subunidad proteica puede ser una o más de las siguientes: un aminoácido, un hidrolizado proteico, un péptido, un dipéptido, un oligopéptido, un polipéptido.
Adecuadamente, en la proteína o subunidad proteica, el aceptor de acilo puede ser uno o más de los siguientes constituyentes de la proteína o subunidad proteica: una serina, una treonina, una tirosina, o una cisteína.
35 Cuando la subunidad proteica es un aminoácido, adecuadamente el aminoácido puede ser cualquier aminoácido adecuado. Adecuadamente, el aminoácido puede ser uno o más de una serina, una treonina, una tirosina, o una cisteína por ejemplo.
40 En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido hasta un glicerol.
En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido hasta un hidroxiácido.
45 En un aspecto, preferiblemente la enzima es capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido hasta un alcohol polivalente.
En un aspecto, la enzima lipolítica puede, siendo también capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido hasta un esterol y/o un estanol, adicionalmente ser capaz de transferir el grupo acilo desde un lípido hasta uno o más de los 50 siguientes: un carbohidrato, una proteína, una subunidad proteica, glicerol.
El término lecitina como se usa en este documento abarca fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina y fosfatidilglicerol.
55 Para algunos aspectos, preferiblemente el sustrato lipídico es al menos un glucolípido, tal como DGDG por ejemplo.
Para algunos aspectos, preferiblemente el sustrato lipídico puede ser adicionalmente un fosfolípido, tal como lecitina, por ejemplo fosfatidilcolina. Otros sustratos fosfolipídicos de acuerdo con la presente invención pueden ser uno o más de N acil fosfatidil etanolamina (APE) o N acil liso-fosfatidil etanolamina (ALPE).
60 Preferiblemente, el sustrato lipídico es un lípido alimenticio, es decir un componente lipídico de un producto alimenticio.
Para algunos aspectos, preferiblemente la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención es incapaz, o 65 sustancialmente incapaz, de actuar sobre un triglicérido y/o un 1-monogliceridos y/o 2-monogliceridos.
E05773820
09-06-2015
En una realización, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención no tiene actividad o no tiene actividad significativa sobre triglicérido y/o 1-monogliceridos y/o 2-monogliceridos.
Adecuadamente, el sustrato lipídico o donante de acilo lipídico puede ser uno o más lípidos presentes en uno o más
5 de los siguientes sustratos: grasas, incluyendo manteca, sebo y grasa de mantequilla; aceites incluyendo aceites extraídos de o derivados de aceite de palma, aceite de girasol, aceite de soja, aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de coco, y aceite de colza. La lecitina de soja, la colza o la yema de huevo también son un sustrato lipídico adecuado. El sustrato lipídico puede ser un lípido de avena u otro material basado en plantas que contenga galactolípidos.
10 En un aspecto, el sustrato lipídico o donante de acilo lipídico es preferiblemente lecitina (tal como fosfatidilcolina) en yema de huevo.
Para algunos aspectos de la presente invención, el lípido puede seleccionarse entre lípidos que tienen una longitud 15 de cadena de ácidos grasos de 8 a 22 carbonos.
Para algunos aspectos de la presente invención, el lípido puede seleccionarse entre lípidos que tienen una longitud de cadena de ácidos grasos de 16 a 22 carbonos, más preferiblemente de 16 a 20 carbonos.
20 Para algunos aspectos de la presente invención, el lípido puede seleccionarse entre lípidos que tienen una longitud de cadena de ácidos grasos de no más de 14 carbonos, adecuadamente de lípidos que tienen una longitud de cadena de ácidos grasos de 4 a 14 carbonos, adecuadamente de 4 a 10 carbonos, adecuadamente de 4 a 8 carbonos.
25 Adecuadamente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención muestra al menos actividad glucolipasa
(E.C. 3.1.1.26). Adecuadamente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención también puede mostrar actividad fosfolipasa A2 (E.C. 3.1.1.4) y/o actividad fosfolipasa A1 (E.C. 3.1.1.32).
Para algunos aspectos, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención puede únicamente tener actividad 30 glucolipasa (E.C. 3.1.1.26).
Para algunos aspectos, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención en una galactolipasa (E.C. 3.1.1.26). El hecho de que la enzima se designe como una galactolipasa no evita, sin embargo, que tenga otras actividades secundarias, tales como actividad hacia otros lípidos polares por ejemplo.
35 Las expresiones "actividad glucolipasa" y "actividad galactolipasa" como se usan en este documento, se usan de forma intercambiable.
Adecuadamente, para algunos aspectos, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención puede ser capaz 40 de transferir un grupo acilo desde un glucolípido y/o un fosfolípido hasta uno o más sustratos aceptores.
Adecuadamente, el sustrato aceptor puede ser uno o más de los siguientes sustratos: un esterol, un estanol, un carbohidrato, una proteína, glicerol.
45 La expresión "lípidos polares" como se usa en este documento, significa fosfolípidos y/o glucolípidos. En algunos aspectos, la expresión lípidos polares preferiblemente significa al menos glucolípidos.
La actividad glucolipasa; la actividad fosfolipasa y/o la actividad triacilglicerol lipasa de una enzima puede determinarse usando los ensayos presentados a continuación en este documento. 50 Determinación de actividad galactolipasa (ensayo de actividad glucolipasa (GLU-7)):
Sustrato
55 Se disolvió digalactosildiglicérido al 0,6% (Sigma D 4651), Tritón-X 100 al 0,4% (Sigma X-100) y CaCl2 5 mM en tampón HEPES 0,05 M pH 7.
Procedimiento de ensayo:
60 Se añadieron 400 µl de sustrato a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se colocó en un Eppendorf Thermomixer a 37°C durante 5 minutos. A tiempo t = 0 min., se añadieron 50 µl de solución enzimática. También se analizó un blanco con agua en lugar de enzima. La muestra se mezcló a 10x100 rpm en un Eppendorf Thermomixer a 37°C durante 1 0 minutos. A tiempo t=10 min., el tubo Eppendorf se colocó en otro thermomixer a 99°C durante 10 minutos p ara detener la reacción.
65 Los ácidos grasos libres en las muestras se analizaron usando el kit NEFA C de WAKO GmbH.
E05773820
09-06-2015
La actividad enzimática GLU a pH 7 se calculó como los micromoles de ácido graso producidos por minuto en condiciones de ensayo.
Determinación de actividad fosfolipasa (ensayo de actividad fosfolipasa (PLU-7)): 5 Sustrato
Se dispersaron L-α fosfatidilcolina al 0,6% de planta al 95% (Avanti nº441601), Tritón-X 100 al 0,4% (Sigma X-100) y CaCl2 5 mM en tampón HEPES 0,05 M pH 7. 10 Procedimiento de ensayo:
Se añadieron 400 µl de sustrato a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se colocó en un Eppendorf Thermomixer a 37°C durante 5 minutos. A tiempo t = 0 min., se añadieron 50 µl de solución enzimática. También se analizó un blanco con
15 agua en lugar de enzima. La muestra se mezcló a 10x100 rpm en un Eppendorf Thermomixer a 37°C durante 1 0 minutos. A tiempo t=10 min., el tubo Eppendorf se colocó en otro thermomixer a 99°C durante 10 minutos p ara detener la reacción.
Los ácidos grasos libres en las muestras se analizaron usando el kit NEFA C de WAKO GmbH. 20 La actividad enzimática PLU-7 a pH 7 se calculó como los micromoles de ácido graso producidos por minuto en condiciones de ensayo.
Determinación de actividad triacilglicérido lipasa: ensayo basado en triglicérido (tributirina) como sustrato (LIPU):
25 La actividad lipasa basada en tributirina se midió de acuerdo con el Food Chemical Codex, Cuarta Edición, National Academy Press, 1996, pág. 803. Con la modificación de que la muestra se disuelve en agua desionizada en lugar de tampón glicina, y el pH de punto de inicio es 5,5 en lugar de 7. 1 LIPU se define como la cantidad de enzima que puede liberar un micromol de ácido butírico por minuto en condiciones de ensayo.
30 En una realización, preferiblemente la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención es una enzima lipolítica de tipo silvestre.
Los términos "natural" y "de tipo silvestre" como se usan en este documento, significan una enzima de origen
35 natural. Es decir, una enzima expresada a partir del código genético endógeno y aislada de su organismo hospedador endógeno y/o una enzima producida de forma heteróloga que no se ha mutado (es decir, no contiene deleciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos) en comparación con la secuencia proteica madura (después de eventos de escisión co-y post-traduccional) producida de forma endógena. Las proteínas naturales y de tipo silvestre de la presente invención pueden codificarse por polinucleótidos de codones optimizados para expresión
40 heteróloga, y también pueden comprender un péptido señal no endógeno seleccionado para la expresión en ese hospedador.
El término "variante" como se usa en este documento significa una proteína expresada a partir de un código genético no endógeno que provoca una o más alteraciones de aminoácido (es decir, deleciones, adiciones o sustituciones de 45 aminoácidos) en comparación con la secuencia natural o de tipo silvestre dentro de la secuencia proteica madura.
La enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención es obtenible (adecuadamente puede obtenerse) de una bacteria.
50 La enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención puede obtenerse (preferiblemente se obtiene) de Streptomyces spp. Preferiblemente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención puede obtenerse (preferiblemente se obtiene) de Streptomyces cepa L131 o Streptomyces cepa L130.
Preferiblemente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia de
55 aminoácidos que tiene al menos un 70%, preferiblemente al menos un 75%, preferiblemente al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%, preferiblemente al menos un 98%, preferiblemente al menos un 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID Nº 4.
Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención comprende
60 una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 75%, preferiblemente al menos un 80%, preferiblemente al menos un 85%, preferiblemente al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%, preferiblemente al menos un 98%, preferiblemente al menos un 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 3.
En una realización, adecuadamente el pH óptimo de la enzima sobre un sustrato galactolipídico es 65 aproximadamente 6-8, preferiblemente aproximadamente 6,5 a 7,5, más preferiblemente aproximadamente 7.
15
25
35
45
55
65 E05773820
09-06-2015
Adecuadamente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención no puede inhibirse o no se inhibe significativamente por inhibidores de lipasas presentes en harina de trigo. La expresión "no se inhibe significativamente" como se usa en este documento significa que la enzima es menos sensible a inhibidores de lipasa presentes en la harina de trigo en comparación con una dosificación equivalente (PLU) de LipopanF™ (Novozymes A/S, Dinamarca), en base al ensayo de fosfolipasa convencional (PLU-7) definido en este documento.
Adecuadamente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención es capaz de hidrolizar al menos el 10% del diéster galactolipídico en el sustrato (es decir, en el producto alimenticio, por ejemplo, masa, por ejemplo) en el monoéster. Preferiblemente, la enzima es capaz de hidrolizar al menos el 20%, más preferiblemente al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% del diéster galactolipídico en el monoéster. Adecuadamente, el diéster galactolipídico puede ser uno o más de MGDG o DGDG y el monoéster poder ser uno o más de MGMG o DGMG, respectivamente.
Adecuadamente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención puede aislarse de un caldo de fermentación de Streptomyces cepa L131 o Streptomyces cepa L130.
Adecuadamente, la enzima puede purificarse por cromatografía líquida.
La secuencia de aminoácidos de la enzima lipolítica purificada puede determinarse por degradación de Edman, análisis LC-MS o MALDI-TOF.
Adecuadamente, la enzima definida en este documento puede catalizar una o más de las siguientes reacciones: interesterificación, transesterificación, alcoholisis, hidrólisis.
El término "interesterificación" se refiere a la transferencia catalizada enzimáticamente de grupos acilo entre un donante lipídico y un aceptor lipídico, donde el donante lipídico no es un grupo acilo libre.
El término "transesterificación" como se usa en este documento significa la transferencia catalizada enzimáticamente de un grupo acilo desde un donante lipídico (diferente a un ácido graso libre) hasta un aceptor de acilo (diferente de agua).
Como se usa en este documento, el término "alcoholisis" se refiere a la escisión enzimática de un enlace covalente de un derivado ácido por reacción con un alcohol ROH de modo que uno de los productos se combine con el H del alcohol y el otro producto se combine con el grupo OR del alcohol.
Como se usa en este documento, el término "alcohol" se refiere a un compuesto alquilo que contiene un grupo hidroxi.
Como se usa en este documento, el término "hidrólisis" se refiere a la transferencia catalizada enzimáticamente de un grupo acilo desde un lípido hasta el grupo OH de una molécula de agua. La transferencia de acilo que resulta de la hidrólisis requiere la separación de la molécula de agua.
El término "producto alimenticio" como se usa en este documento significa una sustancia que es adecuada para consumo humano y/o animal.
Adecuadamente, el término "producto alimenticio" como se usa en este documento puede significar un producto alimenticio en una forma que está lista para su consumo. Como alternativa o adicionalmente, sin embargo, el término producto alimenticio como se usa en este documento puede significar uno o más materiales alimenticios que se usan en la preparación de un producto alimenticio. A modo de ejemplo solamente, el término producto alimenticio abarca tanto productos horneados producidos a partir de masa así como la masa usada en la preparación de dichos productos horneados.
En un aspecto preferido, la presente invención proporciona un producto alimenticio definido anteriormente donde el producto alimenticio se selecciona entre uno o más de los siguientes: huevos, productos basados en huevo, incluyendo aunque sin limitación mahonesa, aliños de ensalada, salsas, helados, huevo en polvo, yema de huevo modificada y productos preparados a partir de la misma; productos horneados, incluyendo panes, tortas, productos de masa dulce, masas laminadas, masas líquidas, muffins, rosquillas, galletas, galletas saladas y galletas dulces; productos de confitería, incluyendo chocolate, golosinas, caramelos, halawa, chicles, incluyendo chicle sin azúcar y edulcorado con azúcar, chicle globo, chicle globo blando, goma de mascar y postres; productos congelados incluyendo sorbetes, preferiblemente productos lácteos congelados, incluyendo helados y leche helada; productos lácteos, incluyendo queso, mantequilla, leche, nata para café, nata montada, crema pastelera, bebidas lácteas y yogures; mousses, nata batida vegetal, productos cárnicos, incluyendo productos cárnicos procesados; aceites y grasas comestibles, productos batidos gaseosos y no gaseosos, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, margarina, productos para untar y mantecas incluyendo mantecas de bajo y muy bajo contenido en grasa; aliños, mahonesa, aderezos, salsas basadas en crema, sopas basadas en crema, bebidas, emulsiones sazonadas y salsas.
15
25
35
45
55
65 E05773820
09-06-2015
Adecuadamente, el producto alimenticio de acuerdo con la presente invención puede ser una "especialidad gastronómica", incluyendo tartas, pasteles, artículos de confitería, chocolates, dulces de azúcar y similares. En un aspecto, el producto alimenticio de acuerdo con la presente invención puede ser un producto de masa o un producto horneado, tal como un pan, un producto frito, un aperitivo, tortas, tartas, brownies, galletas dulces, fideos, artículos de aperitivo tales como galletas saladas, galletas integrales, pretzels, y patatas fritas, y pasta.
En un aspecto adicional, el producto alimenticio de acuerdo con la presente invención puede ser un producto alimenticio derivado de plantas tales como harinas, pre-mezclas, leche en polvo, aliños de ensalada, margarina, productos para untar, manteca de cacahuete, mantecas, helado, aceites de cocinar.
En otro aspecto, el producto alimenticio de acuerdo con la presente invención puede ser un producto lácteo, incluyendo mantequilla, leche, crema, queso tal como quesos naturales, procesados, y de imitación en una diversidad de formas (incluyendo triturado, de barra, lonchas o rayado), queso en crema, helado, postres congelados, yogurt, bebidas de yogurt, grasa de mantequilla, grasa láctea anhidra, otros productos lácteos. La enzima de acuerdo con la presente invención puede mejorar la estabilidad de la grasa en productos lácteos.
Es particularmente ventajoso utilizar la enzima de acuerdo con la presente invención en queso. Por tanto, una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención puede usarse ventajosamente para producir queso. La enzima lipolítica cataliza la hidrolisis de fosfolípidos en la leche que contribuye a una producción aumentada de queso. Preferiblemente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención puede añadirse a la leche (mencionada como leche de queso) antes de o durante el proceso de fabricación de queso.
En otro aspecto, el producto alimenticio de acuerdo con la presente invención puede ser un producto alimenticio que contenga ingredientes derivados de animales, tales como productos cárnicos procesados, aceites de cocinar, mantecas.
En un aspecto adicional, el producto alimenticio de acuerdo con la presente invención puede ser una bebida, una fruta, fruta mezclada, un vegetal o vino. En algunos casos la bebida puede contener hasta 20 gr/l de fitoesteroles añadidos.
En otro aspecto, el producto alimenticio de acuerdo con la presente invención puede ser un pienso animal. El pienso animal puede enriquecerse con fitoesteroles y/o fitoestanoles, preferiblemente con beta-fitoesterol/estanol. Adecuadamente, el pienso animal puede ser un pienso para aves de corral. Cuando el producto alimenticio es pienso para aves de corral, la presente invención puede usarse para disminuir el contenido de colesterol de huevos producidos por aves de corral alimentadas con el producto alimenticio de acuerdo con la presente invención.
En un aspecto, preferiblemente el producto alimenticio se selecciona entre uno o más de los siguientes: huevos, productos basados en huevo, incluyendo mahonesa, aliños de ensalada, salsas, helado, huevo en polvo, yema de huevo modificada y productos fabricados a partir de los mismos.
Preferiblemente, el producto alimenticio de acuerdo con la presente invención es un producto alimenticio que contiene agua. Adecuadamente, el producto alimenticio puede estar compuesto por un 10-98% de agua, adecuadamente por un 14-98%, adecuadamente por un 18-98% de agua, adecuadamente por un 20-98%, adecuadamente por un 40-98%, adecuadamente por un 50-98%, adecuadamente por un 70-98%, adecuadamente por un 75-98%.
Para algunos aspectos, el producto alimenticio de acuerdo con la presente invención puede no ser un aceite derivado de plantas puro, tal como aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de cacahuete, aceite de colza por ejemplo. Para evitar dudas, en algunos aspectos de la presente invención, el producto alimenticio de acuerdo con la presente invención puede comprender un aceite, pero el producto alimenticio no está compuesto principalmente por aceite o mezclas de aceite. Para algunos aspectos, preferiblemente el producto alimenticio comprende menos del 95% de lípidos, preferiblemente menos del 90% de lípidos, preferiblemente menos del 85%, preferiblemente menos del 80% de lípidos. Por tanto, para algunos aspectos de la presente invención, el aceite puede ser un componente del producto alimenticio, pero preferiblemente el producto alimenticio no es un aceite per se.
Las ventajas de usar una enzima lipolítica capaz de transferir un grupo acilo en aplicaciones de alimentos, se muestran en las solicitudes de patente WO2004/064987, WO2004/064537, PCT/IB2004/004374 y GB0513859.9.
La producción de ácidos grasos libres puede ser perjudicial para los productos alimenticios. Los ácidos grasos libres se han ligado con malos olores y/o malos sabores en productos alimenticios, así como otros efectos nocivos, incluyendo un sabor jabonoso en productos lácteos tales como queso, por ejemplo. Adecuadamente, en algunas realizaciones de la presente invención, la enzima lipolítica es capaz de transferir el ácido graso desde el lípido a un aceptor de acilo, por ejemplo un esterol y/o estanol. Por tanto, el nivel global de ácidos grasos libres en el producto alimenticio no aumenta o aumenta solamente a un grado insignificante. Por tanto, una enzima lipolítica capaz de transferir un grupo acilo de acuerdo con la presente invención puede proporcionar uno o más de los siguientes
15
25
35
45
55
65 E05773820
09-06-2015
efectos técnicos inesperados en la producción de queso: una disminución en el efecto de desprendimiento de aceites en el queso; un aumento en la producción de queso; una mejora en el aroma; una reducción del mal olor; una reducción del sabor "jabonoso". La utilización de una enzima lipolítica mostrada en este documento que puede transferir el grupo acilo a un carbohidrato así como a un esterol y/o un estanol es particularmente ventajosa para productos alimenticios que comprenden huevos. En particular, la presencia de azúcares, en particular glucosa, en huevos y productos de huevo a menudo se observa como desventajosa. La yema de huevo puede comprender hasta el 1% de glucosa. De acuerdo con la presente invención, este azúcar indeseado puede eliminarse fácilmente por "esterificación" del azúcar para formar un éster de azúcar.
La presencia de diglicéridos en aceites comestibles es desventajosa. En particular, los diglicéridos en aceites comestibles (en particular aceite de palma) pueden conducir a un aceite de baja calidad. Adecuadamente, en algunas realizaciones de la presente invención, una enzima lipolítica mostrada en este documento es capaz de transferir el ácido graso desde el lípido hasta un aceptor de acilo que reduce el nivel de diglicéridos en el aceite sin aumentar o aumentar significativamente el nivel de ácidos grasos libres.
Una enzima lipolítica mostrada en este documento es capaz de hidrolizar una parte principal de los fosfolípidos en un aceite comestible o vegetal. Esto es muy ventajoso en el desgomado enzimático de aceites vegetales o comestibles. Adecuadamente, en algunas realizaciones de la presente invención, la enzima lipolítica puede ser capaz de transferir el ácido graso desde el lípido hasta un aceptor de acilo. Por tanto, ventajosamente el nivel global de ácidos grasos libres en el aceite no aumenta o aumenta solamente a un grado insignificante. La producción de ácidos grasos libres puede ser perjudicial en el aceite comestible. Preferiblemente, el método de acuerdo con la presente invención provoca el desgomado de un aceite comestible donde la acumulación de ácidos grasos libres se reduce y/o elimina.
Debe entenderse que las reivindicaciones de la presente invención incluyen cada uno de los productos alimenticios enumerados anteriormente.
En algunas de las aplicaciones mencionadas en este documento, particularmente las aplicaciones en alimentos, tales como las aplicaciones en panadería, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención puede usarse con uno o más emulsionantes convencionales, incluyendo por ejemplo monoglicéridos, ésteres de ácido diacetil tartárico de mono-y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de azúcar, estearoil lactilato de sodio (SSL) y lecitinas.
Además o alternativamente, la enzima de acuerdo con la presente invención puede usarse con una o más enzimas de calidad alimenticia adecuadas diferentes. Por tanto, está dentro del alcance de la presente invención que, además de la enzima lipolítica de la presente invención, pueda añadirse al menos una enzima adicional al producto horneado y/o a la masa. Dichas enzimas adicionales incluyen enzimas degradantes de almidón tales como endo-o exoamilasas, pululanasas, enzimas desramificadoras, hemicelulasas incluyendo xilanasas, celulasas, oxidorreductasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, piranosa oxidasa, sulfidrilo oxidasa o una carbohidrato oxidasa tal como una que oxida maltosa, por ejemplo, hexosa oxidasa (HOX), lipasas, fosfolipasas y hexosa oxidasa, proteasas, y aciltransferasas (tales como las descritas en el documento PCT/IB2004/000575, por ejemplo).
La presente invención abarca composiciones de enzimas alimentarias, incluyendo composiciones que mejoran el pan y/o la masa que comprenden la enzima de acuerdo con la presente invención, y opcionalmente que comprenden adicionalmente otra enzima, tal como una o más enzimas de calidad alimenticia adecuadas diferentes, incluyendo enzimas que degradan el almidón tal como endo-o exoamilasas, pululanasas, enzimas desramificadoras, hemicelulasas incluyendo xilanasas, celulasas, oxidorreductasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, piranosa oxidasa, sulfidrilo oxidasa o una carbohidrato oxidasa tal como una que oxida maltosa, por ejemplo, hexosa oxidasa (HOX), lipasas, fosfolipasas y hexosa oxidasa, proteasas, y aciltransferasas (tales como las descritas en el documento PCT/IB2004/000575, por ejemplo).
En algunas aplicaciones mencionadas en este documento, particularmente en aplicaciones alimenticias, tales como aplicaciones de panadería, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención puede añadirse en combinación
o secuencialmente con uno o más sustratos enzimáticos. A modo ejemplo solamente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención puede añadirse junto con uno o más sustratos lipídicos polares y/o uno o más sustratos aceptores de acilo.
En algunas aplicaciones mencionadas en este documento, particularmente en aplicaciones alimenticias, tales como aplicaciones de panadería, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención puede usarse con uno o más hidroxiácidos, incluyendo por ejemplo ácido tartárico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico o ácido ascórbico, por ejemplo.
La expresión "propiedades mejoradas" como se usa en este documento significa cualquier propiedad que pueda mejorarse por la acción de la enzima lipolítica de la presente invención. En particular, el uso de la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención provoca una o más de las siguientes características: volumen aumentado del producto horneado; estructura de la miga mejorada del producto horneado; propiedades anti-envejecimiento en el
15
25
35
45
55
65 E05773820
09-06-2015
producto horneado; resistencia aumentada, estabilidad aumentada, rigidez reducida y/o manejabilidad mejorada de la masa.
Las propiedades mejoradas se evalúan por comparación con una masa y/o un producto horneado preparado sin la adición de la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención.
La expresión "producto horneado" como se usa en este documento, incluye un producto preparado a partir de una masa. Ejemplos de productos horneados (sean de tipo blanco, ligero u oscuro) que pueden producirse ventajosamente por la presente invención incluyen una o más de los siguientes: pan (incluyendo pan blanco, integral y de centeno), típicamente en forma de barra de pan o panecillos, bolitos, pan tipo baguette francesa, pan pita, tacos, tortilla de maíz, tortilla de trigo, tortas, panqueques, galletas, pan crujiente, pasta, fideos y similares.
La masa de acuerdo con la presente invención puede ser una masa leudada o una masa a someter a fermentación. La masa puede fermentarse de diversos modos tal como añadiendo bicarbonato sódico o similares, o añadiendo un cultivo de levaduras adecuado tal como un cultivo de Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadería).
La presente invención se refiere adicionalmente al uso de la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención para producir una masa de pasta, preferiblemente preparada a partir de harina de trigo duro o una harina de calidad comparable.
La enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención es adecuada para su uso en el desgomado enzimático de aceites vegetales o comestibles. En el procesamiento de aceite vegetal o comestible, el aceite comestible o vegetal se trata con enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención para hidrolizar una parte principal de los lípidos polares (por ejemplo, fosfolípido). Preferiblemente, los grupos acilo grasos se hidrolizan a partir de los lípidos polares. El proceso de desgomado típicamente provoca la reducción del contenido de lípidos polares, particularmente de fosfolípidos, en un aceite comestible debido a la hidrolisis de una parte principal (es decir, más del 50%) del lípido polar, por ejemplo, fosfolípido. Típicamente, la fase acuosa que contiene el lípido polar hidrolizado (por ejemplo, fosfolípido) se separa del aceite. Adecuadamente, el aceite comestible o vegetal puede tener inicialmente (pretratamiento con la enzima de acuerdo con la presente invención) un contenido de fosforo de 50-250 ppm.
En una realización, la presente invención se refiere al uso de la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención en la bioconversión de lípidos polares (preferiblemente glucolípidos) para preparar productos de alto valor, tales como ésteres de carbohidrato y/o ésteres de proteína y/o ésteres de subunidad proteica y/o un éster de hidroxiácido. El uso de una enzima lipolítica, particularmente una enzima lipolítica capaz de transferir grupos acilo desde un sustrato lípido polar (preferiblemente un glucolípido) hasta un aceptor de acilo, en la bioconversión de lípidos polares y las ventajas del mismo, se detalla en el documento PCT/IB2004/004374.
En una realización, la enzima lipolítica para su uso en los métodos de la presente invención puede inmovilizarse. Cuando es el caso en que se inmoviliza la enzima, la mezcla que comprende un donante de acilo, opcionalmente un aceptor de acilo, y opcionalmente agua puede pasarse a través de una columna por ejemplo que comprenda la enzima inmovilizada. Inmovilizando la enzima es posible reutilizarla fácilmente.
Adecuadamente, la enzima inmovilizada puede usarse en un reactor de flujo o en un reactor de lotes que contiene una mezcla de reacción que comprende un donante de acilo lipídico y opcionalmente un aceptor de acilo disuelto en agua. Cuando el aceptor de acilo está presente, el donante y el aceptor están en un sistema de dos fases o una emulsión. La mezcla de reacción puede agitarse o sonicarse opcionalmente. Una vez la reacción ha alcanzado el equilibrio, por ejemplo, la mezcla de reacción y la enzima inmovilizada pueden separarse. Adecuadamente, el producto de reacción puede fraccionarse, por ejemplo, por cromatografía de interacción hidrófoba, cristalización o destilación de alto vacío.
La lípido acetil transferasa inmovilizada puede prepararse usando técnicas de inmovilización conocidas en la técnica. Existen numerosos métodos para preparar enzimas inmovilizadas, que serán evidentes para un especialista en la técnica (por ejemplo, las técnicas mencionadas en el documento EP 0 746 608; o Balcao V.M. et al Enzyme Microb Technol. 1996 May 1; 18(6):392-416; o Retz et al Chem Phys Lipids 1998 Junio:93(1-2) : 3-14; Bomscheuer et al Trends Biotechnol. 2002 Oct; 20(10):433-7; Plou et al Biotechnology 92 (2002) 55-66; Warmuth et al 1992 Bio Forum 9, 282-283; Ferrer et al 2000 J. Chem Technol. Biotechnol. 75, 1-8; o Christensen et al 1998 Nachwachsende Rohstoff 10, 98-105; Petersen y Christenen 2000 Applied Biocatalysis Harwood Academic Publishers, Amsterdam.
Las técnicas que pueden usarse en este documento incluyen acoplamiento covalente a Eupergit C, adsorción en polipropileno y granulación en sílice, por ejemplo.
ENZIMAS LIPOLÍTICAS DE ACUERDO CON LA PRESENTE INVENCIÓN
La enzima lipolítica para su uso de acuerdo con la presente invención y/o en los métodos descritos en este documento es preferiblemente una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos galactolípidos y/o capaz de
E05773820
09-06-2015
transferir un grupo acilo desde al menos un galactolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo, donde la enzima está codificada por un ácido nucleico seleccionado entre el grupo que consiste en:
d) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 3;
5 e) un ácido nucleico que está relacionado con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 por la degeneración del código genético; y f) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 3.
10 Preferiblemente, la enzima lipolítica usada de acuerdo con la presente invención y/o en los métodos descritos en este documento es una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos un galactolípido y/o capaz de transferir un grupo acilo desde al menos un galactolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº4 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con la misma. Las enzimas lipolíticas adecuadas que tienen actividad galactolipasa para su uso de
15 acuerdo con la presente invención y/o en los métodos de la presente invención pueden comprender una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos y/o estar codificada por las siguientes secuencias de nucleótidos:
Thermobifida\fusca GDSx 548 aa
20 SEC ID Nº 5
imagen1
SEC ID Nº 6
imagen2
E05773820
09-06-2015
imagen3
Thermobifida\fusca\ -GDSx
SEC ID Nº 7
imagen4
Corynebacterium\effciens\ GDSx 300 aa
SEC ID Nº 8
imagen5
15 SEC ID Nº 9
imagen6
E05773820
09-06-2015
imagen7
S.coelicolor\ GDSx 268 aa
SEC ID Nº 12
imagen8
E05773820
09-06-2015
SEC ID Nº 13
imagen9
S.avermitilis\ GDSx 269 aa
SEC ID Nº 14
imagen10
E05773820
09-06-2015
SEC ID Nº 15
imagen11
Thermobifida\fusca\ -GDSx
SEC ID Nº 16
imagen12
Thermobifida\fusca\ -GDSx
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50 E05773820
09-06-2015
SEC ID Nº 17
imagen13
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos un galactolípido y/o capaz de transferir un grupo acilo desde al menos un galactolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas como SEC ID Nº 4 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con la misma, o una enzima lipolítica capaz de hidrolizar lípidos polares y/o capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido polar hasta uno o más sustratos aceptores de acilo codificada por una cualquiera de las secuencias de nucleótidos mostradas como SEC ID Nº 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con la misma, en un producto alimenticio para la preparación de un lisoglucolípido, por ejemplo digalactosil monoglicérido (DGMG) o monogalactosil monoglicérido (MGMG) por tratamiento de un glucolípido (por ejemplo, digalactosil diglicérido (DGDG) o monogalactosil diglicérido (MGDG)) con la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención para producir el producto de hidrolisis parcial, es decir, el lisoglucolípido.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona también adicionalmente el uso de una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos un galactolípido y/o capaz de transferir un grupo acilo desde al menos un galactolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas como SEC ID Nº 4 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con la misma, o una enzima lipolítica capaz de hidrolizar lípidos polares y/o capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido polar hasta uno o más sustratos aceptores de acilo codificada por una cualquiera de las secuencias de nucleótidos mostradas como SEC ID Nº 3 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con la misma, en un producto alimenticio para la preparación de un lisofosfolípido, por ejemplo lisolecitina, por tratamiento de un fosfolípido (por ejemplo, lecitina) con la enzima para producir el producto de hidrolisis parcial, es decir, un lisofosfolípido.
En otro aspecto, la presente invención proporciona también adicionalmente el uso de una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos un galactolípido y/o capaz de transferir un grupo acilo desde al menos un galactolípido hasta uno
o más sustratos aceptores de acilo que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas como SEC ID Nº 4 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con la misma, o una enzima lipolítica capaz de hidrolizar lípidos polares y/o capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido polar hasta uno o más sustratos aceptores de acilo codificada por una cualquiera de las secuencias de nucleótidos mostradas como SEC ID Nº 3 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con la misma, en un huevo o un producto basado en huevo para la hidrolisis de fosfolípidos y/o glucolípidos.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos un galactolípido y/o capaz de transferir un grupo acilo desde al menos un galactolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas como SEC ID Nº 4
o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con la misma, o una enzima lipolítica capaz de hidrolizar lípidos polares y/o capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido polar hasta uno o más sustratos aceptores de acilo codificada por una cualquiera de las secuencias de nucleótidos mostradas como SEC ID Nº 3 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con la misma, en un sustrato (preferiblemente, un producto alimenticio) para hidrolizar grupos acilo graso.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos un galactolípido y/o capaz de transferir un grupo acilo desde al menos un galactolípido hasta uno o más sustratos
15
25
35
45
55
65 E05773820
09-06-2015
aceptores de acilo que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas como SEC ID Nº 4
o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con la misma, o una enzima lipolítica capaz de hidrolizar lípidos polares y/o capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido polar hasta uno o más sustratos aceptores de acilo codificada por una cualquiera de las secuencias de nucleótidos mostradas como SEC ID Nº 3 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con la misma, en un aceite comestible para reducir el contenido de un fosfolípido.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de la enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos un galactolípido y/o capaz de transferir un grupo acilo desde al menos un galactolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas como SEC ID Nº 4
o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con la misma, o una enzima lipolítica capaz de hidrolizar lípidos polares y/o capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido polar hasta uno o más sustratos aceptores de acilo codificada por una cualquiera de las secuencias de nucleótidos mostradas como SEC ID Nº 3 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con la misma, en un sustrato (preferiblemente una mezcla de bioconversión que comprende lípidos polares (preferiblemente glucolípidos)) para la producción en la preparación de productos de alto valor, tales como ésteres de carbohidrato y/o ésteres de proteína y/o ésteres de subunidad proteica y/o un éster de hidroxiácido.
En otro aspecto amplio la presente invención puede proporcionar una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos un glucolípido y/o capaz de transferir un grupo acilo desde al menos un galactolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo, donde la enzima se puede obtener, preferiblemente se obtiene, de Streptomyces avermitilis.
En una realización de la presente invención, preferiblemente la especie Streptomyces de la cual se puede obtener la enzima lipolítica (o se obtiene) no es Streptomyces rimosus.
En una realización de la presente invención, preferiblemente la especie Streptomyces de la cual se puede obtener la enzima lipolítica (o se obtiene) no es Streptomyces coelicolor.
VENTAJAS
Una ventaja de la presente invención es que la enzima lipolítica tiene actividad significativa de hidrolisis de glucolípidos. Esto fue sorprendente para una enzima lipolítica de Streptomyces spp.
Una ventaja adicional de la presente invención es que la enzima lipolítica no tiene actividad o no tiene actividad significativa de hidrolisis de triacilglicerol.
AISLADA
En un aspecto, preferiblemente la secuencia está en una forma aislada. El término "aislada" significa que la secuencia está al menos sustancialmente libre de al menos un componente diferente con el cual está asociado de forma natural la secuencia en la naturaleza y como se encuentra en la naturaleza.
PURIFICADA
En un aspecto, preferiblemente la secuencia está en una forma purificada. El término "purificada" significa que la secuencia está en un estado relativamente puro -por ejemplo, al menos aproximadamente un 90% puro, o al menos aproximadamente un 95% puro o al menos aproximadamente un 98% puro.
SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS
El alcance de la presente invención abarca secuencias de nucleótidos que codifican enzimas que tienen las propiedades específicas definidas en este documento.
La expresión "secuencia de nucleótidos" como se usa en este documento, se refiere a una secuencia oligonucleotídica o secuencia polinucleotídica, y variantes, homólogos, fragmentos y derivados de las mismas (tales como partes de las mismas). La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico o sintético o recombinante, que puede ser bicatenaria o monocatenaria ya sea que represente la hebra con sentido o antisentido.
La expresión "secuencia de nucleótidos" en relación con la presente invención incluye ADN genómico, ADNc, ADN sintético, y ARN. Preferiblemente, significa ADN, más preferiblemente secuencia de ADNc codificante para la presente invención.
En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos cuando se refiere a y cuando se abarca por el alcance per se de la presente invención, no incluye la secuencia de nucleótidos nativa de acuerdo con la presente invención
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65 E05773820
09-06-2015
cuando está en su entorno natural y cuando está ligada a su secuencia o secuencias asociadas de forma natural que también están en su entorno natural. Para facilitar las referencias, llamaremos a esta realización preferida la "secuencia de nucleótidos no nativa". A este respecto, la expresión "secuencia de nucleótidos nativa" significa una secuencia de nucleótidos completa que está en su entorno nativo y cuando está unida de forma funcional a un promotor completo con el que está asociado de forma natural, estando dicho promotor también en su entorno nativo. Sin embargo, la secuencia de aminoácidos abarcada por la presente invención puede aislarse y/o purificarse después de la expresión de una secuencia de nucleótidos en su organismo nativo. Preferiblemente, sin embargo, la secuencia de aminoácidos abarcada por el alcance de la presente invención puede expresarse por una secuencia de nucleótidos en su organismo nativo pero donde la secuencia de nucleótidos no está bajo el control del promotor con el que está asociada de forma natural dentro de ese organismo.
PREPARACIÓN DE LA SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS
Típicamente, la secuencia de nucleótidos abarcada por el alcance de la presente invención se prepara usando técnicas de ADN recombinante (es decir, ADN recombinante). Sin embargo, en una realización alternativa de la invención, la secuencia de nucleótidos podría sintetizarse, por completo o en parte, usando métodos químicos bien conocidos en la técnica (véase, Caruthers MH et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 y Horn T et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).
Una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que tiene las propiedades específicas definidas en este documento puede identificarse y/o aislarse y/o purificarse de cualquier célula u organismo que produzca dicha enzima. Son bien conocidos diversos métodos dentro de la técnica para la identificación y/o aislamiento y/o purificación de secuencias de nucleótidos. A modo de ejemplo, pueden usarse técnicas de amplificación por PCR para preparar más de una secuencia una vez se ha identificado y/o aislado y/o purificado una secuencia adecuada.
A modo ejemplo adicional, puede construirse una biblioteca de ADN genómico y/o ADNc usando ADN cromosómico
o ARN mensajero del organismo que produce la enzima. Si la secuencia de aminoácidos de la enzima o una parte de la secuencia de aminoácidos de la enzima es conocida, pueden sintetizarse sondas oligonucleotídicas marcadas y usarse para identificar clones que codifican la enzima a partir de la biblioteca genómica preparada a partir del organismo. Como alternativa, podría usarse una sonda oligonucleotídica marcada que contiene secuencias homólogas a otra enzima conocida para identificar clones que codifican la enzima. En el último caso, se usan condiciones de hibridación y lavado de inferior rigurosidad.
Como alternativa, los clones que codifican la enzima podrían identificarse insertando fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformando bacterias enzima negativas con la biblioteca de ADN genómico resultante, y después sembrando las bacterias transformadas en placas de agar que contienen un sustrato para la enzima (por ejemplo, maltosa para una enzima que produce glucosidasa (maltasa)), permitiendo de ese modo que se identifiquen clones que expresan la enzima.
En una alternativa adicional más, la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima puede prepararse de forma sintética por métodos convencionales establecidos, por ejemplo, el método de fosforamidita descrito por Beucage
S.L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, pág. 1859-1869, o el método descrito por Matthes et al., (1984) EMBO J. 3, pág., 801-805. En el método de fosforamidita, se sintetizan oligonucleótidos, por ejemplo, en un sintetizador de ADN automatizado, se purifican, hibridan, ligan y clonan en vectores apropiados.
La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico o sintético mixto, origen sintético y ADNc mixto, o de origen genómico y ADNc mixto, preparada por ligamiento de fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según lo apropiado) de acuerdo con técnicas convencionales. Cada fragmento ligado corresponde a diversas partes de la secuencia completa de nucleótidos. La secuencia de ADN también puede prepararse por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo como se describe en el documento US 4,683,202 o en Saiki R K et al., (Science (1988) 239, pág. 487-491).
Debido a la degeneración en el código genético, pueden producirse fácilmente secuencias de nucleótidos en que el uso de codones de triplete, para algunos o todos los aminoácidos codificados por la secuencia de nucleótidos original, se han cambiado produciendo de ese modo una secuencia de nucleótidos con baja homología a la secuencia de nucleótidos original pero que codifica la misma secuencia de aminoácidos, o una variante, codificada por la secuencia de nucleótidos original. Por ejemplo, para la mayoría de los aminoácidos, la degeneración del código genético es en la tercera posición en el codón de triplete (posición oscilante) (para referencia véase Stryer, Lubert, Biochemistry, Tercera Edición, Freeman Press, ISBN 0-7167-1920-7) por lo tanto, una secuencia de nucleótidos en que todos los codones de triplete se han "oscilado" en la tercera posición sería aproximadamente un 66% idéntica a la secuencia de nucleótidos original, sin embargo, la secuencia de nucleótidos enmendada codificaría la misma secuencia de aminoácidos primaria, o una variante, que la secuencia de nucleótidos original.
Por lo tanto, la presente invención se refiere adicionalmente a cualquier secuencia de nucleótidos que tenga uso alternativo de codones de triplete para al menos un codón de triplete que codifica un aminoácido, pero que codifica
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65 E05773820
09-06-2015
la misma secuencia polipeptídica, o una variante, que la secuencia polipeptídica codificada por la secuencia de nucleótidos original.
Además, organismos específicos típicamente tienen una desviación en cuanto a los codones de triplete que se usan para codificar los aminoácidos. Están ampliamente disponibles tablas de uso de codones preferidos, y pueden usarse para preparar genes con codones optimizados. Dichas técnicas de optimización de codones se usan rutinariamente para optimizar la expresión de transgenes en un hospedador heterólogo.
EVOLUCIÓN MOLECULAR
Una vez se ha aislado una secuencia de nucleótidos codificante de enzima, o se ha identificado una secuencia putativa de nucleótidos que codifica enzima, puede ser deseable modificar la secuencia de nucleótidos seleccionada, por ejemplo puede ser deseable mutar la secuencia para preparar una enzima de acuerdo con la presente invención.
Pueden introducirse mutaciones usando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados.
Un método adecuado se describe en Morinaga et al (Biotechnology (1984) 2, pág., 646-649). Otro método para introducir mutaciones en secuencias de nucleótidos que codifican enzima se describe en Nelson y Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, pág., 147-151).
En lugar de mutagénesis dirigida al sitio, tal como se ha descrito anteriormente, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente por ejemplo usando un kit comercial tal como el kit de mutagénesis por PCR GeneMorph de Stratagene, o el kit de mutagénesis aleatoria por PCR Diversify de Clontech. El documento EP 0 583 265 se refiere a métodos para optimizar mutagénesis basada en PCR, que también puede combinarse con el uso de análogos mutagénicos de ADN tales como los descritos en el documento EP 0 866 796. Son adecuadas tecnologías de PCR propensas a error para la producción de variantes de enzimas lipolíticas con características preferidas. El documento WO0206457 se refiere a evolución molecular de lipasas.
Un tercer método para obtener nuevas secuencias es fragmentar secuencias de nucleótidos no idénticas, usando cualquier cantidad de enzimas de restricción o una enzima tal como Dnasa I, y reensamblando las secuencias completas de nucleótidos que codifican proteínas funcionales. Como alternativa, puede usarse una o múltiples secuencias de nucleótidos no idénticas e introducir mutaciones durante el reensamblaje de la secuencia de nucleótidos completa. Son adecuadas tecnologías de arrastre de ADN y reordenamiento de familias para la producción de variantes de lípido acil transferasas con características preferidas. Los métodos adecuados para realizar el "arrastre" pueden encontrarse en los documentos EP0 752 008, EP1 138 763, EP1 103 606. El arrastre también puede combinarse con otras formas de mutagénesis de ADN como se describe en el documento US
6.180.406 y el documento WO 01/34835.
Por tanto, es posible producir numerosos mutaciones dirigidas al sitio o aleatorias en una secuencia de nucleótidos, in vivo o in vitro, y para seleccionar posteriormente la funcionalidad mejorada del polipéptido codificado por diversos medios. Usando métodos de recombinación in silico y exo mediados (véanse los documentos WO 00/58517, US 6.344.328, US 6.361.974), por ejemplo, puede realizarse evolución molecular donde la variante producida retiene homología muy baja a enzimas o proteínas conocidas. Dichas variantes obtenidas de ese modo pueden tener analogía estructural significativa con enzimas lipolíticas conocidas, pero tener muy baja homología de secuencia de aminoácidos.
Como ejemplo no limitante, además, pueden recombinarse mutaciones y variantes naturales de una secuencia polinucleotídica con las variantes de tipo silvestre u otras mutaciones o variantes naturales para producir nuevas variantes. Dichas nuevas variantes también pueden seleccionarse para funcionalidad mejorada del polipéptido codificado.
La aplicación de los métodos de evolución molecular mencionados anteriormente y similares permite la identificación y selección de variantes de las enzimas de la presente invención que tienen características preferidas sin ningún conocimiento previo de estructura o función proteica, y permite la producción de mutaciones o variantes no predecibles pero beneficiosas. Existen numerosos ejemplos de la aplicación de evolución molecular en la técnica para la optimización o alteración de actividad enzimática, dichos ejemplos incluyen, aunque sin limitación, uno o más de los siguientes: expresión y/o actividad optimizada en una célula hospedadora o in vitro, actividad enzimática aumentada, especificidad por sustrato y/o producto alterada, estabilidad enzimática o estructural aumentada o disminuida, actividad/especificidad enzimática alterada en condiciones ambientales preferidas, por ejemplo, temperatura, pH, sustrato.
Como será evidente para los especialistas en la técnica, usando herramientas de evolución molecular puede alterarse una enzima para mejorar la funcionalidad de la enzima.
E05773820
09-06-2015
Adecuadamente, al enzima lipolítica usada en la invención puede ser una variante, es decir, puede contener al menos una sustitución, deleción o adición de aminoácido, en comparación con una enzima precursora. Las enzimas variantes retienen al menos el 20%, 30%, 40%, 50 %, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% de homología con la enzima precursora. Las enzimas precursoras adecuadas pueden incluir cualquier enzima con actividad esterasa o
5 lipasa. Preferiblemente, la enzima precursora se alinea con la secuencia consenso pfam00657.
En una realización preferida, una enzima lipolítica variante retiene o incorpora al menos uno o más de los restos de aminoácido de la secuencia consenso pfam00657 encontrados en los bloques GDSx, GANDY y HPT.
10 Las enzimas, tales como lipasas, sin actividad o baja actividad galactolipasa y/o fosfolipasa en un entorno acuoso pueden mutarse usando herramientas de evolución molecular para introducir o potenciar la actividad galactolipasa y/o fosfolipasa, produciendo de ese modo una enzima lipolítica con actividad galactolipasa y/o fosfolipasa significativa adecuada para su uso en las composiciones y métodos de la presente invención.
15 Adecuadamente, la enzima variante puede no tener actividad sobre triglicéridos y/o monoglicéridos y/o diglicéridos.
Como alternativa, la enzima variante para su uso en la invención puede tener actividad aumentada sobre triglicéridos, y/o también puede tener actividad aumentada sobre uno o más de los siguientes, lípidos polares, fosfolípidos, lecitina, fosfatidilcolina, glucolípidos, digalactosil monoglicérido, monogalactosil monoglicérido.
20 SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS
El alcance de la presente invención también abarca secuencias de aminoácidos de enzimas que tienen las propiedades específicas definidas en este documento.
25 Como se usa en este documento, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónima del término "polipéptido" y/o el término "proteína". En algunos casos, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónima del término "péptido". En algunos casos, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónima del término "enzima".
30 La secuencia de aminoácidos puede prepararse/aislarse a partir de una fuente adecuada, o puede prepararse de forma sintética o puede prepararse mediante el uso de técnicas de ADN recombinante.
La enzima abarcada en la presente invención puede usarse junto con otras enzimas. Por tanto, la presente invención también cubre una combinación de enzimas donde la combinación comprende la enzima de la presente
35 invención y otra enzima, que puede ser otra enzima de acuerdo con la presente invención. Este aspecto se analiza en una sección posterior.
Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos cuando se refiere a y cuando está abarcada por el alcance per se de la presente invención no es una enzima nativa. A este respecto, la expresión "enzima nativa" significa una enzima
40 completa que está en su entorno nativo y cuando se ha expresado por su secuencia de nucleótidos nativa.
IDENTIDAD/HOMOLOGÍA
La presente invención también abarca el uso de homólogos de cualquier secuencia de aminoácidos de una enzima o 45 de cualquier secuencia de nucleótidos que codifique dicha enzima.
Aquí, el término "homólogo" significa una entidad que tiene una cierta homología con las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos. Aquí, el término "homología" puede equipararse con "identidad". Estos términos se usarán de forma intercambiable en este documento.
50 En el presente contexto, se adopta que una secuencia de aminoácidos homóloga incluye una secuencia de aminoácidos que puede ser al menos un 87 o 90% idéntica, preferiblemente al menos un 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a la secuencia. Típicamente, los homólogos comprenderán los mismos sitios activos etc. -por ejemplo que la secuencia de aminoácidos objeto. Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud (es
55 decir, restos de aminoácido que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad.
En el presente contexto, se adopta que una secuencia de nucleótidos homóloga incluye una secuencia de nucleótidos que puede ser al menos un 85 o 90% idéntica, preferiblemente al menos un 95, 96, 97, 98 o 99%
60 idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima de la presente invención (la secuencia objeto). Típicamente, los homólogos comprenderán las mismas secuencias que codifican los sitios activos etc. que la secuencia objeto. Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud (es decir, restos de aminoácido que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.
65
15
25
35
45
55
65 E05773820
09-06-2015
Para las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos, las comparaciones de homología pueden realizarse a ojo, o más habitualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencia fácilmente disponibles. Estos programas informáticos disponibles en el mercado pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias. El % de homología puede calcularse sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el correspondiente aminoácido en la otra secuencia, un resto cada vez. Esto se llama una alineación "sin huecos". Típicamente, dichas alineaciones sin huecos se realizan solamente sobre una cantidad relativamente corta de restos.
Aunque éste es un método muy simple y coherente, no logra tener en consideración que, por ejemplo, en un par de secuencias por lo demás idénticas, una inserción o deleción cause que los siguientes restos de aminoácido se pongan fuera de la alineación, provocando de este modo potencialmente una gran reducción en el % de homología cuando se realiza una alineación global. Por consiguiente, la mayoría de los métodos de comparación de secuencia se diseñan para producir alineaciones óptimas que tengan en consideración posibles inserciones y deleciones sin penalizar excesivamente el valor de homología global. Esto se consigue insertando "huecos" en la alineación de secuencia para intentar maximizar la homología local.
Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones por hueco" a cada hueco que sucede en la alineación de modo que, para la misma cantidad de aminoácidos idénticos, una alineación de secuencia con la menor cantidad posible de huecos -que refleja mayor vinculación entre las dos secuencias comparadas -consiga un mayor valor que una con muchos huecos. Típicamente se usan "costes de hueco afines" que cargan un coste relativamente alto para la existencia de un hueco y una penalización más pequeña para cada resto posterior en el hueco. Éste es el sistema de valoración de huevos más habitualmente usado. Las altas penalizaciones por hueco por supuesto producirán alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de los programas de alineación permitirán modificar las penalizaciones por hueco. Sin embargo, se prefiere usar los valores por defecto cuando se usan dichos software para las comparaciones de secuencia. Por ejemplo, cuando se usa el paquete GCG Wisconsin Bestfit, la penalización por hueco por defecto para secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada extensión.
El cálculo del % máximo de homología por lo tanto requiere en primer lugar la producción de una alineación óptima, teniendo en consideración penalizaciones por hueco. Un programa informático adecuado para realizar dicha alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al. 1984 Nuc. Acids Research 12 p387). Ejemplos de otros software que pueden realizarse comparaciones de secuencia incluyen, aunque sin limitación, el paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4ª Ed -Capítulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410) y la serie GENEWORKS de herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para búsquedas offline y online (véase Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, páginas 7-58 a 7-60).
Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere usar el programa GCG Bestfit. Una nueva herramienta, llamada BLAST 2 Sequences también está disponible para comparar secuencias de proteínas y nucleótidos (véase FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; y FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8).
Aunque el % final de homología puede medirse en términos de identidad, el propio proceso de alineación típicamente no se basa en una comparación de pares de todo o nada. En su lugar, generalmente se usa una matriz de valores de similitud escalada que asigna valores a cada comparación por pares en base a la similitud química o distancia evolutiva. Un ejemplo de dicha matriz habitualmente usada es la matriz BLOSUM62 -la matriz por defecto para la serie BLAST de programas. Los programas GCG Wisconsin generalmente usan los valores por defecto públicos o una tabla de comparación de símbolos personalizada si se suministra (véase el manual del usuario para detalles adicionales). Para algunas aplicaciones, si se prefiere usar los valores por defecto públicos para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.
Como alternativa, los porcentajes de homología pueden calcularse usando la característica de alineación múltiple en DNASIS™ (Hitachi Software), basada en un algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG y Sharp PM (1988), Gene 73 (1), 237-244).
Una vez el software ha producido una alineación óptima, es posible calcular el % de homología, preferiblemente el % de identidad de secuencia. El software típicamente hace esto como parte de la comparación de secuencia y genera un resultado numérico.
En un aspecto preferible de la presente invención, se usa el siguiente software y ajustes para calcular el porcentaje de homología/identidad de secuencia. Para secuencias de aminoácidos, los porcentajes de identidad (homología) o "positivos" se calculan por el AlignX VectorNTI (Vector NTI Advance 9.1 de Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, EEUU.) para cada posible par de secuencias de aminoácidos. Los ajustes son parámetros por defecto (penalización por abertura de hueco -10, penalización por extensión de hueco 0,1).
Para cada secuencia de ácido nucleico, los porcentajes de identidad (homología) o "positivos" se calculan por el programa AlignX VectorNTI de Informax Inc. (EEUU) para cada posible par de secuencias de ácido nucleico. Los
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55 E05773820
09-06-2015
ajustes son ajustes por defecto que para ADN son: penalización por abertura de hueco: 15 y penalización por extensión de hueco: 6,66. (Mismos ajustes para alineaciones múltiples).
Preferiblemente, la identidad de aminoácidos (homología) se calcula en toda la secuencia de aminoácidos de longitud completa (por ejemplo, SEC ID 4, 5, 7, 8, 10, 12 y 14), o para ácido nucleico respeto a un polinucleótido correspondiente que codifica la respectiva secuencia de aminoácidos de longitud completa. La identidad de aminoácidos o ácidos nucleicos (homología) puede calcular, preferiblemente, comparando la homología/identidad sobre la secuencia polipeptídica madura, es decir, una secuencia polipeptídica que se ha procesado co-o posttraduccionalmente, por ejemplo por escisión de un péptido señal N-terminal, o un evento de escisión C-terminal.
Las secuencias también pueden tener deleciones, inserciones o sustituciones de restos de aminoácido que producen un cambio silencioso y provocar una sustancia funcionalmente equivalente. Pueden hacerse sustituciones deliberadas de aminoácidos en base a la similitud en propiedades de aminoácidos (tales como polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los restos) y por lo tanto es útil agrupar aminoácidos juntos en grupos funcionales. Los aminoácidos pueden agruparse juntos en base a las propiedades de su cadena lateral solamente. Sin embargo, es más útil incluir datos de mutación también. Estos conjuntos de aminoácidos así derivados tienen probabilidad de conservarse por razones estructurales. Estos conjuntos pueden describirse en forma de un diagrama de Venn (Livingstone C.D. y Barton G.J. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput.Appl Biosci. 9: 745-756) (Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J.Theor.Biol. 119; 205-218). Las sustituciones conservativas pueden hacerse, por ejemplo, de acuerdo con la siguiente tabla que describe un diagrama de Venn generalmente aceptado de agrupación de aminoácidos.
CONJUNTO
SUB-CONJUNTO
Hidrófobo
F W Y H K M I L V A G C Aromático F W Y H
Alifático
I L V
Polar
W Y H K R E D C S T N Q Cargado H K R E D
Cargado positivamente
H K R
Cargado negativamente
E D
Pequeño
V C A G S P T N D Mínimo A G S
La presente invención también abarca sustitución homóloga (sustitución y remplazo se usan ambos en este documento para indicar el intercambio de un resto existente de aminoácido, con un resto alternativo) que puede suceder, es decir, sustitución similar por similar tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar etc. También puede suceder sustitución no homóloga, es decir, de una clase de resto a otra o como alternativa implicando la inclusión de aminoácidos no naturales tales como ornitina (a partir de ahora en este documento mencionada como Z), ácido diaminobutírico ornitina (a partir de ahora en este documento mencionada como B), norleucina ornitina (a partir de ahora en este documento mencionada como O), piridilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.
Los remplazos también pueden hacerse por aminoácidos no naturales.
Las secuencias de aminoácidos variantes pueden incluir grupos espaciadores adecuados que pueden insertarse entre dos restos de aminoácido cualesquiera de la secuencia incluyendo grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo además de espaciadores de aminoácido tales como restos de glicina o β-alanina. Una forma adicional de variación implica la presencia de uno o más restos de aminoácido en forma peptoide, y será bien comprendida por los especialistas en la técnica. Para evitar dudas, "la forma peptoide" se usa para hacer referencia a restos de aminoácido variantes donde el grupo sustituyente de carbono α está en el átomo de nitrógeno del resto en lugar del carbono α. Los procesos para preparar péptidos en la forma peptoide son conocidos en la técnica, por ejemplo Simon RJ et al., PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13 (4), 132-134.
Las secuencias de nucleótidos para su uso en la presente invención pueden incluir dentro de ellas nucleótidos sintéticos o modificados. Se conocen en la técnica varios tipos diferentes de modificación para oligonucleótidos. Éstos incluyen estructuras metil-fosfonato y fosforotioato y/o la adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los propósitos de la presente invención, debe entenderse que las secuencias de nucleótidos descritas en este documento pueden modificarse por cualquier método disponible en la técnica. Dichas modificaciones pueden realizarse para potenciar la actividad in vivo o vida de las secuencias de nucleótidos de la presente invención.
La presente invención también abarca el uso de secuencias de nucleótidos que son complementarias a las secuencias presentadas en este documento, o cualquier derivado, fragmento o derivado de las mimas. Si la secuencia es complementaria a un fragmento de las mismas, entonces esa secuencia puede usarse como sonda para identificar secuencias codificantes similares en otros organismos, etc.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65 E05773820
09-06-2015
Los polinucleótidos que no son 100% homólogos a las secuencias de la presente invención pero están dentro del alcance de la invención pueden obtenerse de varios modos. Otras variantes de las secuencias descritas en este documento pueden obtenerse por ejemplo sondeando bibliotecas de ADN preparadas a partir de una serie de individuos, por ejemplo, individuos de diferentes poblaciones. Además, pueden obtenerse otros homólogos y dichos homólogos y fragmentos de los mismos en general serán capaces de hibridar selectivamente con las secuencias mostradas en las secuencias enumeradas en este documento. Dichas secuencias pueden obtenerse sondeando bibliotecas de ADNc preparadas a partir de o bibliotecas de ADN genómico de otras especies, y sondeando dichas bibliotecas con sondas que comprenden todo o parte de una cualquiera de las secuencias en las listas de secuencias adjuntas en condiciones de medio de alta rigurosidad. Se aplica consideraciones similares para obtener homólogos de especie y variantes alélicas del polipéptido o secuencias de nucleótidos de la invención.
También pueden obtenerse variantes y homólogos de cepa/especie usando PCR degenerada que usará cebadores diseñados para abordar secuencias en las variantes y homólogos que codifican secuencias de aminoácidos conservadas dentro de las secuencias de la presente invención. Las secuencias conservadas pueden predecirse, por ejemplo, alineando las secuencias de aminoácidos de varias variantes/homólogos. Las alineaciones de secuencia pueden realizarse usando software informáticos conocidos en la técnica. Por ejemplo se usa ampliamente el programa GCG Wisconsin PileUp.
Los cebadores usados en PCR degenerada contendrán una o más posiciones degeneradas y se usarán en condiciones de rigurosidad inferiores a las usadas para clonar secuencias con cebadores de secuencia únicos frente a secuencias conocidas.
Como alternativa, dichos polinucleótidos pueden obtenerse por mutagénesis dirigida al sitio de secuencias caracterizadas. Esto puede ser útil cuando, por ejemplo, se requieren cambios de secuencia de codones silenciosos para optimizar preferencias de codones para una célula hospedadora particular en que se están expresan secuencias polinucleotídicas. Pueden desearse otros cambios de secuencia para introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, o para alterar la propiedad o función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.
Los polinucleótidos (secuencias de nucleótidos) de la invención pueden usarse para producir un cebador, por ejemplo, un cebador de PCR, un cebador para una reacción alternativa de amplificación, una sonda, por ejemplo, marcada con un marcador de revelado por medios convencionales usando marcadores radiactivos o no radiactivos,
o los polinucleótidos pueden clonarse en vectores. Dichos cebadores, sondas y otros fragmentos serán de al menos 15, preferiblemente al menos 20, por ejemplo al menos 25, 30 o 40 nucleótidos de longitud, y también están abarcados por el término polinucleótidos de la invención como se usa en este documento.
Los polinucleótidos tales como polinucleótidos y sondas de ADN de acuerdo con la invención pueden producirse de forma recombinante, sintética, o por cualquier medio disponible para los especialistas en la técnica. También pueden clonarse por técnicas convencionales.
En general, los cebadores se producirán por medios sintéticos, que implican una fabricación por etapas de la secuencia deseada de ácido nucleico un nucleótido cada vez. Las técnicas para conseguir esto usando técnicas automatizadas están fácilmente disponibles en la técnica.
Generalmente se producirán polinucleótidos más largos usando medios recombinantes, por ejemplo usando técnicas de clonación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Los cebadores pueden diseñarse para contener sitios adecuados de reconocimiento para enzimas de restricción de modo que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonación adecuado.
BIOLÓGICAMENTE ACTIVO
Preferiblemente, las secuencias variantes etc. son al menos tan biológicamente activas como las secuencias presentadas en este documento.
Como se usa en este documento "biológicamente activo" se refiere a una secuencia que tiene una función estructural similar (pero no necesariamente al mismo grado), y/o función reguladora similar (pero no necesariamente al mismo grado), y/o función bioquímica similar (pero no necesariamente al mismo grado) de la secuencia de origen natural.
HIBRIDACIÓN
La presente invención también abarca secuencias que son complementarias a las secuencias de ácido nucleico de la presente invención o secuencias que son capaces de hibridar con las secuencias de la presente invención o con secuencias que son complementarias a las mismas.
E05773820
09-06-2015
El término "hibridación" como se usa en este documento incluirá "el proceso por el cual una hebra de ácido nucleico se une con una hebra complementaria a través de apareamiento de bases" así como el proceso de amplificación realizado en tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
5 La presente invención también abarca el uso de secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridar con las secuencias que son complementarias a las secuencias presentadas en este documento, o cualquier derivado, fragmento o derivado de las mismas.
El término "variante" también abarca secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de 10 hibridar con las secuencias de nucleótidos presentadas en este documento.
Preferiblemente, el término "variante" abarca secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridar en condiciones rigurosas (por ejemplo, 50ºC y SSC 0,2x {SSC 1x = NaCl 0,15 M, Na3citrato 0,015 M pH 7,0}) con las secuencias de nucleótidos presentadas en este documento.
15 Más preferiblemente, el término "variante" abarca secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridar en condiciones altamente rigurosas (por ejemplo, 65ºC y SSC 0,1x {SSC 1x = NaCl 0,15 M, Na3citrato 0,015 M pH 7,0}) con las secuencias de nucleótidos presentadas en este documento.
20 La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con las secuencias de nucleótidos de la presente invención (incluyendo secuencias complementarias de las presentadas en este documento).
La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos que son complementarias a secuencias que 25 pueden hibridar con las secuencias de nucleótidos de la presente invención (incluyendo secuencias complementarias de las presentadas en este documento).
También se incluyen dentro del alcance de la presente invención secuencias polinucleotídicas que son capaces de hibridar con las secuencias de nucleótidos presentadas en este documento en condiciones de rigurosidad intermedia 30 a máxima.
En un aspecto preferido, la presente invención cubre secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con la secuencia de nucleótidos de la presente invención, o el complemento de la misma, en condiciones rigurosas (por ejemplo, 50ºC y SSC 0,2x).
35 En un aspecto más preferido, la presente invención cubre secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con la secuencia de nucleótidos de la presente invención, o el complemento de la misma, en condiciones altamente rigurosas (por ejemplo, 65ºC y SSC 0,1x).
40 RECOMBINANTE
En un aspecto, la secuencia para su uso en la presente invención es una secuencia recombinante -es decir una secuencia que se ha preparado usando técnicas de ADN recombinante.
45 Estas técnicas de ADN recombinante pertenecen a las capacidades de una persona especialista en la técnica. Dichas técnicas se explican en la bibliografía, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
SINTÉTICO
50 En un aspecto, la secuencia para su uso en la presente invención es una secuencia sintética -es decir, una secuencia que se ha preparado por síntesis química o enzimática in vitro. Incluye, aunque sin limitación, secuencias preparadas con uso de codones óptimos para organismos hospedadores -tales como las levaduras metilotróficas Pichia y Hansenula.
55 EXPRESIÓN DE ENZIMAS
La secuencia de nucleótidos para su uso en la presente invención puede incorporarse en un vector replicable recombinante. El vector puede usarse para replicar y expresar la secuencia de nucleótidos, en forma enzimática, en 60 y/o a partir de una célula hospedadora compatible.
La expresión puede controlarse usando secuencias de control por ejemplo secuencias reguladoras.
La enzima producida por una célula recombinante hospedadora por expresión de la secuencia de nucleótidos puede 65 secretarse o puede contenerse de forma intracelular dependiendo de la secuencia y/o el vector usados. Las
E05773820
09-06-2015
secuencias codificantes pueden diseñarse con secuencias señal que dirijan la secreción de las secuencias codificantes de sustancia a través de una membrana celular procariota o eucariota particular.
VECTOR DE EXPRESIÓN 5 La expresión "vector de expresión" significa una construcción con capacidad de expresión in vivo o in vitro.
Preferiblemente, el vector de expresión se incorpora en el genoma de un organismo hospedador adecuado. El término "incorporado" preferiblemente cubre la incorporación estable en el genoma.
10 La secuencia de nucleótidos de la presente invención puede estar presente en un vector en que la secuencia de nucleótidos está unida de forma funcional a secuencias reguladoras capaces de proporcionar la expresión de la secuencia de nucleótidos por un organismo hospedador adecuado.
15 Los vectores para su uso en la presente invención pueden transformarse en una célula hospedadora adecuada como se describe a continuación para proporcionar la expresión de un polipéptido de la presente invención.
La elección del vector, por ejemplo, un plásmido, cósmido, o vector fágico a menudo dependerá de la célula hospedadora en que tiene que introducirse.
20 Los vectores para su uso en la presente invención pueden contener uno o más genes marcadores de selección tales como un gen, que confiere resistencia a antibióticos, por ejemplo, resistencia a ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Como alternativa, la selección puede conseguirse por co-transformación (como se describe en el documento WO91/17243).
25 Los vectores pueden usarse in vitro, por ejemplo, para la producción de ARN o usarse para transfectar; transformar, transducir o infectar una célula hospedadora.
Por tanto, en una realización adicional, la invención proporciona un método para preparar secuencias de nucleótidos
30 de la presente invención introduciendo una secuencia de nucleótidos de la presente invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula hospedadora compatible, y cultivando la célula hospedadora en condiciones que provocan la replicación del vector.
El vector puede comprender adicionalmente una secuencia de nucleótidos que posibilita que el vector se replique en 35 la célula hospedadora en cuestión. Ejemplos de dichas secuencias son los orígenes de replicación de plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y pIJ702.
SECUENCIAS REGULADORAS
40 En algunas aplicaciones, la secuencia de nucleótidos para su uso en la presente invención está unida de forma funcional a una secuencia reguladora que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia de nucleótidos, tal como por la célula hospedadora elegida. A modo de ejemplo, la presente invención cubre un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de la presente invención unida de forma funcional a dicha secuencia reguladora, es decir, el vector es un vector de expresión.
45 La expresión "unido de forma funcional" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes descritos están en una relación que les permite funciona de su modo pretendido. Una secuencia reguladora "unida de forma funcional" a una secuencia codificante está ligada de tal modo que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatible con las secuencias de control.
50 La expresión "secuencias reguladoras" incluye promotores y potenciadores y otras señales de regulación de la expresión.
El término "promotor" se usa en el sentido normal de la técnica, por ejemplo un sitio de unión a ARN polimerasa.
55 La expresión potenciada de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima de la presente invención también puede conseguirse mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo regiones promotoras, líderes de secreción y terminadoras.
60 Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención se une de forma funcional a al menos un promotor.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de nucleótidos en un hospedador bacteriano, fúngico o de levadura son bien conocidos en la técnica. 65
E05773820
09-06-2015
CONSTRUCCIONES
El término "construcción" -que es sinónimo de términos tales como "conjugado", "casete" e "híbrido" -incluye una secuencia de nucleótidos para su uso de acuerdo con la presente invención directa o indirectamente unida a un 5 promotor.
Un ejemplo de una unión indirecta es la provisión de un grupo espaciado adecuado tal como una secuencia intrónica, tal como el intrón Sh1 o el intrón ADH, intermedia, el promotor y la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Lo mismo es cierto para el término "fusionado" en relación a la presente invención que incluye unión
10 directa o indirecta. En algunos casos, los términos no cubren la combinación natural de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína asociada de forma normal con el promotor génico de tipo silvestre y cuando ambos se expresan en su entorno natural.
La construcción incluso puede contener o expresar un marcador, que permite la selección de la construcción 15 genética.
Para algunas aplicaciones, preferiblemente la construcción de la presente invención comprende al menos la secuencia de nucleótidos de la presente invención unida de forma funcional a un promotor.
20 CÉLULAS HOSPEDADORAS
La expresión "célula hospedadora" -en relación a la presente invención incluye cualquier célula que comprenda la secuencia de nucleótidos o un vector de expresión como se ha descrito anteriormente y que se usa en la producción recombinante de una enzima que tiene las propiedades específicas como se define en este documento.
25 Por tanto, una realización adicional de la presente invención proporciona células hospedadoras transformadas o transfectadas con una secuencia de nucleótidos que expresa la enzima de la presente invención. Las células se elegirán para ser compatibles con dicho vector y pueden ser, por ejemplo, células procariotas (por ejemplo bacterianas), fúngicas, de levaduras o vegetales. Preferiblemente, las células hospedadoras no son células
30 humanas.
Ejemplos de organismos hospedadores bacterianos adecuados son especies bacterianas gram positivas o gram negativas.
35 Dependiendo de la naturaleza de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima de la presente invención, y/o la conveniencia de procesamiento adicional de la proteína expresada, pueden preferirse hospedadores eucariotas tales como levaduras u otros hongos. En general, se prefieren células de levadura sobre las células fúngicas porque son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas se secretan mal de la célula de levadura, o en algunos casos no se procesan apropiadamente (por ejemplo, hiperglucosilación en levaduras). En estos casos, debe
40 seleccionarse un organismo hospedador fúngico diferente.
El uso de células hospedadoras adecuadas -tales como células hospedadoras de levadura, fúngicas y vegetales puede proporcionar modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, miristoilación, glucosilación, truncamiento, lipidación y fosforilación de tirosina, serina o treonina) que puedan necesitarse para conferir actividad biológica
45 óptima sobre productos de expresión recombinante de la presente invención.
La célula hospedadora puede ser una cepa deficiente en proteasa o proteasa menos.
El genotipo de la célula hospedadora puede modificarse para mejorar la expresión.
50 Ejemplos de modificaciones de células hospedadoras incluyen deficiencia en proteasa, suplementación de ARNt raros, y modificación del potencial reductor en el citoplasma para potenciar la formación de enlaces disulfuro.
Por ejemplo, la célula hospedadora E. coli puede sobre-expresar ARNt raros para mejorar la expresión de proteínas
55 heterólogas como se ejemplifica/describe en Kane (Curr Opin Biotechnol (1995), 6, 494-500 "Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in E.coli"). La célula hospedadora puede ser deficiente en carias enzimas reductoras favoreciendo de este modo la formación de enlaces disulfuro estables como se ejemplifica/describe en Bessette (Proc Natl Acad Sci USA (1999), 96, 13703-13708 " Efficient folding of proteins with multiple disulphide bonds in the Escherichia coli cytoplasm").
60 En una realización, la célula hospedadora es un bacteria, preferiblemente una bacteria gram-positiva, preferiblemente una célula hospedadora seleccionada entre Actinobacteria, tal como Bifidobacteria y Aeromonas, particularmente preferiblemente Aeromonas salmonicida. Aún más preferidos son Actinomicetales tales como Corynebacteria, en particular Corynebacterium glutamicum y Nocardia. Son particularmente preferidos
65 Streptomycetaceae, tales como Streptomyces, especialmente S. lividans.
E05773820
09-06-2015
Puede usarse un hospedador microbiano para la expresión del gen de galactolipasa, por ejemplo Eubacteria, Archea
o Fungi, incluyendo levaduras. Se prefieren Eubacterias, por ejemplo, Firmicutes (bacteria Gram positiva de bajo GC), tal como Bacillus subtilis y otras especies de bacilos, bacterias ácido lácticas tales como especies de los géneros Lactobacillus y Lactococcus.
5 También se prefieren Proteobacterias Gram-negativas, en particular Gammaproteobacteria, tales como especies hospedadoras que pertenecen a los géneros Pseudomonas, Xanthomonas, Citrobacter y Escherichia, especialmente Escherichia coli.
10 En otra realización, la célula hospedadora es el mimo género que la especie hospedadora nativa, es decir el gen recombinante se re-introduce y expresa en una especie del mismo género que la especie de la cual se aisló el gen recombinante.
En otra realización, la célula hospedadora es la especie hospedadora nativa, es decir el gen recombinante se re15 introduce y expresa en la misma especie de la cual se aisló el gen recombinante.
ORGANISMO
El término "organismo" en relación a la presente invención incluye cualquier organismo que podría comprender la
20 secuencia de nucleótidos que codifica la enzima de acuerdo con la presente invención y/o productos obtenidos de la misma, y/o donde un promotor puede permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención cuando está presente en el organismo.
Los organismos adecuados pueden incluir un procariota, hongo, levadura o una planta.
25 La expresión "organismo transgénico" en relación a la presente invención incluye cualquier organismo que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima de acuerdo con la presente invención y/o los productos obtenidos de la misma, y/o donde un promotor puede permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención dentro del organismo. Preferiblemente la secuencia de nucleótidos se
30 incorpora en el genoma del organismo.
La expresión "organismo transgénico" no cubre secuencia codificantes nativas de nucleótidos en su entorno natural cuando están bajo el control de su promotor nativo que también está en su entorno natural.
35 Por lo tanto, el organismo transgénico de la presente invención incluye un organismo que comprende una cualquiera de, o combinaciones de, la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima de acuerdo con la presente invención, construcciones de acuerdo con la presente invención, vectores de acuerdo con la presente invención, plásmidos de acuerdo con la presente invención, células de acuerdo con la presente invención, tejidos de acuerdo con la presente invención, o los productos de los mismos.
40 Por ejemplo, el organismo transgénico también puede comprender la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima de la presente invención bajo el control de un promotor heterólogo.
TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS/ORGANISMO HOSPEDADOR
45 Como se ha indicado previamente, el organismo hospedador puede ser un organismo procariota o un organismo eucariota. Ejemplos de hospedadores procariotas adecuados incluyen E. coli y Bacillus subtilis.
Los contenidos sobre la transformación de hospedadores procariotas están bien documentados en la técnica, por
50 ejemplo véase Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Si se usa un hospedador procariota entonces puede que se necesite que la secuencia de nucleótidos se modifique adecuadamente antes de la transformación -tal como por eliminación de intrones.
Pueden transformarse células de hongos filamentosos usando diversos métodos conocidos en la técnica -tales
55 como un proceso que implica la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos seguida de regeneración de la pared celular de un modo conocido. El uso de Aspergillus como microorganismo hospedador se describe en el documento EP 0 238 023.
Otro organismo hospedador puede ser una planta. Puede encontrarse una revisión de las técnicas generales usadas
60 para transformar plantas en artículos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech Marzo/Abril 1994 17-27). Pueden encontrarse contenidos adicionales sobre transformación de plantas en el documento EP-A-0449375.
Se presentan contenidos generales sobre la transformación de hongos, levaduras y plantas en las siguientes 65 secciones.
E05773820
09-06-2015
HONGOS TRANSFORMADOS
Un organismo hospedador puede ser un hongo -tal como un hongo filamentoso. Ejemplos de hospedadores adecuados de éstos incluyen cualquier miembro que pertenezca a los géneros Thermomyces, Acremonium, 5 Aspergillus, Penicillium, Mucor, Neurospora, Trichoderma y similares.
Se revisan contenidos sobre la transformación de hongos filamentosos en el documento US-A-5741665 que expone que las técnicas convencionales para la transformación de hongos filamentosos y el cultivo de los hongos son bien conocidas en la técnica. Se encuentra una revisión extensiva de las técnicas aplicadas a N. crassa, por ejemplo, en
10 Davis y de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.
Se revisan contenidos adicionales sobre transformación de hongos filamentosos en el documento US-A-5674707.
En un aspecto, el organismo hospedador puede ser del género Aspergillus, tal como Aspergillus niger.
15 Un Aspergillus transgénico de acuerdo con la presente invención también puede prepararse siguiendo, por ejemplo, los contenidos de Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. En: Martinelli S.D., Kingdom J.R. (Editores) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol. 29, Elsevier Amsterdam 1994, pág. 641-666). La expresión génica en hongos filamentosos se ha revisado en Punt et al. (2002) Trends Biotechnol 2002, Mayo;
20 20(5):200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4):273-306.
LEVADURAS TRANSFORMADAS
En otra realización, el organismo transgénico puede ser una levadura.
25 Se proporciona una revisión de los principios de expresión génica heteróloga en levaduras en, por ejemplo, Methods Mol Biol (1995), 49:341-54, y Curr Opin Biotechnol (1997) Oct; 8(5):554-60.
A este respecto, las levaduras -tales como las especies Saccharomyces cereviseae o Pichia pastoris (véase FEMS 30 Microbiol Rev (2000 24(1):45-66), pueden usarse como vehículo para la expresión génica heteróloga.
Se da una revisión de los principios de expresión génica heteróloga en Saccharomyces cerevisiae y la secreción de productos génicos por E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol. 5, Anthony H Rose y J Stuart Harrison, eds, 2ª edición, Academic Press Ltd.).
35 Para la transformación de levaduras, se han desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo, puede prepararse una Saccharomyces transgénica de acuerdo con la presente invención siguiendo los contenidos de Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, Londres, 275, 104); e Ito, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168).
40 Las células transformadas de levadura pueden seleccionarse usando diversos marcadores selectivos -tales como marcadores auxotróficos, marcadores dominantes de resistencia a antibióticos.
PLANTAS/CÉLULAS VEGETALES TRANSFORMADAS
45 Un organismo hospedador adecuado para la presente invención puede ser una planta. Puede encontrarse una revisión de los contenidos generales en artículos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech Marzo/Abril 1994 17-27).
50 CULTIVO Y PRODUCCIÓN
Las células hospedadoras transformadas con la secuencia de nucleótidos de la presente invención pueden cultivarse en condiciones conductoras a la producción de la enzima codificada y que faciliten la recuperación de la enzima desde las células y/o el medio de cultivo.
55 El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar la célula hospedadora en cuestión y obtener la expresión de la enzima.
La proteína producida por una célula recombinante puede presentarse sobre la superficie de la célula.
60 La enzima puede secretarse desde las células hospedadoras y puede recuperarse convenientemente desde el medio de cultivo usando procedimientos bien conocidos.
E05773820
09-06-2015
SECRECIÓN
A menudo, es deseable que la enzima se secrete desde el hospedador de expresión al medio de cultivo desde donde la enzima puede recuperarse más fácilmente. De acuerdo con la presente invención, la secuencia líder de 5 secreción puede seleccionarse en base al hospedador de expresión deseado. También pueden usarse secuencias señal híbridas con el contexto de la presente invención.
Ejemplos típicos de secuencias líder de secreción heterólogas son aquellas que se originan a partir del gen de la amiloglucosidasa (AG) fúngica (glaA -versiones tanto de 18 como de 24 aminoácidos por ejemplo de Aspergillus), el 10 gen del a-factor (levaduras por ejemplo Saccharomyces, Kluyveromyces y Hansenula) o el gen de la α-amilasa (Bacillus).
A modo de ejemplo, se revisa la secreción de proteínas heterólogas en E. coli en Methods Enzymol (1990) 182:132
43.
15 DETECCIÓN
Se conoce en la técnica una diversidad de protocolos para detectar y medir la expresión de la secuencia de aminoácidos. Ejemplos incluyen ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y 20 clasificación de células activadas fluorescentes (FACS).
Los especialistas en la técnica conocen una amplia diversidad de marcadores y técnicas de conjugación y pueden usarse en diversos ensayos de ácido nucleico y aminoácidos.
25 Varias compañías tales como Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI), y US Biochemical Corp (Cleveland, OH) suministran kits comerciales y protocolos para estos procedimientos.
Las moléculas indicadoras o marcadores adecuados incluyen aquellos radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, o cromogénicos así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas 30 magnéticas y similares. Las patentes que muestran el uso de dichos marcadores incluyen US-A-3.817.837; US-A3.850.752; US-A-3.939.350; US-A-3.996.345; US-A-4.277.437; US-A-4.275.149 y US-A-4.366.241.
Además, pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes como se muestra en el documento US-A-4.816.567.
35 PROTEÍNAS DE FUSIÓN
La secuencia de aminoácidos para su uso de acuerdo con la presente invención puede producirse como una proteína de fusión, por ejemplo para ayudar en la extracción y purificación. Ejemplos de compañeros de proteínas de fusión incluyen glutatión-S-transferasa (GST), 6xHis, GAL4 (dominios de unión a ADN y/o activación transcripcional)
40 y(β-galactosidasa). También puede ser conveniente incluir un sitio de escisión proteolítica entre el compañero de proteínas de fusión y la secuencia proteica de interés para permitir la eliminación de secuencias de proteína de fusión.
Preferiblemente, la proteína de fusión no impedirá la actividad de la secuencia proteica. 45 Los sistemas de expresión de fusión génica en E. coli se han revisado en Curr Opin Biotechnol (1995) 6(5):501-6.
En otra realización de la invención, la secuencia de aminoácidos puede ligarse a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para seleccionar bibliotecas de péptidos para agentes capaces de 50 afectar a la actividad de la sustancia, puede ser útil codificar una sustancia quimérica que exprese un epítopo heterólogo que se reconoce por un anticuerpo disponible en el mercado.
APLICACIÓN A GRAN ESCALA
55 En una realización preferida de la presente invención, la secuencia de aminoácidos se usa para aplicaciones a gran escala.
Preferiblemente la secuencia de aminoácidos se produje en una cantidad de 1 g por litro a aproximadamente 2 g por litro del volumen total de cultivo celular después de cultivo del organismo hospedador.
60 Preferiblemente la secuencia de aminoácidos se produce en una cantidad de 100 mg por litro a aproximadamente 900 mg por litro del volumen total de cultivo celular después de cultivo del organismo hospedador.
Preferiblemente la secuencia de aminoácidos se produce en una cantidad de 250 mg por litro a aproximadamente 65 500 mg por litro del volumen total de cultivo celular después de cultivo del organismo hospedador.
E05773820
09-06-2015
ALIMENTOS
La composición de la presente invención puede usarse como -o en la preparación de -un alimento. Aquí, el término "alimento" se usa en un sentido amplio -y cubre alimentos para seres humanos así como alimentos para animales 5 (es decir piensos). En un aspecto preferido, el alimento es para consumo humano.
El alimento puede estar en forma de una solución o en forma de un sólido -dependiendo del uso y/o el modo de aplicación y/o el modo de administración.
10 INGREDIENTES DE ALIMENTOS
La composición de la presente invención puede usarse como un ingrediente de alimentos.
Como se usa en este documento la expresión "ingrediente de alimentos" incluye una formulación, que se añade o 15 puede añadirse a alimentos funcionales o productos alimenticios e incluye formulaciones que pueden usarse a bajos niveles en una amplia diversidad de productos que requieren, por ejemplo, acidificación o emulsión.
El ingrediente de alimentos puede estar en forma de una solución o en forma de un sólido -dependiendo del uso y/o el modo de aplicación y/o el modo de administración. 20 PRODUCTOS ALIMENTICIOS
La composición de la presente invención puede usarse en la preparación de productos alimenticios tales como uno o más de: productos de confitería, productos lácteos, productos cárnicos, productos de avicultura, productos 25 pesqueros y productos de panadería.
La presente invención también proporciona un método para preparar un alimento o un ingrediente de alimentos, comprendiendo el método mezclar una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención con otro ingrediente de alimentos.
30 Se presentan aspectos preferibles adicionales en las reivindicaciones adjuntas y en las siguientes Figuras y ejemplos.
La Figura 1 muestra el fragmento de PCR SEC ID Nº 1, que es un polinucleótido parcial que no codifica enzima; 35 esta secuencia es un gen de ARN ribosómico 16S ampliamente usado para comparaciones taxonómicas;
La Figura 2 muestra el Fragmento de PCR SEC ID Nº 2, que es un polinucleótido parcial que no codifica enzima; esta secuencia es un gen de ARN ribosómico 16S ampliamente usado para comparaciones taxonómicas;
40 La Figura 3 muestra un polinucleótido que codifica una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención (SEC ID Nº 3);
La Figura 4 muestra una secuencia de aminoácidos de una enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención (SEC ID Nº 4); 45 La Figura 5 muestra la estructura de los vectores de expresión de enzima lipolítica pGTK(L131) y pET11(131-51);
La Figura 6 muestra un gráfico del efecto de una enzima lipolítica de Streptomyces sp. L130 sobre digalactosildiglicérido en masa;
50 La Figura 7 muestra en forma gráfica el efecto de una enzima lipolítica de Streptomyces sp. L131 sobre digalactosildiglicérido en masa;
La Figura 8 muestra en forma gráfica el efecto de una enzima lipolítica de Streptomyces sobre triglicérido en 55 masa;
La Figura 9 muestra el perfil de pH de la enzima lipolítica obtenida de Streptomyces sp. L131 sobre sustrato galactolipídico;
60 La Figura 10 muestra una placa de TLC de lípidos extraídos de masa tratada con una enzima lipolítica de Streptomyces expresada en E. coli marcada nº 236; Carril 1 = control; Carril = nº 236, 0,225PLU-7/g harina; Carril 3 = nº 236, 0,45 PLU-7/g harina; Carril 4 = nº 236, 0,675 PLU-7/g harina; Carril 5 = material de referencia DGDG.
La Figura 11 muestra la construcción del vector de expresión pRX487 a partir de pUC18 (L131R) y pIJ48; 65
E05773820
09-06-2015
La Figura 12 muestra en forma gráfica el efecto de la temperatura sobre la estabilidad y actividad de una enzima lipolítica de Streptomyces sp L131;
La Figura 13 muestra en forma gráfica las especificidades de sustrato de galactolipasas de Streptomyces sp 5 L131, Streptomyces avermitilis, Corynebacterium efficiens y Thermobifida fusca;
La Figura 14 muestra la estructura de un vector de expresión pCB5(TF) para la expresión de lipasa de Thermobifida fusca en C. glutamicum;
10 La Figura 15 muestra una alineación de secuencia de L131 y homólogos de S. avermitilis y T. fusca;
La Figura 16 muestra una placa de HPTLC de productos de reacción del tratamiento enzimático de muestras de aceite de soja crudo. Carril 1 = control Carril 2 = 99% de aceite crudo y 1% de K371 10% en agua Carril 3 = 98% de aceite crudo y 2% de K371 10% en agua Carril 4 = 97% de aceite crudo y 3% de K371 10% en agua Carril 5 =
15 99,7% de aceite crudo y 0,3% de Lecitase Ultra™ nº 3108 1% en agua Carril 6 = 99% de aceite crudo, 0,3% de Lecitase Ultra™ nº 3108 1% en agua y 0,7% de agua. Como referencia se analiza fosfatidilcolina (PC); y
La Figura 17 muestra una placa de HPTLC de productos de reacción del tratamiento enzimático de muestras de aceite de soja crudo. Carril 1 = control Carril 2 = 99% de aceite crudo y 1% de K371 10% en agua Carril 3 = 98%
20 de aceite crudo y 2% de K371 10% en agua Carril 4 = 97% de aceite crudo y 3% de K371 10% en agua Carril 5 = 99,7% de aceite crudo y 0,3% de Lecitase Ultra nº 3108 1% en agua Carril 6 = 99% de aceite crudo, 0,3% de Lecitase Ultra™ nº 3108 1% en agua y 0,7% de agua, junto con carriles de referencia de éster de colesterol, monoglicérido, diglicérido, triglicérido y esterol vegetal.
25 Ejemplo 1: Identificación de una cepa bacteriana que produce galactolipasa.
Se aislaron dos cepas microbianas con un fenotipo similar codificado L130 y L131 de tierra recogida en el sur de Finlandia. Los genes de ARN 16S de estos dos cepas se amplificaron por PCR convencional usando los cebadores oligonucleotídicos 536f (CAGCMGCCGCGGTAATWC) y 1392r (ACGGGCGGTGTGTRC). Los fragmentos de PCR 30 resultantes se secuenciaron parcialmente. Las SEC ID Nº 1 y 2 son polinucleótidos no codificantes de enzima. Estas secuencias son genes de ARN ribosómico 16S ampliamente usados para comparaciones taxonómicas. Se descubrió que la SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2 tienen una alta similitud. Las secuencias después se compararon con las secuencias génicas de ARN 16S en GenBank. Para ambos aislados la mayor homología (97%) se observó con la secuencia de un gen de ARN 16S de Streptomyces thermosacchari. Por tanto, las cepas se llamaron
35 Streptomyces sp. L130 y Streptomyces sp. L131.
Ejemplo 2: Preparación de muestras de enzima lipolítica (galactolipasa) de las cepas Streptomyces sp. L130 y L131.
40 Se inocularon 0,5 l de medio LB con Streptomyces L130 y se cultivaron en un agitador rotatorio a 200 rpm y 30ºC durante 2 días. Este cultivo se usó como inóculo para un fermentador de 10 l que contenía el mismo medio. El cultivo se continuó durante 3 días a 30ºC, 600 rpm de velocidad de agitación y 0,5 v/v de aireación. El caldo de fermentación se aclaró por centrifugación (15 min a 5000 rpm) y se añadió Triton X-100 hasta concentración final del 0,1%. La solución se concentró usando la celda de ultrafiltración Vivaflow 200 (Vivascience AG, Hannover,
45 Alemania) hasta 300 ml. El concentrado se dializó frente a 10 l de tampón Tris HCl 20 mM, pH 7 que contenía CaCl2 2 mM y MgCl2 2 mM seguido de diálisis frente a 0,5 l de glicerol al 85%. Las preparaciones resultantes contenían 90 U de ensayo de actividad galactolipasa como se ha definido anteriormente (GLU-7). La cepa Streptomyces L131 se cultivó en las mismas condiciones y su caldo de cultivo se concentró por el mismo procedimiento. La preparación de galactolipasa resultante contenía 70 U de actividad.
50 Ejemplo 3 -Experimentos de horneado
Las galactolipasas de los aislados bacterianos L130 y L131 indicaron una alta actividad sobre sustratos lipídicos polares, galactolípidos (DGDG) y fosfolípidos, (actividad galactolipasa y fosfolipasa), equivalente a la de una lipasa
55 de Fusarium oxisporum (Lipopan F™ Novozymes A/S Dinamarca): sin embargo, se descubrió que la galactolipasa de los aislados bacterianos L130 y L131 (es decir la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención) no tenía actividad significativa de triglicéridos. Esto contrasta agudamente con la actividad lipasa de Fusarium oxisporum -LipopanF™.
60 Las enzimas lipolíticas de los aislados bacterianos L130 y L131 se prepararon como se ha descrito en el Ejemplo 2 y se analizaron para la caracterización de su actividad sobre glucolípidos, fosfolípidos y triglicéridos, ambos en condiciones convencionales de ensayo y dentro de una masa.
Experimentos de horneado a pequeña escala y un sistema de masa modelo. Ambas enzimas son muy activas sobre 65 galactolípidos en harina.
E05773820
09-06-2015
Materiales y métodos Se prepararon tres muestras de cada enzima como en el Ejemplo 3. Cada muestra se marcó como se muestra en la tabla 1: Tabla 1
ID
Organismo Marca GLU-7 PLU-7
180
Streptomyces spp L 130 A Enzima lipolítica 0,58 PLU/ml 0,95 1,31
181
Streptomyces spp L 130 B Enzima lipolítica 0,44 PLU/ml. 0,91 1,31
182
Streptomyces spp L 130 C Enzima lipolítica 1,8 PLU/ml. 1,21 1,53
183
Streptomyces spp L 131 A Enzima lipolítica 0,54 PLU/ml. 0,63 1,29
184
Streptomyces spp L 131 B Enzima lipolítica 0,64 PLU/ml. 0,84 1,16
185
Streptomyces spp L 131 C Enzima lipolítica 0,85 PLU/ml. 1,35 1,17
La actividad fosfolipasa y galactolipasa de las enzimas se evaluó usando el ensayo de actividad fosfolipasa (PLU-7) y el ensayo de actividad galactolipasa (GLU-7) mencionados anteriormente en este documento.
10 Experimento de suspensión de masa
Se cambiaron de escala 0,8 gramos de harina de trigo en un tubo de centrífuga de 12 ml con tapa. Se añadieron 1,5 ml de agua que contenía la enzima. La muestra se mezcló en un Whirley y se colocó en un armario de calentamiento a 30ºC durante 60 minutos. Se añadieron 6 ml de n-Butanol:Etanol 9:1, y la muestra se mezcló de nuevo hasta que
15 la harina se distribuyó finamente en el disolvente. Los tubos se colocaron en un baño de agua a 95ºC durante 10 minutos. Después se mezclaron de nuevo y se colocaron en un dispositivo de rotación 45 rpm, durante 45 minutos.
La muestra después se centrifugó a 2000 g durante 10 minutos. Y se transfirieron 2 ml de sobrenadante a un frasco de vidrio dram de 10 ml. El disolvente se evaporó a 70ºC bajo una corriente de nitrógeno. 20 Los lípidos aislados se analizaron por GLC.
Cromatografía de gases
25 Cromatógrafo de gases capilar Perkin Elmer 8420 equipado con columna de sílice condensada WCOT de 12,5 m x 0,25 mm DI x 0,1 mm de fenil-metil-silicona al 5% (CP Sil 8 CB de Crompack).
Vehículo: Helio. Inyección: 1,5 ml con división.
30 Detector: FID. 385ºC. Programa de horno: 1 2 3 4 Temperatura del horno [ºC] 80 200 240 360 Isotérmica, tiempo [min] 2 0 0 10 Tasa de temperatura [ºC/min] 20 10 12
35 Preparación de la muestra: El lípido extraído de 0,2 gramos de harina se disolvió en 2 ml de heptano:piridina 2:1 que contenía un patrón interno heptadecano, 2 mg/ml. Se transfirieron 500 µl de la muestra a un vial ondulado. Se añadieron 100 µl de MSTFA (N-metil-N-trimetilsilil-trifluoracetamida) y la reacción se incubó durante 15 minutos a 90ºC.
40 Cálculo: Los factores de respuesta para monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos, ácido graso libre y galactolípidos se determinaron a partir de mezclas de referencia de estos componentes. En base a estos factores de respuesta se calcularon los lípidos en la masa.
45 Resultados
Las muestras de enzima de Streptomyces se analizaron para la actividad fosfolipasa y galactolipasa con resultados mostrados en la tabla 2. También se calculó la proporción de actividad PLU-7/GLU-7. La proporción media para las muestras fue 1,4, pero con alguna desviación en algunas de las muestras, que podría explicarse por desviaciones
50 analíticas.
Tabla 2 E05773820
Muestra ID
Organismo GLU-7 PLU-7 Proporción PLU-7/GLU-7
180
L 130 A 0,95 1,31 1,4
181
L 130 B 0,91 1,31 1,4
182
L 130 C 1,21 1,53 1,3
183
L 131 A 0,63 1,29 2,0
09-06-2015
Muestra ID
Organismo GLU-7 PLU-7 Proporción PLU-7/GLU-7
184
L 131 B 0,84 1,16 1,4
185
L 131 C 1,35 1,17 0,9
Experimento de masa
La actividad de la enzima sobre lípidos de trigo se ensayó en el experimento de suspensión de masa como se ha mencionado en materiales y métodos. Los lípidos aislados de la masa se analizaron por GLC como se muestra en la tabla 3.
Tabla 3. Análisis GLC de lípidos de masa (% basado en peso de harina). FFA= ácidos grasos libres. MGMG=monogalactosilmonoglicérido. DGMG=digalactosildiglicérido. MGDG=monogalactosildiglicérido. DGDG=digalactosildiglicérido. TRI= triglicérido.
Muestra
Dosificación de enzima
ID
PLU/g harina FFA MGMG DGMG MGDG DGMG TRI
185
0,105 0,1642 0,0042 0,0380 0,0345 0,1520 0,5515
185
0,263 0,1687 0,0130 0,0670 0,0239 0,0941 0,5470
185
0,526 0,2096 0,0121 0,0664 0,0158 0,0617 0,5460
185
1,05 0,2597 0,0036 0,0546 0,0068 0,0303 0,5301
182
0,097 0,1542 0,0051 0,0563 0,0313 0,1148 0,5475
182
0,244 0,1687 0,0159 0,0785 0,0200 0,0566 0,5280
182
0,488 0,2095 0,0055 0,0646 0,0098 0,0219 0,5418
182
0,976 0,2581 0,0092 0,0439 0,0043 0,0045 0,5579
Control
0 0,1529 0,0006 0,0188 0,0440 0,1443 0,5054
Lipopan F™
1,47 0,23 0,03 0,10 0,01 0,07 0,44
10 Los resultados de la tabla 3 y tabla 4 confirman que las enzimas aisladas en el sobrenadante de fermentación de Streptomyces sp L130 y L131 son muy activas sobre galactolípidos en una masa. Los diésteres DGDG y MGDG se hidrolizan en los correspondientes monoésteres DGMG y MGMG. Los resultados también se ilustran de forma gráfica en las Figuras 6 y 7. Estos resultados confirman que ambas enzimas son muy activas a baja dosificación de 0-0,2 Unidades/g de harina y se produce la correspondiente cantidad de monoéster. A mayor dosificación de 0,4-1
15 Unidades/gramo de harina, el DGDG se degrada adicionalmente pero también se observa algo de hidrólisis de los monoésteres. Esto puede indicar que las enzimas no son específicas para la posición del ácido graso en la molécula de galactolípido.
La actividad de las enzimas sobre triglicérido, como se ilustra en la Figura 8, es casi inexistente. Por lo tanto se
20 concluye que las enzimas ensayadas no tienen efecto significativo sobre triglicérido. Esto también está en acuerdo con algunos experimentos realizados sobre tributirina como sustrato, donde no se observó actividad.
SUMARIO
25 Se aisló una enzima lipolítica en el sobrenadante de fermentación de Streptomyces sp.
Se descubrió que la enzima lipolítica tenía actividad tanto fosfolipasa como galactolipasa, pero no actividad significativa sobre triglicéridos. La proporción de actividad fosfolipasa:galactolipasa fue aprox. 1,4 para las muestras ensayadas.
30 Los experimentos de suspensión de masa confirman que las enzimas eran activas sobre galactolípidos en la harina. Las enzimas eran activas en masa a una dosificación muy baja de 0-0,2 Unidades/g de harina. Fosfolipasas comerciales como Lipopan F™ (Novozymes A/S, Dinamarca) tienen que dosificarse en dosificación 3-4 veces mayor para obtener el mismo efecto sobre galactolípidos. Los experimentos de suspensión de masa también confirmaron
35 que las enzimas de Streptomyces sp. no tenían actividad medible sobre triglicéridos.
Ejemplo 4: Clonación del gen de la enzima lipolítica de Streptomyces sp. L131.
Se aisló el ADN cromosómico de Streptomyces sp. L131 usando una modificación de un método convencional. Las
40 bacterias se cultivaron en un agitador rotatorio en medio LB a 30ºC y alta aireación (100 ml de medio por matraz con deflectores de 0,5 l, 200 rpm) hasta temprana fase estacionaria. Del cultivo bacteriano de 500 ml se recogieron células con centrifugación y se lavaron una vez con tampón de lisis (glucosa 550 mM, Tris 100 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0).
15
25
35
45
55
65 E05773820
09-06-2015
El sedimento celular se re-suspendió en 10 ml de tampón de lisis y se añadió lisozima hasta 1 mg/ml. Las células se incubaron a 37ºC durante al menos 15 min. El progreso de la digestión con lisozima fue seguido por la transferencia de alícuotas de suspensión bacteriana en solución de SDS al 1% y medición de la absorción de la mezcla resultante a 600 nm. La cantidad de lisozima y el tiempo de incubación se ajustaron de modo que al menos el 70-90% de todas las células se lisaran, evidenciado por la disminución en A600. En este punto temporal, se añadió SDS a la suspensión bacteriana hasta el 1% y proteinasa K hasta 0,1 mg/ml. La suspensión se incubó a 56ºC durante 30 min seguido de extracciones con fenol y cloroformo. Después de la extracción con cloroformo, se precipitó el ADN con acetato sódico (concentración final 0,5 M) e isopropanol (0,6 vol/vol) y el sedimento de ADN se lavó con etanol al 70%, se secó al vacío y se disolvió en tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM) que contenía RNasa A (0,01 mg/ml).
El ADN se digirió parcialmente con endonucleasa de restricción Sau3A y los hidrolizados se fraccionaron en un gel de agarosa al 0,8%. La fracción de 3-10 kb de Sau3A se aisló de los geles de agarosa por electroelución. Esta preparación de ADN se usó para construir una biblioteca génica usando el kit de clonación de Stratagene (LaJolla, EEUU) ZAP Express/Predigested Vector/Gi-gapack (producto nº 239615). El ligamiento, compactación, amplificación de la biblioteca y su conversión a la forma de fagómido se realizaron de acuerdo con los protocolos proporcionados por Stratagene. La forma plasmídica de la biblioteca génica resultante se seleccionó sobre placas indicadoras preparadas del siguiente modo. Se colocaron 80 ml de agar LB estéril que contenía 25 mg/l de kanamicina en cada placa Petri de 15 cm y se dejó solidificar. Posteriormente, se añadió la capa de agar superior de 10 ml que contenía DGDG al 0,5% y Safranina O al 0,0005%. La biblioteca génica se sembró a una densidad de aproximadamente 5000 colonias por placa de 15 cm. Las placas se incubaron a 37ºC durante 24 h seguido de una incubación de cuatro días a temperatura ambiente. Se seleccionó un clon que formaba un halo rojo en la placa indicadora de la biblioteca y se purificó por clonación en una nueva placa indicadora.
El plásmido aislado de este clon (llamado pBK(L131)) se usó para re-transformar E. coli cepa XL1-Blue MRF' para resistencia a kanamicina. Todos estos transformantes presentaban genotipo galactolipasa-positivo. pBK(L131) contenía un inserto de aproximadamente 7,5 kb. Este inserto se secuenció. Se encontró que una región secuenciada (SEC ID Nº 3) contenía una fase de lectura abierta que codificaba una proteína (SEC ID Nº 4) que mostraba homología con una lipasa conocida de Streptomyces rimosus. Esta lipasa, un miembro de la llamada familia GDSX de lipasas/esterases/acil transferasas se conoce solamente por ser capaz de hidrolizar lípidos neutros y sustratos artificiales de lipasa.
Se construyó una serie de deleciones y sub-clones del inserto original y se ensayó para la actividad galactolipasa. Se descubrió que el derivado de deleción que portaba el fragmento EcoRI -SacI de 3 kb del inserto original aún retiene la actividad DGDGsa completa. Estos datos se correlacionaban bien con los resultados del ADN parcial. Un área demostró homología a lipasas conocidas. Esta área se secuenciación posteriormente de forma completa. La comparación de esta secuencia con GenBank reveló que el homólogo más cercano (58,5%) de la galactolipasa L131 que se ha caracterizado bioquímicamente es una lipasa de S. rimosus, y se identificó como una lípido:acil transferasa en el documento WO04/064987 y el documento WO04/064537.
Expresión de galactolipasa L131 en E. coli
El sistema pET convencional, en que el gen está bajo el control del promotor del fago T7, se usó para expresar la galactolipasa L131 en E. coli.
Expresión de galactolipasa L131 en Streptomyces lividans
El vector lanzadera pRX487-5 (Figura 11) (derivado de pIJ4987: Kieser T. et al. Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation, Crowes, Norwich, Inglaterra (2000)) usado para la expresión de galactolipasa L131 en
S. lividans combina el plásmido de E. coli pUC18 y el plásmido de S. lividans IJ487. En pRX487-5, se coloca el promotor lac de pUC18 cadena arriba del gen de la kanamicina fosfotransferasa sin promotor de pIJ487. De hecho, el plásmido transformó E. coli no solamente para ampicilina sino también para al menos un bajo nivel (5 mg/l) de resistencia a kanamicina. El vector contiene el fragmento EcoRI-XbaI no modificado del ADN cromosómico de S. thermosacchari que comprende la secuencia codificante completa del gen de la galactolipasa, aproximadamente 160 pb de secuencia no codificante cadena arriba y 420 pb de secuencia no codificante cadena abajo. Todos los transformantes presentaron niveles similares de actividad galactolipasa juzgados por la formación de halo en placas indicadoras. Asimismo, cuando se cultivaba S. lividans que porta pRX487-5 a un nivel de 10 l y se clonaba el cultivo resultante en placas indicadoras, todos los clones parecían producir cantidades iguales de actividad galactolipasa. En cultivos pequeños de matraz en agitación inoculados por células vegetales directamente de placas, los transformantes típicamente producían aproximadamente 10-20 mU/ml de actividad galactolipasa después de 3 días de cultivo. Cuando se inoculaban cultivos de matraz en agitación con esporas de S. lividans recombinante, se midieron actividades galactolipasa mayores (aproximadamente 30 mU/ml), lo que se correlaciona con mayor acumulación de biomasa. En un experimento donde se cultivó S. lividans que porta pRX487-5 en fermentado en condiciones de alta aireación y modo de alimentación por lotes (véase material y métodos para los detalles) la acumulación de biomasa alcanzó 170 g/l (peso húmedo). Por consiguiente, se detectó actividad galactolipasa mucho mayor -aproximadamente 1 U/ml.
15
25
35
45
55
65 E05773820
09-06-2015
Propiedades bioquímicas de L131
Se ensayaron algunas propiedades bioquímicas de L131. Se descubrió que el pH óptimo de la enzima era aproximadamente 6,5-7,5 (Figura 9). La enzima mostró actividad máxima hacia DGDG a una temperatura ~50ºC. Por encima de esta temperatura sucedía inactivación, pero no bruscamente, y después de 20 min de incubación en 90ºC, se detectó ~10% de actividad residual (Figura 12).
Ejemplo 5: Expresión de enzima lipolítica de Streptomyces L131 de acuerdo con el gen de la presente invención en
E. coli
La fase de lectura abierta de pBK(L131) que codifica la presunta enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención se amplificó por PCR usando los cebadores oL131-5 (GGTGAATTCATGAGATTGACCCGATCCCTGTCGG, cebador con sentido) y oL131-3 (ACTTCTAGAGCGGCGCCACCGTGACGTACA, cebador antisentido). El fragmento de ADN amplificado se digirió con EcoRI y XbaI y se clonó en un vector lanzadera de B. subtilis -E. coli pGTK44. Este vector se ha construido sustituyendo el fragmento SalI-EcoRI del plásmido pGTK44 (Povelainen et al., Biochem J. 371, 191-197 (2003)) que contiene el promotor degQ36 con el fragmento EcoRI-SalI de pGT44 (Kerovuo J. et al. Biotechnology Letters 22, 1311-1317 (2000)).
La actividad galactolipasa se detectó en E. coli transformado con el plásmido resultante pGTK44(L131) (Figura 5) usando placas indicadoras. Los transformantes de control (que contenían el plásmido precursor pGTK44) eran galactolipasa-negativos. Por tanto, la secuencia proteica representada por la SEC ID Nº 4 de hecho posee actividad galactolipasa. El mismo par de cebadores amplificó un fragmento del mismo tamaño (por electroforesis en gel de agarosa) con ADN cromosómico de Streptomyces sp. L130 que confirma adicionalmente las observaciones previas acerca de la estrecha similitud de las dos cepas aisladas y sus genes de galactolipasa.
Para la expresión en E. coli bajo el control del promotor del fago T7, se amplificó la región codificante de galactolipasa deducida por PCR usando ADN cromosómico de Streptomyces sp. L131 como molde y los dos cebadores oligonucleotídicos (oL131-51 GGTCATGCTAGCATGAGATTGACCCGATCCCTGTCGG y oL131-31 GCATGGATCCGCGGCGCCACCGTGACGTACA). El producto de PCR se digirió con NheIy BamHI y se ligó con el vector pET11a (Novagen, EEUU) digerido con las mismas endonucleasas de restricción. La mezcla de ligamiento se usó para transformar la cepa de E. coli XL-Blue1 MRF' y se aislaron 12 diferentes clones plasmídicos con patrones de restricción correspondientes a la estructura de pET11(131-51) (Fig. 4). Cada clon plasmídico se usó para transformar por separado la cepa de E. coli BL21(DE3) y los transformantes resultantes se cultivaron en LBampicilina que contenía capa indicadora de actividad galactolipasa (Ejemplo 4). La mayoría de los clones no expresaron galactolipasa activa. Uno clon (pET11(131-51)-12) se seleccionó como fuente de galactolipasa recombinante para posterior caracterización.
La enzima expresada en E. coli (marcada nº 236) se analizó y se descubrió que tenía: 0,33 GLU/ml y 0,36 PLU/ml, cuando se analizó usando el ensayo GLU-7 y el ensayo PLU-7 mostrados en este documento.
En cultivo líquido E. coli BL21(DE3) expresó aproximadamente 2 mU/ml de actividad galactolipasa después de 40 h de cultivo en caldo LB-ampicilina (37ºC, 200 rpm de agitación). Esencialmente toda la actividad se encontró en el caldo de cultivo. No se detectó actividad galactolipasa en E. coli BL21(DE3) transformada con pET11a (Novagen, EEUU) y cultivada en las mismas condiciones.
Se concentraron aproximadamente cuatro litros de cultivo en caldo de cultivo que contenía galactolipasa en un evaporador rotatorio a aproximadamente 300 ml y se dializó frente a 15 l de tampón Tris HCl 20 mM, pH 7 que contenía CaCl2 2 mM y MgCl2 2 mM. El material dializado se concentró de nuevo en un evaporador rotatorio a aproximadamente 30 ml y se dializó frente a 2 l de glicerol al 50%. La preparación resultante (18 ml) contenía aproximadamente 100 mU/ml de actividad galactolipasa.
La enzima expresada en E. coli (marcada nº 236) también se ensayó en masa. Se observó alta actividad sobre galactolípidos en masa como puede observarse a partir de la Figura 10, que muestra una palca de TLC.
Ejemplo 6: Expresión de la enzima lipolítica de acuerdo con el gen de la presente invención de Streptomyces sp. L131 en diferentes hospedadores.
La construcción del vector pGTK44(L131) se ha resumido en el Ejemplo 5. Además de E. coli, este vector puede usarse para producir enzima lipolítica de Streptomyces L131 de acuerdo con la presente invención en Bacillus. Usar este vector es solamente uno de los muchos posibles modos de expresar la enzima lipolítica L131 de acuerdo con la presente invención en Bacillus. Por ejemplo, puede remplazarse el promotor pst empleado en pGTK44(L131) por cualquier otro promotor constitutivo o regulado fuerte activo en Bacillus. Muchos de estos promotores son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el promotor degQ36 (Yang M et al. J. Bacteriol. 166, 113-119 (1986)), el promotor cdd, también conocido como p43 (Wang PZ, Doi RH. J. Biol. Chem. 259, 8619-8625 (1984), promotores de amilasa o proteasa neutra etc. Además de pGTK44(L131) y otros vectores de Bacillus basados en el replicón pTZ12 (Aoki T. et
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65 E05773820
09-06-2015
al., Mol. Gen. Genet. 208, 348-352 (1987)) puede usarse cualquier otro vector plasmídico (por ejemplo, pUB110, Gryczan TJ et al. J. Bacteriol. 134, 318-29 (1978) y sus derivados).
Otros hospedadores preferidos para la expresión de la enzima lipolítica de Streptomyces L131 de acuerdo con el gen de la presente invención son bacterias Gram positivas de alto GC, en particular, Streptomyces, (por ejemplo, S. lividans, S. coelicolor, S. griseus, S. natalensis, S. rubiginosus, S. olivaceus, S. olivochromogenes, S. violaceoruber), En dichos hospedadores, la enzima lipolítica de acuerdo con el gen de la presente invención puede introducirse bajo su propio promotor en un vector multi-copia (por ejemplo, usando derivados de pIJ110 tales como pU486, Ward et al. Mol. Gen. Genet. 203, 468-478 (1986)) o colocarse bajo el control de un promotor fuerte de Streptomyces, por ejemplo ermE* (Schmitt-John T, Engels JW. Appl. Microbiol. Biotechnol. 36, 493-498 (1992)) o el promotor de tipA inducible por tiostreptona (Kieser T et al. en Practical Streptomyces Genetics, pág. 386, The John Innes Foundation, Norwich RU (2000)).
Además de hospedadores procariotas, el gen de la enzima lipolítica L131 puede expresarse en una de las muchas especies fúngicas adecuadas. En particular, son adecuadas levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Hansenula polimorpha. En levaduras, el gen de la enzima lipolítica puede colocarse bajo el control de cualquiera de los promotores fuertes de levadura conocidos, tales como promotores glucolíticos (PGK, GDH, ENO etc.), promotores inducidos por privación de fosfato tales como PHO5, los promotores del metabolismo de etanol/metanol tales como el promotor ADH1 en S. cerevisiae o promotores inducibles por metanol en H. polimorpha o P. pastoris.
Cuando se expresa el gen de la enzima lipolítica en cualquier hospedador, sería ventajosa la construcción de un gen sintético o semi-sintético que codifique la secuencia de la SEC ID 4. Asimismo, pueden diseñarse genes parcial o completamente sintéticos basados en secuencias disponibles a través de búsquedas de homología in silico como se ha explicado en el Ejemplo 4. Dichas secuencias pueden incorporar varias características útiles que están ausentes en genes de enzima lipolítica de tipo silvestre. Por ejemplo, la desviación de codones puede corregirse para corresponder mejor a las preferencias de codones de los hospedadores de expresión. Un caso especial de la corrección de desviación de codones útil para todos los hospedadores es convertir el codón de inicio GTG de la SEC ID Nº 3 en ATG. Otra modificación típica obvia para los especialistas en la técnica es intercambiar la secuencia señal nativa de Streptomyces de la enzima lipolítica L131 con una secuencia señal nativa de o que se sabe que es funcional en el hospedador de expresión elegido.
Ejemplos previos de sistemas de expresión útiles para la enzima lipolítica L131 se centraron en el uso de vectores plasmídicos para la introducción del gen de la enzima lipolítica en el hospedador de expresión. Éste es, de hecho, el modo preferido para implementar la presente invención. Sin embargo, también es factible un enfoque alternativo para integrar el casete de expresión (incluyendo promotor, región codificante del gen de enzima lipolítica y un terminador de la transcripción opcional) en un cromosoma. En particular, sería eficaz la integración multi-copia del casete de expresión en el cromosoma del hospedador.
Los hospedadores recombinantes que expresan el gen de la enzima lipolítica pueden mutarse, ventajosamente, para reducir el nivel de actividad proteasa en el caldo de cultivo. El cultivo de cualquiera de dichos hospedadores recombinantes puede realizarse en presencia de compuestos que estabilizan la enzima. Dichos compuestos pueden ser diversas proteínas (por ejemplo, caseína, peptona de albúmina sérica) o diferentes lípidos, lisolípidos o detergentes (por ejemplo, galactolípidos, mono-y diacilgliceroles o Triton X-100).
Ejemplo 7 Actividad acil-transferasa de enzima lipolítica de Streptomyces L131 y sus derivados
Algunas lipasas también pueden poseer actividad acil-transferasa. En particular, algunos miembros de la familia GDSX, por ejemplo, aciltransferasa de Aeromonas hydrophile (P10480) (mostrada en la solicitud internacional en trámite junto con la presente Nº PCT/IB2004/000655) tienen alta actividad acil-transferasa. Por tanto, puede predecirse que la enzima lipolítica de Streptomyces L131 tendrá también la actividad acil-transferasa también. Esta actividad puede potenciarse adicionalmente a través de mutagénesis aleatoria/evolución dirigida. Además, como la acil-transferasa de A. hydrophila y la enzima lipolítica de Streptomyces L131 comparte el mismo plegamiento proteico global, es posible combinar la especificidad de sustrato de la enzima lipolítica de Streptomyces L131 con la alta eficacia transferasa de la enzima de Aeromonas. Esta combinación puede conseguirse a través de las técnicas conocidas de mutagénesis dirigida/diseño de proteínas o por transposición de genes.
Ejemplo 8 Identificación de enzima lipolíticas alternativas de otras especies de Streptomyces.
La familia GDSX de esterasas (Upton C, Buckley JT. Trends Biochem. Sic. 20, 178-179 (1995), pfam00657.11) es un grupo of esterasas/lipasas/acil transferasas que comparten un motivo de secuencia específico alrededor de la serina del sitio activo (GDSX donde X es un resto de aminoácido hidrófobo). Este grupo de enzimas es también conocido como familia II de lipasa (Arpigny JL, Jaeger K-E. Biochem. J. 343, 177-183 (1999)). Aunque esta familia incluye muchos tipos diferentes de esterasas, lipasas y acil-transferasas, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención es una enzima GDSX.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65 E05773820
09-06-2015
Por tanto, las secuencias mostradas en la presente invención de la enzima lipolítica de Streptomyces sp. L131 (galactolipasa) pueden usarse in silico para identificar otras galactolipasas de otras especies de Streptomyces.
Para determinar si una proteína tiene el motivo GDSX de acuerdo con la presente invención, la secuencia se compara preferiblemente con los perfiles del modelo oculto de Markov (perfiles HMM) de la base de datos pfam.
Pfam es una base de datos de familias de dominio proteico. Pfam contiene múltiples alineaciones de secuencia seleccionadas para cada familia así como perfiles del modelo oculto de Markov (perfiles HMM) para identificar estos dominios en nuevas secuencias. Puede encontrarse una introducción a Pfam en Bateman A et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30; 276-280. Se usan modelos ocultos de Markov en varias bases de datos dirigidas a clasificar proteínas, para una revisión véase Bateman A y Haft DH (2002) Brief Bioinform 3; 236-245, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list uids = 12230032&dopt=Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list uids =11752314&dopt=Abstract.
Para una explicación detallada de los modelos ocultos de Markov y el modo en que se aplican en la base de datos Pfam véase Durbin R, Eddy S, y Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4. El paquete de software Hammer puede obtenerse de Washington University, St Louis, EEUU.
Como alternativa, el motivo GDSX pueden identificarse usando el paquete de software Hammer, las instrucciones se proporcionan en Durbin R, Eddy S, y Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4 y las referencias en el mismo, y el perfil HMMER2 proporcionado dentro de esta memoria descriptiva.
A la base de datos PFAM puede accederse, por ejemplo, a través de varios servidores que están actualmente localizados en los siguientes sitios web. http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.sht ml http://pfam.wustl.edu/ http://pfam.jouy.inra.fr/ http://pfam.cgb.ki.se/
La base de datos ofrece un motor de búsqueda donde se puede introducir una secuencia proteica. Usando los parámetros por defecto de la base de datos, entonces se analizarán la secuencia proteica para la presencia de dominios Pfam. El dominio GDSX es un dominio establecido en la base de datos y como tal se reconocerá su presencia en cualquier secuencia de consulta. La base de datos reportará la alineación de la secuencia consenso Pfam00657 para la secuencia de consulta.
Preferiblemente, cuando se alinea con la secuencia consenso Pfam00657, la enzima lipolítica para su uso en las composiciones/métodos de la invención tiene al menos uno, preferiblemente más de uno, preferiblemente más de dos, de los siguientes, un bloque GDSx, un bloque GANDY, un bloque HPT. Adecuadamente, la enzima lipolítica puede tener un bloque GDSx y un bloque GANDY. Como alternativa, la enzima puede tener un bloque GDSx y un bloque HPT. Preferiblemente la enzima comprende al menos un bloque GDSx.
El dominio GDSX pfam00657 es un identificador único que distingue proteínas que poseen este dominio de otras enzimas.
Además o como alternativa a ello, pueden identificarse enzima lipolíticas alternativas de otras especies de Streptomyces realizando una comparación de identidad de secuencia y/o hibridación con uno o más de los fragmentos de secuencia de PCR mostrados como SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 2. Adecuadamente, las comparaciones pueden realizarse con fragmentos que comprenden más de 15 nucleótidos de la SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 2, preferiblemente con fragmentos que comprenden más de 20 nucleótidos de la SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 2. Adecuadamente, podrían usarse las secuencias completas mostradas como SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 2. Preferiblemente, la hibridación se realiza en condiciones de alta o muy alta rigurosidad. Las secuencias de nucleótidos que tienen al menos un 80%, preferiblemente al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad con la SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 2 indican cepas de Streptomyces que pueden ser fuentes de la enzima lipolítica, es decir la galactolipasa, de acuerdo con la presente invención.
Ejemplo 9: Identificación de galactolipasas para su uso en los métodos y usos de la presente solicitud
Como se ha mencionado anteriormente, la secuencia de la nueva Streptomyces thermosacchari L131 ofrece la posibilidad de identificación in silico de nuevas galactolipasas de familia II. A este respecto, una región particular que puede ser de particular interés es el motivo GDSX.
E05773820
09-06-2015
El motivo GDSX está compuesto de cuatro aminoácidos conservados. Preferiblemente, la serina dentro del motivo es una serina catalítica de la enzima lípido aciltransferasa. Adecuadamente, la serina del motivo GDSX puede estar en una posición correspondiente a Ser-16 en la enzima lipolítica de Aeromonas hydrophila mostrada en Brumlik y Buckley (Journal of Bacteriology Abr. 1996, Vol. 178, Nº 7, pág. 2060-2064).
5 Para determinar si una proteína tiene el motivo GDSX, la secuencia se compara preferiblemente con los perfiles de modelo oculto de Markov (perfiles HMM) de la base de datos pfam. Como se ha mencionado en el Ejemplo 8, pfam es una base de datos de familias de dominio proteico. Por tanto, la base de datos pfam también puede usarse para identificar enzimas adecuadas de géneros diferentes a Streptomyces.
10 Como alternativa, el motivo GDSX puede identificarse usando el paquete de software Hammer, las instrucciones se proporcionan en Durbin R, Eddy S, y Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4 y las referencias en el mismo, y el perfil HMMER2 proporcionado en esta memoria descriptiva.
15 Preferiblemente, la enzima lipolítica de acuerdo con la presente invención comprende el motivo GDSX.
Cuando se alinea con la secuencia consenso Pfam00657 de pfam (como se describe en el documento WO04/064987) y/o la secuencia L131 en este documento descrita (SEC ID Nº 4)
20 i) La enzima galactolipasa/lípido acil-transferasa de la invención, o para uso en métodos de la invención, tiene preferiblemente un motivo GDSx, más preferiblemente un motivo GDSY. y/o
25 ii) La enzima galactolipasa/lípido acil-transferasa de la invención, o para uso en métodos de la invención, tiene preferiblemente un bloque GANDY, más preferiblemente un bloque GANDY que comprende amino GGNDx, más preferiblemente GGNDA o GGNDL. y/o
30 iii) La enzima de la invención, o para uso en métodos de la invención, tiene preferiblemente un bloque HTP. y preferiblemente
iv) La enzima galactolipasa/lípido acil-transferasa de la invención, o para uso en métodos de la invención, tiene preferiblemente un motivo GDSY y un bloque GANDY que comprende amino GGNDx, preferiblemente GGNDA o 35 GGNDL, y un bloque HTP (histidina conservada).
A este respecto, los inventores identificaron una secuencia homóloga a Streptomyces L131 que no comprendía un motivo GDSX: concretamente Novosphingobium aromaticivorans (NAL) Novosphingobium\aromaticivorans\ GDSx 284 aa
40
SEC ID Nº 10
imagen14
E05773820
09-06-2015
SEC ID Nº 11
imagen15
5 Esta enzima comprende la secuencia "GSSF" en oposición a GDSX.
Cuando se ensayaba se descubrió que esta enzima no comprende actividad glucolipasa de acuerdo con la presente invención.
10 Por lo tanto, el motivo GDSx puede ser importante cuando se intenta identificar otras galactolipasas adecuadas.
De forma notable, la enzima de S. rimosus que se ha purificado y caracterizado bioquímicamente y muestra aproximadamente un 56% de homología de secuencia con Streptomyces L131 (Abramic M., et al. (1999); Vujaklija
D. et al. (2002)) se sabe que hidroliza lípidos neutros tales como trioleína o ésteres de nitrofenilo de grasas. La
15 enzima de S. rimosus también puede hidrolizar galactolipasa de acuerdo con la presente invención. Asimismo, otras dos especies de Streptomyces para las cuales están disponibles los datos de secuencia genómica -S. coelicolor A2(3) y S. avermitilis pueden contener enzimas que tengan actividad galactolipasa, por ejemplo (NP_625998 y NP_827753) están actualmente anotadas en GenBank como "hidrolasas secretadas putativas".
20 Pueden identificarse muchos otros homólogos útiles de galactolipasa de Streptomyces L131 por un enfoque similar. Las enzimas galactolipasa/lípido acil-transferasa adecuadas para su uso en los métodos de la invención pueden identificarse por alineación con la secuencia L131 usando Align X, el algoritmo de alineación por pares Clustal W de VectorNTI usando ajustes por defecto.
25 Como alternativa, la galactolipasa adecuada para su uso en los métodos de la invención puede identificarse por alineación de la secuencia consenso Pfam00657 de pfam (como se describe en el documento WO04/064987).
La Figura 15 muestra una alineación de secuencia de L131 y homólogos de S. avermitilis y T. fusca. La Figura 15 ilustra la conservación del motivo GDSx (GDSY en L131 y S. avermitilis y T. fusca), la caja GANDY, que es GGNDA 30 o GGNDL, y el bloque HPT (considerado como la histidina catalítica conservada). Estos tres bloques conservados están resaltados en la Figura 15.
Cuando se alinea con la secuencia consenso Pfam00657 de pfam (como se describe en el documento WO04/064987) y/o la secuencia L131 descrita en este documento (SEC ID Nº 4) es posible identificar tres regiones 35 conservadas, el bloque GDSx, el bloque GANDY y el bloque HTP (véase el documento WO04/06498 para detalles adicionales).
Ejemplo 10: Clonación génica y construcción de vectores de expresión
40 Se usaron Corynebacterium efficiens DSM 44549, Thermobifida fusca DSM 43792 y Streptomyces avermitilis DSM46492 para aislar los genes homólogos al gen de la galactolipasa de S. thermosacchari L131.
15
25
35
45
55
65 E05773820
09-06-2015
Las cepas con un número DSM otorgado están depositadas y públicamente disponibles en Deutsche Sam mlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM).
Se usaron Escherichia coli cepas XL-Blue MRF', BL21(DE3) (Novagen) y S17-1 (Simon R. et al., 1983), Bacillus subtilis BD170, Streptomyces lividans cepa 1326 (John Innes Centre), Corynebacterium glutamicum DSM20300 como hospedadores para expresión heteróloga. La cepa de Aeromonas salmonicida (DSM 12609) también se usó como hospedador de expresión.
Se aislaron S. thermosacchari L131, Citrobacter freundii P3-42 y Enterobacter nimipressuralis P1-60 en nuestro laboratorio del entorno natural y se identificaron taxonómicamente por secuenciación génica de ARNr 16S.
Se usaron los siguientes medios de cultivo en este estudio. Se usó LB (5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de triptona, 10 g/l de NaCl, pH 7,0), 2xYT (10 g/l de NaCl, 10 g/l de extracto de levadura, 16 g/l triptona) para el cultivo de E. coli y otras bacterias Gram-negativas. Se usó caldo nutriente (3 g/l de extracto de carne vacuna, 5 g/l de peptona, pH 7,0) para cultivar C. efficiens y N. aromaticivorans, se usó caldo YM (3 g/l de extracto de levadura, 3 g/l de extracto de malta, 5 g/l de peptona, 10 g/l de dextrosa, pH 7,0) para el cultivo de S. avermitilis, se usó medio 65 (4 g/l de glucosa, 4 g/l de triptona, 10 g/l de extracto de malta, 2 g/l de CaCO3, pH 7,2) para T. fusca.
Aislamiento de ADN
Se usó procedimiento convencional de lisis alcalina combinado con método de purificación en columna Qiagen para aislamiento del plásmido. Una excepción fue el aislamiento preparativo de ADN plasmídico a partir de Streptomyces. En este caso, se usó centrifugación en equilibrio en gradiente de CsCI como etapa de purificación final.
Métodos para la introducción de ADN en cepas microbianas
Ambas cepas de E. coli y C. glutamicum se transformaron por electroporación usando cubetas de 1 mm y los siguientes ajustes paramétricos de electroporación: 1800V, -3,89ºC (25ºF), 200 µl. B. subtilis BD170 se transformó por el método "Paris" basado en competencia natural (Harwood C.R. y Cutting S.M., 1990). Streptomyces lividans se transformó por el método de protoplastos (Kieser T. et al., 2000). El ADN se introdujo en A. salmonicida por conjugación con E. coli usando el método de acoplamiento de filtro de Harayama et al. (1980).
Construcción de mutante resistente a rifampicina de A. salmonicida
Se sembraron aproximadamente 108 células de cultivo durante una noche de A. salmonicida DSM12609 en una serie de placas de agar LB que contenían 5-30 mg/l de rifampicina. Las placas se irradiaron por luz UV de onda corta usando el dispositivo SpectroLinker XL-1500 (Spectronics Corp. EEUU). La dosis de radiación fue 4-6 J/M2. Las placas se incubaron a 30ºC durante 2 días. Se seleccionaron varias colonias que crecieron en 30 mg/l de rifampicina y se ensayaron adicionalmente en 50 mg/l de rifampicina. Se eligió un clon resistente a 50 mg/l de rifampicina (llamado R1) para el trabajo posterior.
Construcción de vectores de expresión de E. coli para homólogos de galactolipasa L131
El gen de la lipasa de Streptomyces avermitilis se amplificó por PCR usando ADN cromosómico como molde y los dos cebadores oligonucleotídicos oSAL-5 (GGGAATTCCATATGAGACGTTCCCGAATTACG) y oSAL-3 (GCATGGATCCGGTGACCTGTGCGACGG). Para la amplificación de genes de lipasa de Thermobifida fusca y Corynebacterium efficiens los cebadores oligonucleotídicos usados fueron oTFL-5 (GGGAATTCCATATGGGCAGCGGACCACGTG) y oTFL-3 (GCATGGATCCGACACGCACGGCTCAACG), oCEL-5 (GGGAATTCCATATGAGGACAACGGTCATCG) y oCEL-3 (GCATGGATCCGGCATCGGGCTCATCC), respectivamente. Los productos de PCR se digirieron con NdeIy BamHI y se ligaron con vector pET11a (Novagen, EEUU) digerido con las mismas endonucleasas de restricción.
El vector de expresión de galactolipasa L131 para S. lividans se construyó del siguiente modo. Se digirió el plásmido pUC18(L131RX) que contiene el fragmento EcoRI-XbaI de 1,37 kb del fragmento original de ADN clonado que portaba el gen de la lipasa L131 (pBK(L131)) con EcoRI y se ligó con pU487 digerido con EcoRI (Kieser et al., 2000). Este ligamiento conduce a la formación de los dos plásmidos recombinante que difieren en la orientación relativa de pIJ487 y pUC18(L131RX). Para el posterior trabajo, se ha seleccionado una variante donde el promotor lac del pUC18 está flanqueando el gen neoR sin promotor de pIJ487 en base al análisis de restricción. Esta construcción se llamó pRX487-5 (Figura 11). Además de resistencia a ampicilina, este plásmido también confiere a E. coli la resistencia a al menos 3 mg/l de kanamicina. Los protoplastos de S. lividans 1326 se transformaron con 0,1-10 µg de pRX487-5 para resistencia a tiostreptona (1,2 mg/l) y kanamicina (5 mg/l). Estos transformantes produjeron galactolipasa activa juzgada por el ensayo de placa indicadora de DGDG-safranina. Los transformantes se sembraron en placas SM (Kieser et al., 2000) suplementadas con 5 mg/ml de kanamicina y se dejaron esporular. Las esporas resultantes se usaron para inocular el matraz de agitación y cultivos de fermentación.
Construcción de vectores de expresión para Corynebacterium glutamicum
15
25
35
45
55
65 E05773820
09-06-2015
Todos los vectores de expresión usados en este trabajo se basan en el plásmido pCB5 que es un vector lanzadera que porta el replicón de C. glutamicum del plásmido pSR1 (Yoshihama et al., 1985) y el replicón ColE1 de E. coli. El promotor que se usa en este vector se obtiene del gen cop1 que codifica la proteína secretada principal de C. glutamicum -PS1. Las enzimas se expresaron a partir de sus genes nativos incluyendo péptidos señal no modificados, por ejemplo T. fusca (Figura 14).
Condiciones de fermentación
Fermentación de cepas de Streptomyces productoras de lipasa
En matraces de agitación, se cultivaron cepas de S. lividans recombinantes productoras de lipasa en un medio que contenía (por litro) 10 g de peptona, 5 g de extracto de levadura, 2 g de K2HPO4 y 10 g de glucosa (pH 7,0) suplementado con antibióticos apropiados: se usó tiostreptona a 1,2 mg/l, kanamicina a 20 mg/l, cloranfenicol a 1,5 mg/l y eritromicina a 1,5 mg/l. Se usaron suspensiones de esporas producidas por cultivo de los transformantes en placas SM para iniciar los cultivos.
Para fermentaciones alimentadas por lotes, se usó fermentador Braun Biostat E (10 l). El medio inicial (7 l), contenía (por litro): peptona 20 g, extracto de levadura, 10 g, glucosa 20 g y antibióticos apropiados como se ha descrito anteriormente (excepto por tiostreptona, que no se usó en cultivos de 10 l). El cultivo se realizó a 30ºC, aireación constante de 10 l/min y 600 rpm de velocidad de agitación. Se cultivaron inóculos (2 x 250 ml por fermentación) en matraces Erlenmeyer de 2 l como se ha descrito en el párrafo previo. La fermentación se realizó en modo discontinuo durante 18-20 h, tiempo después del cual, se suministró una solución que contenía glucosa al 30% y peptona al 12,5% al cultivo de fermentador a una velocidad de 0,5 ml/min. Las muestras (30 ml) del cultivo se extrajeron de forma aséptica dos veces al día.
Fermentación de cepas recombinantes de C. glutamicum
Se cultivaron cultivos en matraz de agitación de C. glutamicum en LB que contenía 50 mg/l de kanamicina a 30ºC y 200 rpm de velocidad de agitación.
Fermentación de cepas recombinantes de A. salmonicida
En matraces de agitación, se cultivaron las cepas recombinantes de A. salmonicida en medio 2xYT suplementado con estreptomicina y kanamicina (a 25 mg/l). Para inducir el promotor tac, se añadieron IPTG (1-5 mM) o lactosa (110%) al medio de cultivo.
Se ensayaron dos series de condiciones para la producción de acil-transferasa recombinante en A. salmonicida a escala de fermentador. En el primer experimento, el medio inicial (7 l) era 2xYT suplementado con glucosa al 2%, 50 mg/l de kanamicina y 50 mg/l de estreptomicina y la solución de suministro (3 l) contenía glucosa al 25%, triptona al 10% y extracto de levadura al 5%, 100 mg/l tanto de kanamicina como de estreptomicina. El cultivo se realizó a aireación de 10 l/min, 600 rpm de velocidad de agitación y 28ºC. El pH se ajustó a 7,5 por NH3 al 25% y ácido fosfórico al 10%. El fermentador se inoculó con 0,5 l de cultivo durante una noche de A. salmonicida y se cultivó en modo discontinuo durante 24 h. En este punto, se añadió IPTG hasta 5 mM y el suministro se inició a una velocidad de 50 ml/h.
En el segundo experimento, el medio inicial se modificó sustituyendo la glucosa con lactosa. La solución de suministro fue 2 l de lactosa al 20%. La temperatura de fermentación se aumentó hasta 30ºC y el pH del medio de cultivo se disminuyó hasta 7,0. La inoculación se hizo como en el primer experimento y el suministro (100 ml/h) se inició después de 20 h de cultivo en el medio inicial.
ENSAYOS ENZIMÁTICOS
Método de selección en placa de safranina
En la selección en placa de safranina la capa inferior contenía medio de cultivo + aditivo, agarosa al 1,5% y safranina al 0,002% (solución madre al 0,2% en agua, filtrada a esterilidad) y la capa superior agarosa al 0,7%, DGDG al 1% y safranina al 0,002%.
Determinación de actividad galactolipasa (ensayo de actividad glucolipasa (GLU-7)):
Sustrato:
Se disolvió digalactosildiglicérido al 0,6% (Sigma D 4651), Triton-X 100 al 0,4% (Sigma X-100) y CaCl2 5 mM en tampón HEPES 0,05 M pH 7. Procedimiento de ensayo:
E05773820
09-06-2015
Se añadieron 400 µl de sustrato a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se colocó en un Eppendorf Thermomixer a 37ºC durante 5 minutos. A tiempo t = 0 min, se añadieron 50 µl de solución enzimática. También se analizó un blanco con agua en lugar de enzima. La muestra se mezcló a 10x00 rpm en un Eppendorf Thermomixer a 37ºC durante 10
5 minutos. A tiempo t = 10 min el tubo Eppendorf se colocó en otro thermomixer a 99ºC durante 10 minutos para detener la reacción. El ácido graso libre en las muestras se analizó usando el kit NEFA C de WAKO GmbH. La actividad enzimática GLU a pH 7 se calculó como micromoles de ácido graso producidos por minuto en condiciones de ensayo
10 Determinación de actividad fosfolipasa (ensayo de actividad fosfolipasa (PLU-7)):
Sustrato
Se dispersó L-α fosfatidilcolina al 0,6% vegetal al 95% (Avanti nº 441601), Triton-X 100 al 0,4% (Sigma X-100) y 15 CaCl2 5 mM en tampón HEPES 0,05 M pH 7.
Procedimiento de ensayo:
Se añadieron 400 µl de sustrato a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se colocó en un Eppendorf Thermomixer a 37ºC
20 durante 5 minutos. A tiempo t = 0 min, se añadieron 50 µl de solución enzimática. También se analizó un blanco con agua en lugar de enzima. La muestra se mezcló a 10x100 rpm en un Eppendorf Thermomixer a 37ºC durante 10 minutos. A tiempo t = 10 min el tubo Eppendorf se colocó en otro thermomixer a 99ºC durante 10 minutos para detener la reacción. El ácido graso libre en las muestras se analizó usando el kit NEFA C de WAKO GmbH. La actividad enzimática PLU-7 a pH 7 se calculó como micromoles de ácido graso producidos por minuto en
25 condiciones de ensayo.
Ensayo espectrofotométrico con palmitato de p-nitrofenilo (pNPP)
Se midió la actividad lipasa con un ensayo espectrofotométrico a 30ºC con pNPP como sustrato, usando tampón
30 Tris-Maleato 50 mM (pH 6,5) con Triton X-100 al 0,4% y goma arábiga al 0,1%. La solución madre de sustrato (100 mM) se preparó en dioxano. La medición cinética se inició mediante la adición de enzima a la mezcla de reacción. Para evaluar la actividad hidrolítica inicial, se siguió el aumento en la absorción a 410 nm con el lector de placa Spectramax cada 20 s durante 20 min. Una unidad de actividad lipasa se definió como la cantidad de enzima que liberaba 1 µmol de p-nitrofenol por min. La actividad hacia otros ésteres de p-NP se midió del mismo modo, usando
35 1 mM de cada sustrato. (Abramic M. et al. (1999))
Determinación de los efectos del pH y la temperatura sobre la actividad lipasa
Para la determinación del efecto del pH sobre la actividad enzimática, se midió sobre un intervalo de pH 2-10 usando 40 el ensayo de actividad galactolipasa excepto que los tampones usados en el experimento fueron los siguientes: pH 2-3,5 Glicina-HCl; pH 4-5 NaOAc; pH 5,5-7,5 Tris-Maleato; pH 7,5-9 Tris-HCl; pH 10 CAPS.
El efecto de la temperatura sobre la actividad galactolipasa se determinó incubando alícuotas de enzima durante 20 min a diversas temperaturas (22ºC-90ºC) después de incubación en hielo durante 60 min. La actividad residual se 45 analizó por el ensayo de actividad galactolipasa.
Para la detección de la temperatura óptima para la actividad galactolipasa, la mezcla de ensayo usual se equilibró a la temperatura requerida (el intervalo 20ºC-70ºC) y se añadieron 2 o 4 µl de enzima para iniciar la reacción. La actividad se analizó por el ensayo de actividad galactolipasa, pero usando un periodo más corto de tiempo (20 min).
50 Ejemplo 11: Caracterización de candidatos de galactolipasa a partir de estudio de biodiversidad
La secuencia de la galactolipasa de Streptomyces thermosacchari L131 ofrece la posibilidad de identificación in silico de nuevas galactolipasas de la familia II.
55 Pueden identificarse muchos otros homólogos útiles de galactolipasa de Streptomyces L131, por ejemplo, "proteína hipotética" de Thermobifida fusca (ZP_00058717) y "proteína hipotética" de Corynebacterium efficiens (NP_738716).
Se clonaron y expresaron 3 homólogos de galactolipasa de Streptomyces L131: los genes de Streptomyces
60 avermitilis (SAL), Thermobifida fusca (TFL), y Corynebacterium efficiens (CEL). Todos los genes se expresaron en E. coli usando sistema de expresión pET. Las cepas recombinantes de E. coli primero se analizaron usando placas indicadoras de DGDG con safranina y se descubrió que las enzimas de S. avermitilis, T. fusca y C. efficiens tenían actividad galactolipasa.
E05773820
09-06-2015
Las enzimas que mostraban actividad galactolipasa se examinaron adicionalmente. Se estudiaron las especificidades de sustrato de esos candidatos de galactolipasa (Figura 13). Se ensayó la actividad de las enzimas candidatas hacia DGDG, lecitina, aceite de oliva, butirato de nitrofenilo, decanoato de nitrofenilo (NP-D) y palmitato de nitrofenilo. Se descubrió que las enzimas tenían perfiles de especificidad de sustrato muy diferentes. La actividad
5 acil-transferasa se ensayó en un ensayo usando NP-D como sustrato y cuantificando tanto la liberación de nitrofenol como ácidos grasos libres por el kit NEFA. Los datos preliminares sugieren que al menos la enzima de Thermobifida fusca tiene actividad transferasa hacia glicerol y glucosa.
Se ensayó la termoestabilidad de los candidatos de galactolipasa. Se descubrió que la enzima de Corynebacterium 10 efficiens era la más termoestable mientras que la enzima de Streptomyces avermitilis era la más termosensible.
Ejemplo 12: Ensayo de desgomado de Streptomyces thermosacchari L131
Se ensayó una fosfolipasa de Streptomyces thermosacchari L131 en aceite de soja crudo. 15 Materiales y métodos
K371: Enzima de Streptomyces thermosacchari L131 expresada en S. lividans secada por congelación en almidón. (Actividad: 108 PLU-7/g). 20 Lecitase Ultra (nº 3108) de Novozymes, Dinamarca
Éster de colesterol, Fluka 26950 Esterol vegetal: Generol 122 N de Henkel, Alemania Aceite de soja crudo de The Solae Company, Aarhus Dinamarca
25 Lecitina: L-α fosfatidilcolina vegetal al 95% (Avanti nº 441601)
Actividad fosfolipasa
El ensayo de fosfolipasa fue el mismo que el usado en el Ejemplo 10. 30 HPTLC
Aplicador: Tomamuestras de TLC automático 4, CAMAG Placa de HPTLC: 20 x 10 cm, Merck nº 1.05641. Activada 30 minutos a 160ºC antes de su uso.
35 Aplicación: se aplicó 1 µl de una solución al 8% de aceite en tampón a la palca de HPTLC usando el aplicador de TLC automático. Tampón de ejecución 4: Cloroformo:Metanol:Agua 75:25:4 Tampón de ejecución 5: P-éter:Metil-terc-butil cetona:Ácido acético 70:30:1
40 Tiempo de aplicación/elución:
Tampón de ejecución 4: 20 min Tampón de ejecución 5: 10 min
45 Desarrollo de TLC
La placa se secó en un horno durante 10 minutos a 160ºC, se enfrió, y se sumergió en acetato cúprico al 6% en H3PO4 al 16%. Se secó adicionalmente 10 minutos a 160ºC y se evaluó directamente.
50 Experimento de desgomado
Se usó Streptomyces thermosacchari L131 (K371) para estudios de desgomado en las formulaciones mostradas en la tabla 4.
55 Las muestras se colocaron a 40ºC durante 18 horas con agitación, tiempo después del cual se recogió una muestra para análisis de HPTLC disolviendo la muestra en Cloroformo:Metanol 2:1.
Tabla 4. Desgomado de aceite de soja crudo con Streptomyces thermosacchari L131 y Lecitase Ultra™
Carril
1 2 3 4 5 6
Aceite de soja crudo
% 99 99 98 97 99,7 99
K371, 10% en agua
% 1 2 3
Lecitase Ultra™ nº 3108, 1% en agua
% 0,3 0,3
Agua
% 1 0 0 0 0,7
E05773820
09-06-2015
Los resultados del análisis de HPTLC se muestran en la Figura 16 y Figura 17.
La Figura 16 muestra la placa de TLC (tampón 4) de productos de reacción procedentes de tratamiento enzimático de muestras de aceite de soja crudo de acuerdo con la tabla 4. Como se ha referenciado, también se analizó 5 fosfatidilcolina (PC). También se indican fosfatidiletanolamina (PE) y lisofosfatidilcolina (LPC).
Los resultados de TLC en la Figura 16 muestran claramente que la fosfatidilcolina se eliminaba completamente añadiendo Streptomyces thermosacchari L131 al aceite. Solamente la dosificación más baja (Carril 2) no hidrolizaba completamente los fosfolípidos. Lecitase Ultra™ también hidrolizaba los fosfolípidos en el aceite cuando estaba
10 disponible agua al 5% (Carril 6) pero sin añadir agua extra (Carril 5) solamente se hidrolizaba parte de los fosfolípidos.
La Figura 17 muestra TLC (tampón 5) de productos de reacción procedentes del tratamiento enzimático de muestras de aceite de soja crudo de acuerdo con la tabla 4. Como se ha referenciado, también se indican éster de colesterol, 15 monoglicérido, diglicérido, triglicérido y esterol vegetal, ácido graso libre (FFA).
Los resultados mostrados en la Figura 17 indican que la hidrólisis de fosfolípidos es coincidente con la formación de ácido graso libre.
20 Conclusión
Los resultados confirman que Streptomyces thermosacchari L131 hidroliza de forma eficaz fosfolípidos en aceite de soja crudo y es una enzima alternativa adecuada para desgoma aceites vegetales.
25 Referencias
Abramic M., Lescic I., Korica T., Vitale L., Saenger W., Pigac J. Purification and properties of extracellular lipase from Streptomyces rimosus. Enzyme and Microbial Technology 25 522-529 (1999)
30 Harayama S., Masataka T., Iino T. High-frequency mobilisation of the chromosome of Escherichia coli by a mutant of plasmid RP4 temperature sensitive for maintenance. Mol. Gen. Genet 180,47-56 (1980).
Harwood C.R. y Cutting S.M. Molecular biological methods for Bacillus. John Wiley & Sons Ltd., West Sussex, Inglaterra (1990)
35 Kieser T., Bibb M.J., Buttner M.J., Chater K.F., Hopwood D.A. Practical Streptomyces genetics. The John Innes Foundation, Crowes, Norwich, Inglaterra (2000)
Vujaklija D., Schroder W., Abramic M., Zou P., Lescic I., Franke P., Pigac J. A novel streptomycete lipase: 40 cloning, sequencing and high-level expression of the Streptomyces rimosus GDS(L)-lipase gene. Arch. Microbiol.178, 124-130 (2002)
Yoshihama M, Higashiro K, Rao EA, Akedo M, Shanabruch WG, Follettie MT, Walker GC, Sinskey AJ. Cloning vector system for Corynebacterium glutamicum. J Bacteriol. 162 (2):591-597 (1985). 45

Claims (36)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos un galactolípido y/o capaz de transferir un grupo acilo desde un galactolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo, en la que la enzima se puede obtener de especies
    5 Streptomyces y comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 4 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con la misma.
  2. 2. Una enzima lipolítica capaz de hidrolizar lípidos polares y/o capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido
    polar hasta uno o más sustratos aceptores de acilo, en la que la enzima está codificada por un ácido nucleico 10 seleccionado entre el grupo que consiste en:
    a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 3; b) un ácido nucleico que está relacionado con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 por la degeneración del código genético; y
    15 c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 3.
  3. 3. Una enzima lipolítica de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2 obtenida de las cepas de Streptomyces
    L130 o L131 depositadas con los números de acceso NCIMB 41226 y NCIMB 41227, respectivamente. 20
  4. 4. Una enzima lipolítica de acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación 3 en la que la enzima es capaz de hidrolizar al menos un galactolípido y/o es capaz de transferir un grupo acilo desde un galactolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo.
    25 5. Una enzima lipolítica de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 4 en la que la enzima es capaz de hidrolizar un lípido polar adicional.
  5. 6. Una enzima lipolítica de acuerdo con la reivindicación 5 en la que el lípido polar es un fosfolípido.
    30 7. Una enzima lipolítica de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 4 en la que la enzima lipolítica es capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido polar hasta uno o más de los siguientes sustratos aceptores de acilo: un esterol, un estanol, un carbohidrato, una proteína o subunidades de la misma, o un glicerol.
  6. 8. Una enzima lipolítica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que la enzima es una 35 enzima de tipo silvestre.
  7. 9. Un ácido nucleico que codifica una enzima lipolítica capaz de hidrolizar al menos un galactolípido y/o capaz de transferir un grupo acilo desde un galactolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 4 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%
    40 de identidad con la misma.
  8. 10. Un ácido nucleico que codifica una enzima lipolítica capaz de hidrolizar lípidos polares y/o capaz de transferir un grupo acilo desde un lípido polar hasta uno o más sustratos aceptores de acilo, seleccionándose dicho ácido nucleico entre el grupo que consiste en:
    45 a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 3; b) un ácido nucleico que está relacionado con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 por la degeneración del código genético; y c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 70% de identidad con
    50 la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 3.
  9. 11. Uso de una enzima lipolítica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en un proceso para preparar un lisoglucolípido por tratamiento de un glucolípido con la enzima lipolítica para producir el producto de hidrólisis parcial, es decir el lisoglucolípido.
    55
  10. 12.
    Uso de una enzima lipolítica de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el lisoglucolípido comprende digalactosil monoglicérido (DGMG) o monogalactosil monoglicérido (MGMG).
  11. 13.
    Uso de una enzima lipolítica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en un proceso para
    60 preparar un liso-fosfolípido, por ejemplo lisolecitina, por tratamiento de un fosfolípido (por ejemplo, lecitina) con la enzima para producir un producto de hidrólisis parcial, es decir un liso-fosfolípido.
  12. 14. Uso de una enzima lipolítica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en un proceso de
    desgomado enzimático de aceite vegetal o comestible, que comprende tratar dicho aceite comestible o vegetal con 65 dicha enzima lipolítica para hidrolizar una parte principal de los lípidos polares.
    48 5
    15
    25
    35
    45
    55
    65
  13. 15.
    Uso de una enzima lipolítica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en un proceso que comprende el tratamiento de un fosfolípido para hidrolizar grupos acilo grasos.
  14. 16.
    Uso de una enzima lipolítica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en un proceso de bioconversión de lípidos polares para preparar productos de alto valor, en el que dicha enzima lipolítica es capaz de hidrolizar dichos lípidos polares.
  15. 17.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 16 en el que dichos productos de alto valor son uno o más de los siguientes: un éster de carbohidrato, un éster de proteína, un éster de subunidad proteica y un éster de hidroxiácido.
  16. 18.
    Un método para preparar un producto alimenticio comprendiendo el método mezclar la enzima lipolítica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 con uno o más ingredientes del producto alimenticio.
  17. 19.
    El método de acuerdo con la reivindicación 18 en el que dicha enzima lipolítica es capaz de hidrolizar un glucolípido y/o un fosfolípido presente en o como al menos uno de dichos ingredientes.
  18. 20.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 18 o 19 en el que el producto alimenticio se selecciona entre uno o más de los siguientes: huevos, productos basados en huevo, incluyendo aunque sin limitación mahonesa, aliños de ensalada, salsas, helados, huevo en polvo, yema de huevo modificada y productos preparados a partir de la misma; productos horneados, incluyendo panes, tortas, productos de masa dulce, masas laminadas, masas líquidas, muffins, rosquillas, galletas, galletas saladas y galletas dulces; productos de confitería, incluyendo chocolate, golosinas, caramelos, halawa, chicles, incluyendo chicle sin azúcar y edulcorado con azúcar, chicle globo, chicle globo blando, goma de mascar y postres; productos congelados incluyendo sorbetes, preferiblemente productos lácteos congelados, incluyendo helados y leche helada; productos lácteos, incluyendo queso, mantequilla, leche, nata para café, nata montada, crema pastelera, bebidas lácteas y yogures; mousses, nata batida vegetal, productos cárnicos, incluyendo productos cárnicos procesados; aceites y grasas comestibles, productos batidos gaseosos y no gaseosos, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, margarina, productos para untar y mantecas incluyendo mantecas de bajo y muy bajo contenido en grasa; aliños, mahonesa, aderezos, salsas basadas en crema, sopas basadas en crema, bebidas, emulsiones sazonadas y salsas.
  19. 21.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 20 en el que dicho producto alimenticio es un producto lácteo.
  20. 22.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 20 en el que dicho producto alimenticio es un huevo o producto basado en huevo.
  21. 23.
    Un método para preparar un lisoglucolípido que comprende tratar un sustrato que comprende un glucolípido con al menos una enzima lipolítica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para producir dicho lisoglucolípido, en el que dicha enzima lipolítica tiene actividad glucolipasa.
  22. 24.
    Un método para preparar un lisofosfolípido que comprende tratar un sustrato que comprende un fosfolípido con al menos una enzima lipolítica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para producir dicho lisofosfolípido, en el que dicha enzima lipolítica tiene actividad fosfolipasa.
  23. 25.
    Un método de desgomado enzimático de aceite vegetal o comestible, que comprende tratar dicho aceite comestible o vegetal con una enzima lipolítica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 capaz de hidrolizar una parte principal de los lípidos polares.
  24. 26.
    Un método de bioconversión de lípidos polares para preparar productos de alto valor que comprende tratar dichos lípidos polares con una enzima lipolítica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para producir dichos productos de alto valor, en el que dicha enzima lipolítica es capaz de hidrolizar dichos lípidos polares.
  25. 27.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 26 en el que dichos productos de alto valor son uno o más de los siguientes: un éster de carbohidrato, un éster de proteína, un éster de subunidad proteica y un éster de hidroxiácido.
  26. 28.
    Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27 en el que dicha enzima lipolítica es capaz de transferir un grupo acilo desde un glucolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo.
  27. 29.
    Un método de acuerdo con la reivindicación 20 en el que dicho producto alimenticio es un producto horneado y al menos uno de dichos ingredientes es una masa.
  28. 30.
    Uso de una enzima lipolítica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en un sustrato para preparar un lisoglucolípido en el que dicha enzima lipolítica tiene actividad glucolipasa.
  29. 31.
    Uso de una enzima lipolítica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en un sustrato para preparar un lisofosfolípido en el que dicha enzima lipolítica tiene actividad fosfolipasa.
    49
  30. 32. Uso de una enzima lipolítica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la preparación de un producto alimenticio, en el que dicha enzima lipolítica es capaz de hidrolizar un glucolípido y/o un fosfolípido.
  31. 33.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 30 a 32 en el que dicha enzima lipolítica es capaz de transferir un grupo 5 acilo desde un glucolípido hasta uno o más sustratos aceptores de acilo.
  32. 34. Uso de acuerdo con la reivindicación 30 en el que dicho lisoglucolípido es DGMG o MGMG.
  33. 35.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 32 en el que dicho producto alimenticio es un producto lácteo. 10
  34. 36. Uso de acuerdo con la reivindicación 35 en el que dicho producto alimenticio es un huevo o un producto basado en huevo y en el que dicha enzima lipolítica es capaz de transferir un grupo acilo hasta uno o más sustratos aceptores de acilo para reducir uno o más de los siguientes efectos nocivos: malos olores y/o malos sabores y/o gusto jabonoso.
    15
  35. 37.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 32 en el que dicho producto alimenticio es un producto horneado.
  36. 38.
    Uso de acuerdo con la reivindicación 30 en el que dicho sustrato es un aceite comestible.
    50
ES05773820.5T 2004-07-16 2005-07-18 Enzima lipolítica, usos de la misma en la industria alimentaria Active ES2539006T3 (es)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0416035.4A GB0416035D0 (en) 2004-07-16 2004-07-16 Protein
GB0416035 2004-07-16
US59118504P 2004-07-26 2004-07-26
US591185P 2004-07-26
GB0513859A GB0513859D0 (en) 2005-07-07 2005-07-07 Method
GB0513859 2005-07-07
PCT/IB2005/002602 WO2006008653A2 (en) 2004-07-16 2005-07-18 Lipolytic enzyme uses thereof in the food industry

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2539006T3 true ES2539006T3 (es) 2015-06-25

Family

ID=38895985

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES05773820.5T Active ES2539006T3 (es) 2004-07-16 2005-07-18 Enzima lipolítica, usos de la misma en la industria alimentaria

Country Status (18)

Country Link
US (5) US7666618B2 (es)
EP (5) EP1791933B1 (es)
JP (1) JP5604032B2 (es)
KR (1) KR101226156B1 (es)
CN (7) CN102154391B (es)
AT (1) ATE514767T1 (es)
AU (4) AU2005263954B2 (es)
BR (2) BRPI0511835A (es)
CA (2) CA2572843A1 (es)
DK (2) DK1776455T3 (es)
EA (1) EA014985B1 (es)
ES (1) ES2539006T3 (es)
HK (1) HK1101189A1 (es)
MX (2) MX2007000626A (es)
NZ (1) NZ551378A (es)
PL (2) PL1791933T3 (es)
PT (1) PT1791933E (es)
WO (2) WO2006008653A2 (es)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6936289B2 (en) 1995-06-07 2005-08-30 Danisco A/S Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
GB0112226D0 (en) * 2001-05-18 2001-07-11 Danisco Method of improving dough and bread quality
DE69904941T3 (de) 1998-07-21 2008-01-31 Danisco A/S Lebensmittel
JP4309137B2 (ja) 2001-05-18 2009-08-05 ダニスコ エイ／エス 酵素を使用した練り粉の調製方法
US20050196766A1 (en) 2003-12-24 2005-09-08 Soe Jorn B. Proteins
US7955814B2 (en) 2003-01-17 2011-06-07 Danisco A/S Method
DE602004030000D1 (de) 2003-01-17 2010-12-23 Danisco Verfahren zur in-situ-herstellung eines emulgators in einem nahrungsmittel
US7906307B2 (en) 2003-12-24 2011-03-15 Danisco A/S Variant lipid acyltransferases and methods of making
US7718408B2 (en) 2003-12-24 2010-05-18 Danisco A/S Method
GB0716126D0 (en) * 2007-08-17 2007-09-26 Danisco Process
GB0405637D0 (en) 2004-03-12 2004-04-21 Danisco Protein
DK1776455T3 (da) 2004-07-16 2015-06-22 Dupont Nutrition Biosci Aps Lipolytisk enzym, anvendelser deraf i fødevareindustrien
BRPI0611892A2 (pt) 2005-06-13 2011-01-04 Novozymes As método para produzir alquil ésteres de ácidos graxos de teor de fósforo reduzido
CN102559627B (zh) * 2007-01-25 2014-09-10 杜邦营养生物科学有限公司 由地衣芽孢杆菌转化细胞制备脂酰基转移酶
EP2405007B1 (en) 2007-01-25 2013-12-04 DuPont Nutrition Biosciences ApS Production of a lipid acyltransferase from transformed Bacillus licheniformis cells
EP2119781B1 (en) 2007-01-30 2012-08-22 Mitsubishi-Kagaku Foods Corporation Glyceroglycolipid lipase
WO2009065415A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Roskilde Universitet Polypeptides comprising an ice-binding activity
WO2009081094A2 (en) * 2007-12-21 2009-07-02 Danisco A/S Process
GB0807161D0 (en) * 2008-04-18 2008-05-21 Danisco Process
GB0812559D0 (en) * 2008-07-09 2008-08-13 Danisco Method
GB0905367D0 (en) * 2009-03-27 2009-05-13 Danisco Method
US8945644B2 (en) * 2009-06-15 2015-02-03 Cavitation Technologies, Inc. Process to remove impurities from triacylglycerol oil
EP2281874A1 (en) 2009-07-31 2011-02-09 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Production of ß-Cells
CN102656264A (zh) 2009-10-15 2012-09-05 丹尼斯科公司 脂质酰基转移酶蛋白及其制备方法
GB0920089D0 (en) 2009-11-17 2009-12-30 Danisco Method
MX2012010399A (es) 2010-03-12 2012-10-05 Dupont Nutrition Biosci Aps Proceso.
GB201007668D0 (en) 2010-05-07 2010-06-23 Danisco Method
AR081950A1 (es) 2010-06-17 2012-10-31 Danisco Proceso de tratamiento de semillas que contienen aceite
ES2649912T3 (es) 2011-02-23 2018-01-16 Dupont Nutrition Biosciences Aps Tratamiento enzimático de la clorofila en los aceites vegetales
AR085251A1 (es) 2011-02-23 2013-09-18 Danisco Proceso para tratar aceite vegetal
US10039306B2 (en) 2012-03-16 2018-08-07 Impossible Foods Inc. Methods and compositions for consumables
US20140220217A1 (en) 2011-07-12 2014-08-07 Maraxi, Inc. Method and compositions for consumables
CN110742128A (zh) 2011-07-12 2020-02-04 非凡食品有限公司 用于消费品的方法和组合物
KR20210095240A (ko) 2011-07-12 2021-07-30 임파서블 푸즈 인크. 소비재를 위한 방법 및 조성물
WO2013104659A2 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process
WO2013104660A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process for treating a plant oil comprising hydrolysing chlorophyll or a chlorophyll derivative and involving partial caustic neutralisation
TR201810285T4 (tr) 2012-02-17 2018-08-27 Clariant Produkte Deutschland Yağın enzimatik zamksı maddelerinin giderilmesi için metot.
WO2013160372A1 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process for treating plant oil involving addition of serial doses of chlorophyll or chlorophyll derivative degrading enzyme
WO2013160374A1 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Dupont Nutrition Biosciences Aps Process for refining crude plant oil involving enzymatic hydrolysis and gum recycling
PE20150179A1 (es) 2012-06-14 2015-02-07 Bunge Global Innovation Llc Proceso para la produccion de aceites bajos en acidos grasos saturados
JP5926801B2 (ja) * 2012-07-17 2016-05-25 国立大学法人福島大学 プラスマローゲンの加水分解方法、プラスマローゲンの測定方法
CN112899250A (zh) * 2012-09-14 2021-06-04 基因组股份公司 具有改善的酯合酶特性的酶变体
CN102907552B (zh) * 2012-10-08 2015-08-05 云南冷云食品饮料有限责任公司 一种添加脂肪分解酶的低脂冰淇淋及其制作工艺
KR20150105979A (ko) 2013-01-11 2015-09-18 임파서블 푸즈 인크. 코아세르베이트를 포함하는 비-낙농 치즈 모조물
RU2701852C2 (ru) 2013-01-11 2019-10-01 Импоссибл Фудз Инк. Способы и композиции для воздействия на профиль вкуса и аромата пригодных к потреблению веществ
WO2014143263A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 United Technologies Corporation Multi-airfoil split and rejoin method
EP2792735A1 (de) * 2013-04-16 2014-10-22 Clariant Produkte (Deutschland) GmbH Verfahren zur Verbesserung der wässrigen enzymatischen Entschleimung von Pflanzenölen
EP2799531A1 (de) 2013-05-03 2014-11-05 Clariant Produkte (Deutschland) GmbH Einsatz von Phosphatasen zur enzymatischen Entschleimung von Triglyceriden
US10172380B2 (en) 2014-03-31 2019-01-08 Impossible Foods Inc. Ground meat replicas
US20170121741A1 (en) 2014-04-01 2017-05-04 Dupont Nutrition Biosciences Aps Method for increasing crude palm oil yields
JP6925258B2 (ja) 2014-07-18 2021-08-25 ジェノマティカ， インコーポレイテッド 脂肪ジオールの微生物による産生
WO2016097266A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Dupont Nutrition Biosciences Aps Method of improving palm oil yields from palm fruit or palm fruit liquid
US10982171B2 (en) 2015-07-17 2021-04-20 Keclon Sa Methods for oil degumming
JP2020508698A (ja) 2017-02-20 2020-03-26 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 焼成に使用するための脂肪分解酵素
US11814598B2 (en) 2018-03-21 2023-11-14 Cargill, Incorporated Synthetic ester and mineral oil dielectric fluids with increased stability
CN110699178B (zh) * 2019-10-17 2022-10-25 贵州长顺八妹农副产品开发有限公司 一种菜籽油中不饱和脂肪酸的提取方法
AU2021227090A1 (en) 2020-02-28 2022-07-14 Chr. Hansen A/S Lipases, compositions, methods and uses thereof
CN112574975B (zh) * 2020-09-30 2022-04-01 华南理工大学 甘油酯脂肪酶突变体g28c-p206c及其编码基因与应用
GB202015772D0 (en) 2020-10-05 2020-11-18 Univ Newcastle Pngase enzymes
CN112450421B (zh) * 2020-10-19 2022-09-23 杭州师范大学 一种低油腻味的蛋黄酱及制备方法
KR20220095932A (ko) 2020-12-30 2022-07-07 주식회사 아데니스 고 hlb 레시틴의 제조시스템 및 그를 이용하여 제조된 고 hlb 레시틴
WO2023031266A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 Chr. Hansen A/S Yarrowia lipolytica and its use for producing lipases specifically liberating short chain fatty acids
MX2024005861A (es) * 2021-11-17 2024-08-06 Int N&H Denmark Aps Modificación enzimática mejorada de galactolípidos en los alimentos.

Family Cites Families (363)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT110768B (de) 1927-09-29 1928-10-10 Patiag Patentverwertungs Und I Windkraftmaschine.
US2888385A (en) * 1952-11-28 1959-05-26 Grandel Felix Process of making a preparation containing lipases and oxidases
US3260606A (en) * 1964-04-29 1966-07-12 Taiyo Food Co Ltd Enzymatic treatment of egg
GB1092775A (en) * 1965-07-07 1967-11-29 Knud Aunstrup Preparation of amyloglucosidase
DK109695C (da) 1966-02-09 1968-06-10 Dansk Siemens Aktieselskab Kobling til automatisk udsendelse af forud bestemte signalfølger, navnlig kaldenumre i telekommunikationsanlæg, samt kodekort til brug i koblingen.
US3368903A (en) * 1966-02-18 1968-02-13 Vanderbilt Co R T Baked goods dough and method
CH461935A (fr) * 1966-05-03 1968-08-31 Menzi Robert Procédé de fabrication de pâtes alimentaires séchées
DE1900959A1 (de) * 1969-01-09 1970-08-27 Unilever Nv Verfahren zur Herstellung von Pflanzenphosphatiden mit universeller Emulgierkraft
US3634195A (en) * 1969-09-08 1972-01-11 Miles Lab Production of lipase
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
GB1375783A (es) 1972-02-04 1974-11-27
GB1442418A (en) 1972-12-14 1976-07-14 Procter & Gamble Method of cleansing polyester-containing fabrics
IL46862A (en) 1974-04-08 1977-12-30 Baxter Travenol Lab Lipolytic enzyme flavoring system for fat-containing food
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3973042A (en) * 1974-05-10 1976-08-03 Cornell Research Foundation, Inc. Flavor development by microbial lipases in pasteurized milk blue cheese
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
GB1525929A (en) * 1974-11-25 1978-09-27 Unilever Ltd Stabilised emulsions comprising phospholipoprotein
GB1577933A (en) 1976-02-11 1980-10-29 Unilever Ltd Fat process and composition
US4160848A (en) * 1977-04-18 1979-07-10 Pennwalt Corporation Antistaling agent for bakery products
JPS6049477B2 (ja) * 1977-04-19 1985-11-01 協和醗酵工業株式会社 グリセロ−ル酸化酵素およびその製造法ならびにグリセロ−ル酸化酵素を用いるグリセロ−ルの定量法
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
JPS5850719B2 (ja) 1978-10-18 1983-11-11 協和醗酵工業株式会社 トリグリセライドの定量方法
JPS602279Y2 (ja) 1979-03-06 1985-01-22 日本板硝子株式会社 コンクリ−トまたはモルタル注入装置
US4399218A (en) * 1980-02-05 1983-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh Method and reagent for the determination of glycerin
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
AU551956B2 (en) 1981-05-07 1986-05-15 Unilever Plc Fat processing
JPS57189637U (es) 1981-05-29 1982-12-01
JPS57189638U (es) 1981-05-29 1982-12-01
JPS58148696U (ja) 1982-03-31 1983-10-05 三菱重工業株式会社 高速増殖炉
JPS6030488B2 (ja) 1982-11-10 1985-07-17 協和醗酵工業株式会社 生地の改良剤およびそれを含有してなる生地
JPS59172485A (ja) 1983-03-18 1984-09-29 Tetsuzo Kato ２，２−ジメチル−１，３−ジオキシン−４−オン誘導体の製造法
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS59183881U (ja) 1983-05-25 1984-12-07 東商株式会社 スナツク飲料のセツト収納袋
DK289083A (da) 1983-06-23 1984-12-24 Novo Industri As Lipase, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf
DK402583D0 (da) * 1983-09-05 1983-09-05 Novo Industri As Fremgangsmade til fremstilling af et immobiliseret lipasepraeparat og anvendelse deraf
DK152763C (da) 1983-09-05 1988-10-24 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret lipasepraeparat
JPS6078529U (ja) 1983-11-04 1985-05-31 オムロン株式会社 押しボタンスイツチ
US4707364A (en) 1984-01-27 1987-11-17 Miles Laboratories, Inc. Composition for accelerating cheese aging
JPS60147578U (ja) 1984-03-13 1985-10-01 トヨタ車体株式会社 クオ−タインナパネル等内板のカバ−取付構造
JPS60258766A (ja) 1984-06-05 1985-12-20 Matsushita Electric Ind Co Ltd 光情報記録再生装置
US4636468A (en) 1984-06-25 1987-01-13 Genencor, Inc. Lipolytic enzyme derived from a aspergillus microorganism having an accelerating effect on cheese flavor development
CA1262654A (en) 1984-08-10 1989-11-07 Takaoki Torigoe Food quality improving agent
NL8402979A (nl) * 1984-09-28 1986-04-16 Tno Werkwijze voor het bestrijden van vaatverwelkingsziekten bij gewassen, in het bijzonder de iepeziekte.
JPS61181390A (ja) 1985-02-06 1986-08-14 Amano Pharmaceut Co Ltd 酵素によるグリセライドの製造法
US4689297A (en) 1985-03-05 1987-08-25 Miles Laboratories, Inc. Dust free particulate enzyme formulation
DE3672270D1 (de) 1985-03-06 1990-08-02 Yoshikawa Oil & Fat Verfahren zur herstellung von fettsaeureestern.
US5219733A (en) * 1985-03-06 1993-06-15 Yoshikawa Oil & Fat Co., Ltd. Process for preparing fatty acid esters
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
JPS61242542A (ja) 1985-04-22 1986-10-28 Fuji Oil Co Ltd チ−ズ風味材の製造法
US5310679A (en) * 1985-05-13 1994-05-10 Artiss Joseph D Composition for reducing turbidity in samples of biological fluids
GB8514708D0 (en) 1985-06-11 1985-07-10 Unilever Plc Enzymatic detergent composition
GB8514707D0 (en) 1985-06-11 1985-07-10 Unilever Plc Enzymatic detergent composition
DK154572C (da) 1985-08-07 1989-04-24 Novo Industri As Enzymatisk detergentadditiv, detergent og fremgangsmaade til vask af tekstiler
GB8525012D0 (en) * 1985-10-10 1985-11-13 Cpc International Inc Carbohydrate refining process
JPH065501Y2 (ja) 1986-01-21 1994-02-09 丸井産業株式会社 沓摺盗み用金具
GB2185990B (en) 1986-02-05 1990-01-24 Unilever Plc Margarine fat
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5536661A (en) * 1987-03-10 1996-07-16 Novo Nordisk A/S Process for the production of protein products in aspergillus
US5874558A (en) * 1986-03-17 1999-02-23 Novo Nordisk Nucleic acid encoding a recombinant humicola sp. lipase
US5766912A (en) * 1986-03-17 1998-06-16 Novo Nordisk A/S Humicola lipase produced in aspergillus
JPH0324096Y2 (es) 1986-04-14 1991-05-27
JPS62262997A (ja) * 1986-05-02 1987-11-16 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ ワツクスの製造方法
JPS62285749A (ja) 1986-06-03 1987-12-11 日東製粉株式会社 パン類の製造方法
JPS6344892A (ja) 1986-08-13 1988-02-25 Kao Corp 油脂類のエステル交換反応方法
ES2058119T3 (es) 1986-08-29 1994-11-01 Novo Nordisk As Aditivo detergente enzimatico.
DK157560C (da) 1986-08-29 1990-06-11 Novo Nordisk As Enzymatisk detergentadditiv, detergent indeholdende det enzymatiske detergentadditiv og fremgangsmaade til vask af tekstiler.
EP0260573A3 (de) 1986-09-18 1989-03-22 Lucas Meyer GmbH & Co Verfahren zur Herstellung eines hydrolysierten Lecithins, sowie Anwendung des hydrolysierten Lecithins
WO1988002775A1 (en) 1986-10-17 1988-04-21 Novo Industri A/S Positionally non-specific lipase from candida sp, a method for producing it, its use and a recombinant dna process for producing it
US5273898A (en) 1986-10-17 1993-12-28 Noro Nordisk A/S Thermally stable and positionally non-specific lipase isolated from Candida
WO1988003365A1 (en) 1986-11-05 1988-05-19 George Weston Foods Limited Novel improvers for flour and yeast raised baked goods
US5108457A (en) 1986-11-19 1992-04-28 The Clorox Company Enzymatic peracid bleaching system with modified enzyme
KR900003014B1 (ko) * 1986-12-27 1990-05-04 도오아 야꾸힌 고오교오 가부시끼가이샤 양식어(養殖魚)용 사료 첨가제
JPH088866B2 (ja) * 1987-03-10 1996-01-31 株式会社ヤクルト本社 ホスホリパ−ゼｄおよびその製造法
US5219744A (en) * 1987-08-26 1993-06-15 Ajinomoto Co., Inc. Process for modifying fats and oils
ATE125865T1 (de) 1987-08-28 1995-08-15 Novo Nordisk As Rekombinante humicola-lipase und verfahren zur herstellung von rekombinanten humicola-lipasen.
EP0321811B2 (en) 1987-12-21 1999-12-22 Dsm N.V. Method for improving flour dough
DK6488D0 (da) * 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
AU2944889A (en) 1988-01-14 1989-08-11 Novo Nordisk A/S Apparatus for determination of the coagulation time of a blood sample
DK77788A (da) * 1988-02-16 1989-08-17 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af kokosnoedolie
JP3079276B2 (ja) * 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
EP0334462B2 (en) 1988-03-25 2002-04-24 Genencor International, Inc. Molecular cloning and expression of genes encoding lipolytic enzymes
US5232846A (en) 1988-08-09 1993-08-03 Unitika Ltd. Method for producing a thermostable lipoprotein lipase from streptomyces
JP2709736B2 (ja) 1988-08-11 1998-02-04 昭和産業株式会社 油脂の精製方法
GB8906837D0 (en) 1989-03-23 1989-05-10 Unilever Plc Bread improvers
DE3920561A1 (de) * 1989-06-23 1991-01-10 Knoll Ag Verfahren zur vermeidung von verdauungsstoerungen bei pflanzenfressenden tieren
CA2063592C (en) 1989-07-07 2003-01-21 Marco L. F. Giuseppin Process for preparing a protein by a fungus transformed by multicopy integration of an expression vector
US5213968A (en) * 1989-08-21 1993-05-25 Nestec S.A. Process for preparing emulsifying agents
EP0426211B1 (en) 1989-09-29 1993-11-24 Unilever N.V. Food product containing dried lyso-phospholipoprotein
US5677160A (en) 1989-10-30 1997-10-14 Henkel Corporation Fat splitting process
WO1991006661A1 (en) 1989-11-03 1991-05-16 Opta Food Ingredients, Inc. Lipase-catalyzed in situ generation of mono- and di-glycerides
US5288619A (en) * 1989-12-18 1994-02-22 Kraft General Foods, Inc. Enzymatic method for preparing transesterified oils
JPH03262492A (ja) 1990-03-06 1991-11-22 P Macneil Gerald モノグリセリドの製造方法
DK19991D0 (da) * 1991-02-06 1991-02-06 Novo Nordisk As Proteinpraeparationer
KR100225087B1 (ko) 1990-03-23 1999-10-15 한스 발터라벤 피타아제의 식물내 발현
IL97645A (en) 1990-03-23 1997-03-18 Gist Brocades Nv Production of enzymes in seeds and their use
EP0531372B2 (en) 1990-05-09 2004-04-14 Novozymes A/S A cellulase preparation comprising an endoglucanase enzyme
US5814501A (en) * 1990-06-04 1998-09-29 Genencor International, Inc. Process for making dust-free enzyme-containing particles from an enzyme-containing fermentation broth
EP0468731A1 (en) 1990-07-26 1992-01-29 Oriental Yeast Co., Ltd. Bread improver and method of producing bread
JP3006085B2 (ja) 1990-11-30 2000-02-07 オリエンタル酵母工業株式会社 製パン改良剤及びそれを用いる製パン法
US5869438A (en) * 1990-09-13 1999-02-09 Novo Nordisk A/S Lipase variants
US5892013A (en) * 1990-09-13 1999-04-06 Novo Nordisk A/S Lipase variants
WO1992005249A1 (en) 1990-09-13 1992-04-02 Novo Nordisk A/S Lipase variants
CA2058056C (en) 1990-12-21 1996-11-05 Chiaki Saito Method of decreasing cholesterol concentration in food
WO1992014830A1 (en) 1991-02-13 1992-09-03 Schneider Manfred P Enzymatic reverse hydrolysis of hydrophilic substrates - preparation of amphiphilic compounds
PH31068A (en) 1991-03-07 1998-02-05 Ici Plc Process for the production of terephthalic acid.
DE4112440C1 (es) 1991-04-16 1992-10-22 Diagen Institut Fuer Molekularbiologische Diagnostik Gmbh, 4000 Duesseldorf, De
ATE169678T1 (de) * 1991-05-01 1998-08-15 Novo Nordisk As Stabilisierte enzyme
JP2708633B2 (ja) 1991-05-03 1998-02-04 ライシオン テータート オサケユイチア アクティエボラーグ 血清における高コレステロールレベルを低めるための物質及びその物質を調製するための方法
DE4115938A1 (de) 1991-05-16 1992-11-19 Metallgesellschaft Ag Enzymatisches verfahren zur verminderung des gehaltes an phosphorhaltigen bestandteilen in pflanzlichen und tierischen oelen
GB9114734D0 (en) 1991-07-09 1991-08-28 Univ London Process for modifying proteins
CA2077020A1 (en) 1991-09-03 1993-03-04 Yoshikazu Isono Process for producing lipoprotein-containing substance having reduced lipid content and food containing substance thus produced
US5879920A (en) * 1991-10-07 1999-03-09 Genencor International, Inc. Coated enzyme-containing granule
ATE133196T1 (de) 1991-11-11 1996-02-15 Akzo Nobel Nv Verfahren zur herstellung von salzgranulaten
MX9206979A (es) 1991-12-04 1993-07-01 Novo Nordisk As Metodo de clonacion de proteinas en levaduras
ES2291264T3 (es) 1991-12-20 2008-03-01 Novo Nordisk A/S Formulacion farmaceutica estabilizada comprendiendo una hormona de crecimiento e histidina.
EP0558112A1 (en) 1992-02-25 1993-09-01 Unilever N.V. Enzymic diglyceride removal
CA2079839A1 (en) 1992-02-28 1993-08-29 Vincent Destefanis Calcium peroxide and ascorbic acid containing compositions as replacements for bromate in breadmaking
GB2267033B (en) 1992-03-07 1996-01-24 David Garnett Lysophospholipid Animal Feed Supplement
DK42092D0 (es) 1992-03-27 1992-03-27 Novo Nordisk As
DK73592D0 (da) 1992-06-03 1992-06-03 Novo Nordisk As Nyt enzym
ES2180541T5 (es) 1992-06-16 2008-12-01 Sankyo Lifetech Company Limited Nueva fosfolipasa a1, procedimiento para su preparacion y uso de la misma.
DK88892D0 (da) * 1992-07-06 1992-07-06 Novo Nordisk As Forbindelse
EP0580252A2 (en) 1992-07-20 1994-01-26 Quest International B.V. Improvements in or relating to pectin methyl esterase
EP0585988B1 (en) 1992-07-27 1996-03-13 Gist-Brocades N.V. Enzyme product and method for improving bread quality
DK104592D0 (da) 1992-08-21 1992-08-21 Novo Nordisk As Fremgangsmaade
WO1994013820A1 (en) 1992-12-10 1994-06-23 Gist-Brocades N.V. Production of heterologous proteins in filamentous fungi
EP0675944B1 (en) 1992-12-22 2003-06-25 Novozymes A/S Alkaline lipase
DK154292D0 (da) 1992-12-23 1992-12-23 Novo Nordisk As Nyt enzym
JP2937746B2 (ja) 1993-04-25 1999-08-23 昭和産業株式会社 油脂の精製方法
WO1994026883A2 (en) 1993-05-18 1994-11-24 Gist-Brocades N.V. Process for dust-free enzyme manufacture
ZA943640B (en) 1993-06-07 1995-01-26 Buckman Labor Inc Synergistically stabilized liquid enzymatic compositions
JP2859520B2 (ja) 1993-08-30 1999-02-17 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物
CN1134726A (zh) 1993-10-04 1996-10-30 诺沃挪第克公司 一种包含修饰酶的酶制剂
DE69429611D1 (de) * 1993-10-29 2002-02-14 Dsm Nv Backverbesserende Zusammensetzungen
EP0652289A1 (en) 1993-11-05 1995-05-10 Unilever Plc Random interesterification of triglyceride fats
DE4339556C1 (de) 1993-11-19 1995-02-02 Metallgesellschaft Ag Verfahren zum Entschleimen von Pflanzenöl mittels Enzymen
EP1090553A3 (en) * 1993-12-24 2001-04-18 Dsm N.V. Dry yeast compositions
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
DE69531538T2 (de) 1994-02-21 2004-06-24 Novozymes A/S Verfahren zur herstellung einer immobilisierten enzympräparation und ihre verwendung
ATE222604T1 (de) 1994-02-22 2002-09-15 Novozymes As Methode zur herstellung einer variante eines lipolytischen enzymes
US5834280A (en) 1994-05-03 1998-11-10 Novo Nordisk A/S Glucose oxidases obtained from a cladosporium
AU695391B2 (en) 1994-05-03 1998-08-13 Novozymes A/S Alkaline glucose oxidase
AU2524695A (en) 1994-05-04 1995-11-29 Genencor International, Inc. Lipases with improved surfactant resistance
US5741665A (en) 1994-05-10 1998-04-21 University Of Hawaii Light-regulated promoters for production of heterologous proteins in filamentous fungi
US5612208A (en) 1994-05-11 1997-03-18 Amano Pharmaceutical Co., Ltd. Ascorbate oxidase, gene encoding the same, process for producing the same, and reagent composition using the same
HUT74965A (en) 1994-06-16 1997-03-28 Firmenich & Cie Flavouring composition and process
EP0687414B1 (en) 1994-06-17 2000-11-08 Dsm N.V. Bread improving composition
MX9701804A (es) 1994-09-21 1997-06-28 Genencor Int Metodos para la eliminacion funcional de substancias grasosas de productos que contienen almidon.
KR970707275A (ko) 1994-10-26 1997-12-01 안네 제케르 지질분해 활성을 갖는 효소(an enzyme with lipolytic activity)
US5929017A (en) * 1994-10-26 1999-07-27 Novonordisk A/S Enzymatic detergent composition
WO1996013579A1 (en) 1994-10-26 1996-05-09 Novo Nordisk A/S Novel lipolytic enzyme
GB2296011B (en) 1994-12-13 1999-06-16 Solvay Novel fusarium isolate and lipases, cutinases and enzyme compositions derived therefrom
US6093562A (en) * 1996-02-05 2000-07-25 Novo Nordisk A/S Amylase variants
AU691409B2 (en) 1995-02-22 1998-05-14 Cerestar Usa, Inc. Process for reducing sterols and free fatty acids from animal fat
JPH08228778A (ja) 1995-02-27 1996-09-10 Showa Denko Kk 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法
JP3359777B2 (ja) * 1995-03-06 2002-12-24 日清製粉株式会社 油揚げ即席麺およびその製造方法
EP0815210B1 (en) 1995-03-16 2004-06-02 Novozymes A/S An enzyme with aminopeptidase activity
EP0817838B1 (en) 1995-03-30 2003-06-11 Novozymes A/S Alkaline lipolytic enzyme
US5919746A (en) * 1995-03-30 1999-07-06 Novo Nordisk A/S Alkaline lipolytic enzyme
AU5333396A (en) 1995-04-11 1996-10-30 Novo Nordisk A/S Bread-improving additive comprising a xylanolytic enzyme
US5989599A (en) 1995-04-24 1999-11-23 Nestec S.A. Process for the interesterification of phospholipids
EP0743017B1 (en) 1995-05-15 2004-09-29 DSM IP Assets B.V. Application of phospholipases in animal feed
GB2301103B (en) 1995-05-23 1999-12-22 Danisco An enzyme system comprising ferulic acid esterase
US6936289B2 (en) * 1995-06-07 2005-08-30 Danisco A/S Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
GB0211975D0 (en) * 2002-05-24 2002-07-03 Danisco Method
ES2182986T5 (es) 1995-06-07 2009-03-01 Danisco A/S Hexosa oxidasa recombinante, procedimiento para su produccion y utilizacion de dicha enzima.
WO1996039851A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Danisco A/S A method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
GB0112226D0 (en) 2001-05-18 2001-07-11 Danisco Method of improving dough and bread quality
US6495357B1 (en) 1995-07-14 2002-12-17 Novozyme A/S Lipolytic enzymes
DE69633825T2 (de) 1995-07-14 2005-11-10 Novozymes A/S Modifiziertes enzym mit lipolytischer aktivität
DE19527274A1 (de) 1995-07-26 1997-01-30 Metallgesellschaft Ag Enzymatisches Verfahren zur Entschleimung von pflanzlichen Ölen mit Aspergillus-Phospholipase
JP4068142B2 (ja) 1995-08-11 2008-03-26 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 新規の脂肪分解酵素
DK0843725T3 (da) 1995-08-11 2002-08-12 Novozymes As Fremgangmåde til fremstilling af polypeptidvarianter
US6153745A (en) 1995-09-22 2000-11-28 Amersham Pharmacia Biotech Uk Limited Relating to mutagenesis of nucleic acids
FR2739860B1 (fr) 1995-10-17 1998-01-02 Coletica Complexes amphiphiles, procede pour leur preparation et compositions en renfermant
DE69618749D1 (de) 1995-12-01 2002-03-14 Unilever Nv Mikrowellen erhitzbare knusperige Brötchen
US6361974B1 (en) 1995-12-07 2002-03-26 Diversa Corporation Exonuclease-mediated nucleic acid reassembly in directed evolution
US6344328B1 (en) 1995-12-07 2002-02-05 Diversa Corporation Method for screening for enzyme activity
US5756328A (en) * 1995-12-20 1998-05-26 Cornell Research Foundation, Inc. Acyltransferase and cDNA encoding acyltransferase
JP3233286B2 (ja) 1996-01-22 2001-11-26 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 環状オリゴマーの酵素加水分解
AU1747797A (en) 1996-01-24 1997-08-20 Novo Nordisk A/S Nucleic acids encoding polypeptides having absidia lipase activity
US5942430A (en) 1996-02-16 1999-08-24 Diversa Corporation Esterases
US6001586A (en) 1996-03-29 1999-12-14 Genencor International, Inc. Compartmentalization method for screening microorganisms
DE69731195T2 (de) 1996-04-25 2006-03-09 Novozymes A/S Alkalisches, lipolytisches enzym
CN1216902A (zh) 1996-05-02 1999-05-19 诺沃挪第克公司 分支酶在烘烤中的用途
EP0906022A1 (en) 1996-05-02 1999-04-07 Novo Nordisk A/S Use of a dextrin glycosyl transferase in baking
DE19620649A1 (de) * 1996-05-22 1997-11-27 Roehm Gmbh Rekombinant hergestellte Lysophospholipase aus Aspergillus
DK0912100T3 (da) 1996-07-01 2001-12-17 Novozymes As Peptido-Glutaminase til bagning
WO1998008939A1 (en) 1996-08-27 1998-03-05 Novo Nordisk A/S Novel lipolytic enzymes
AU4376597A (en) 1996-09-26 1998-04-17 Novo Nordisk A/S An enzyme with cyclomaltodextrin glucanotransferase (cgtase) activity
WO1998014594A2 (en) 1996-09-30 1998-04-09 Genencor International, Inc. Esterases, dna encoding therefor and vectors and host cells incorporating same
JPH10155493A (ja) 1996-10-04 1998-06-16 Sankyo Co Ltd アスペルギルス属由来のホスホリパーゼａ１をコードする遺伝子
AU4451897A (en) 1996-10-11 1998-05-11 Novo Nordisk A/S Use of a carbohydrate binding domain in baking
JP3182381B2 (ja) 1996-10-25 2001-07-03 日清製粉株式会社 麺類の機械製麺法
JP2001504327A (ja) 1996-10-31 2001-04-03 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 新規ホスホリパーゼ、その生産及び使用
DE19648343C1 (de) * 1996-11-22 1998-02-12 Roehm Gmbh Verfahren zur Herstellung von Backwaren mit verbesserter Frischhaltung
JP3582265B2 (ja) 1996-11-28 2004-10-27 味の素株式会社 改質穀粉及びこれを使用した穀粉加工食品
DK0869167T4 (da) 1996-12-09 2010-03-08 Novozymes As Reduktion af phosphor-indeholdende bestanddele i spiseolier; som omfatter en stor mængde ikke-hydrerbart phosphor, ved anvendelse af en phospholipase, en phospholipase fra en trådsvamp, der har en phospholipase A og/eller B aktivitet
US6103505A (en) 1996-12-09 2000-08-15 Novo Nordisk A/S Method for reducing phosphorus content of edible oils
DE19701348A1 (de) * 1997-01-16 1998-07-23 Roehm Gmbh Protein mit Phospholipaseaktivität
US5821102A (en) 1997-01-21 1998-10-13 Novo Nordisk Biotech Inc. Nucleic acids encoding polyeptides having absidia lipase activity
JP4018769B2 (ja) 1997-01-28 2007-12-05 日本ケミテック株式会社 膵リパーゼ活性阻害剤、機能性食品及び食品添加物
CA2284097A1 (en) 1997-03-18 1998-09-24 Novo Nordisk A/S Shuffling of heterologous dna sequences
EP0973399B1 (en) 1997-04-09 2002-07-17 Danisco A/S Improved method for preparing flour doughs and products made from such doughs using glycerol oxidase
GB9709161D0 (en) 1997-05-06 1997-06-25 Danisco A process of preparing an anti-oxidant
WO1998051163A2 (en) 1997-05-16 1998-11-19 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods of producing protein hydrolysates
EP0882797B1 (en) 1997-06-04 2003-07-16 Loders Croklaan B.V. Preparation of symmetrical triglycerides aba
RU2140751C1 (ru) 1997-06-11 1999-11-10 Ассоциация "Ассоя" Пищевая добавка для производства хлеба и хлебобулочных изделий
JP4121186B2 (ja) 1997-06-16 2008-07-23 株式会社日立製作所 セラミックス管の検査方法及びその装置
CA2294925A1 (en) 1997-06-23 1998-12-30 The Procter & Gamble Company Enzymatic detergent compositions
EP0913468A3 (en) 1997-07-22 2001-06-13 Dsm N.V. Bread improving comüposition
DK0897667T4 (da) 1997-07-31 2009-02-16 Dsm Ip Assets Bv Brödforbedrende sammensætning
US6355282B1 (en) 1997-10-31 2002-03-12 Amano Pharmaceutical Co., Ltd. Dough composition and preparation thereof
US6156548A (en) 1997-12-23 2000-12-05 Novo Nordisk A/S Immobilization of enzymes with a fluidized bed for use in an organic medium
CN1152135C (zh) 1997-12-23 2004-06-02 诺沃挪第克公司 酶的固定化方法
AU2207099A (en) 1997-12-24 1999-07-19 Genencor International, Inc. An improved method of assaying for a preferred enzyme and/or preferred detergentcomposition
GB9801408D0 (en) 1998-01-22 1998-03-18 Unilever Plc Frozen food product
JPH11228986A (ja) 1998-02-10 1999-08-24 Agency Of Ind Science & Technol 固定化ホスホリパーゼによる脱ガム法
AU3247699A (en) 1998-02-17 1999-09-06 Novo Nordisk A/S Lipase variant
BR9909280A (pt) 1998-04-01 2000-11-21 Danisco Exoamilases não maltogênicas e sua utilização no retardo de retrogradação de amido
WO1999053001A1 (en) 1998-04-08 1999-10-21 Novo Nordisk A/S An enzymatic oil-degumming process
JPH11290078A (ja) 1998-04-09 1999-10-26 Kansai Kagaku Kikai Seisaku Kk 細胞表層にリパーゼを有する酵母並びにその利用
US6815190B1 (en) 1998-04-12 2004-11-09 Novozymes A/S Cutinase variants
US6365204B1 (en) * 1998-04-20 2002-04-02 Novozymes Preparation of dough and baked products
DE69904161T3 (de) 1998-04-20 2008-11-06 Novozymes A/S Herstellung von teig sowie backprodukten
BR9909605A (pt) 1998-04-30 2001-09-11 Du Pont Fragmento de ácido nucléico isolado codificador de toda ou uma parte substancial de uma lipase de triacilglicerol ácida, gene quimérico, célula hospedeira transformada, polipeptìdio lipase de triacilglicerol ácida e neutra, método de alteração do nivel de expressão de uma lipase de triacilglicerol em uma célula hospedeira, método de obtenção de um fragmento de ácido nucléico codificador de toda ou uma parte substancial da sequência de aminoácido codificadora de uma lipase de triacilglicerol e produto
US6866837B2 (en) * 1998-06-05 2005-03-15 Mallinckrodt Inc. Radiolabeled peptides for the diagnosis and treatment of breast and prostate tumors and metastases of such tumors
US20030074695A1 (en) * 1998-06-24 2003-04-17 Farese Robert V. Plant diacylglycerol O-acyltransferase and uses thereof
JP4514952B2 (ja) * 1998-07-02 2010-07-28 カルジーン エルエルシー ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタンパク質
SE510497C2 (sv) 1998-07-15 1999-05-31 Biofeed Thailand Co Ltd Funktionellt födoämne innehållande mikroorganismer
DE69904941T3 (de) 1998-07-21 2008-01-31 Danisco A/S Lebensmittel
JP3414652B2 (ja) 1998-10-12 2003-06-09 敷島製パン株式会社 小麦粉焼成品、その製造方法および品質改良剤
FI115527B (fi) 1998-10-16 2005-05-31 Upm Kymmene Oyj Kasvisterolijohdannaisten käyttö ja niitä sisältäviä tuotteita
EP1131444B1 (en) * 1998-11-10 2006-04-19 Novozymes, Inc. Polypeptides having lysophospholipase activity and nucleic acids encoding same
US7312062B2 (en) * 1998-11-27 2007-12-25 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
RU2235775C2 (ru) 1998-11-27 2004-09-10 Новозимс А/С Способ получения варианта липолитического фермента и липолитический фермент (варианты)
WO2000032758A1 (en) * 1998-11-27 2000-06-08 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
EP2716753A1 (en) * 1998-11-27 2014-04-09 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants
JP2000226335A (ja) 1998-12-04 2000-08-15 Amano Pharmaceut Co Ltd 経口用酵素製剤、酵素含有食材及び酵素製剤の服用方法
KR100748061B1 (ko) 1998-12-04 2007-08-09 노보자임스 에이/에스 큐티나제 변이체
CN1255533C (zh) 1998-12-04 2006-05-10 诺维信公司 角质酶变体
AU779969B2 (en) 1998-12-17 2005-02-24 National Research Council Of Canada Diacylglycerol acyltransferase gene from plants
KR20010101594A (ko) 1999-01-22 2001-11-14 훈자 디 마리아 카르멜라 마라찌타 에스.아.에스. 지단백질 복합체 및 이를 함유하는 조성물
ATE313636T1 (de) 1999-02-16 2006-01-15 Senesco Inc Dna kodierend für pflanzliche lipase, transgene pflanzen und ein verfahren zur kontrolle der seneszenz in pflanzen
US6399121B1 (en) 1999-03-16 2002-06-04 Novozymes A/S Process for producing cheese
AU766617B2 (en) 1999-03-16 2003-10-23 Novozymes A/S Process for producing cheese
JP2004500019A (ja) 1999-03-26 2004-01-08 ディベルサ　コーポレーション 定方向進化におけるエキソヌクレアーゼ仲介核酸再集合
AU3418400A (en) 1999-03-30 2000-10-23 Novozymes A/S Preparation of dough and baked products
KR20010108379A (ko) 1999-03-31 2001-12-07 피아 스타르 리파제 변이체
ATE446370T1 (de) 1999-04-12 2009-11-15 Monsanto Technology Llc Öl, das brassicastanol enthält
US6162260A (en) 1999-05-24 2000-12-19 Novo Nordisk Biochem North America, Inc. Single-bath biopreparation and dyeing of textiles
DE60040980D1 (de) 1999-06-02 2009-01-15 Novozymes As Chemisch veränderte, lipolytische enzyme
EP1057415A1 (en) 1999-06-04 2000-12-06 Societe Des Produits Nestle S.A. Lipase-treated pasta and manufacturing process
US6254645B1 (en) * 1999-08-20 2001-07-03 Genencor International, Inc. Enzymatic modification of the surface of a polyester fiber or article
ATE484595T1 (de) * 1999-08-30 2010-10-15 Monsanto Technology Llc Pflanzen-sterol-acyltransferasen
US6337187B1 (en) 1999-11-05 2002-01-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 18891, a novel human lipase
DE10030529A1 (de) 1999-09-30 2001-04-19 Biotechnolog Forschung Gmbh DNA-Sequenzen, die Estergruppen spaltende Enzyme kodieren
WO2001027251A1 (en) 1999-10-14 2001-04-19 Novozymes A/S Lysophospholipase from aspergillus
US6146869A (en) 1999-10-21 2000-11-14 Novo Nordisk Biotech, Inc. Polypeptides having phospholipase B activity and nucleic acids encoding same
DE19953854C2 (de) 1999-11-09 2002-01-17 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur Herstellung von Biopolymeren mit veränderten Eigenschaften
FI108204B (fi) 1999-11-25 2001-11-30 Kari Johannes Kirjavainen Kalvo energioiden muuntamiseksi
GB2358784B (en) 1999-12-03 2004-06-30 Danisco Method of improving dough and bread quality
CN1407856A (zh) 1999-12-03 2003-04-02 丹尼斯科有限公司 改进生面团和面包质量的方法
GB9928968D0 (en) 1999-12-07 2000-02-02 Danisco Enzyme
AU2367401A (en) 1999-12-23 2001-07-09 Dsm N.V. Bread improver comprising bile salt and phospholipase a
US7078205B2 (en) * 2000-02-17 2006-07-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequences encoding melanoma associated antigen molecules, aminotransferase molecules, atpase molecules, acyltransferase molecules, pyridoxal-phosphate dependent enzyme molecules and uses therefor
CA2399700C (en) 2000-03-08 2013-10-01 Danisco A/S Xylanase variants having altered sensitivity to xylanase inhibitors
IL135466A (en) 2000-04-04 2006-07-05 Sobhi Basheer A process for the selective alcoholization of free sterols in a fatty product using a non-solvent lipase complex fixed on a matrix
DE60140385D1 (de) 2000-04-14 2009-12-17 Novozymes Inc Pektinase-Behandlung von Kartoffelprodukten
DE10018787A1 (de) 2000-04-15 2001-05-03 Nikolaus Weber Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Carbonsäure-sterylestern
EP2258852A1 (en) 2000-04-28 2010-12-08 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variant
CA2408406C (en) 2000-06-02 2014-07-29 Novozymes A/S Cutinase variants
US6509182B2 (en) * 2000-06-26 2003-01-21 Novozymes A/S Lipolytic enzymes
US6558715B1 (en) * 2000-10-31 2003-05-06 Novozymes Biotech, Inc. Methods for using lipases in baking
US6511837B2 (en) * 2000-06-26 2003-01-28 Novozymes A/S Lipolytic enzymes
EP2281878A1 (en) * 2000-06-26 2011-02-09 Novozymes A/S Lipolytic enzyme
US6432898B1 (en) 2000-10-31 2002-08-13 Novozymes Biotech, Inc. Polypeptides having lipase activity and nucleic acids encoding same
US6506588B2 (en) * 2000-06-26 2003-01-14 Novozymes, A/S Lipolytic enzymes
EP1298205A4 (en) 2000-07-03 2004-06-16 Mochida Pharm Co Ltd NEW LIPASE
AU7235901A (en) * 2000-07-06 2002-01-21 Novozymes As Method of preparing a dough or a baked product made from a dough, with addition of lipolytic enzymes
WO2002006457A2 (en) 2000-07-13 2002-01-24 Maxygen, Inc. Novel lipase genes
AU2001272373A1 (en) 2000-07-19 2002-01-30 Novozymes A/S Cgtase and dna sequence encoding same
DK1309677T4 (da) 2000-08-11 2012-06-25 Genencor Int Bacillustransformation, transformanter og mutantbiblioteker
DE10042636C1 (de) * 2000-08-30 2002-04-11 Epcos Ag Elektrisches Bauelement und Verfahren zu dessen Herstellung
KR100380804B1 (ko) * 2000-09-15 2003-04-18 한국과학기술원 내열성을 갖는 포스포리파제 ａ1의 돌연변이체 및 그의제조방법
AU2001293671A1 (en) 2000-09-25 2002-01-08 Novozymes A/S Methods for processing crustacean material
WO2002024881A1 (en) 2000-09-25 2002-03-28 Novozymes A/S Phospholipase from zygoascus hellenicus
ATE326851T1 (de) 2000-10-12 2006-06-15 Novozymes As Herstellung eines gebackenen produktes aus teig
JP3739274B2 (ja) 2000-10-31 2006-01-25 Ｋｄｄｉ株式会社 ２系統映像の位置ずれ補正装置
ES2279842T3 (es) 2000-11-17 2007-09-01 Danisco A/S Procedimiento para la prevencion de la reaccion de maillard en productos alimenticios.
US6660491B2 (en) * 2000-11-24 2003-12-09 Ikeda Food Research Co., Ltd. Process for producing dietary sterol fatty acid esters
CA2431972C (en) 2001-01-10 2012-10-23 Novozymes A/S Thermostable lipolytic enzyme variant
AU2002229513A1 (en) 2001-02-07 2002-08-19 Novozymes A/S Lipase variants
CN1235499C (zh) 2001-02-21 2006-01-11 诺维信公司 含淀粉的食品的生产
AU2002234513B2 (en) 2001-02-23 2006-12-07 Novozymes A/S Method of generating diversity into lipolytic enzymes and lipolytic enzyme genes
JP4309137B2 (ja) * 2001-05-18 2009-08-05 ダニスコ エイ／エス 酵素を使用した練り粉の調製方法
US6645749B2 (en) * 2001-05-25 2003-11-11 Novozymes A/S Lipolytic enzyme
US7630836B2 (en) 2001-05-30 2009-12-08 The Kitasato Institute Polynucleotides
US7419658B2 (en) 2001-07-09 2008-09-02 Euroscreen S.A. Isolated ligand of ChemerinR
DE50115482D1 (de) 2001-07-11 2010-06-24 Cognis Ip Man Gmbh Lipase/Acyltransferase aus Candida parapsilosis
EP1285969B1 (en) 2001-08-22 2006-10-11 Härting, Thomas Francis Process for producing sterol or stanol esters by enzymatic transesterification in solvent and water-free media
DE10142014B4 (de) 2001-08-28 2004-11-11 Degussa Bioactives Deutschland Gmbh & Co. Kg Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin
GB0121387D0 (en) 2001-09-04 2001-10-24 Danisco Modified hydrolases
AU2002340786A1 (en) 2001-11-05 2003-05-19 Novozymes A/S Fat splitting process
WO2003060112A1 (en) 2002-01-16 2003-07-24 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variants and method for their production
WO2003070013A1 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Novozymes A/S Process for producing cheese
US7010968B2 (en) 2002-04-18 2006-03-14 Schrader Bridgeport International, Inc. Determination of wheel sensor position using a wireless solution
US7226771B2 (en) * 2002-04-19 2007-06-05 Diversa Corporation Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
AU2003243157C1 (en) 2002-04-19 2008-09-04 Verenium Corporation Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US20040087531A1 (en) 2002-05-16 2004-05-06 Adam Telerman Compositions and methods for the treatment of cancer
CN100545261C (zh) 2002-05-21 2009-09-30 Dsmip资产有限公司 新的磷脂酶及其用途
SE0201581D0 (sv) 2002-05-29 2002-05-29 Scandinavian Biotechnology Res New improved acyltransferase
CN100347278C (zh) * 2002-05-30 2007-11-07 科学与工业研究委员会 物理精炼植物油的预处理方法
AU2003277844A1 (en) 2002-06-24 2004-01-06 Campbell Soup Company Dispensing system and method
US20040203791A1 (en) 2002-06-26 2004-10-14 Pan Shaowei Method and apparatus for implementing bi-directional soft handovers between wireless networks via mobile station control
JP2004024199A (ja) * 2002-06-28 2004-01-29 National Food Research Institute マンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードするポリヌクレオチド
CN100411525C (zh) 2002-07-03 2008-08-20 诺维信公司 用脂加氧酶和脂解酶对生面团的处理
CN1675355A (zh) 2002-08-19 2005-09-28 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 新颖的脂肪酶及其用途
CA2403025A1 (en) 2002-10-08 2004-04-08 Cognis Deutschland Gmbh & Co. Kg Enzymes with lipase/acyltransferase activity
US6773731B2 (en) * 2002-10-18 2004-08-10 James S. Campbell Liquid egg yolk product comprising lysophospholipoprotein
GB2379165A (en) 2002-10-22 2003-03-05 Dsm Nv Animal feed
JP4300839B2 (ja) 2002-11-14 2009-07-22 セイコーエプソン株式会社 画像処理装置、画像処理方法および画像処理プログラム
WO2004053039A2 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Novozymes A/S Detergent composition comprising endo-glucanase
DK1573052T3 (da) 2002-12-12 2008-07-21 Novozymes As Fremgangsmåde til udvælgelse af lipolytisk enzym
EP1579057A4 (en) 2002-12-23 2007-08-01 Novozymes North America Inc PROCESS FOR TREATING POLYESTER FABRICS
DE602004030000D1 (de) * 2003-01-17 2010-12-23 Danisco Verfahren zur in-situ-herstellung eines emulgators in einem nahrungsmittel
US7955814B2 (en) * 2003-01-17 2011-06-07 Danisco A/S Method
ATE487796T1 (de) 2003-01-17 2010-11-15 Danisco Verfahren zur in-situ-herstellung eines emulgators in einem nahrungsmittel
ES2215482B1 (es) 2003-03-28 2005-12-16 Consejo Sup. De Invest. Cientificas Composicion mejoradora de masas para panaderia y pasteleria.
EP1620551B1 (en) 2003-04-28 2013-09-18 Novozymes A/S Phospholipase and method of producing it
EP1639102A2 (en) 2003-06-19 2006-03-29 Novozymes A/S Phospholipase variants
WO2005005977A2 (en) 2003-06-30 2005-01-20 Applera Corporation Fluorescent phospholipase assays and compositions
WO2005007818A2 (en) 2003-07-07 2005-01-27 Genencor International, Inc. Exo-specific amylase polypeptides, nucleic acids encoding those polypeptides and uses thereof
JP4327536B2 (ja) 2003-09-01 2009-09-09 レシップ株式会社 券硬貨投入口及びそれを備えた券硬貨分離装置
DE602004031662D1 (de) 2003-12-03 2011-04-14 Procter & Gamble Perhydrolase
US7906307B2 (en) * 2003-12-24 2011-03-15 Danisco A/S Variant lipid acyltransferases and methods of making
GB0716126D0 (en) 2007-08-17 2007-09-26 Danisco Process
NZ547082A (en) 2003-12-24 2009-07-31 Danisco Enzymatic treatment of oils
US7718408B2 (en) * 2003-12-24 2010-05-18 Danisco A/S Method
EP1704236B1 (en) * 2003-12-24 2017-11-29 DuPont Nutrition Biosciences ApS Proteins
CN1922301A (zh) 2004-02-24 2007-02-28 诺和酶股份有限公司 液体去污剂中酶的稳定化
GB0405637D0 (en) 2004-03-12 2004-04-21 Danisco Protein
CN1938422A (zh) 2004-04-08 2007-03-28 金克克国际有限公司 突变体α－淀粉酶
DK1776455T3 (da) 2004-07-16 2015-06-22 Dupont Nutrition Biosci Aps Lipolytisk enzym, anvendelser deraf i fødevareindustrien
DE602004002866T2 (de) 2004-08-06 2007-05-24 De Smet Engineering N.V. Verfahren zum Rückgewinnen von Öl
US8557551B2 (en) 2004-09-10 2013-10-15 Dsm Ip Assets B.V. Compositions and methods for making and modifying oils
DE602005026541D1 (de) 2004-09-21 2011-04-07 Novozymes As Subtilasen
EP1799819B1 (en) * 2004-09-30 2011-03-23 Novozymes Inc. Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same
PL1649756T3 (pl) 2004-10-25 2011-03-31 Nestec Sa Modyfikowany produkt kakaowy i sposób jego wytwarzania
EP1830657B1 (en) 2004-12-21 2011-02-23 Novozymes A/S Method for producing fractions of a milk composition
DE102005039836A1 (de) 2005-08-23 2007-03-01 Cognis Ip Management Gmbh Sterolesterpulver
EP1788080A1 (en) 2005-11-22 2007-05-23 Süd-Chemie Ag Use of a thermostable phospholipase in the degumming of an oil or fat, and a method for obtaining a thermostable phopholipase
EP1876222A1 (en) 2006-07-06 2008-01-09 Cognis IP Management GmbH Process for production of fatty acids, fatty acid esters and sterolesters from soapstock
PL2057274T3 (pl) 2006-09-21 2014-05-30 Dsm Ip Assets Bv Fosfolipazy, kodujące je kwasy nukleinowe i sposoby ich wytwarzania i stosowania
EP2405007B1 (en) 2007-01-25 2013-12-04 DuPont Nutrition Biosciences ApS Production of a lipid acyltransferase from transformed Bacillus licheniformis cells
DK2118248T3 (da) 2007-01-30 2014-11-03 Bunge Oils Inc Enzymatisk degummiering under anvendelse af en blanding af PLA- og PLC-phospholipaser
WO2009002480A2 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Danisco Us, Inc., Genencor Division Acyl transferase having altered substrate specificity
CN101200754B (zh) 2007-12-07 2010-06-02 中国农业科学院油料作物研究所 无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法
WO2009081094A2 (en) 2007-12-21 2009-07-02 Danisco A/S Process
JP5211852B2 (ja) 2008-05-23 2013-06-12 株式会社Ｉｈｉ 加圧浮上装置及び加圧浮上方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2572843A1 (en) 2006-01-26
US8535900B2 (en) 2013-09-17
EA200700040A1 (ru) 2007-10-26
US20070298157A1 (en) 2007-12-27
AU2010214721A1 (en) 2010-09-23
DK1791933T3 (da) 2011-09-05
AU2005264077A1 (en) 2006-01-26
AU2005263954A2 (en) 2006-01-26
ATE514767T1 (de) 2011-07-15
BRPI0511835A (pt) 2008-01-08
EP2267107A2 (en) 2010-12-29
WO2006008653A2 (en) 2006-01-26
AU2010214723B2 (en) 2012-12-13
EP2267107A3 (en) 2011-05-25
US7666618B2 (en) 2010-02-23
EP1776455A2 (en) 2007-04-25
EP2275522A3 (en) 2011-09-21
CN102277231A (zh) 2011-12-14
HK1101189A1 (en) 2007-10-12
AU2005263954A1 (en) 2006-01-26
WO2006008653A3 (en) 2007-03-29
JP5604032B2 (ja) 2014-10-08
WO2006008653A9 (en) 2007-02-22
AU2005264077B2 (en) 2011-06-02
AU2005263954B2 (en) 2011-04-07
KR20070015205A (ko) 2007-02-01
CN102876739A (zh) 2013-01-16
AU2010214721B2 (en) 2012-02-02
EP2267108A1 (en) 2010-12-29
CN101052702B (zh) 2013-01-09
US20120064192A1 (en) 2012-03-15
EP1776455B1 (en) 2015-03-18
CA2571694A1 (en) 2006-01-26
PL1776455T3 (pl) 2015-09-30
EP2275522A2 (en) 2011-01-19
CN102154391A (zh) 2011-08-17
BRPI0513438A2 (pt) 2011-01-04
US8889371B2 (en) 2014-11-18
CN102533440B (zh) 2017-09-19
WO2006008508A1 (en) 2006-01-26
CA2571694C (en) 2014-09-02
CN102154391B (zh) 2014-07-30
US20110086131A1 (en) 2011-04-14
DK1776455T3 (da) 2015-06-22
CN101818177A (zh) 2010-09-01
MX2007000626A (es) 2007-03-07
PT1791933E (pt) 2011-08-26
CN102533440A (zh) 2012-07-04
MX2007000627A (es) 2007-06-25
US20110014317A1 (en) 2011-01-20
CN1984982A (zh) 2007-06-20
KR101226156B1 (ko) 2013-01-24
US8927036B2 (en) 2015-01-06
EP1791933A1 (en) 2007-06-06
CN101052702A (zh) 2007-10-10
AU2010214723A1 (en) 2010-09-23
PL1791933T3 (pl) 2011-12-30
EP1791933B1 (en) 2011-06-29
EA014985B1 (ru) 2011-04-29
JP2008506381A (ja) 2008-03-06
NZ551378A (en) 2009-06-26
US8192782B2 (en) 2012-06-05
US20080131936A1 (en) 2008-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2539006T3 (es) Enzima lipolítica, usos de la misma en la industria alimentaria
EP1599278B1 (en) Method of producing a hydroxy acid ester
JP5697294B2 (ja) 糖脂質アシル基転移酵素変異体及びその製造方法
US8278062B2 (en) Method of using lipid acyltransferase
JP2007516717A6 (ja) タンパク質
RU2538144C2 (ru) Липолитические ферменты, их применение при использовании пищевых продуктов
RU2371474C2 (ru) Способ получения сложного эфира углерода, сложного эфира белка, сложного эфира белковой субъединицы или сложного эфира гидроксикислоты с использованием липидацилтрансферазы
JP2010142243A (ja) リン脂質転移酵素活性が向上した脂質アシル基転移酵素変異体