ES2180541T5

ES2180541T5 - Nueva fosfolipasa a1, procedimiento para su preparacion y uso de la misma.

Info

Publication number: ES2180541T5
Application number: ES93304607T
Authority: ES
Inventors: Atsushi c/o Sankyo Company Limited Hattori; Noriyoshi c/o Sankyo Company Limited Uchida; Masahiro c/o Sankyo Company Limited Kitaoka
Original assignee: Sankyo Lifetech Co Ltd
Current assignee: Sankyo Lifetech Co Ltd
Priority date: 1992-06-16
Filing date: 1993-06-14
Publication date: 2008-12-01
Anticipated expiration: 2013-06-14
Also published as: DE69332217D1; US5538874A; EP0575133B1; FI932758A; EP0575133A3; EP0575133B2; PT575133E; NZ247891A; CA2098421C; US5521080A; IL106033A; DK0575133T4; DE69332217T3; AU4130893A; EP0575133A2; HK1010393A1; CA2098421A1; AU667217B2; FI112499B; ES2180541T3

Abstract

SE PRESENTA UNA FOSFOLIPASA A1 QUE ES CAPAZ DE HIDROLIZAR UN FOSFOLIPIDO PARA PRODUCIR UN FOSFOLIPIDO DE 2-ACIL Y QUE SE OBTIENE A PARTIR DE ESPECIES DEL HONGO "ASPERGILLUS".

Description

Nueva Fosfolipasa A1, procedimiento para su preparación y uso de la misma.

La presente invención se refiere a una enzima capaz de hidrolizar el grupo 1-acilo de un fosfolípido, es decir a una Fosfolipasa A1, así como al procedimiento para la producción y al uso de la misma como enzima.

Las fosfolipasas son enzimas que actúan sobre los fosfolípidos: son enzimas selectivas que se clasifican de acuerdo con su lugar de acción en la molécula de fosfolípido. Así, una Fosfolipasa A1 hidroliza el grupo 1-acilo de un fosfolípido, es decir, hidroliza el enlace entre el ácido graso y el residuo de glicerina de la posición 1 del fosfolípido. Una Fosfolipasa A2 hidroliza el grupo 2-acilo, o acilo central y las Fosfolipasas C y D, que también son conocidas como fosfodiesterasas, rompen en los dos lados del puente fosfodiéster.

La hidrólisis de un fosfolípido por una fosfolipasa da lugar a la producción de un llamado "lisofosfolípido". La hidrólisis selectiva de un sustrato fosfolípido con una Fosfolipasa A1 produce un 2-acil lisofosfolípido y la hidrólisis selectiva de un fosfolípido con una Fosfolipasa A2 da lugar a la producción de un 1-acil lisofosfolípido.

Aunque los fosfolípidos se utilizan industrialmente, se ha demostrado que los lisofosfolípidos son más adecuados en ciertos aspectos para la aplicación industrial. Así, los lisofosfolípidos muestran una solubilidad incrementada en agua, lo cual hace que tengan propiedades de agentes emulsionantes mejoradas en emulsiones de aceite/agua y una capacidad para formar emulsiones que sean más estables en las condiciones de cambio de pH, por ejemplo, que sean estables bajo condiciones ácidas, y con los cambios de temperatura. Además, la capacidad del lisofosfolípido para formar una emulsión no se ve reducida por la presencia de iones, tales como iones magnesio o calcio.

Estas propiedades superiores de los lisofosfolípidos significan que son particularmente adecuados para su uso en muchas aplicaciones industriales, tales como en la tecnología de los alimentos, o en las industrias de cosméticos y farmacéuticas. Además, se ha demostrado, que la conversión de un fosfolípido en un lisofosfolípido en sustancias que contengan fosfolípidos, tales como productos de alimentación, conduce generalmente a una mejora de ciertas propiedades de estas sustancias. Así, por ejemplo, una masa formada a partir de harina de trigo que contenga lisofosfolípidos es menos pegajosa que una masa en la que la harina de trigo no contenga ningún lisofosfolípido. Sin embargo, todavía no está claro si estas mejoras, como la de la masa, son sólo atribuibles a la presencia de los lisofosfolípidos, o a una reacción sinérgica de los lisofosfolípidos con otras sustancias en el producto.

La lecitina es un fosfolípido típico ampliamente utilizado en la industria, por ejemplo en la tecnología de los alimentos, en productos de alimentación animal y en preparaciones farmacéuticas. La lecitina es un agente se superficie activa, tiene actividad antioxidante y una acción de activación fisiológica, así como otras propiedades. Sin embargo, una emulsión que contenga lecitina es menos estable que las emulsiones que contienen otros agentes de superficie activa, y esto se ha demostrado de un modo particular en la tecnología de los alimentos. Se ha demostrado que la hidrólisis enzimática de un fosfolípido, tal como la lecitina, que convierte al menos parte de éste en un lisofosfolípido, mejora estas propiedades, y de este modo mejora el valor del derivado de lecitina resultante.

Se conoce la hidrólisis enzimática de un fosfolípido, utilizando una fosfolipasa aislada de un micro-organismo. Dicha hidrólisis utilizando una Fosfolipasa A está descrita en, por ejemplo, la publicación de la patente japonesa no examinada No. Sho-58-212783, y la hidrólisis utilizando una lipasa está descrita en la publicación de la patente japonesa no examinada No, Sho-63-42691. Además, la enzima Taka-Diastase^{R}, que ha sido aislada de la especie de Aspergillus conocida como "cofre del tesoro de enzimas", A. oryzae [Biochem. Z., 261 (1933) 275], ha demostrado una actividad de lipasa que es capaz de hidrolizar un fosfolípido. Sin embargo, la fosfolipasa más comúnmente utilizada en la hidrólisis industrial de fosfolípidos es la pancreatina, una enzima que se prepara a partir del páncreas de cerdos y que demuestra la actividad de una Fosfolipasa A2.

Las enzimas aisladas de micro-organismos han demostrado tener menos actividad que la Fosfolipasa A2 pancreática de porcino. Otras enzimas, tales como las lipasas, tienen una menor especificidad por el substrato así como desventajas adicionales, incluyendo un bajo rendimiento de lisofosfolípidos y una calidad menor del producto final lisofosfolípido, debido a la presencia de sub-productos. Aunque el término genérico "lipasa" puede parecer que incluye fosfolipasas, de hecho, las actividades enzimáticas son distintas, particularmente por el hecho de que las fosfolipasas son más selectivas en su lugar de hidrólisis que las lipasas. Es además aparente que algunas enzimas que demuestran la actividad de una fosfolipasa también demuestran una actividad separada que está clasificada como la actividad de una lipasa. Esto se demuestra más claramente en los Ejemplos de la presente solicitud.

Aunque la pancreatina tiene mejores propiedades que las enzimas del anterior estado de la técnica aisladas a partir de micro-organismos, la hidrólisis de un fosfolípido utilizando pancreatina tiene muchas desventajas.

En primer lugar, es necesario hacer continuos ajustes al pH de la mezcla de reacción durante la hidrólisis de un substrato fosfolípido con Fosfolipasa A2 pancreática de porcino. El pH óptimo para la actividad de la pancreatina se encuentra en el intervalo entre neutro y débilmente alcalino. Sin embargo, durante la reacción de hidrólisis, la liberación de ácidos grasos libres hace que el pH caiga, es decir que aumenta la acidez de la mezcla de reacción, de modo que, a no ser que se realice una acción en sentido contrario, la mezcla se vuelve ácida, y por consiguiente se sitúa a un pH fuera del óptimo para la actividad de la enzima. Por consiguiente, el pH de la reacción debe ser controlado cuidadosamente a lo largo de la reacción, y debe ser ajustado siempre que sea necesario. Un problema adicional asociado con este ajuste constante del pH es la necesidad resultante de eliminar del producto final al final de la reacción aquellas sustancias que han sido añadidas para ajustar el pH durante la reacción.

Un segundo problema es que la pancreatina es muy estable, tanto al tratamiento por calefacción como a los disolventes orgánicos, y por consiguiente es muy difícil de desactivar la enzima. Esto significa que la eliminación de la Fosfolipasa A2 a partir de la mezcla de hidrólisis al final de la reacción es muy difícil. La presencia de Fosfolipasa A2 residual en el producto final, en combinación con cualquier substrato fosfolípido original no hidrolizado durante la reacción, deja un potencial para una reacción adicional de la enzima residual en el substrato restante. La continua actividad de la fosfolipasa en el producto produce la liberación de ácidos grasos libres en el producto final, dando lugar a un cambio progresivo en las propiedades del producto. Esto puede disminuir claramente el valor del producto final.

Tradicionalmente el tratamiento con calefacción ha sido utilizado en los procedimientos que implican el uso de enzimas para desactivar la enzima residual. Sin embargo, la Fosfolipasa A2 pancreática de porcino no está suficientemente desactivada por el tratamiento por calefacción, e incluso el tratamiento de la enzima a una temperatura de 95ºC durante 30 minutos no desactivará de manera suficiente la enzima residual. El uso de una mayor temperatura es imposible en vista a la sensibilidad del fosfolípido y de los ácidos grasos a calentar; estas dos sustancias se ven dañadas o destruidas a temperaturas de aproximadamente 120ºC.

Se han propuesto varias soluciones para estos dos problemas principales. Así, se ha utilizado el fraccionamiento de disolventes para eliminar sustancias añadidas con el fin de ajustar el pH, tal como se ha descrito en la patente U.S. No. 3.652.397. De un modo alternativo, se ha llevado a cabo la reacción enzimática en un disolvente orgánico no iónico, no polar, con el fin de reducir el problema de pH [publicación de la patente japonesa no examinada No. Hei-3-98590]. Se ha descrito una propuesta adicional de superar el problema del pH en la publicación de la patente japonesa no examinada No. Sho-62-14790 y en la publicación de la patente japonesa No. Hei-4-81431, en las que se reclama que se añade un compuesto a la reacción que reacciona con cualquier ácido graso libre en la mezcla de reacción para formar un jabón metálico insoluble en agua. El problema de la desactivación de la enzima residual ha sido abordado por una variedad de métodos, como por ejemplo: por una combinación del fraccionamiento de disolventes, utilizando una variedad de disolventes, y cromatografía de columna, utilizando gel de sílice, por ejemplo; o por secado del fosfolípido después del tratamiento con una Fosfolipasa A2, seguido por fraccionamiento utilizando un disolvente polar [publicación de la patente japonesa no examinada No. Sho-62-262998]. Un método adicional, descrito en la publicación de la patente japonesa no examinada No. Sho-63-233750, implica el tratamiento de la Fosfolipasa A2 en el producto de reacción con una proteasa, seguido por la desactivación de la proteasa por tratamiento térmico.

Las soluciones propuestas hasta ahora para solucionar los problemas asociados con el uso de Fosfolipasa A2 pancreática de porcino, son, sin embargo, costosas en tiempo y dinero, además de complicadas. También pueden dar lugar a un menor rendimiento y afectar la seguridad del producto final.

En FEMS Microbiol. Lett., 3(2), 85-7, Vol. 3, No. 2, 1978 se describe la detección de la actividad de la Fosfolipasa A1 en varios filamentos de hongos, incluyendo cepas de Aspergillus, pero no se describe el aislamiento ni la purificación de la enzima. En Biological Abstracts, vol. 72 Philadelphia, PA, US; resumen no. 012592 se describe la purificación y la caracterización de las Fosfolipasas A1 y A2 en el hongo N. crassa. En la patente WO-A-89/01524 se describe la hidrólisis de los enlaces éster de fosfolípidos por varias fosfolipasas.

Se mantiene una necesidad de un método para la producción de lisofosfolípidos que puedan ser utilizados con confianza en muchas aplicaciones comerciales e industriales.

La presente invención proporciona una solución para muchos problemas identificados anteriormente proporcionando una nueva preparación de enzima que hidroliza un fosfolípido para producir un lisofosfolípido, no viéndose dicha preparación de la enzima dramáticamente afectada por el pH, y siendo fácilmente desactivada a temperaturas que no tienen un efecto de deterioro en el fosfolípido o en los ácidos grasos en la mezcla de reacción, teniendo dicha preparación de la enzima otras propiedades valiosas.

Así, la presente invención proporciona la Fosfolipasa A1 tal como se define en Reivindicación 1.

La presente invención también proporciona el uso de la Fosfolipasa A1 tal como se define en Reivindicación 1 en la preparación de un lisofosfolípido a partir de un fosfolípido.

La presente invención proporciona además un procedimiento para la preparación de una Fosfolipasa A1 de acuerdo con la Reivindicación 1, procedimiento que se describe en mayor detalle a continuación.

La presente invención se entiende además con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 representa la velocidad de conversión aparente de un fosfolípido en un lisofosfolípido, en la reacción descrita en el Ejemplo 6, descrito a continuación, así como los cambios en el pH de la mezcla de reacción durante el progreso de la reacción;

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La Figura 2 muestra la relación entre el pH y la actividad de la enzima producida de acuerdo con el Ejemplo 2, descrito a continuación, y demuestra el pH óptimo para la actividad de dicha enzima;

La Figura 3 muestra la relación entre el pH y la estabilidad de la enzima producida de acuerdo con el ejemplo 2, descrito a continuación;

La Figura 4 muestra la relación entre el pH y la estabilidad de la Fosfolipasa A1a y de la Fosfolipasa A1b, producida de acuerdo con el Ejemplo 3, descrito a continuación. El círculo lleno representa la Fosfolipasa A1a y el círculo vacío representa la Fosfolipasa A1b;

La Figura 5 muestra la relación entre el pH y la estabilidad de la enzima producida de acuerdo con el Ejemplo 5, descrito a continuación;

La Figura 6 muestra la relación entre la temperatura y la estabilidad de las enzimas producidas de acuerdo con los Ejemplos 2 (círculo lleno) y 5 (círculo vacío), descrito a continuación;

La Figura 7 muestra la relación entre el pH y la actividad de las enzimas producidas de acuerdo con el Ejemplo 3 (Fosfolipasa A1a y Fosfolipasa A1B) y el Ejemplo 5, descrito a continuación, dándose esta actividad en presencia del detergente no iónico Triton X-100^{R}. En este dibujo, el círculo lleno representa la Fosfolipasa A1a producida de acuerdo con el ejemplo 3, el círculo vacío representa la Fosfolipasa A1b producida de acuerdo con el ejemplo 3 descrito a continuación, y el diamante representa la enzima producida de acuerdo con el ejemplo 5, descrito a continuación;

La Figura 8 muestra la relación entre el pH y la actividad de las enzimas producidas de acuerdo con el Ejemplo 3 (Fosfolipasa A1a y Fosfolipasa A1B) y el Ejemplo 5, descrito a continuación, dándose esta actividad en ausencia del detergente ni iónico Triton X-100^{R}. En este dibujo, el círculo lleno representa la Fosfolipasa A1a producida de acuerdo con el Ejemplo 3 descrito a continuación, el círculo vacío representa la Fosfolipasa A1b producida de acuerdo con el Ejemplo 3 descrito a continuación, y el diamante representa la enzima producida de acuerdo con el Ejemplo 5, descrito a continuación;

La Figura 9 muestra la relación entre la temperatura y la actividad de las preparaciones de enzima de la presente invención. En este gráfico, el círculo lleno representa la Fosfolipasa A1a producida de acuerdo con el Ejemplo 3 descrito a continuación, el círculo vacío representa la Fosfolipasa A1b producida de acuerdo con el Ejemplo 3 descrito a continuación, el diamante representa la enzima producida de acuerdo con el Ejemplo 5 descrito a continuación y el cuadrado representa la enzima producida de acuerdo con el Ejemplo 2 descrito a continuación.

En la Figura 4, se determinó la estabilidad de la enzima a diferentes valores de pH por mezcla de la enzima con diferentes tampones. Así, a pH 3,2-6,0, el tampón fue una solución acuosa de ácido acético/acetato sódico; a pH 5,5-8,5, el tampón fue una solución acuosa de monofosfato potásico y difosfato sódico y a pH 8,0-12,5, el tampón fue una solución acuosa de glicina/cloruro sódico-hidróxido sódico.

De un modo similar, en la Figura 5, se determinó la estabilidad de la enzima a diferentes valores de pH por mezcla de la enzima con diferentes tampones. Así, a pH 3,2-6,0, el tampón fue una solución acuosa de ácido acético/acetato sódico; a pH 5,5-8,5, el tampón fue una solución acuosa de tris aminometano/ácido maleico y a pH 8,0-12,5, el tampón fue una solución acuosa de glicina/cloruro sódico-hidróxido sódico.

La Fosfolipasa A1 de la presente invención se puede obtener a partir de hongos filamentosos seleccionados entre el Aspergillus niger y el Aspergillus oryzae. Una Fosfolipasa A1 es una enzima que es capaz de hidrolizar el grupo acilo de la posición 1 de un fosfolípido, una actividad que es clasificada bajo el número de enzima EC3.1.1.32 [Enzyme Nomenclature 1984, Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry on the Nomenclature y Classification of Enzyme-Catalysed Reactions, Academic Press Inc.].

La selección del hongo escogido a partir del Aspergillus niger y del Aspergillus oryzae no es esencial para la presente invención, siempre que el microorganismo seleccionado produzca la enzima deseada. Hemos encontrado que los microorganismos siguientes producen la enzima deseada, y así preferimos de modo general que una de estas cepas se utilice como fuente para la Fosfolipasa A1 de la presente invención.

Aspergillus oryzae: ejemplos de la misma incluyen la cepa SANK 11870 o la cepa disponible bajo Institute of Fermentation (IFO) número 30102;

Aspergillus niger: ejemplos de la misma incluyen la cepa disponible bajo la American Type Culture Collection (ATCC) número 9642 o la cepa disponible bajo Institute of Fermentation (IFO) número 4407.

Es deseable que no sólo la cepa natural original sino también las cepas variantes, tanto las creadas de forma natural como artificial, sean capaces de producir la enzima deseada, y dichas cepas también se encuentran incluidas en la presente invención.

Lo más preferido es que la cepa de A. oryzae SANK 11870 y la de A. niger asequible bajo el número de ATCC 9642 se utilicen como fuente de micro-organismos para la enzima de la presente invención.

Los micro-organismos identificados anteriormente son todos conocidos y han sido descritos en la literatura, por ejemplo, en la Publicación de Patente Japonesa No. Sho-46-32792; J. Gen. Appl. Microbiol., 17 (1971) 281 y Biochem. Z., 261 (1933) 275, incorporándose todas dichas publicaciones a la presente invención por referencia. Cada uno de los micro-organismos se obtiene libremente de la American Type Culture Collection en los Estados Unidos de América, o a partir del Institute of Fermentation en Osaka, Japan, o del Institute of Applied Microbiology en Japón, utilizando los números de identificación IAM, IFO o ATCC proporcionados anteriormente.

Además, el Aspergillus oryzae SANK 11870 ha sido depositado en el National Institute of Bioscience y Human Technology, de la Agency of Industrial Science y Technology, el 18 de Mayo de 1993, bajo las condiciones del Tratado de Budapest, y recibió el número de depósito FERM BP-3887.

La Fosfolipasa A1 de la presente invención tiene un peso molecular de entre aproximadamente 30.000 y 40.000 daltons, preferiblemente entre aproximadamente 32.000 y 37.000 daltons, tal como se ha determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sódico [Weber y col., J. Biol. Chem., 244 (1969) 4406]. El peso molecular de la enzima puede variar dependiendo de la fuente de la enzima, es decir la enzima aislada de una especie de Aspergillus puede tener un peso molecular diferente respecto a la enzima cuando aislada de diferentes especies del género Aspergillus.

Las enzimas de la presente invención, es decir la Fosfolipasa A1 que pueden ser obtenidas a partir de diferentes cepas de hongos seleccionados entre el Aspergillus niger y el Aspergillus oryzae también se caracterizan por el pH al que migran durante la electroforesis de punto isoeléctrico (pI). Hemos encontrado que las enzimas de la presente invención tienen un pI aproximado a pH entre 2,8 y 4,5, preferiblemente entre pH 3,0 y 4,3, cuando se utiliza electroforesis de punto isoeléctrico bajo condiciones estándar.

La Fosfolipasa A1 que se obtiene a partir de hongos seleccionados entre el Aspergillus niger y el Aspergillus oryzae es superior al estado de la técnica de las fosfolipasas, particularmente en el hecho de que es una fosfolipasa acídica es decir, que es activa a un pH bajo. Así, se ha encontrado que la Fosfolipasa A1 de la presente invención demuestra una actividad satisfactoria en la hidrólisis de un fosfolípido para producir un lisofosfolípido entre un pH de 2,5 y un pH de 6,0, preferiblemente entre pH de 3,2 y pH de 5,5. El pH óptimo para la actividad de la enzima es dependiente de ciertas condiciones, tales como el sistema utilizado para la medida de dicha actividad óptima y de la pureza de la enzima. Las sustancias que solubilizan el ácido graso libre generado durante la hidrólisis del fosfolípido, tal como el detergente no iónico Triton X-100^{R}, pueden afectar el pH óptimo para la actividad de la enzima.

Así, cuando se mide el pH óptimo para la actividad de la enzima para llevar a cabo la reacción con una solución de enzima en una solución de tampón de acetato acuoso 50 mM, a 37ºC durante 10 minutos y en presencia del detergente no iónico Triton X-100^{R}, se obtiene la actividad máxima dentro del intervalo de pH de entre 3,5 y 5,0. El pH óptimo para la actividad también puede variar dependiendo de la fuente de Fosfolipasa A1. Así, las muestras de Fosfolipasa A1 obtenidas, por ejemplo, a partir de las especies de Aspergillus descritas anteriormente, tienen un pH óptimo para la actividad en presencia de Triton X-100^{R} de entre aproximadamente pH 3,5 y 5,0, preferiblemente aproximadamente pH 4.0 (ver Figuras 2 y 7, descritas a continuación).

Cuando se mide el pH óptimo para la actividad en ausencia de Triton X-100^{R}, por ejemplo, por reacción de la enzima con el substrato en una solución de tampón de acetato acuoso de 50 mM, a 37ºC durante 10 minutos, el pH óptimo para la actividad de la Fosfolipasa A1 de la presente invención está comprendido en el intervalo de aproximadamente pH 4,0 a 5,5. De nuevo, este valor puede diferir de acuerdo con la fuente de la fosfolipasa, y hemos encontrado que la Fosfolipasa A1 aislada de A. oryzae y de A. niger tiene un pH óptimo para la actividad de aproximadamente entre pH 4,5 y 5,5 bajo estas condiciones (ver Figura 8, descrita a continuación).

Adicionales ventajas de la enzima de la presente invención se demuestran por el intervalo de temperaturas en el que la enzima es activa. Se ha encontrado que la Fosfolipasa A1 de la presente invención es activa entre aproximadamente 30ºC y aproximadamente 65ºC. La temperatura a la que la enzima es más activa dependerá de, por ejemplo, el microorganismo a partir del que ha sido aislada. Así, hemos encontrado que la enzima aislada de A. oryzae es activa entre aproximadamente 30 y 65ºC, demostrando que presenta una actividad óptima alrededor de 50-60ºC, preferiblemente a 55ºC (ver Figura 9, descrita a continuación). Por otra parte, la Fosfolipasa A1 de la presente invención aislada de una cepa de A. niger demuestra una actividad óptima a temperaturas comprendidas entre aproximadamente 50 y 60ºC, tal como se muestra en la Figura 9, descrita a continuación.

También hemos encontrado que la Fosfolipasa A1 de la presente invención es estable en un amplio, pero claramente delimitado, intervalo de valores de pH y de temperaturas. La estabilidad de la enzima respecto al pH y a la temperatura está, sin embargo, influenciada por factores tales como la concentración de la enzima, la pureza de la enzima y la fuente a partir de la cual la enzima fue originalmente aislada. En términos generales, hemos encontrado que a una concentración de aproximadamente 10 unidades/ml la Fosfolipasa A1 de la presente invención es estable a un pH de aproximadamente 5,5 o superior, cuando se encuentra en solución de tampón de acetato sódico en ácido acético acuoso 33 mM, y a aproximadamente 10,5 o menos cuando se encuentra en una solución de tampón 33 mM de glicina acuosa en cloruro sódico-hidróxido sódico (ver Figura 4, descrita a continuación). Además, la enzima preparada tal como se ha descrito en el Ejemplo 2, descrito a continuación, ha mostrado ser estable entre aproximadamente pH 3 y aproximadamente pH 8,5. Estas mediciones se determinaron por medición de la actividad de la Fosfolipasa A (de acuerdo el método descrito en el Ejemplo 8(i), descrito a continuación) en una solución de la enzima al 1% (peso/volumen) tanto en tampón de acetato 0,2 M (pH entre 3,2 y 6,5) o tampón de tris(hidroximetil)aminometano (tris) ácido clorhídrico 0,01 M (pH entre 6,5 y 9,0) después de un tratamiento térmico a 37ºC durante 60 minutos. La actividad a pH 5,5 después de este tratamiento se tomó como del 100%. Los resultados se muestran en la Figura 3.

El intervalo claramente delimitado de temperaturas a las que la Fosfolipasa A1 de la presente invención es estable es una ventaja adicional de la enzima. Se ha encontrado que la enzima tiene un límite de estabilidad superior a la temperatura dentro del intervalo de entre aproximadamente 45ºC y aproximadamente 90ºC, aunque se prefiere que este límite superior sea 90ºC. La estabilidad a la temperatura de la enzima preparada tal como se ha descrito en el Ejemplo 2, detallado a continuación, se ilustra en la Figura 6. A un pH de 4,0, la enzima es estable a temperaturas comprendidas entre aproximadamente 30ºC y aproximadamente 55ºC. Este valor se determinó midiendo la actividad de la Fosfolipasa A, de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 8(i), detallado a continuación, después del tratamiento térmico de la solución de la enzima a temperaturas comprendidas entre 30 y 70ºC durante 30 minutos. La actividad de la solución de la enzima no sometida a tratamiento térmico se tomó como del 100%.

También hemos observado que la preparación de la enzima de la presente invención no tiene una estructura de cristal, y que la actividad de la enzima no es inhibida a ningún grado significativo por iones de metales polivalentes, tales como mercurio, plomo o hierro. Además, el agente quelante, el ácido etilendiamintetraacético (EDTA) no tiene ningún efecto aparente en la actividad de la enzima.

Las enzimas preferidas de la presente invención son la Fosfolipasa A1 aislada de A. oryzae SANK 11870, en particular, las Fosfopolipasas A1a y A1b, que poseen las características siguientes, y la Fosfolipasa A1 aislada de la cepa de A. niger disponible bajo el número ATCC 9642, poseyendo las características dadas a continuación.

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A. Fosfolipasa A1a de Oryzae:

Peso molecular:: 37.000 daltons, tal como se ha determinado por electroforesis sobre gel de poliacrilamida en presencia de docecil sulfato sódico.

Punto isoeléctrico (pI):: pI a pH 3,9, tal como se ha determinado por electroforesis de punto isoeléctrico.

pH activo óptimo:: pH entre 3,5 y 4.5 en presencia de Triton X-100^{R} (un detergente no iónico) o pH entre 4,5 y 5,5 en ausencia de Triton X-100^{R}.

Zona de pH estable:: pH de 5,5 o superior (con respecto a una solución de enzima que contiene aproximadamente 10 unidades/ml de enzima en un tampón de acetato sódico en ácido acético 33 mM) o pH de 10,5 o menos (con respecto a una solución de enzima que contiene aproximadamente 10 unidades/ml de enzima en una solución de 33 mM de glicina en el tampón cloruro sódico-hidróxido sódico.

Temperatura óptima:: entre 50ºC y 60ºC.

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A. Fosfolipasa A1b de Oryzae:

Peso molecular:: 35.000 daltons, tal como se ha determinado por electroforesis sobre gel de poliacrilamida en presencia de docecil sulfato sódico.

Punto isoeléctrico (pI):: pI a pH 4,3, tal como se ha determinado por electroforesis de punto isoeléctrico.

pH activo óptimo:: pH entre 3,5 y 4,5 en presencia de Triton X-100^{R} o pH entre 4,5 y 5,5 en ausencia de Triton X-100^{R}.

Zona de pH estable:: pH entre 5,5 o superior (con respecto a una solución de la enzima que contiene aproximadamente 10 unidades/ml de enzima en una solución de tampón de 33 mM de ácido acético/acetato sódico) o un pH de 10,5 o menos (con respecto a una solución de la enzima que contiene aproximadamente 10 unidades/ml de enzima en una solución de 33 mM de glicina en el tampón de cloruro sódico-hidróxido sódico)

Temperatura óptima:: entre 50ºC y 60ºC.

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A. Fosfolipasa A1 de Niger:

Peso molecular:: 32.000 daltons, tal como se determinó utilizando una columna de Superosa 12^{R}.

Punto isoeléctrico (pI):: pI a pH 3,0, tal como se ha determinado por electroforesis de punto isoeléctrico.

pH activo óptimo:: pH entre 4,0 y 5,0 en presencia de Triton X-100^{R} y pH entre 4,5 y 5,0 en ausencia de Triton X-100^{R}.

Temperatura óptima:: entre 50ºC y 60ºC.

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La Fosfolipasa A1 de la presente invención su puede obtener a partir de hongos seleccionados entre el Aspergillus niger y el Aspergillus oryzae. La enzima puede ser aislada de la cepa deseada de este hongo utilizando técnicas bien conocidas en el estado de la técnica.

Más particularmente, se ha encontrado que la Fosfolipasa A1 de la presente invención puede ser obtenida por:

(a) cultivo de una Fosfolipasa A1 producida de la cepa de Aspergillus niger o Aspergillus oryzae a temperaturas comprendidas entre 10 y 40ºC durante un periodo de entre 3 y 20 días;

(b) al final del periodo de cultivo, por dilución del cultivo con agua o una solución de tampón apropiada;

(c) filtrado de la solución resultante bajo presión para eliminar cualquier residuo insoluble; y

si se desea:

(d) purificación de la enzima.

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La cepa seleccionada de Aspergillus niger o de Aspergillus oryzae puede ser cultivada utilizando la técnica de cultivo de "salvado de trigo" ("wheat bran"). De un modo general esta técnica comprende la inoculación de un medio sólido o líquido de base de grano con esporas de la cepa escogida, seguido por el cultivo. El medio puede estar formado por cualquier grano, tal como arroz, trigo, maíz, habas de soja, semillas de sésamo, o pasta de semillas de algodón, junto con entre la mitad y dos veces el peso del grano en agua. Una vez se ha mezclado el agua y el grano, se hierve el grano resultante a una temperatura adecuada, por ejemplo a aproximadamente 120ºC, durante un periodo suficiente para esterilizarlo, como por ejemplo entre 15 y 30 minutos. A continuación se enfría el medio antes de usarlo.

El medio inoculado es cultivado de modo adecuado a temperaturas comprendidas entre 10 y 40ºC, preferiblemente entre 15 y 35ºC, y más preferiblemente a entre 18 y 32ºC.

La duración del tiempo durante el que se cultiva el medio inoculado depende de varios factores, tales como la composición del medio y los sustituyentes utilizados para formar el medio. Sin embargo, hemos encontrado que, utilizando cualquiera de las composiciones para ser usadas como medio señaladas anteriormente, y cultivando entre las temperaturas indicadas anteriormente, se obtuvo la producción óptima de la enzima después del cultivo durante entre 3 y 20 días, preferiblemente entre 4 y 8 días.

Lo más preferido es cultivar el medio inoculado a aproximadamente 30ºC durante un tiempo apropiado, por ejemplo durante aproximadamente 15 horas, y a continuación que el medio sea adicionalmente cultivado a una menor temperatura, tal como 19ºC, durante tanto tiempo como se desee, preferiblemente durante aproximadamente 5 días.

Una vez se ha superado el periodo de cultivo, se añade al medio de cultivo agua o una solución tampón apropiada, por ejemplo un tampón de acetato o una solución de tampón de fosfato, con el fin de diluir el medio. Se añaden al medio de forma adecuada entre una y veinte veces el peso del medio en tampón o agua. A continuación se agita bien la mezcla y entonces puede eliminarse la enzima de la solución. La enzima puede ser eliminada de la solución utilizando cualquier técnica estándar. Se ha encontrado que la filtración a presión es particularmente adecuada para la separación de la enzima. De un modo típico la enzima puede ser separada por filtración del caldo de cultivo, diluido con un volumen adecuado de agua, a través, de por ejemplo, una capa de una red de hilos y una tela de filtro en un vaso apropiado y bajo presión.

La Fosfolipasa A1 de la presente invención puede ser utilizada en un estado de purificación parcial o, de un modo alternativo, puede ser purificada hasta cualquier estado de purificación antes de su uso. El estado de purificación puede depender de, por ejemplo, el uso final al que se destine la enzima. Así, cuando se vaya a añadir la Fosfolipasa A1 de la presente invención a, por ejemplo, harina de trigo, para la hidrólisis del fosfolípido contenido en el mismo, se prefiere que la preparación de la enzima no contenga ninguna proteasa u otro contaminante similar. Sin embargo, cuando la presencia de contaminantes no tenga una mayor significación en el uso final de la enzima, la enzima puede ser utilizada en un menor estado de pureza.

La Fosfolipasa A1 de la presente invención, tanto si es una enzima única como si está presente como dos enzimas distintas tal como se produce por, por ejemplo el A. oryzae, puede ser purificada utilizando técnicas que son estándar en el estado de la técnica. Dichas técnicas incluyen, pero no están limitadas a, salar, precipitar utilizando disolventes orgánicos, adsorción utilizando un intercambiador de iones como adsorbente, ultrafiltración o secado a vacío. Cualquiera de estas técnicas puede ser utilizada tanto sola, como en combinación con otra de estas, o una técnica diferente.

Los siguientes procedimientos ejemplifican el método para el aislamiento y la purificación de una enzima Fosfolipasa A1 de un hongo seleccionado entre el Aspergillus niger y el Aspergillus oryzae, particularmente del A. oryzae SANK 11870.

Después de que se cultivara el micro-organismo durante el periodo de tiempo deseado, se puede añadir acetona o etanol enfriados, mientras se somete a agitación, para hacer un extracto del medio de cultivo, por ejemplo un cultivo sólido de las especies de Aspergillus en, por ejemplo, salvado de trigo. La acetona o el etanol fríos se añaden de un modo típico a una concentración final de entre aproximadamente el 60 y el 80% (v/v). A continuación se deja en reposo la mezcla resultante, después de lo cual se centrifuga en las condiciones estándar, por ejemplo tal como se ilustra en los Ejemplos que se presentan a continuación, para obtener un precipitado. Este precipitado es disuelto adecuadamente a continuación en una cantidad de una solución tampón, por ejemplo, en una solución de tampón acetato 50 mM (pH 5,5), después de lo cual la mezcla puede ser salificada utilizando, por ejemplo, sulfato amónico. A continuación puede separarse el precipitado por centrifugación adicional.

El precipitado resultante puede entonces ser disuelto en un tampón apropiado, por ejemplo, en una solución tampón de acetato acuoso 50 mM (pH 5,5) conteniendo sulfato amónico 1 M. Se elimina cualquier residuo insoluble que se forme dejando que el residuo se purifique utilizando técnicas cromatográficas, tales como una cromatografía en columna sobre Butil-Toyopearl Pak 650S^{R} (fabricado por Tosoh Corp.) utilizando una solución tampón de acetato acuoso 50 mM conteniendo sulfato amónico como eluyente.

La enzima resultante de la primera cromatografía es parcialmente purificada y puede, en el caso en que así se desee, ser utilizada en dicha forma. Sin embargo, pueden realizarse etapas adicionales de purificación. Dichas etapas pueden incluir, por ejemplo, dializar la enzima con una solución tampón de acetato acuoso 20 mM (pH 5,5), seguida por una purificación adicional utilizando una cromatografía de columna en, por ejemplo, una columna de Q-Sefarosa^{R} (fabricada por Pharmacia AB) utilizando una solución tampón de acetato 20 mM (pH 5,5) conteniendo cloruro sódico como eluyente. Como resultado de esta purificación se obtiene una Fosfolipasa A1.

Una purificación adicional de la Fosfolipasa A1 obtenida en esta forma puede, dependiendo de la fuente de micro-organismo, dar lugar a la producción de más de un enzima teniendo la actividad de la Fosfolipasa A1. Así, con la preparación de Fosfolipasa A1 obtenida en un modo similar al descrito anteriormente a partir de A. oryzae SANK 11870, las etapas de purificación adicionales dan lugar a la producción de la Fosfolipasa A1a y la Fosfolipasa A1b. Dichas etapas de purificación adicionales incluyen, por ejemplo, salificación con sulfato amónico y filtración sobre gel utilizando una columna Superosa 12^{R} (fabricada por Pharmacia AB), seguida por una cromatografía de columna en una columna MonoQ^{R} (fabricada por Pharmacia AB) utilizando una solución tampón de acetato acuoso 20 mM (pH 4,5) conteniendo cloruro sódico como eluyente.

La Fosfolipasa A1 de la presente invención es capaz de hidrolizar el fosfolípido para producir lisofosfolípido y, más específicamente, elimina el grupo 1-acilo del fosfolípido para producir 2-acil lisofosfolípido.

En vista a lo anterior, la presente invención también proporciona, por consiguiente, el uso de una Fosfolipasa A1 que puede obtenerse de un hongo seleccionado entre el Aspergillus niger y el Aspergillus oryzae en la producción de lisofosfolípido a partir de fosfolípido.

La cantidad de la Fosfolipasa A1 de la presente invención a utilizar en la hidrólisis de un fosfolípido no es esencial para la presente invención. Además, se ha encontrado que esta cantidad puede variar dependiendo de, por ejemplo, la temperatura a la que se lleva a cabo la reacción, el tiempo de reacción, el pH de la solución durante la reacción, las propiedades y la calidad del substrato particular, y la cantidad de conversión del fosfolípido a lisofosfolípido que se desee. Sin embargo, se ha encontrado de modo general que es suficiente una cantidad de aproximadamente 1000 unidades de actividad de enzima por gramo de substrato. De un modo alternativo, este resultado puede expresarse como el porcentaje de enzima por peso del substrato, por ejemplo una cantidad de enzima equivalente a entre el 0,05% en peso y el 10% en peso, siendo preferiblemente suficiente entre el 0,2% en peso y el 2% en peso, del substrato.

La selección de substrato para la enzima no está virtualmente limitado, en tanto en cuanto el substrato contiene, o es, un fosfolípido. De un modo similar, la concentración del substrato no es esencial para la presente invención. Del mismo modo, la fuente y las propiedades del substrato fosfolípido no son esenciales para la presente invención. Ejemplos de fosfolípidos adecuados que contienen substratos que pueden ser tratados con la enzima de la presente invención incluyen: fosfolípidos vegetales, tales como los obtenidos a partir de habas de soja, trigo, cebada, maíz, semilla de colza, cartamo, girasol, cacahuetes y semillas de algodón; fosfolípidos derivados de animales, tales como los fosfolípidos de yema de huevo, cerebro de animales (por ejemplo, de vacas, ovejas, cerdos y pollos) y fosfolípidos derivados microbialmente, tales como los derivados de células clorella y de hongos filamentosos. Los substratos que son más adecuados para el tratamiento con la enzima de la presente invención incluyen fosfolípidos de habas de soja, trigo o yema de huevo. Cuando se utiliza lecitina como substrato, por ejemplo lecitina derivada de harina de la harina de trigo, de habas de soja o de yema de huevo, es particularmente adecuado utilizar una concentración de lecitina de entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 50% en la mezcla de reacción.

La presente invención también proporciona un procedimiento para la hidrólisis de un fosfolípido, procedimiento que comprende la mezcla de una Fosfolipasa A1 que se puede obtener de un hongo seleccionado entre el Aspergillus niger y el Aspergillus oryzae con un fosfolípido que contiene el substrato bajo condiciones que permiten la hidrólisis de dicho substrato y, opcionalmente, que la reacción se complete, eliminado la enzima residual de la mezcla de reacción, o de otro modo mediante su inactivación.

En este procedimiento, se prefiere que una o ambas enzimas y el substrato sea húmedo, y más preferiblemente en solución, antes de la mezcla. La enzima o la solución del substrato es adecuadamente acuosa y disolventes adecuados incluyen agua obtenida por intercambio iónico, agua destilada, agua de pozo y agua del grifo. Cuando se utiliza agua tratada, tal como agua de intercambio iónico o agua destilada, se prefiere añadir a la solución una pequeña cantidad de una sal, tal como cloruro cálcico. El pH del medio puede ser ajustado en el caso en que sea necesario, por ejemplo para incrementar la reacción de hidrólisis, por la adición de un ácido acuoso, tal como ácido acético; una base, tal como hidróxido sódico; o una solución tampón, tal como una solución tampón de acetato acuoso. El pH de la mezcla de reacción se ajusta de un modo adecuado a un pH comprendido dentro del intervalo de entre pH 2,5 y pH 6,5, preferiblemente entre pH 3,5 y pH 5,5.

La reacción de la enzima puede, en el caso en que se desee, ser llevada a cabo en presencia de un disolvente no iónico, no polar. Puede utilizarse cualquier disolvente adecuado, pero se prefiere de un modo general que el disolvente sea un éter, tal como éter dietílico o dioxano; un hidrocarburo, tal como hexano, benceno o tolueno; o un éster, tal como acetato de etilo o acetato de butilo.

La temperatura a la cual se lleva a cabo la reacción no es esencial para la presente invención. Generalmente, sin embargo, la reacción procede a una velocidad satisfactoria a temperaturas comprendidas entre 10ºC y 70ºC, preferiblemente entre 20ºC y 65ºC. Se prefiere que la reacción se lleve a cabo a una temperatura comprendida entre 30ºC y 60ºC.

El tiempo requerido para la reacción varia dependiendo de, por ejemplo, la temperatura de reacción y el pH. Sin embargo, se ha encontrado que, bajo las condiciones señaladas anteriormente, un tiempo de reacción comprendido entre 10 minutos y 10 días, preferiblemente entre 1 hora y 2 días, dará lugar a una buena conversión del fosfolípido a la forma liso.

Siguiendo la reacción, la enzima resultante puede, de un modo opcional, ser eliminada de la mezcla de reacción por, por ejemplo, extracción con un disolvente orgánico adecuado, o puede, de otro modo, ser tratada para hacerla inactiva, por ejemplo por tratamiento térmico. Bajo condiciones normales, se prefiere que la enzima residual sea desactivada, aunque pueden producirse situaciones en las que no se requiera la necesidad de esta desactivación.

Se ha encontrado que la Fosfolipasa A1 de la presente invención puede ser desactivada con facilidad por procedimientos simples, tales como un tratamiento térmico suave, sometiendo la mezcla de reacción a presión, alterando el pH de la mezcla de reacción a un pH comprendido entre pH 3,0 y 6,0, o por cualquier combinación de estas técnicas. Sin embargo, el tratamiento térmico suave es el método preferido para la desactivación de la enzima. En particular, se ha encontrado que el calentamiento de la mezcla de reacción entre 45ºC y 90ºC, preferiblemente entre 50ºC y 80ºC, durante un periodo comprendido entre 5 minutos y 5 horas, preferiblemente entre 10 minutos y 2 horas, desactivará la enzima.

Cuando se añade la Fosfolipasa A1 de la presente invención al substrato fosfolípido para la producción de un lisofosfolípido, el producto de reacción puede ser utilizado con o sin purificación. Así, el producto de la reacción puede ser utilizado directamente, o puede ser sometido a procedimientos que lo dejan libre de la enzima residual, del substrato residual y de cualquier otro contaminante. Ejemplos de dichos procedimientos incluyen filtración para eliminar insolubles; concentración, por ejemplo por concentración por capa fina; purificación utilizando, por ejemplo, técnicas cromatográficas estándar, recristalización, o secado, por ejemplo liofilizado o secado por pulverización. De un modo alternativo, puede añadirse agua al producto lisofosfolípido, y la mezcla puede ser extraída a continuación utilizando un disolvente inmiscible en agua seguido por la eliminación del disolvente de extracción en el caso en que sea necesario.

De un modo alternativo, si se desea, la Fosfolipasa A1 de la presente invención puede ser añadida directamente al producto que contiene un fosfolípido, por ejemplo a una masa conteniendo harina de trigo. Esto puede ser llevado a cabo con el fin de mejorar las propiedades físicas del producto final, por ejemplo pan o molleras preparadas a partir de la masa tratada. Tales mejoras pueden facilitar la manipulación del producto; por ejemplo, puede mejorarse la elasticidad y la facilidad de extensión de la masa, y puede reducirse la pegajosidad de la masa. En tales situaciones puede ser deseable añadir otros factores al mismo tiempo, tales como una Fosfolipasa D y un emulsionante, como por ejemplo monoglicérido o estearil lactato cálcico.

La presente invención también se describe con referencia a los siguientes Ejemplos, en los que los Ejemplos 1 a 5 ilustran los métodos de preparación de las fosfolipasas de la presente invención y los Ejemplos 6 a 8 muestran la aplicación y actividad de las fosfolipasas de la invención.

Ejemplo 1 Preparación de la Fosfolipasa A1 en crudo a partir de A. Oryzae

Se inocularon unas muestras de esporas procedentes de un cultivo inclinado recogido con un ansa calibrada de Aspergilius Oryzae (SANK 11870) en 12 g de un medio que consistía en una mezcla con iguales cantidades en peso de salvado de trigo y agua. La cepa se cultivó luego a 30ºC durante 6 días.

Toda la cepa precultivada se inoculó luego en un medio adicional producido al colocar 600 g de una mezcla con iguales cantidades de salvado de trigo y agua en un plato metálico (42x24x7 (profundidad) cm) y hirviendo la mezcla a 120ºC durante 30 minutos. La cepa se cultivó luego a 30ºC durante 15 horas, después de las cuales se cultivó adicionalmente a 19ºC durante 5 días.

Al final de este tiempo se añadieron 3 litros de agua, y se mezcló a fondo, preparándose de esta manera la mezcla de salvado de trigo. La mezcla se dejó en reposo a 37ºC durante 2 horas, después de lo cual se filtró para obtener 2,87 litros de un extracto enzimático que tenía una concentración de Fosfolipasa A de 5,9 unidades/mL, tal y como se determina por el método descrito en el Ejemplo 8(i), más abajo. Se añadió luego una cantidad suficiente de una solución acuosa de ácido acético a este extracto enzimático para ajustar el pH de la mezcla a 4,0. Se añadió una cantidad de acetona fría, equivalente a 3 veces el volumen de la mezcla, y la mezcla se dejó en reposo durante toda la noche en una cámara fría para precipitar el enzima. Se eliminó el sobrenadando y el precipitado se lavó con acetona y se secó al vacío para obtener 11,1 g de un polvo en crudo de Fosfolipasa A1, que tenía un concentración de 1,170 unidades/g, tal y como se determina por el método descrito en el Ejemplo 8(i), más abajo.

Las actividades de los principales enzimas en esta preparación, por gramo de preparación, se observan en la Tabla 3, más abajo.

Ejemplo 2 Preparación de la Fosfolipasa A1 a partir de A. Oryzae

10 g de fosfolipasa A1 en crudo, preparada tal y como se describe en el Ejemplo 1, anterior, se disolvieron en aproximadamente 100 mL de agua. Se añadió luego una cantidad suficiente de una solución acuosa de ácido acético 1N a la solución resultante para ajustar el pH a 4,0. El volumen de la mezcla se hizo 200 mL por adición de agua, después de lo cual se añadieron 200 mL de acetona fría. La mezcla se mantuvo en reposo durante 1 hora. Al final de este tiempo, la mezcla se centrifugó a 5000 rpm durante 10 minutos (Hitachi, CR2OB2, Rotor: RPR 12-2) para obtener el primer precipitado.

Este precipitado se ensayó utilizando los procedimientos descritos en el Ejemplo 8(i), (ii), (iii), (iv), más adelante, y por esta razón se determinó que el precipitado tenía actividad amilasa así como una pequeña cantidad de actividad proteica. El precipitado también demostró una actividad de Fosfolipasa A de 320 unidades.

Se añadieron luego 600 mL de acetona fría al sobrenadante obtenido anteriormente, se mezcló la solución resultante, y se dejó en reposo durante 1 hora a temperatura ambiente. Al final de este tiempo, la mezcla se centrifugó a 5000 rpm durante 10 minutos (Hitachi CR20B2, Rotor: RPR 12-2) para obtener un segundo precipitado. Este segundo precipitado demostró una actividad de Fosfolipasa A de 7800 unidades, cuando se ensayó por el método descrito en el Ejemplo 8 (i), más adelante.

Este segundo precipitado se disolvió luego en 500 mL de una solución de amortiguador de acetato acuoso 50 mM (pH 5,5), después de lo cual, se añadieron 300 g de sulfato de amonio para provocar el fraccionamiento salino. El precipitado se separó luego por centrifugación a 10,000 rpm durante 20 minutos, y el precipitado así obtenido se disolvió en aproximadamente 50 mL de una solución de amortiguador de acetato acuoso 50 mM (pH 5,5) que contenía sulfato de amonio 1 M. La materia insoluble se separó en sus partes constituyentes por cromatografía en columna, utilizando una columna de Butil Toyopearl Pak 650S (fabricada por Toso Corp.) por un método de elución en gradiente, utilizando como eluyente una solución de amortiguador de acetato acuoso 50 mM (pH 5,5) que contenía sulfato de sodio a una concentración que variaba entre 0 M y 1 M La fracción que contenía una preparación que tenía actividad de Fosfolipasa A1, pero que no tenía substancialmente actividad de amilasa o proteasa, eluyó a una concentración de sulfato de amonio de 0,6 M o menor. Esta fracción se sometió luego al primero de dos pasos:

(a) Se eliminaron las sales de la fracción mediante diálisis de la fracción frente al agua y por evaporación a presión reducida para obtener 40 mg de Fosfolipasa A1; o

(b) La fracción se dializó con una solución acuosa de amortiguador de acetato 20 mM (pH 5,5) y luego se purificó utilizando una columna de cromatografía en una columna de Q-Sepahrose (fabricada por Pharmacia AB), con un método de elución en gradiente, utilizando como eluyente una solución de amortiguador de acetato acuoso 20 mM que contenía cloruro de sodio a una concentración que variaba entre 0 y 0,5 M. La fracción de fosfolipasa A1 así obtenida tenía 4000 unidades de actividad de Fosfolipasa A1, determinada por el método descrito en el Ejemplo 8 (i), más adelante.

Nosotros confirmamos que la preparación del enzima producido de acuerdo al paso (a), estaba esencialmente libre de actividad lipasa, ver más adelante la Tabla 3, lo cual indica que la fosfolipasa A1 producida por el método descrito anteriormente tiene una actividad lipasa equivalente a aproximadamente 0,1% o menos de su actividad de fosfolipasa A1.

Nosotros confirmamos luego, por el siguiente método, que el enzima obtenido por cada uno de los procedimientos descritos anteriormente era una fosfolipasa A1. Se reaccionaron 0,0236 unidades del enzima obtenido ya sea por el paso (a) o el paso (b) anteriores durante 10 minutos con (i) 0,1 \mumol de L- \alpha-dipalmitoilfosfatidilcolina (1 mCi/mmol) en el que el grupo de palmitoilo en la posición 2 se encuentra marcado con ^{14}C (New Corp., NEC 764), y (ii) con 0,1 \mumol de L-\alpha-dipalmitoilfosfatidilcolina (2 mCi/mmol) en el que los grupos de palmitoilo en las posiciones 1 y 2 se encuentran marcados con ^{14}C (New Corp., NEC 682). El volumen final de cada mezcla de reacción fue de 90 \muL. Se liberó ácido palmítico marcado con ^{14}C tan solo en la reacción del enzima con la L-\alpha-dipalmitoilfosfatidilcolina en el que ambas posiciones 1 y 2 de los grupos palmitoilo se marcaron con ^{14}C. Esta es una confirmación de que la preparación de fosfolipasa puede hidrolizar la lecitina y que esta hidrólisis tiene lugar tan sólo en los grupos 1-acil.

Ejemplo 3 Fosfolipasa A1a y A1b 3(i) Separación y purificación

Se añadió una cantidad suficiente de sulfato de amonio a la preparación de fosfolipasa obtenida como se describe en la parte (b) del Ejemplo 2 anterior, para provocar el fraccionamiento salino. El producto resultante se filtró por filtración en gel en una columna de Superosa 12 (fabricada por Pharmacia AB) utilizando como eluyente una solución de amortiguador de acetato acuoso 20 mM (pH 4,5), seguido por cromatografía en columna en una columna MonoQ (fabricada por Pharmacia AB) utilizando un método de elución en gradiente con una solución de amortiguador de acetato acuoso 20 mM (pH 4,5) que contenía una concentración de cloruro de sodio que variaba desde 0 a 0,25 M como el eluyente. Este procedimiento da lugar a la preparación de Fosfolipasa A1a que tiene una concentración de Fosfolipasa A de 880 unidades y una Fosfolipasa A1b que tiene una concentración de Fosfolipasa A de 2400 unidades.

Ejemplo 4 Fosfolipasa A en crudo

Se siguió un procedimiento similar al que se describe en el Ejemplo 1, anterior, pero utilizando una muestra de un cultivo inclinado recogido con una ansa calibrada de Aspergillus Níger ATCC 9642 en lugar de la cepa A. Oryzae utilizada allí, para obtener 19,2 g de Fosfolipasa A1 en crudo, que tenía una concentración, en la liberación de ácido graso a partir del fosfolípido, de 119 unidades/g, determinado al utilizar el método descrito en el Ejemplo 8(i), más abajo.

Varias actividades de los enzimas asociados con esta preparación enzimática se observan en la Tabla 3, más adelante.

Ejemplo 5 5(i) Fosfolipasa A1

Se siguió un procedimiento similar al descrito anteriormente en los Ejemplos 2 y 3(i), pero utilizando 10 g de una preparación de Fosfolipasa A1 en crudo obtenida en el Ejemplo 4, anterior, para poder purificar esta preparación. Entre las técnicas de purificación utilizadas se incluyen la fraccionación y precipitación con acetona y la cromatografía en columna utilizando una columna de Butil Toyopearl Pak 650 S; una columna de Q-Sepahrose, y una columna de Superose 12. Se produjeron 0,015 g de Fosfolipasa A1 en forma de un polvo, que tenía una concentración de 2100 unidades/g, de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 8(i), más abajo.

Nosotros confirmamos luego, por el siguiente método, que el enzima obtenido por el procedimiento descrito anteriormente era una Fosfolipasa A1. Se reaccionaron 0,0236 unidades del enzima obtenido anteriormente durante 10 minutos con (i) 0,1 \mumol de L-\alpha-dipalmitoilfosfatidilcolina (1 mCi/mmol) en el que el grupo de palmitoilo en la posición 2 se encuentra marcado con ^{14}C (New Corp., NEC 764), y (ii) con 0,1 \mumol de L-\alpha-dipalmitoilfosfatidilcolina (2 mCi/mmol) en el que los grupos de palmitoilo en las posiciones 1 y 2 se encuentran marcados con ^{14}C (New Corp., NEC 682). El volumen final de cada mezcla de reacción fue de 90 \muL. Se liberó ácido palmítico marcado con ^{14}C tan solo en la reacción del enzima con la L-\alpha-dipalmitoilfosfatidilcolina en el que ambas posiciones 1 y 2 de los grupos palmitoilo se marcaron con ^{14}C. Esta es una confirmación de que la preparación de fosfolipasa puede hidrolizar la lecitina y que esta hidrólisis tiene lugar tan sólo en los grupos 1-acilo.

Ejemplo 6 Preparación de Lisofosfolípido

Se establecieron varios sistemas de ensayo para poder determinar la actividad de la preparación enzimática de la presente invención en la hidrólisis de fosfolípido, así como para determinar la dependencia de la reacción con el pH. Varios sistemas de reacción tuvieron las siguientes composiciones:

Experimento 1-A: una suspensión al 10% (p/p) de 5 g de SLP-blanco en 45 mL de agua;

Experimento 2-A: una suspensión al 10% (p/p) de 5 g de SLP-blanco en 45 mL de una solución acuosa de un amortiguador de acetato 20 mM (pH 3,5);

Experimento 1-B: una suspensión al 10% (p/p) de 5 g de SLP-blanco en 45 mL de agua;

Experimento 2-B: una suspensión al 10% (p/p) de 5 g de SLP-blanco en 45 mL de una solución acuosa de ácido clorhídrico tris(hidroximetil)aminometano 20 mM (tris-ácido clorhídrico) (pH 9,0); y

Experimento 3-B: una suspensión al 10% (p/p) de 5 g de SLP-blanco en 45 mL de agua, con adición de una cantidad suficiente de una solución acuosa de hidróxido de sodio para mantener el pH dela mezcla de reacción entre 7,5 y 8,5.

[El SLP-blanco se fabrica por True Lecithin Kogyo Co., Ltd, y su sustrato lecitina en forma de polvo. Teniendo un contenido de fosfolípido no inferior al 95% y un contenido de fosfatidilcolina del 23-30%].

Se colocaron 50 mL de cada uno de los sistemas de reacción enumerados bajo los experimentos 1-A, 2-A, 1-B, 2-B y 3-B anteriores, y 0,2 g de cloruro de calcio en una cubeta de 100 mL, y la mezcla resultante se mezcló a fondo utilizando un homogeneizador de ultrasonidos. Después de la homogeneización la mezcla se calentó a 37ºC y los enzimas de ensayo apropiados se añadieron a la mezcla calentada, mientras se mantenía la agitación de la mezcla. Cada enzima de ensayo se utilizó en una cantidad de 865 unidades. La cubeta se cubrió con una película de Sealon (Fuji Phptp Film Co. Ltd.) para prevenir la evaporación de la humedad y se agitó la mezcla de reacción, mientras se mantenía la temperatura de la mezcla a 37ºC.

Los enzimas de ensayo fueron Fosfolipasas A1, preparadas tal y como se describe anteriormente en el Ejemplo 2, y la Fosfolipasa A2, obtenida a partir del páncreas porcino (fabricado por Sigma Corp.). La actividad del enzima fosfolipasa A2 se midió a pH 8,0. La fosfolipasa A1 se utilizó en los experimentos 1-A y 2-A anteriores, y la fosfolipasa A2 fue el enzima que se utilizó en los experimentos 1-B, 2-B y 3-B, anteriores.

Las muestras se cogieron de cada mezcla de reacción al principio de la reacción, así como después a intervalos de una hora. En total se cogieron cuatro muestras. La cantidad de ácido graso libre en cada uno da las muestras se determinó utilizando el reactivo cuantitativo de ácido graso libre, Determiner NEFA (Kyowa Medex Co., Ltd).

La velocidad de conversión aparente a lisofosfolípido, es decir, la velocidad a la que el fosfolípido se convierte a lisofosfolípido, se determinó utilizando la siguiente fórmula:

A/B x 100

En la que:

A representa el número de moles de lisofosfolípido (es decir, el número de moles de ácido graso liberado por la reacción enzimática); y

B representa el número de moles del sustrato fosfolípido en la muestra.

Para este cálculo se asumió que el peso molecular promedio del fosfolípido contenido en el SLP-blanco fue de 765 daltons.

Los resultados se indican en la Tabla 1.

TABLA 1

1

Como se puede observar a partir de los resultados anteriores, la fosfolipasa A1 de la presente invención demostró una velocidad de conversión de fosfolípido a lisofosfolípido que fue superior a la de la fosfolipasa A2 pancreática porcina, incluso en ausencia de un regulador de pH.

La velocidad de conversión aparente de fosfolípido a lisofosfolípido y los cambios en el pH a lo largo del tiempo en el experimento 1-A se observan en la Figura 1.

Ejemplo 7 Desactivación del enzima residual por Tratamiento en caliente 7(i) Fosfolipasa A1 obtenida a partir de A. Oryzae

Se colocaron 50 mL de una solución definida bajo el experimento 3-A, 4-A, 4-B o 5-B, más abajo, y 0,2 g de cloruro de calcio en una cubeta de 100 mL, y la mezcla resultante se mezcló a fondo, utilizando un homogeneizador de ultrasonidos. La mezcla se calentó luego a una temperatura de 37ºC, después de lo cual se añadió el enzima de ensayo, mientras se mantenía la agitación de la mezcla. Cada enzima de ensayo se utilizó en una cantidad de 2160 unidades. A todas las reacciones enzimáticas se les permitió avanzar por encima de un periodo de 5 horas, mientras se agitaban las mezclas y manteniendo las mezclas a una temperatura de 37ºC.

Los sistemas de reacción tuvieron las composiciones siguientes:

Experimento 3-A: una suspensión al 10% (p/p) de 5 g de SLP-blanco en 45 mL de una solución acuosa de un amortiguador de acetato 5 mM (pH 4,5);

Experimento 4-A: una suspensión al 50% (p/p) de 25 g de SLP-blanco en 25 mL de una solución acuosa de un amortiguador de acetato 5 mM (pH 3,5);

Experimento 4-B: una suspensión al 10% (p/p) de 5 g de SLP-blanco en 45 mL de una solución acuosa de un amortiguador de ácido tris-clorhídrico 5 mM (pH 8,0); y

Experimento 5-B: una suspensión al 50% (p/p) de 25 g de SLP-blanco en 25 mL de una solución acuosa de un amortiguador de ácido tris-clorhídrico 5 mM (pH 8,0).

El enzima de ensayo utilizado en los experimentos 3-A y 4-A fue la fosfolipasa A1 (preparada tal y como se describe en el Ejemplo 2) y el enzima de ensayo utilizado en los experimentos 4-B y 5-B fue la fosfolipasa A2 pancreática porcina (fabricada por Sigma Corp.).

La velocidad aparente de conversión del fosfolípido a lisofosfolípido al final de un período de 5 horas fue aproximadamente del 65% en el Experimento 5-B, es decir, el sistema en el que el sustrato era una suspensión al 50% (p/p) de SLP-blanco en una solución acuosa de amortiguador de ácido tris-clorhídrico 5 mM, mientras que la velocidad de conversión en los otros experimentos, es decir, 3-A, 4-A y 4-B fue del 90% o más.

Al final de la reacción enzimática, es decir, después de un periodo de 5 horas, se colocaron aproximadamente 7 g de cada una de las soluciones de reacción en diversos tubos de ensayo Somogyi. Cada tubo se cubrió con una película de Sealon, para prevenir la evaporación de la humedad, y los tubos se mantuvieron en reposo a temperaturas desde 50ºC a 80ºC durante 30 minutos. En este contexto, se expusieron los contenidos de los diferentes tubos a diferentes temperaturas.

La actividad de la Fosfolipasa A residual en cada una de las soluciones de reacción se midió de acuerdo al método descrito en el Ejemplo 8(i), más abajo. La actividad residual de la fosfolipasa A2 pancreática porcina se midió a pH 8, mientras que la actividad residual de la fosfolipasa A1 de la presente invención se midió a pH 4. La actividad residual se expresa basándose en que una solución de la reacción no sometida a tratamiento con calor tendría una actividad residual del 100%. Las actividades residuales en los sistemas de ensayo son, además, expresadas como un porcentaje de una reacción que no se ha procesado.

Los resultados se indican en la Tabla 2.

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TABLA 2

3

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Los resultados anteriores claramente muestran que la fosfolipasa A1 de la presente invención, que proviene del A. Oryzae, se desactiva a una temperatura menor que la Fosfolipasa A2, que proviene del páncreas porcino.

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7(ii) Fosfolipasa A1 obtenida a partir de A. Níger

Siguiendo un procedimiento similar al descrito anteriormente en el Ejemplo 7 (i), pero utilizando 10 mL de una suspensión al 10% (p/p) de 1 g de SLP-blanco en 9 mL de una solución acuosa de amortiguador de acetato 5 mM, 0,04 g de cloruro de calcio, y 151 unidades de fosfolipasa A1 (obtenida a partir de A. Níger, como se describe en anteriormente en el Ejemplo 5), se determinó la cantidad de desactivación por el tratamiento con calor del enzima.

La velocidad aparente de conversión del fosfolípido a lisofosfolípido al final de un periodo de cinco horas del experimento no fue inferior al 90%.

La actividad de la fosfolipasa A1 residual en cada una de los soluciones de reacción se midió de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 8(i), y su actividad se expresó de la misma manera como en la Tabla 2, citada anteriormente.

Los resultados se muestran más abajo.

TABLA 2A

4

Ejemplo 8

La preparación enzimática de la presente invención puede tener más de una actividad enzimática asociada con ésta. La actividad predominante es la de una fosfolipasa, pero se han demostrado también en menores cantidades, actividades de lipasa, amilasa, proteasa ácida y neutra y proteasa alcalina. Lo que sigue son los ensayos utilizados para determinar estas actividades adicionales en las preparaciones enzimáticas.

8(i) Ensayo de la actividad de Fosfolipasa A

Se añadieron 0,05 mL de una solución acuosa 0,1 M de cloruro de calcio y 0,25 mL de una solución acuosa de amortiguador de acetato 0,2 M (pH 4,0) a 0,5 mL de una solución formada al mezclar una suspensión al 2,0% (p/p) de SLP-blanco (fabricado por True Lecithin Kogyo Co., Ltd.) y Triton X-10Q al 4% (v/v) en agua. A continuación, se añadió 0,1 mL de la solución enzimática apropiada a la mezcla resultante, y la mezcla se agitó hasta que resultó en una mezcla homogénea. La mezcla obtenida de esta manera se dejó en reposo a 37ºC durante 10 minutos, para permitir que la reacción enzimática tuviera lugar. Al final de este tiempo, se añadió 0,1 mL de una solución acuosa de ácido clorhídrico 1 N a la mezcla de reacción para parar la reacción enzimática. Se cogió luego una muestra de 0,02 mL de la mezcla de reacción, y ésta se utilizó para determinar la cantidad de ácido graso libre. El ácido graso libre se cuantificó utilizando un reactivo cuantitativo de ácido graso libre, Determiner NEFA (Kyowa Medex Cp., Ltd.)

La actividad enzimática que produce 1 \muM de ácido graso por minuto de la reacción enzimática se definió como 1 unidad.

8(ii) Ensayo de la actividad lipasa

Se añadieron 0,05 mL de una solución acuosa 0,1 M de cloruro de calcio y una solución de amortiguador de acetato 0,2 M (pH 6,0) a 0,5 mL de una emulsión de aceite de oliva al 2,0% (p/v) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). La emulsión de aceite de oliva se preparó al añadir 10 mL de una solución acuosa al 0,5% (p/p) de goma arábica a 0,2 g de aceite de oliva, y luego dispersando la mezcla durante 5 minutos con un homogeneizador de ultrasonidos. Se añadieron luego 0,1 mL de la solución enzimática apropiada a la mezcla y la mezcla se agitó hasta que se llegó a la homogeneidad. La mezcla resultante se dejó en reposo luego a 37ºC durante 10 minutos, para permitir que la reacción enzimática avanzase. Al final de este tiempo, se añadió 0,1 mL de una solución acuosa de ácido clorhídrico 1 N a la mezcla para parar la reacción enzimática. Se cogió luego una muestra de 0,02 mL de la solución de la reacción, y esto se utilizó para determinar la cantidad de ácido graso libre en la mezcla, utilizando un reactivo cuantitativo de ácido graso libre, Determiner NEFA (Kyowa Medex Co. Ltd.). Se define como 1 unidad la actividad enzimática que produce 1 \mumol de ácido graso por minuto de la reacción enzimática.

8(iii) Ensayo para la actividad de Amilasa (Forma de Saccharified)

Se colocó en un tubo de ensayo 0,5 mL de sustrato. El sustrato se preparó al añadir una cantidad apropiada de agua, por ejemplo, 20 mL, a 2 g de un almidón soluble y luego calentando la mezcla resultante para disolver el almidón. La mezcla se enfrió luego, se añadieron 20 mL de una solución acuosa de amortiguador de acetato 0,2 M (pH 4,5) y luego se añadió el agua para llevar el volumen final a 50 mL.

El sustrato se calentó luego en un baño de agua termostático mantenido a 37ºC, y luego se añadió 0,25 mL de la solución enzimática apropiada al sustrato. Después de que se había permitido avanzar la reacción enzimática durante 30 minutos, se terminó por la adición de 0,25 mL de una solución acuosa de hidróxido de sodio 0,5 N. La cantidad de azúcar reducido producida por la reacción enzimática se midió luego en esta solución de reacción utilizando la técnica de ensayo de azúcar reducido de Somogyi-Nelson (J. Biol.. Chem., 160 (1945), 61-68 y J. Biol. Chem., 153 (1944) 375-380). La actividad enzimática que produce el azúcar reducido equivalente a 1 \mumol de glucosa por minuto de la reacción enzimática se define como 1 unidad.

8(iv) Ensayo para la actividad de proteasa

La actividad proteasa se midió utilizando el método de Hagiwara [Enzyme Research Methods 2, Asakura Publishing, 237-246 (1956)]. Para la medición de las tres diferentes actividades de proteasa, es decir, proteasa ácida, neutra y alcalina, el pH del sustrato se puso a diferentes valores. Así, para la proteasa ácida se utilizó un pH de 3,0 y para las actividades de proteasa neutra y alcalina se utilizó un pH de 7,0. La actividad enzimática que produce una sustancia no proteica que demuestra una absorbancia a 275 nm que es equivalente a 1 \mug de tirosina por minuto bajo condiciones estándar en cumplimiento con los requerimientos de Nothrop y Anson [Northrop, J. Gen. Physiol., 16 (1932) 41 y Anson, J. Gen. Physiol., 22 (1938) 79] se define como una unidad.

La siguiente Tabla 3 muestra varias actividades enzimáticas por gramo de preparaciones de fosfolipasa de la presente invención.

TABLA 3

5

Claims

1. Una Fosfolipasa Al que se obtiene de un hongo seleccionado entre el Aspergillus niger y el Aspergillus oryzae caracterizado porque dicha Fosfolipasa Al:

(a) hidroliza los fosfolípidos entre aproximadamente pH 2,5 y aproximadamente pH 6,0;

(b) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 30.000 y aproximadamente 40.000 daltons, tal como se ha determinado por electroforesis sobre gel de poliacrilamida y dodecil sulfato sódico;

(c) tiene una estabilidad respecto a la temperatura con un límite superior de entre aproximadamente 45 y aproximadamente 90ºC;

(d) tiene un pI bajo la electroforesis de punto isoeléctrico a aproximadamente un pH comprendido entre pH 2,8 y pH 4,5;

(e) Tiene una temperatura óptima para la actividad de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 65ºC.; y

(f) Tiene un pH óptimo para la actividad de entre pH 3,2 y pH 5,5.

2. Una Fosfolipasa Al de acuerdo con la Reivindicación 1 que es estable a temperaturas de menos de 90ºC.

3. Una Fosfolipasa Al de acuerdo con la Reivindicación 1 que es estable a un pH de entre aproximadamente pH 3 y aproximadamente pH 10,5.

4. Una Fosfolipasa Al de acuerdo con la Reivindicación 1 que tiene un peso molecular de entre aproximadamente 32.000 y 37.000 daltons tal como se ha determinado por electroforesis sobre gel de poliacrilamida y dodecil sulfato sódico.

5. Una Fosfolipasa Al de acuerdo con la Reivindicación 1 que tiene un pI bajo electroforesis de punto isoeléctrico de entre aproximadamente pH 3,0 y aproximadamente pH 4,3.

6. Una Fosfolipasa Al de acuerdo con la Reivindicación 1 que tiene una temperatura óptima para la actividad de desde aproximadamente 50ºC hasta 65ºC.

7. Una Fosfolipasa Al de acuerdo con la Reivindicación 1 que se puede obtener a partir de un hongo seleccionado entre:

Aspergillus oryzae SANK 11870 FERM BP-3887;

Aspergillus oryzae disponible bajo el número del Institute of Fermentation 30102;

Aspergillus niger, disponible bajo el número del American Type Culture Collection 9642; y

Aspergillus niger, disponible bajo el número Institute of Fermentation 4407.

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8. Una Fosfolipasa Al de acuerdo con la Reivindicación 1 que es aislada a partir del Aspergillus oryzae SANK 11870, disponible bajo el número de depósito FERM BP-3887.

9. Una Fosfolipasa Al de acuerdo con la Reivindicación 1 que es aislada a partir de la cepa de Aspergillus niger que se puede obtener bajo el número American Type Culture Collection 9642.

10. Fosfolipasa Ala que se puede obtener a partir del Aspergillus oryzae SANK 11870 FERM BP-3887 y que tiene las siguientes características:

pH activo óptimo:: pH entre 3,5 y 4.5 en presencia de Triton X-100^{R} o

\quad: pH entre 4,5 y 5,5 en ausencia de Triton X-100^{R};

Zona de pH estable:: pH de 5,5 o superior, con respecto a una solución de enzima que contiene aproximadamente 10 unidades/ml de enzima en una solución tampón de 33 mM de ácido acético/acetato sódico, o pH de 10,5 o menos, con respecto a una solución de enzima que contiene aproximadamente 10 unidades/ml de enzima en una solución tampón de 33 mM de glicina/cloruro sódico-hidróxido sódico; y

Temperatura óptima:: entre 50ºC y 60ºC.

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11. Una Fosfolipasa A1b que se puede obtener a partir del Aspergillus oryzae SANK 11870 FERM BP-3887 y que tiene las siguientes características:

Punto isoeléctrico:: pI a pH 4,3, tal como se ha determinado por electroforesis de punto isoeléctrico.

pH activo óptimo:: pH entre 3,5 y 4,5 en presencia de Triton X-100^{R} o

\quad: pH entre 4,5 y 5,5 en ausencia de Triton X-100^{R}.

Zona de pH estable:: pH entre 5,5 o superior, con respecto a una solución de la enzima que contiene aproximadamente 10 unidades/ml de enzima en una solución de tampón de 33 mM de ácido acético/acetato sódico, o un pH de 10,5 o menos, con respecto a una solución de la enzima que contiene aproximadamente 10 unidades/ml de enzima en una solución tampón de 33 mM de glicina/cloruro sódico-hidróxido sódico; y

Temperatura óptima:: entre 50ºC y 60ºC.

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12. Una Fosfolipasa Al que se puede obtener a partir del Aspergillus niger ATCC 9642 y que tiene las siguientes características:

Punto isoeléctrico:: pI a pH 3,0, tal como se ha determinado por electroforesis de punto isoeléctrico.

pH activo óptimo:: pH entre 4,0 y 5,0 en presencia de Triton X-100^{R} y pH entre 4,5 y 5,0 en ausencia de Triton X-100^{R}; y

Temperatura óptima:: entre 50ºC y 60ºC.

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13. El uso de una Fosfolipasa Al tal como se define en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 12 en la preparación de un lisofosfolípido a partir de un substrato fosfolípido.

14. El uso de la Reivindicación 13 en el que la Fosfolipasa Al se utiliza a una concentración de aproximadamente 1000 unidades de actividad de enzima por gramo de substrato.

15. El uso de la Reivindicación 13 en el que el substrato fosfolípido deriva de animales, vegetales o micro-organismos.

16. El uso de la Reivindicación 13 en el que el substrato fosfolípido deriva de habas de soja, trigo o yema de huevo.

17. El uso de la Reivindicación 13 en el que el substrato es lecitina.

18. El uso de la Reivindicación 13 en el que el substrato es lecitina a una concentración de entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 50% en la mezcla de reacción.

19. El uso de la Reivindicación 13 en el que la preparación de un lisofosfolípido a partir de un fosfolípido tiene lugar en una solución acuosa.

20. El uso de la Reivindicación 13 en el que la preparación de un lisofosfolípido a partir de un fosfolípido tiene lugar a una temperatura comprendida entre 10 y 70ºC.

21. El uso de la Reivindicación 13 en el que la preparación de un lisofosfolípido a partir de un fosfolípido tiene lugar a una temperatura comprendida entre aproximadamente 20 y 65ºC.

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22. El uso de la Reivindicación 13 en el que, siguiendo la preparación de un lisofosfolípido a partir de un fosfolípido, se desactiva la Fosfolipasa Al residual.

23. El uso de la Reivindicación 13 en el que, siguiendo la preparación de un lisofosfolípido a partir de un fosfolípido, el lisofosfolípido es purificado al menos parcialmente.

24. El uso de la Reivindicación 13 en el que la Fosfolipasa Al es añadida directamente a un fosfolípido conteniendo el producto.

25. Un método de preparación de una Fosfolipasa Al de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que comprende

(a) cultivar una Fosfolipasa A1 producida de la cepa de Aspergillus niger o Aspergillus oryzae a temperaturas comprendidas entre 10 y 40ºC durante un periodo de entre 3 y 20 días;

(b) al final del periodo de cultivo, diluir el cultivo con agua o una solución de tampón apropiada;

(c) filtrar la solución resultante bajo presión para eliminar cualquier residuo insoluble; y

si se desea:

(d) purificar la enzima.

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26. El método de la Reivindicación 25 en el que la cepa es cultivada a temperaturas comprendidas entre 18 y 32ºC.

27. El método de la Reivindicación 25 en el que la cepa es cultivada durante un tiempo comprendido entre 4 y 8 días.

28. El método de la Reivindicación 25 en el que la cepa es cultivada a 30ºC durante 15 horas, y a continuación a 19ºC durante 5 días.

29. El método de la Reivindicación 25 en el que se diluye el cultivo con entre una y veinte veces el peso del medio en agua o una solución de tampón acuoso.

30. El método de la Reivindicación 25 en el que se purifica la Fosfolipasa Al por uno cualquiera o una combinación de los métodos seleccionados entre el grupo que consiste en: dializar la mezcla; cromatografía de columna; salificar; o filtración sobre gel.